KR101663912B1

KR101663912B1 - 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 함유하는 피부 미백, 주름개선 또는 재생용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101663912B1
Application number: KR1020150134689A
Authority: KR
Inventors: 조용우; 최지숙; 김은지; 윤화인; 김준성
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2015-01-08
Filing date: 2015-09-23
Publication date: 2016-10-10
Also published as: KR20160086253A

Abstract

본 발명은 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 피부 미백, 주름개선 또는 재생용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 엑소좀은 줄기세포의 세포증식, 분화, 재생과 관련된 유전자, 단백질, 성장인자 등을 함유하고 있으며, 항생제나 혈청, 배양액의 유해 인자들이 포함되지 않은 정제된 성분이고, 세포 유래 지질 전달체이기 때문에 피부 미백, 주름개선, 피부 재생을 포함한 기능성 화장품 조성물, 미용 목적의 흉터 개선 제제 등으로 적용이 가능하다.

Description

줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 함유하는 피부 미백, 주름개선 또는 재생용 화장료 조성물{Cosmetic composition containing exosomes extracted from stem cell for skin whitening, antiwrinkle or regeneration}

본 발명은 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 함유하는 피부 미백, 주름개선 또는 재생용 화장료 조성물에 관한 것이다.

종래에는 줄기세포를 배양하여 얻은 배양액을 화장료로 사용하고자 하였다. 일반적으로 줄기세포를 배양하기 위해서는 적당량의 항생제와 혈청이 함유된 배양 배지를 사용한다. 현재 화장품 조성물로 개발된 줄기세포 배양액은 대부분 일반적인 배양 배지를 사용하고 있으며(한국 등록특허 제1237430호), 리포좀에 줄기세포 배양액을 포접시킨 화장품 조성물(한국 등록특허 제1047873호), 화장품 원료로 허용되지 않은 성분을 제외하고 제작된 배양 배지를 사용하는 화장품 조성물(한국 등록특허 제1413686호), 무혈청 배양액을 함유하는 화장품 조성물(한국 등록특허 제1108847호) 등이 개발되었다.

배양 배지는 세포가 증식하기 위한 단백질, 아미노산, 호르몬 및 성장인자가 포함된 물질로 매우 정교하게 만들어져 공급되어 왔지만, 세포배양용 배지, 항생제, 그리고 혈청 모두가 검증되지 않은 위험성이 있기 때문에 연구용으로만 사용해야 하고 인체에는 사용을 금지하고 있다. 또한, 배양배지에 포함되는 콜린 클로라이드(choline chloride), 하이포잔틴-소듐 염(hypoxanthine-sodium salt), 티미딘(thymidine), 푸트레신 디하이드로클로라이드(putrescine dihydrochloride), 페릭 니트레이트(ferric nitrate), L-글루타민(glutamin) 등의 성분은 화장품 원료로 허용되지 않기 때문에 이러한 배양배지의 이용은 화장품 조성물로 적합하지 않다. 이와 같이 배양액에는 줄기세포가 분비하는 다양한 단백질, 싸이토카인, 성장인자 등이 함유되어 있는 반면, 세포가 성장하면서 분비한 노폐물이나 오염방지를 위해 첨가된 항생제, 또한 동물유래 혈청 등의 성분도 포함되어 있기 때문에 피부에 사용할 경우 각종 위험에 노출될 가능성이 높다.

줄기세포 배양액의 피부 흡수율을 높이기 위해 지질로 구성된 리포좀으로 배양액을 포접하는 기술 또한 화장료로 이용하기에는 배양액 성분에 제한이 있으며, 리포좀으로 포접하는 과정중 배양액 성분의 변질 및 오염, 리포좀으로 포접하는 별도의 처리과정이 필요하다.

이러한 줄기세포 배양액의 단점을 보완하기 위하여, 줄기세포 유래 엑소좀을 추출하여 이용하기 위한 기술이 개발되고 있다. 줄기세포는 일반적으로 항생제 및 혈청이 함유된 배지에서 배양된다. 대부분의 엑소좀을 포함한 세포분비물(secretome)은 세포배양 상층액으로 부터 얻어지는데, 현재 사용되는 줄기세포 유래 엑소좀(stem cell-derived exosome) 추출법으로는 엑소좀을 포함한 세포분비물을 추출하는 단계에서 배지(medium)나 혈청(serum)내의 단백질에 의한 간섭으로 인해 완전한 정제가 어렵다는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하고, 추출한 엑소좀의 피부 미백 효과, 주름개선 효과, 피부 재생 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

한국 등록특허 제1237430호 한국 등록특허 제1047873호 한국 등록특허 제1413686호 한국 등록특허 제1108847호

본 발명의 목적은 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 미백, 주름개선 또는 재생용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구체예는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물, 보다 구체적으로 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 미백, 주름개선 또는 재생용 화장료 조성물을 제공한다.

줄기세포로부터 무혈청, 무항생제 배지에서 추출된 엑소좀은 콜라겐을 포함한 세포 외 기질 유도체 및 피부 재생에 유효한 성장인자를 함유하고 있어 피부개선에 효과적으로 응용할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "줄기세포"란 증식하는 줄기세포를 의미한다. 이로부터 줄기세포의 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀을 추출할 수 있다.

상기 줄기세포는 골수 줄기세포, 제대혈 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포일 수 있으며, 인체 유래 또는 동물이나 식물 유래 줄기세포일 수 있고, 예를 들어 인체 지방유래 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "인체 지방유래 줄기세포"란 인간의 지방세포로부터 유래된 줄기세포(human adipose-derived stem cells)를 의미한다. 이로부터 지방세포의 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀을 추출할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "엑소좀(exosome)"이란 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

상기 엑소좀은 당업계에 알려진 엑소좀 추출 방법을 이용하여 제조할 수 있고, 예를 들어

1) 줄기세포를 배양 배지에 배양한 다음 무혈청 및 무항생제 배지에서 계대배양하는 단계;

2) 세포 배양 상층액을 회수하는 단계;

3) 회수한 세포 배양 상층액을 원심분리하는 단계; 및

4) 엑소좀을 분리 및 정제하는 단계에 의하여 제조될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, 엑소좀은 인체 지방유래 줄기세포를 계대배양하는 과정에서 추출하였다. 구체적으로, 인체 지방유래 줄기세포를(passage 3 ~ 7) 일반 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin)에서 배양한 다음, 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 무혈청, 무항생제 배지이면서 페놀 레드(phenol red)가 없는 DMEM 배지로 교체하여 24시간 동안 유지하였다. 24시간 후, 세포 배양 상층액을 회수하였다. 회수한 세포배양 상층액은 300 xg에서 10분간 원심분리하여 세포를 제거하였으며, 그 후 2,000 xg에서 30분간 원심분리하여 세포 분비물을 제거해주었다. 이후, 분자량 3,000의 필터가 장착된 원심분리 튜브를 이용하여 5,000 xg에서 60분간 원심분리를 하여 농축하였다. 농축 후 수득한 상층액은 엑소좀 분리 시약과 1:0.5 비율로 혼합하고 4 ℃에서 하루 동안 보관하였다. 10,000 xg에서 60분간 원심분리를 통해 엑소좀 침전물을 얻은 후, 0.22 μm 필터를 통해 여과하였고 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)로 세척하였다. 세척한 엑소좀 침전물은 10,000 xg에서 60분간 원심분리한 후 PBS에 재현탁하였다(도 1). 상층액을 회수한 이후 다시 일반 배양배지를 줄기세포에 첨가하여 배양하였으며, 이러한 과정은 줄기세포 계대 7까지 반복하였다. 이렇게 줄기세포를 계대 7까지 증식시키는 과정에서 추출한 엑소좀을 이용하여 화장료 조성물을 제조하였다.

상기 엑소좀은 1 내지 100 μg/mL의 농도로 함유될 수 있고, 구체적으로 1 내지 90 μg/mL의 농도로 함유될 수 있으며, 보다 구체적으로 1 내지 80 μg/mL의 농도로 함유될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 10, 30 또는 50 μg/mL의 농도로 처리한 결과, 인체 피부섬유아세포의 상처 회복력이 우수하고(도 8), 콜라겐 합성율이 우수하고(도 9), 멜라닌 합성이 감소함을 확인하였다(도 10).

상기 엑소좀은 리포좀에 포접시켜 엑소좀이 포접된 리포좀 형태로 화장료 조성물에 함유될 수 있으나, 이에 한정되지 않고 화장료 조성물로 사용하기에 적절한 형태라면 어떤 형태라도 가능하며, 리포좀에 포접되지 않고 엑소좀 자체를 사용하는 것이 가능하다.

상기 엑소좀은 엑소좀이 포접된 리포좀 형태로 사용될 경우, 리포좀 전체 중량에 대하여 0.1 내지 10.0 중량%로 함유될 수 있고, 보다 구체적으로 0.1 내지 1.0 중량%로 함유될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 엑소좀이 포접된 리포좀은 전체 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10.0 중량%로 함유될 수 있고, 보다 구체적으로 1 내지 10 중량%로 함유될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, 상온(15 ℃)에서 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 0.01 중량%가 포함된 수상에 레시틴 3중량%를 분산시킨 뒤, 초임계 이산화탄소를 이용하여 역마이셀(reverse micelle) 에멀젼(수산/저온공정 이산화탄소)을 형성시켰다. 그 다음, 상기 반응을 중지하고 초임계 이산화탄소를 감압 기화시켜 초임계 이산화탄소 상을 제거하고 엑소좀이 포접된 저온공정 리포좀 현탁액을 얻었다. 이렇게 제조한 엑소좀이 포접된 리포좀을 전체 화장료 조성물 총 중량에 대하여 5 중량% 함유되도록 하여 화장료 조성물을 제조하였다.

본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀은 인체 지방유래 줄기세포의 배양 과정 중에 얻은 배양액을 이용한다는 점에서는 종래 기술들과 유사하지만, 배양액을 그대로 사용하지 않고 배양액 내에 존재하는 나노베지클 형태의 엑소좀을 추출, 정제하여 화장료로 사용한다는 점에서 차별성이 있다. 줄기세포 엑소좀을 추출, 정제할 경우, 엑소좀에 담지된 재생 관련 단백질, 콜라겐 유도체 및 다양한 성장인자들만을 유효하게 사용할 수 있으므로 항생제 및 혈청을 포함한 배지 성분에 의해 야기되는 문제들을 해결할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀은 줄기세포의 유전정보, 단백질, 성장인자가 담지되었을 뿐 아니라 엑소좀 자체가 캐리어 역할까지 할 수 있다. 약 50-150 nm 크기의 지질로 이루어진 엑소좀은 세포 유래 물질이기 때문에 생체적합하며, 세포의 흡수율 또한 매우 좋다. 따라서 종래의 기술과 같이 배양액을 리포좀에 포접하는 별도의 과정이 필요하지 않으며, 피부에 쉽게 적용할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 화장료는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치 및 분무제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것이나, 특정 제형에 한정되는 것은 아니고 통상적인 화장료 조성물의 제형을 가질 수 있다.

아울러, 상기 각각의 제형에 첨가물 역시 한정되지 않으며 화장료 분야의 일반적인 첨가물이 첨가될 수 있다. 상기 화장료 분야의 일반적인 첨가물의 예로는 항생제, 결합제, 붕해제, 희석제, 활택제, 안정제, 보존료, 향료, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 함유하는 화장료 조성물은 흉터 개선 제제로 이용할 수 있다. 줄기세포 유래 엑소좀에는 세포증식 및 분화, 피부재생을 유도하는 단백질과 성장인자들이 함유되어 있기 때문에 오래된 상처 및 여드름 흉터에 적용하여 흉터를 완화시킬 수 있다. 따라서, 흉터 개선 제제로 이용되는 경우, 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 포함된 스프레이, 젤타입 연고, 패치 등의 형태로 적용이 가능하다.

또한, 본 발명의 다른 구체예는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 보다 구체적으로 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 약학적 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물은 약학적 조성물로도 사용될 수 있다.

상기 엑소좀은 1 내지 100 μg/mL의 농도로 함유될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물은 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1~500 ㎎, 1~100 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고제, 겔제, 크림제, 리니멘트제, 로션제, 액제, 패치, 분무제 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 증식하는 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(Human adipose-derived stem cells; Stem-EXO)의 크기를 확인한 결과, 그 크기가 약 69nm로 인체 피부각질세포로부터 추출한 엑소좀(Human epidermal keratinocytes; K-EXO) 또는 인체 피부섬유아세포로부터 추출한 엑소좀(Human foreskin fibroblasts; F-EXO) 보다 작음을 확인할 수 있다(도 3).

본 발명의 다른 일 실시예에서, Stem-EXO, K-EXO, F-EXO 내에 존재하는 주름개선, 미백, 피부재생 관련 생체활성인자를 비교 분석한 결과, Stem-EXO는 콜라겐의 합성을 촉진하고 분해를 억제하는 메커니즘과 관련된 단핵세포화학유인물질단백질-1, -3 (monocyte chemoattractant protein, MCP-1, -3), 케모카인 리간드 5 (chemokine ligand 5, CCL-5), 콜라게네이즈저해제(the tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1), 미백과 관련된 인터루킨-6, -8(interleukin, IL-6, -8), 피부재생 및 혈관생성과 관련된 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 플라스미노겐활성화인자(palsminogen activator inhibitor-1, PAI-1), 엔지오제닌(angiogenin), 엔지오포이에틴(angiopoietin-1)이 K-EXO와 F-EXO에 비해 과발현 되는 것을 확인하였다(도 5 내지 7).

본 발명의 또 다른 일 실시예에서, Stem-EXO의 인체 피부섬유아세포의 상처(wound) 회복 효과를 확인한 결과, Stem-EXO는 10, 30, 50 μg/mL의 농도로 처리되었을 때 K-EXO 또는 F-EXO에 비해 피부섬유아세포의 이동 효과가 우수하여 상처 회복 효과가 우수함을 확인할 수 있었다(도 8).

본 발명의 또 다른 일 실시예에서, Stem-EXO의 주름개선 효과를 확인한 결과, Stem-EXO의 처리 농도가 증가함에 따라 콜라겐 합성도 증가하였으며, 특히 50 μg/mL에서 K-EXO 또는 F-EXO 보다 매우 우수한 콜라겐 합성율을 보였으므로, 주름개선 효과가 우수함을 확인할 수 있었다(도 9).

본 발명의 또 다른 일 실시예에서, Stem-EXO의 멜라닌 생성 억제 효과를 확인한 결과, 마우스 멜라노마(melanoma)에 Stem-EXO를 10, 30, 50 μg/mL의 농도로 처리하였을 때 모든 농도에서 멜라닌 합성이 감소하였음을 확인하였으므로, 미백 효과가 매우 우수함을 확인할 수 있었다(도 10).

본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀은 줄기세포가 증식하는 과정에서 분비되는 엑소좀으로 줄기세포의 세포증식, 분화, 재생과 관련된 유전자, 단백질, 성장인자 등을 함유하고 있기 때문에 세포 활성화제나 성장인자 같은 다른 첨가물 없이도 피부재생을 유도할 수 있다. 또한, 항생제나 혈청, 배양액의 유해 인자들이 포함되지 않은 정제된 성분이기 때문에 배양액 화장품의 문제점을 극복할 수 있으며, 세포 유래 지질 전달체이기 때문에 세포 침투 및 유효인자 전달 효율이 매우 뛰어나다. 이에 따라, 본 발명은 피부 미백, 주름개선 또는 재생을 포함한 기능성 화장품 조성물, 미용 목적의 흉터 개선 제제 등으로 적용이 가능하다.

도 1은 증식하는 인체 지방유래 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 방법에 대한 모식도이다.
도 2는 인체 지방유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells), 인체 피부각질세포(Human epidermal keratinocytes) 및 인체 피부섬유아세포(Human foreskin fibroblasts)를 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 3은 인체 지방유래 줄기세포로(Stem-Exo)부터 추출된 엑소좀의 특성에 대한 도이다. 인체 피부각질세포(K-Exo) 및 인체 피부섬유아세포(F-Exo)로부터 추출된 엑소좀을 대조군으로 사용하였다; A: 엑소좀의 구조 및 모양(투과전자현미경, transmission electron microscope)(Scale bars는 각각 50 nm (black), 100 nm (white) 및 200 nm (yellow)를 나타냄), B: 엑소좀의 크기(나노입자분석기, dynamic light scattering).
도 4는 마이크로어레이를 이용하여 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(Stem-EXO), 인체 피부각질세포로부터 추출된 엑소좀(K-EXO) 및 인체 피부섬유아세포로부터 추출된 엑소좀(F-EXO) 내에 포함된 생체활성인자의 발현량을 비교한 도이다; A: 마이크로어레이 표, B: 마이크로어레이 결과, C: 생체활성인자들의 상대적 발현량을 나타낸 그래프.
도 5은 마이크로어레이를 이용하여 엑소좀 내 주름 개선 효과와 관련된 생체활성인자(PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, FGF-6, MCP-1, MCP-3, Eotaxin, CCL-5, TIMP-1)의 발현량을 나타낸 도이다; Stem-EXO: 증식하는 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, K-EXO: 인체 피부각질세포로부터 추출된 엑소좀, F-EXO: 인체 피부섬유아세포로부터 추출된 엑소좀.
도 6는 마이크로어레이를 이용하여 엑소좀 내 미백 관련 생체활성인자(TGF-beta, TNF-alpha, IL-6, IL-8)의 발현량을 나타낸 도이다; Stem-EXO: 증식하는 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, K-EXO: 인체 피부각질세포로부터 추출된 엑소좀, F-EXO: 인체 피부섬유아세포로부터 추출된 엑소좀.
도 7는 마이크로어레이를 이용하여 엑소좀 내 피부재생 및 미세혈관 생성 관련 생체활성인자(EGF, HGF, PAI-1, VEFG, Angiogenin, Angiopoietin-1)의 발현량을 나타낸 도이다; Stem-EXO: 증식하는 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, K-EXO: 인체 피부각질세포로부터 추출된 엑소좀, F-EXO: 인체 피부섬유아세포로부터 추출된 엑소좀.
도 8은 인체 지방유래 줄기세포 엑소좀(Stem-EXO)이 인체 섬유아세포의 이동에 미치는 영향을 나타낸 도이다; GM: 줄기세포 배양 배지(growth medium), SFM: 무혈청 배양 배지(serum-free medium), Stem-EXO: 증식하는 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, K-EXO: 인체 피부각질세포로부터 추출된 엑소좀, F-EXO: 인체 피부섬유아세포로부터 추출된 엑소좀.
도 9은 인체 지방유래 줄기세포 엑소좀(Stem-EXO)이 인체 섬유아세포의 콜라겐 합성에 미치는 영향을 나타낸 도이다; SFM: 무혈청 배양 배지(serum-free medium), Stem-EXO: 증식하는 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, K-EXO: 인체 피부각질세포로부터 추출된 엑소좀, F-EXO: 인체 피부섬유아세포로부터 추출된 엑소좀.
도 10은 인체 지방유래 줄기세포 엑소좀(Stem-EXO)이 마우스 멜라노사이트(melanocyte) 세포의 멜라닌(melanin) 합성에 미치는 영향을 나타낸 도이다; GM: 줄기세포 배양 배지(growth medium), SFM: 무혈청 배양 배지(serum-free medium), Stem-EXO: 증식하는 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, K-EXO: 인체 피부각질세포로부터 추출된 엑소좀, F-EXO: 인체 피부섬유아세포로부터 추출된 엑소좀.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

<실시예 1> 인체 지방유래 줄기세포로부터 엑소좀의 추출

인체 지방유래 줄기세포를 계대(passage) 7까지 증식시키는 과정에서 엑소좀을 추출하였다. 즉, 증식하는 인체 지방유래 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하였다.

구체적으로, 인체 지방유래 줄기세포를(passage 3 ~ 7) 일반 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin)에서 배양하였다. 그 다음, 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 무혈청, 무항생제 배지이면서 페놀 레드(phenol red)가 없는 DMEM 배지로 교체하여 24시간 동안 유지하였다. 24시간 후, 세포 배양 상층액을 회수하였다. 회수한 세포배양 상층액은 300 xg에서 10분간 원심분리하여 세포를 제거하였으며, 그 후 2,000 xg에서 30분간 원심분리하여 세포 분비물을 제거해주었다. 이후, 분자량 3,000의 필터가 장착된 원심분리 튜브(molecular weight cut off=3,000, amicon tube)를 이용하여 5,000 xg에서 60분간 원심분리를 하여 농축하였다. 농축 후 수득한 상층액은 엑소좀 분리 시약(exosome isolation reagent)과 1:0.5 비율로 혼합하고 4 ℃에서 하루 동안 보관하였다. 10,000 xg에서 60분간 원심분리를 통해 엑소좀 침전물을 얻은 후, 0.22 μm 필터(Exosome spin column)를 통해 여과하였고 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)로 세척하였다. 세척한 엑소좀 침전물은 10,000 xg에서 60분간 원심분리한 후 PBS에 재현탁하였다(도 1). 상층액을 회수한 이후 다시 일반 배양배지를 줄기세포에 첨가하여 배양하였으며, 이러한 과정은 줄기세포 계대 7까지 반복하였다. 이렇게 줄기세포를 계대 7까지 증식시키는 과정에서 추출한 엑소좀을 하기 실험에서 사용하였다. 인체 지방유래 줄기세포 엑소좀의 효능을 비교하기 위해 인체 피부각질세포 및 인체 피부섬유아세포로부터 상기 방법을 통해 동일하게 엑소좀을 추출하였다(도 2).

<실시예 2> 엑소좀의 현미경 분석

실시예 1의 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(Stem-Exo), 인체 피부각질세포로부터 추출된 엑소좀(K-Exo) 및 인체 피부섬유아세포로부터 추출된 엑소좀(F-Exo)을 투과전자현미경(transmission electron microscope)과 나노입자분석기(dynamic light scattering)를 사용하여 크기 및 모양을 확인하였다.

그 결과, 각각 추출된 엑소좀의 모양을 투과전자현미경으로 확인할 수 있었다(도 3A). 또한, 엑소좀의 크기는 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 약 69 nm, 인체 피부각질세포로부터 추출된 엑소좀이 약 79.7 nm, 인체 피부섬유아세포로부터 추출된 엑소좀이 약 94.6 nm의 크기를 가져, 인체 지방유래 줄기세포 엑소좀(Stem-Exo)의 크기가 가장 작은 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 3> 엑소좀 내 단백질 및 주름 개선, 미백, 피부 재생 관련 생체활성인자 분석

인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(Stem-EXO)과 인체 피부각질세포로부터 추출된 엑소좀(K-EXO) 및 인체 피부섬유아세포로부터 추출된 엑소좀(F-EXO) 내에 존재하는 주름개선, 미백, 피부재생 관련 생체활성인자를 비교 분석하기 위하여, 마이크로어레이(microarray)를 실시하였다. 마이크로어레이는 항원-항체반응을 통해 이루어지며, 레이저 스캐너(GenePix 4000B)를 통해 형광(Streptavidin-Cy3) 발현 정도를 측정하였다.

마이크로어레이 분석을 통해 주름 개선에 영향을 주는 9가지의 생체활성인자(PDFG-AA, PDGG-AB, PDGF-BB, FGF-6, MCP-1, MCP-3, Eotaxin, CCL-5, TIMP-1), 4가지의 미백 관련 생체활성인자(TGF-beta, TNF-alpha, IL-6, IL-8) 및 6가지 피부재생 및 혈관생성 관련 생체활성인자(EGF, HGF, PAI-1, VEGF, Angiogenin, Angiopoietin-1)를 확인하였고, 이에 대하여 각각의 생체활성인자들의 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 및 인체 피부각질세포와 인체 피부섬유아세포로부터 추출된 엑소좀에서의 상대적인 발현량을 비교하였다(도 4). 도 4 그래프는 생체활성인자들의 상대적 발현량을 보여주는 것이며, 가로축은 인체 지방유래 줄기세포 엑소좀, 세로축은 각각 피부각질세포 및 섬유아세포 엑소좀을 의미한다. 또한, 적색과 녹색 선은 각각 1.5배 기준 증가/감소를 나타낸다. 도 5에는 엑소좀 내 주름 개선 효과와 관련된 생체활성인자를 나타내었고, 도 6에는 엑소좀 내 미백 효과와 관련된 생체활성인자를 나타내었으며, 도 7에는 엑소좀 내 피부재생 및 미세혈관 생성 관련 생체활성인자를 나타내었다.

그 결과, 도 5, 6 및 7과 같이 증식하는 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(Stem-EXO)과 인체 피부각질세포로부터 추출된 엑소좀(K-EXO) 및 인체 피부섬유아세포로부터 추출된 엑소좀(F-EXO)에 존재하는 생체활성인자의 종류에 차이가 나는 것을 확인하였다. 특히, 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(Stem-EXO)은 콜라겐의 합성을 촉진하고 분해를 억제하는 메커니즘과 관련된 단핵세포화학유인물질단백질-1, -3 (monocyte chemoattractant protein, MCP-1, -3), 케모카인 리간드-5 (chemokine ligand 5, CCL-5), 콜라게네이즈저해제(the tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1), 미백과 관련된 인터루킨-6, -8(interleukin, IL-6, -8), 피부재생 및 혈관생성과 관련된 간세포성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 플라스미노겐활성화인자(palsminogen activator inhibitor-1, PAI-1), 엔지오제닌(angiogenin), 엔지오포이에틴(angiopoietin-1)이 K-EXO와 F-EXO에 비해 과발현되는 것을 확인하였다(도 5, 6 및 7).

< 실시예 4> 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 이용한 인체 피부섬유아세포의 이동 효과

인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 인체 피부섬유아세포의 이동에 미치는 영향을 알아보기 위해, 증식하는 인체 지방유래 줄기세포 배양 배지로부터 추출된 엑소좀(Stem-EXO)과 인체 피부각질세포로부터 추출된 엑소좀(K-EXO) 및 인체 피부섬유아세포로부터 추출된 엑소좀(F-EXO)을 각각 포함하는 배지 조성물을 이용하였다. 상기 배지 조성물은 Stem-EXO는 10, 30, 50 μg/mL 농도로 DMEM 무혈청 배양 배지에 추가하여 사용하였고, K-EXO와 F-EXO는 50 μg/mL 농도를 DMEM 무혈청 배양 배지에 추가하여 사용하였다. 양성대조군으로 10%의 혈청이 포함된 DMEM 배지를 사용하고, 음성대조군으로 DMEM 무혈청 배지를 사용하였다. 인간 피부섬유아세포는 녹색형광염색(green fluorescence dye)으로 표지한 후, 24 well plate에 각각 1×10⁵ cells/well로 분주하고 배양배지(DMEM containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin)에서 72시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포가 부착된 plate 바닥의 중심을 멸균된 파이펫팁(yellow tip)을 사용하여 인위적으로 일정한 간격의 상처(wound)를 제작하고 엑소좀이 포함된 상기 배지 조성물을 각각의 세포에 처리하였다.

그 결과, 24시간이 되었을 때 Stem-EXO가 포함한 배지를 처리한 세포가 음성대조군, K-EXO 및 F-EXO를 처리한 세포보다 이동(migration)되는 정도가 더 높게 나타나는 것을 확인할 수 있고, 30 및 50 μg/mL의 Stem-EXO가 포함된 배지에서 그 경향이 더 두드러지게 나타나는 것을 알 수 있었다. 48시간 후, 10, 30, 50 μg/mL Stem-EXO가 포함된 배지에서 이동(migration)이 빠르게 진행되어 K-EXO와 F-EXO가 포함된 배지에 비해 상처(wound) 회복에 더 좋은 효과를 보였다(도 8).

따라서, 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀(Stem-Exo)이 K-EXO 또는 F-EXO 보다 인체 피부섬유아세포의 이동 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5> 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 주름개선 효과

인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 인체 피부섬유아세포의 콜라겐 합성에 미치는 영향을 알아보기 위해, 증식하는 줄기세포 배양 배지로부터 추출된 엑소좀(Stem-EXO), 인체 피부각질세포로부터 추출된 엑소좀(K-EXO) 또는 인체 피부섬유아세포로부터 추출된 엑소좀(F-EXO)을 각각 포함하는 배지 조성물을 이용하였다. 상기 배지 조성물은 Stem-EXO은 10, 30, 50 μg/mL 농도로 DMEM 무혈청 배양 배지에 추가하여 사용하였고, K-EXO와 F-EXO는 50 μg/mL 농도를 DMEM 무혈청 배양 배지에 추가하여 사용하였으며, 음성대조군으로 DMEM 무혈청 배지를 사용하였다. 인간 피부섬유아세포는 48 well plate에 각각 5×10⁴ cells/well로 분주하고 배양배지(DMEM containing 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin)에서 72시간 동안 배양한 후, 인산완충식염수로 세포를 세척하고 엑소좀이 포함된 상기 배지 조성물을 각각의 세포에 처리하였다.

배양완료 후, 각 well의 배양액은 회수하여 25℃, 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 이어서 상층액을 취해 수용성 콜라겐(soluble collagen)의 추출 및 정량에 사용하였다. 배양액이 제거된 플레이트의 각 well에 PBS를 넣고 세척한 후, 트립신(tyrpsin-EDTA) 처리를 통해 세포를 바닥으로부터 분리시키고 세포수를 측정하였다.

수용성 콜라겐의 정량을 위해 Sircol collagen assay 키트(Biocolor, UK)를 사용하였다. 상기 획득된 상층액은 polyethylene glycol이 혼합된 Tris-HCl (pH 7.6) 버퍼를 처리하여 4 ℃에서 12시간 이상 유지시켰으며, 이후 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 콜라겐을 농축시켰다. 상층액을 제거한 후, 제공된 콜라겐 흡착 염료(sircol dye reagent)를 콜라겐 펠렛에 1 mL 추가하고 30분 동안 진탕 배양하였다. 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 흡착되지 않은 염료를 제거하고 펠렛을 acid-salt 버퍼로 세척한 후, alkali reagent를 처리하여 콜라겐에 흡착된 염료를 녹여내고 555 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선의 수식에 흡광도를 대입하여 Stem-EXO, K-EXO, F-EXO 및 음성 대조물질을 첨가한 웰의 수용성 콜라겐의 양을 계산하였다. 보정된 콜라겐의 양을 계산식에 대입하여 합성율을 계산하였다.

그 결과, Stem-EXO 투여군의 수용성 콜라겐 합성율은 음성 대조군(0.138 ㎍)과 비교했을 때 엑소좀 처리 농도에 의존하여 증가하였으며, 특히 50 ㎍/mL의 Stem-EXO 투여군의 경우 콜라겐 합성량이 2.59 ㎍으로, 동일양의 K-EXO(1.4 ㎍)나 F-EXO(0.8 ㎍)에 비해 유의하게 증가 되었다.

따라서, 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 피부 섬유아세포의 콜라겐합성을 촉진시키는 효과가 있는 것으로 판단된다(도 9).

< 실시예 6> 마우스 멜라노마(melanoma)를 이용한 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 멜라닌 생성 억제 효과

인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(Stem-EXO)과 대조군으로 인체 피부각질세포로부터 추출된 엑소좀(K-EXO) 및 인체 피부섬유아세포로부터 추출된 엑소좀(F-EXO)의 미백효과를 마우스 멜라노마에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 통해 판단하였다. 상기 멜라노마 세포는 마우스 흑색종에서 유래한 세포이며, 멜라닌이라는 흑색 색소를 분비하는 세포이다. 멜라노마 세포를 96 well plate에 1 × 10⁵ 농도로 분주하여 세포를 부착시킨 후 Stem-EXO, K-EXO, F-EXO가 함유된 배지로 교체하여 3일 동안 배양하였다. 3일 후, 배지는 모두 회수하여 4,500 rpm에서 10분 동안 원심분리한 다음 405 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 밖으로 방출된 멜라닌 양을 계산하였다. Plate에 붙어있는 세포는 트립신(Trypsin-EDTA) 처리를 하여 떼어낸 후 세포 수를 측정한 다음 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 세포를 PBS로 1회 세척한 후 원심분리하여 세포 펠렛을 얻고, 여기에 10% dimethyl sulfoxide (DMSO)가 들어있는 1 N sodium hydroxide (NaOH) 용액을 1ml 첨가하여 80 ℃에서 2시간 멜라닌을 녹인 다음 96 well plate에 넣고 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 이용하여 멜라닌을 정량하고 시료의 단백질 농도로 표준화하여 멜라닌 합성 농도를 측정하였다.

인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 10, 30, 50 ㎍/mL의 농도로 상기 멜라노마 세포에 처리한 후 멜라닌 합성 정도를 관찰한 결과, 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 모든 농도에서 멜라닌 합성이 감소하였음을 확인하였다(도 10).

< 실시예 7> 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 포함하는 화장료 조성물

상기 실시예 1에 따라 증식하는 인체 지방유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 포접된 리포좀을 제조하였다.

구체적으로, 상온(15 ℃)에서 레시틴 3중량%를 상기 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 0.01 중량%가 포함된 수상에 분산시킨 뒤 초임계 이산화탄소를 이용하여 역마이셀(reverse micelle) 에멀젼(수상/저온공정 이산화탄소)을 형성시켰다. 그 다음 상기 반응을 중지하고 초임계 이산화탄소를 감압 기화시켜 초임계 이산화탄소 상을 제거하고 상기 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 포접된 저온공정 리포좀 현탁액을 얻었다. 이때 반응 공정의 온도는 4 ℃이하로 진행하였다.

상기 엑소좀이 포접된 리포좀을 이용하여 하기 표 1에 기재된 조성으로 화장료 조성물을 제조하였다.

배합성분	함량 ( 중량% )
스테아린산	2
세틸알코올	2
라놀린 알코올	2
액상파라핀	7
사이클로메치콘	5
폴리옥시에틸렌 모노올레익산 에스테르	2
헥산디올	2
글리세린	3
트리에틸아민	5
카보머	0.2
본 발명의 실시예에 따른 엑소좀이 포접된 리포좀	5
정제수	to 100

< 제형예 1> 유연 화장수( 스킨 )의 제조

상기 실시예 7의 방법으로 얻은 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 포접된 리포좀을 이용하여 하기 표 2와 같은 조성으로 유연 화장수(스킨)를 제조하였다.

배합성분	함량 ( 중량% )
본 발명의 실시예에 따른 엑소좀이 포접된 리포좀	5
에탄올	10
글리세린	3
부틸렌글리콜	3
소듐 히알루로네이트	0.1
트리에탄올아민	0.1
항산화제	0.1
방부제, 향, 색소	미량
정제수	to 100

< 제형예 2> 영양화장수(로션)의 제조

상기 실시예 7의 방법으로 얻은 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 포접된 리포좀을 이용하여 하기 표 3과 같은 조성으로 영양 화장수(로션)를 제조하였다.

배합성분	함량 ( 중량% )
본 발명의 실시예에 따른 엑소좀이 포접된 리포좀	5
글리세린	5
미네랄오일	4
밀납	4
폴리솔베이트-60	1.5
카르복시비닐폴리머	0.1
부틸렌글리콜	3
스쿠알란	5
트리에탄올아민	0.15
방부제, 향, 색소	미량
정제수	to 100

Claims

인체 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 피부 미백, 주름개선 또는 재생용 화장료 조성물.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 엑소좀은 1 내지 100 μg/mL의 농도로 함유되는 것인 피부 미백, 주름개선 또는 재생용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화장료는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치 및 분무제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것인 피부 미백, 주름개선 또는 재생용 화장료 조성물.