KR102176845B1 - 유도된 엑소좀을 포함하는 피부 재생 및 상처 치유용 조성물 - Google Patents

유도된 엑소좀을 포함하는 피부 재생 및 상처 치유용 조성물 Download PDF

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Abstract

세포에 초음파 자극을 제공하고, 세포가 없는 배양 배지에 초음파 자극을 제공하는 단계; 상기 세포와 상기 배양 배지를 혼합하여 일정 시간 배양하는 단계; 및 상기 혼합물에서 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하고, 상기 배양 배지는 혈관전구세포 배지, 간엽성전구세포 배지, 상피줄기세포 배지, 진피줄기세포 배지, 조혈모세포 배지, 지방줄기세포 배지, 중간엽줄기세포 배지 또는 배아줄기세포 배지 중 어느 하나인, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법을 개시한다. 이러한 엑소좀의 제조방법은, 다루기 어려운 줄기세포뿐 아니라 손쉽게 얻고 유지할 수 있는 체세포로부터도 초음파 처리라는 간단한 과정을 통해 단시간 안에 높은 수율로 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀을 수득할 수 있다. 이렇게 수득한 엑소좀은 포함된 각종 인자의 양 및 수 역시 높고, 상기 엑소좀 및 이를 포함하는 조성물은 피부 재생 및 상처 치유를 유도할 수 있는 다양한 인자가 증가되어 있으며, 엑소좀은 인지질 기반의 막구조를 가져 피부 침투가 용이하여 물질의 전달 효율이 높아 피부 재생 및 상처 치유를 효과적으로 유도할 수 있고, 안전하고 합성의약품의 사용으로 나타나는 부작용이 없다는 장점이 있다.

Description

유도된 엑소좀을 포함하는 피부 재생 및 상처 치유용 조성물 {COMPOSITION FOR TISSUE REGENERATION AND WOUND HEALING COMPRISING INDUCED EXOSOMES}
본 발명은 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀과 그 제조방법, 그리고 상기 엑소좀을 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 세포 및 배양 배지에 초음파를 가한 후 혼합하여 세포로부터 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀을 유도하는 엑소좀 제조방법, 상기 제조방법으로 제조되고 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 인자를 다량 포함하는 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀 및 상기 엑소좀을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
인체에서 가장 큰 조직인 피부는 감각을 수용하며 비타민D를 합성하고 체온 조절 및 면역 감시에 관여하는 다양한 기능 외에 기본적으로 질병 및 수분 증발에 대한 보호막을 제공하는 1차 방어선으로서의 중요한 기능을 가진다. 피부의 상처 치유는 지혈(hemostasis), 염증(inflammation), 증식(proliferation) 및 재형성(remodeling)의 네 단계를 수반하는 복잡한 단계이다. 상처 형성 직후부터 몇 시간 이내까지 일어나는 첫번째 단계에는 혈액응고(clotting) 및 임시적인 상처기질(provisional wound matrix)이 형성되고, 첫번째 단계를 거치며 활성화된 염증 단계는 호중구(neutrophil) 모집과 단핵구(monocyte)의 참여 및 변성을 통해 감염체 및 괴사조직을 제거하게 된다. 증식 단계에서는 육아조직(granulation tissue) 형성, 혈관 네트워크 회복, 섬유아세포(fibroblast)의 표면으로의 이동, 재상피화(reepithelization), 신생혈관생성(angiongenesis) 등이 일어나며, 상처 형성 21일부터 1년 후까지 이어지는 성숙(remodeling) 단계에서는 세포사멸(apoptosis)을 통해 육아조직 형성이 멈추는 등 증식 단계에서 활발히 진행되던 과정들이 서서히 멈추고, 증식 단계에서 다량 생산된 콜라겐III이 더 질긴 콜라겐I으로 대체되며, 근섬유아세포가 콜라겐에 다중연결되며 흉터면적을 줄이게 된다. 상기 과정 중에서 한 가지라도 적절히 작용하지 않을 경우 상처는 그 치유가 지연되거나 만성화될 수 있으며, 이때 특히 1차 방어선으로서의 역할에 심각한 문제가 생기게 된다.
피부 부속구조(skin appendages)는 모근, 피지샘, 손톱 및 땀샘을 포함한다. 큰 상처의 치유 경과는 종마다 차이가 있다. 어류 및 양서류 등 하등 척추동물의 경우, 비늘, 분비샘 등 피부 부속구조를 포함한 피부의 재생이 온전히 일어나게 된다. 반면, 배아 단계를 제외하고 포유류에서는 피부재생이 온전하지 않아 피부 부속구조가 없는 흉터 조직이 생성되고, 이는 추가적인 보호, 보온 및 감각과 관련된 피부 부속구조의 기능이 제대로 수행될 수 없도록 하며, 미용 및 심리적인 면에서 삶의 질을 낮추게 된다.
생물체 유래 단백질, 유전자, 세포 등을 원료로 한 의약품인 생물의약품(biologics)은 합성의약품처럼 체내에서 발생되는 대사 산물이 없어 독성이 낮고, 질환의 발병기전에 선택적으로 작용하여 효과가 좋고 부작용이 적다는 장점을 가진다. 최근 이러한 장점이 각광받으면서 피부 재생 및 상처 치유를 목적으로 생물의약품, 특히 줄기세포를 이용하는 방법이 개발되고 있으며, 줄기세포 자체, 그 추출물 또는 배양액을 이용하는 방법 등이 개시되어 있다. 하지만, 줄기세포를 이용하는 상기 조성물들은 공통적으로 까다로운 줄기세포의 분리 및 증폭이라는 효율성 및 경제성의 문제를 가지고, 줄기세포 치료제의 경우 암으로의 전이 등에 대한 위험성이 존재하며, 줄기세포 추출물의 경우 세포로부터 유효성분을 정제하는 것이 쉽지 않아 비용과 시간이 많이 소요된다는 단점이 있고, 줄기세포 배양액의 경우 유효성분 외에도 세포로부터 분비된 노폐물이나 오염방지를 위해 첨가된 항생제 및 혈청 등 인체 사용시의 위험이 검증되지 않은 물질들이 포함되어 있다는 문제점이 있다.
엑소좀은 자연적으로 분비되는 30 내지 200 nm 직경의 나노소낭으로, 유래 세포로부터 다양한 물질을 운반하는 중요한 나노매개체로 작용할 수 있음이 알려져 있다. 엑소좀이 mRNA 전달을 통해 목표 세포의 표현형을 변화시킬 수 있다는 발견 이래로, 여러 연구에 의해 엑소좀이 세포 분화 등에 관여한다는 것이 밝혀졌다. 최근 엑소좀을 치료 목적으로 인체에 직접 사용하는 가능성이 다양하게 모색되고 있다. 특히 엑소좀은 이러한 생물의약품 부문에서 작은 분자, 펩타이드, 성장인자, 항체, 핵산 등의 생물약제(biopharmaceuticals)에 비해 다양한 단백질 및 핵산을 함유하고 있어 좀더 복잡하고 오래 가는 효과를 낼 수 있고, 세포와 같이 큰 의약품에 비해 전이 등의 위험이 없으며 세포의 주입시에 일어나는 소포체 형태로의 분해가 필요 없으므로 세포와는 다른 시공간적 효과를 가질 수 있다는 장점을 가진다. 최근, 특히 여러 증상 개선 및 치유 효과를 가지는 것으로 알려진 줄기세포로부터 얻은 엑소좀을 치료 조성물로 사용하는 기술이 개발되고 있다. 대한민국 공개특허 10-2017-0044999(2015.10.16.)에서는 성체줄기세포 또는 그 배양액 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 조성물에 대해 개시하고 있다. 그러나, 상기 공개특허의 기술을 포함하여 엑소좀을 사용하는 치료 조성물 관련 기술들은 엑소좀 수득 수율이 낮고, 대부분 분리 및 증폭이 까다로운 줄기세포를 사용한다. 따라서 엑소좀을 임상적으로 사용하기 위해서는, 줄기세포가 아니라 쉽게 얻고 증폭·유지할 수 있는 세포로부터 엑소좀을 얻으면서도, 그 수율을 높일 수 있는 기술이 요구된다.
본 발명은 전술한 문제를 해결하고자 안출된 것으로서, 본 발명의 일 실시예는 세포에 초음파 자극을 제공하고, 세포가 없는 배양 배지에 초음파 자극을 제공하는 단계; 상기 세포와 상기 배양 배지를 혼합하여 일정 시간 배양하는 단계; 및 상기 혼합물에서 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하고, 상기 배양 배지는 혈관전구세포 배지, 간엽성전구세포 배지, 상피줄기세포 배지, 진피줄기세포 배지, 조혈모세포 배지, 지방줄기세포 배지, 중간엽줄기세포 배지 또는 배아줄기세포 배지 중 어느 하나인, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀을, 손쉽게 얻을 수 있는 세포로부터 단시간에 높은 수율로 얻을 수 있는 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 제조방법으로 제조되어, 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자의 RNA가 증가된 엑소좀을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 엑소좀을 포함하여, 안전하고, 합성의약품에 비해 높은 지속력을 가질 수 있는 피부 재생 및 상처 치유용 조성물을 제공한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 한정되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
전술한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본 발명의 일 측면에 따른, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법은 세포에 초음파 자극을 제공하고, 세포가 없는 배양 배지에 초음파 자극을 제공하는 단계; 상기 세포와 상기 배양 배지를 혼합하여 일정 시간 배양하는 단계; 및 상기 혼합물에서 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하고, 상기 배양 배지는 혈관전구세포 배지, 간엽성전구세포 배지, 상피줄기세포 배지, 진피줄기세포 배지, 조혈모세포 배지, 지방줄기세포 배지, 중간엽줄기세포 배지 또는 배아줄기세포 배지 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 세포는 포유류 유래의 섬유아세포 또는 기관 내 조직세포 중 어느 하나일 수 있다.
상기 세포에 제공되는 초음파 자극은 10 내지 30 KHz, 0.5 내지 3 W/cm2로 1 내지 10초 동안 수행되는 것일 수 있다.
상기 배양 배지에 제공되는 초음파 자극은 10 내지 30 KHz, 1 내지 20 W/cm2로 1 내지 20분 동안 수행되는 것일 수 있다.
상기 혼합물의 배양은 1 내지 10일 동안 진행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 엑소좀을 분리하는 단계는 상기 배양 후의 혼합물을 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 상기 상층액을 필터로 여과하여 여과액을 수득하는 단계; 및 상기 여과액을 농축하는 단계; 를 포함할 수 있다. 상기 엑소좀을 분리하는 단계는 상기 상층액을 필터로 여과하기 전에 4℃이하에서 7일 내지 1달 동안 보관하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리된 엑소좀은 직경이 50 내지 200 nm인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은, 모발 재생 효과를 가진 엑소좀은, 상기 제조방법으로 제조된 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 엑소좀은 상기 제조방법을 거치지 않은 세포로부터 분비된 엑소좀에 비해 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자의 RNA가 증가되어 있으며, 상기 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자는 유전자는 EGFR, FN1, MMP9, MMP2, MAPK1, FGF2, CTGF, AKT1, ALB, TGFB1, MAPK3, VEGFA, FGF7, HGF, IL6, EGF, miR-210, miR-31, Col1α, ELN, PCNA, N-cadherin 및 Cyclin-D1 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 엑소좀은 상기 제조방법을 거치지 않은 세포로부터 분비된 엑소좀에 비해 피부에 도포 시 피부에서 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자의 RNA 발현을 더 증가시키고, 상기 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자는 Col1α1, Col3α1, ELN, PCNA, N-cadherin 및 Cyclin-D1 중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은, 상기 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀을 포함하는 조성물을 제공한다.
여기서, 상기 조성물은 상기 엑소좀이 상기 엑소좀이 106 개/ml 내지 1014개/ml농도로 포함된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 엑소좀의 제조방법은 분리 및 증폭 과정이 까다로운 줄기세포 및 전구세포는 물론 쉽게 얻을 수 있는 체세포로부터도, 초음파 처리라는 간단한 과정을 통해 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가지는 엑소좀 분비를 다량 유도할 수 있다. 이렇게 유도된 엑소좀은 그 수득 수율이 기존의 방법에 비해 높으며, 상기 엑소좀 내에 포함된 각종 인자의 양 및 수 역시 높다.
본 발명의 일 실시예에 따른 엑소좀 및 이를 포함하는 조성물은 피부 재생 및 상처 치유를 유도할 수 있는 다양한 인자를 다량 함유할 수 있다. 또한 엑소좀은 인지질 기반의 막구조를 가져 두피 침투가 용이하여 물질의 전달 효율이 높으므로 본 발명의 일 실시예에 따른 엑소좀은 피부 재생 및 상처 치유를 효과적으로 유도할 수 있고, 합성의약품의 사용으로 나타나는 부작용이 없다는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 엑소좀은 포유류에서는 일반적으로 불완전하게 일어나는 상처 치유가 좀더 온전하도록 유도하여 흉터가 남지 않거나 작게 형성되도록 하고, 상처 부위의 모근 등 피부 부속구조도 재생될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 실시예1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 생성 데이터로, 엑소좀 마커인 CD63의 유도를 나타낸 면역형광염색 이미지(a), 유도된 엑소좀 내의 피부 재생 및 상처 치유 관련 유전자의 RNA를 분석한 qRT-PCR 데이터(b) 및 RNA-seq 데이터(c-f), 및 RNA-seq으로 iExo에서만 12 이상 read count된 유전자들의 Gene ontology 분석 결과(g).
도 2는 본 발명의 실시예1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀에 의한 in vitro 효과 데이터로, 상기 엑소좀을 여러 농도로 처리한 HDF에서의 세포증식 마커 Ki67 발현을 나타낸 면역형광염색 이미지(a), MTT assay로 측정한 HDF의 각 엑소좀 처리농도별 시간별 증식율(b), scratch assay로 측정한 HDF의 각 엑소좀 처리농도별 시간별 이동능(c-d), 엑소좀 처리 농도별 HUVEC의 tube 형성을 나타낸 광학현미경 이미지, 형성된 tube의 길이 및 교차점 수 (e-g), 엑소좀을 처리한 세포 내 피부 재생 및 상처 치유 관련 유전자의 RNA를 분석한 qRT-PCR 데이터(h).
도3은 본 발명의 실시예 1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀에 의한 in vivo 효과 데이터로, 상기 엑소좀을 여러 농도로 처리한 마우스에서의 시간에 따른 상처 치유 경과 이미지(a) 및 상처 부위 조직 단면 H&E 염색 결과(b), 상처 부위의 농도별 세포 증식(c) 및 엑소좀의 침투(d), 엑소좀 처리 농도별 상처 부위에서의 RT-PCR 결과(e) 및 상처 경과 3주 후 상처부위의 피하 혈관발달 정도(f).
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 의해 정의될 뿐이다.
덧붙여, 본 발명에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명의 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 '포함'한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 측면에 따른, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법은 세포에 초음파 자극을 제공하고, 세포가 없는 배양 배지에 초음파 자극을 제공하는 단계; 상기 세포와 상기 배양 배지를 혼합하여 일정 시간 배양하는 단계; 및 상기 혼합물에서 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하고, 상기 배양 배지는 혈관전구세포 배지, 간엽성전구세포 배지, 상피줄기세포 배지, 진피줄기세포 배지, 조혈모세포 배지, 지방줄기세포 배지, 중간엽줄기세포 배지 또는 배아줄기세포 배지 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
상기 세포는 포유류 유래의 섬유아세포 또는 기관 내 조직세포 중 어느 하나일 수 있다. 이는, 후술할 본 발명의 일 측면에 따른 모발 재생 효과를 가지는 엑소좀의 제조방법에 따르면, 상기 엑소좀은 어떤 세포를 사용하더라도 수득이 가능하므로, 얻기 힘들고 증폭이 까다로운 줄기세포나 전구세포보다 섬유아세포나 기관 내 조직세포 등 수득, 유지 및 증폭이 쉬운 세포가 더 손쉽고 효율적이기 때문이다. 상기 세포는 상기 엑소좀의 후술할 생체에 대한 추후 용도에 따라 자가유래(autologous), 동종유래(allogeneic) 또는 이종유래(heterologous) 중 어느 하나일 수 있고, 이종유래인 경우 포유류로부터 얻어진 것일 수 있다. 면역거부반응에 대한 가능성을 줄이기 위해, 바람직하게는 동종유래, 가장 바람직하게는 자가유래의 것을 사용할 수 있다.
상기 세포에 초음파 자극을 가하는 단계는, 세포에 직접 초음파 처리를 하거나, 세포가 초기 배양 배지에 간신히 덮힐 정도로 최소한의 양만 포함된 상태에서 진행될 수 있다. 이때의 초기 배양 배지는 상기 세포를 건강한 상태로 유지할 때 사용하는 일반적인 배지로, 상기 세포의 통상적인 배양에 적합한 배지, 예컨대, 상기 세포가 섬유아세포이고, 항생제와 혈청이 포함된 DMEM 배지일 수 있다.
상기 배양 배지(세포가 없이 초음파 처리되는 배지)는 전술한 바와 같이 혈관전구세포 배지, 간엽성전구세포 배지, 상피줄기세포 배지, 진피줄기세포 배지, 조혈모세포 배지, 지방줄기세포 배지, 중간엽줄기세포 배지 또는 배아줄기세포 배지 중에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 피부줄기세포 배지, 골수줄기세포 배지, 혈관내피전구세포 배지, 혈관전구세포 배지, 간엽성전구세포 배지, 상피줄기세포 배지, 진피줄기세포 배지, 조혈모세포 배지, 지방줄기세포 배지, 중간엽줄기세포 배지 또는 배아줄기세포 배지 및 각종 성체줄기세포 배지 중 어느 하나일 수 있다. 이는, 본 발명의 발명자에 의해 출원된 대한민국 특허출원 제10-2018-0060317호의 발명에 따르면, 초음파 처리된 제2세포 배지(제2세포를 배양하거나 제2세포로 분화를 유도할 수 있는 배지) 및 초음파 처리된 제1세포의 혼합물을 배양함으로써 얻은 엑소좀을 다른 세포에 처리하면 이 세포를 제2세포로 리프로그래밍할 수 있고, 상기 줄기세포 또는 전구세포, 그 추출물, 배양액 등은 모두 피부 재생 및 상처 치유에 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
상기 세포에 제공되는 초음파 자극은 10 내지 30 KHz, 0.5 내지 3 W/cm2로 1 내지 10초 동안 수행되는 것일 수 있다.
상기 배양 배지에 제공되는 초음파 자극은 10 내지 30 KHz, 1 내지 20 W/cm2로 1 내지 20분 동안 수행되는 것일 수 있다.
상기 혼합물의 배양은 1 내지 10일 동안 진행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 엑소좀을 분리하는 단계는 상기 배양 후의 혼합물을 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 상기 상층액을 필터로 여과하여 여과액을 수득하는 단계; 및 상기 여과액을 농축하는 단계; 를 포함할 수 있다. 상기 엑소좀을 분리하는 단계는 상기 상층액을 필터로 여과하기 전에 4℃이하에서 7일 내지 1달 동안 보관하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리된 엑소좀은 직경이 50 내지 200 nm인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은, 모발 재생 효과를 가진 엑소좀은, 상기 제조방법으로 제조된 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 엑소좀은 상기 제조방법을 거치지 않은 세포로부터 분비된 엑소좀에 비해 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자의 RNA가 증가되어 있으며, 상기 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자는 EGFR(Epidermal growth factor receptor), FN1(Fibronectin 1), MMP9(Matrix Metallopeptidase 9), MMP2(Matrix Metallopeptidase 2), MAPK1(Mitogen-activated protein kinase 1), FGF2(Fibroblast growth factor 2), CTGF(Connective tissue growth factor), AKT1(AKT Serine/Threonine kinase 1), ALB(Albumin), TGFB1(Transforming growth factor beta 1), MAPK3(Mitogen-activated protein kinase 3), VEGFA(Vascular endothelial growth factor A), FGF7(Fibroblast growth factor 7), HGF(Hepatocyte growth factor), IL6(Interleukin 6), EGF(Epidermal growth factor), miR-210(MicroRNA 210), miR-31(MicroRNA 31), Col1α1(Collagen 1 alpha 1), ELN(Elastin), PCNA(Proliferatin cell nuclear antigen), N-cadherin 및 Cyclin-D1 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 엑소좀은 상기 제조방법을 거치지 않은 세포로부터 분비된 엑소좀에 비해 피부에 도포 시 피부에서 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자의 RNA 발현을 더 증가시키고, 상기 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자는 Col1α1, Col3α1(Collagen 3 alpha 1), ELN, PCNA, N-cadherin 및 Cyclin-D1 중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은, 상기 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀을 포함하는 조성물을 제공한다.
여기서, 상기 조성물은 상기 조성물은 상기 엑소좀이 106 개/ml 내지 1014개/ml농도로 포함된 것일 수 있고, 좀더 바람직하게 1011 개/ml 내지 1012개/ml농도로 포함된 것일 수 있다. 이는 포함된 엑소좀의 농도가 106 개/ml 미만이거나 1014 개/ml을 초과할 경우 피부 재생 및 상처 치유 효과가 떨어질 수 있고, 특히 농도가 지나치게 높아질 경우, 경제성 역시 떨어지기 때문이다.
상기 조성물에는 상기 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀 이외에도 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 유효성분의 흡수나 재생 및 치유 반응을 좀더 증진시킬 수 있는 기타 첨가제 등이 다양하게 첨가될 수 있음은 자명한 사항이므로, 이에 대한 구체적 설명은 제외하기로 한다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명의 모든 실시예 및 실험예 상의 모든 세포 배양은 37℃, 5% CO2 조건에서 이루어졌다.
실시예1. 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조.
피부 재생 및 상처 치유 효과를 갖는 엑소좀을 얻기 위하여, 1 Х106 개의 인간진피섬유아세포(HDF)에 UltraRepro 1001(STEMON Inc., Seoul, Republic of Korea)을 이용하여 20 KHz, 1.0 W/cm2의 초음파 자극을 5초간 직접 가하였다. 2 Х105 개의 UHDF를 35-mm 페트리 디쉬에 초음파 처리된(20 KHz, 5.0 W/cm2, 10분) 배아줄기세포 배양 배지 (DMEM/F12, 15% FBS, 2mM GlutaMAX, 0.1% NEAA, 0.1% 페니실린/스트렙토마이신, 0.1mM β-메르캅토에탄올, 1000 unit/ml 백혈병억제인자(LIF))와 함께 하루 동안 배양하였다. 이렇게 초음파 처리한 HDF(UHDF)를 배양한 배양 배지로부터 엑소좀을 상기 UHDF를 배양한 배양 배지로부터 엑소좀을 다음과 같이 분리하였다: 배양 배지를 3,000 X g로 20분간 원심분리하여 세포 데브리 및 죽은 세포를 제거한 후, 상층액을 0.22-mm 필터(Minisart®Syringe Filter, Sartorius, Goettingen, Germany)에 통과시켰다. 통과하여 나온 배지를 Amicon®Ultra-15 100,000 kDa device (Millipore, Billerica, MA, USA)에 넣고 14,000 X g로 20분간 원심분리하여 엑소좀(iExo)을 농축시켰다.
실험예1. 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀 분석 실험
실시예 1의 피부 재생 및 상처 치유 효과를 갖는 엑소좀의 제조방법에 따라 배양한 UHDF를 CD63 엑소좀 마커에 대한 면역형광염색을 통해 분석한 결과(이때, 대조염색은 핵염색제인 DAPI로 함), 다량의 엑소좀이 생성되고 있음을 확인할 수 있었다(도1a). 상기 세포의 배양액으로부터 분리한 엑소좀(iExo)으로부터 RNA를 추출하여 qRT-PCR을 통해 분석한 결과, 조직 재생 및 상처 치유와 연관된 세포외 구성물질(extracellular matrix) 관련 유전자인 Col1α1, Col3α1 및 ELN과, 세포 증식과 관련된 유전자인 PCNA, N-Cadherin 및 Cyclin-D1 등의 발현이 대조군으로부터 분리한 엑소좀(nExo)에 비해 높아진 것을 알 수 있었다(도 1b). 또한 RNA-seq 결과, iExo에서는 nExo에 비해 상기 6개 유전자 외에도 많은 유전자가 다량 발현되고 있음이 확인되었고, 대표적으로 EGFR, FN1, MMP9, MMP2, MAPK1, FGF2, CTGF, AKT1, ALB, TGFB1, MAPK3, VEGFA, FGF7, HGF, IL6, EGF 등의 단백질 코딩 유전자와 miR-210, miR-31 등의 마이크로RNA를 포함하였다(도 1c-d). iExo에서 발현이 증가된 유전자들을 분석한 결과, 상기 유전자들은 상처 치유, 혈관형성, 세포 성장, 세포 이동, 세포 증식, 염증 반응, 재생, 분비, 조직 재생 및 리모델링 등과 관련된 것으로 나타났다(도 1e-g).
실험예2. 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀 처리에 따른 세포 표현형 분석 실험
실시예 1의 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법에 따라 제조한 엑소좀을 배지에 추가하여 HDF를 배양하고, 이에 대해 엑소좀의 농도에 따른 효과를 확인해 보았다. 우선, 세포 증식 효과를 관련 마커인 Ki67에 대한 면역형광염색을 통해 분석한 결과, 실험군은 대조군에 비해 상기 마커의 발현이 더 높았는데, 특히 5X1011개/ml 및 10X1011개/ml 농도의 엑소좀을 처리하였을 때 그 효과가 더 뛰어났음을 알 수 있었고, 세포 수가 더 많이 증가하였음을 확인하였다(도2a-b). 다음으로, 상기 HDF를 플레이트에 가득 차도록 배양 후 20 μl yellow tip으로 선을 그어 세포 간 거리를 떨어뜨린 후 엑소좀을 처리하여 배양하는 wound healing assay를 진행하였는데, 이 결과 엑소좀 처리군에서 빈 공간이 상대적으로 빠르게 채워지는 것으로 나타나(도 2c-d), 대조군의 세포 이동률이 높은 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, 실시예 1에 따라 제조된 엑소좀의 농도에 따른 조직 재생 과정 중 혈관 형성 효율을 분석하고자, 내피 세포인 HUVEC에 서로 다른 농도의 엑소좀을 처리하고, 10시간 후에 관(tube) 형성을 확인하였다. 그 결과, 엑소좀 처리군이 대조군에 비해 관을 잘 형성하였음을 육안으로도 확인할 수 있었고(도 2e) 관의 길이 및 교착점 수 역시 더 높게 나타났는데(도 2f-g), 특히 5X1011개/ml 및 10X1011개/ml 농도로 처리한 군에서 더 나은 효과가 있었던 것으로 나타났다.
마지막으로, 엑소좀을 처리한 세포 내 조직 재생 및 상처 치유 관련 유전자인 Col1α1, Col3α1, ELN, PCNA, N-cadherin 및 Cyclin-D1의 발현을 qRT-PCR로 분석하였다. 그 결과, 실험군의 경우 대조군에 비해 상처 치유 관련 유전자의 발현이 높게 나타났다(도 2h).
실험예3. 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀 처리의 in vivo 효과 분석 실험
실시예 1의 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법에 따라 제조한 엑소좀의 효과를 in vivo에서 확인하기 위해 6주된 C57 마우스의 피부에 punch로 6 mm의 상처를 내고, iExo를 각각 0, 5, 10, 20 X1011개/ml 농도로 PBS에 희석하여 상처 부위에 주2회 발라주었다.
그 결과, 1주 후 엑소좀 처리 마우스의 경우 외부로 드러난 상처(opening)의 크기가 처리하지 않은 마우스에 비해 확연히 줄어든 것을 확인할 수 있었다(도 3a; 이와 관련하여, 2주차에는 엑소좀 처리 마우스의 경우 상처가 완전히 닫히고 그 위로 모발이 자라 처리군간 비교사진을 찍을 수 없었다). 또한, 1주 및 2주 후 각각 상처부위 조직 단면을 H&E 염색으로 확인한 결과, 엑소좀을 처리하지 않은 마우스에 비해 처리한 경우 상처의 크기가 작아 빠르게 피부 재생 및 상처 치유가 일어난 것을 확인할 수 있었고, 특히 상처 부위에 10 및 20 X1011개/ml 농도의 엑소좀을 처리한 경우 2주차에 피부 조직이 완전히 회복되어 피부조직을 구성하는 표피와 진피층, 지방층, 근육층이 명확하게 구분할 수 있도록 재생되었고, 진피층과 지방층에 상처 부위와 주변 부위 간 차이 없이 피부 부속조직인 모낭이 자리잡은 것으로 나타났다(도 3b). 추가로, 면역형광염색을 통해 상처 회복 부위의 조직 단면에 세포 증식 마커인 Ki67을 확인한 결과, 엑소좀을 처리하지 않은 군에 비해 처리군에서 Ki67이 광범위하게 관찰되어(도 3c) 손상부위에 세포 증식이 활발하게 진행되고 있음을 알 수 있었다. iExo를 Vybrant™DiD Cell-Labeling Solution을 이용하여 염색하여 상처 부위에 처리하고 2주 후 iExo 처리된 부위를 형광현미경으로 분석한 결과, iExo가 상처 부위 전반에 침투되었고, 이러한 전반적인 침투에 의해 상기와 같은 효과가 나타났음을 확인할 수 있었다(도 3d).
다음으로, 엑소좀을 처리한 상처 부위에서 조직 재생 및 상처 치유 관련 유전자인 Col1α1, Col3α1, ELN, N-cadherin 및 Cyclin-D1의 발현을 qRT-PCR로 분석하였고, 그 결과 실험군의 경우 대조군에 비해 상기 유전자 중 하나 이상의 발현이 대체로 높게 나타났다(도 3e). 이때, 각 농도별로 증가량이 가장 많은 유전자는 달랐고, 농도와 발현 증감의 상관관계는 확인하기 어려웠다.
마지막으로, 상처 치유가 완료된 3주차에 상처 부위의 피하 혈관 발달 정도를 확인하였다. 그 결과, iExo를 처리한 조직의 혈관이 더 많이 발달된 것으로 나타났다(도 3f).
종합하여 보면, 실시예 1에 따라 제조된 엑소좀은 세포 증식과 이동 및 혈관 발달 등을 촉진함으로써 조직의 상처 치유 및 재생 능력을 향상시켜줄 수 있다. 또한, 상기 엑소좀의 효과는 in vivo에서도 나타나 피부 재생 및 상처 치유 속도를 높이는 한편, 흉터가 더 작게 나거나 없이 피부 부속조직도 재생될 수 있는 좀더 온전한 피부 재생 및 상처 치유를 유도할 수 있다.
비교예1. 엑소좀에 대한 대조군
초음파로 자극하지 않은 HDF(NHDF)를 2 mM GlutaMAXTM-I Supplement(Gibco), 6 U/mL heparin (Sigma-Aldrich) 및 200 μM ascorbic acid (Sigma-Aldrich)가 포함된 섬유아세포 배지(10% fetal bovine serum(Gibco) 및 1% penicillin/streptomycin(Gibco)가 포함된 DMEM(Gibco))에 배양하였다. 상기 NHDF를 배양한 배양 배지로부터 엑소좀(nExo)을 분리할 때에는 실시예1의 엑소좀 분리 방법과 동일한 과정을 거쳤다.
비교예2. 엑소좀에 의해 유도된 세포의 대조군
1 Х105 개의 HDF를 35-mm 페트리 디쉬에 시딩하여 하루 동안 배양한 후, 배지를 비교예1에 따라 수득한 엑소좀을 포함한 배지로 바꾸어 5일 동안 배양하였다. 이때, 엑소좀을 포함한 배지는 배아줄기세포 배양 배지를 사용하였으며, 배양 배지는 2일마다 교체되었다.
비교예3. 엑소좀에 의해 피부 재생 및 상처 치유 유도된 마우스의 대조군
iExo 희석 용매인 PBS를 직경 6mm의 punch 상처를 낸 마우스에 주2회 발라주었다.
전술한 본 발명에 대한 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

  1. 포유류 유래의 섬유아세포에 초음파 자극을 제공하고, 세포가 없는 배양 배지에 초음파 자극을 제공하는 단계;
    상기 세포와 상기 배양 배지를 혼합하여 일정 시간 배양하는 단계; 및
    상기 혼합물에서 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하고,
    상기 배양 배지는 상피줄기세포 배지, 진피줄기세포 배지, 지방줄기세포 배지, 중간엽줄기세포 배지 및 배아줄기세포 배지 중 어느 하나이며,
    상기 세포에 제공되는 초음파 자극은 10 내지 30 KHz, 0.5 내지 3 W/cm2로 1 내지 10초 동안 제공되는 것이고, 상기 배양 배지에 제공되는 초음파 자극은 10 내지 30 KHz, 1 내지 20 W/cm2로 1 내지 20분 동안 제공되는 것이며,
    상기 엑소좀을 분리하는 단계는 상기 배양 후의 혼합물을 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 상기 상층액을 필터로 여과하여 여과액을 수득하는 단계; 및 상기 여과액을 농축하는 단계를 포함하며,
    상기 분리된 엑소좀은 직경이 50 내지 200nm인 것을 특징으로 하는, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 혼합물의 배양은 1 내지 10일 동안 진행되는 것을 특징으로 하는, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀을 분리하는 단계는
    상기 상층액을 필터로 여과하기 전에 4℃이하에서 7일 내지 1달 동안 보관하는 단계를 추가로 포함하는 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 따른 제조방법으로 제조된 엑소좀을 포함하는, 피부 재생 및 상처 치유용 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 엑소좀은 제1항의 제조방법을 거치지 않은 세포로부터 분비된 엑소좀에 비해 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자의 RNA가 증가되어 있으며,
    상기 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자는 EGFR, FN1, MMP9, MMP2, MAPK1, FGF2, CTGF, AKT1, ALB, TGFB1, MAPK3, VEGFA, FGF7, HGF, IL6, EGF, miR-210, miR-31, Col1α1, ELN, PCNA, N-cadherin 및 Cyclin-D1 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 피부 재생 및 상처 치유용 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 엑소좀은 제1항의 제조방법을 거치지 않은 세포로부터 분비된 엑소좀에 비해 피부에 도포 시 피부에서 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자의 RNA 발현을 더 증가시키고,
    상기 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자는 Col1α1, Col3α1, ELN, PCNA, N-cadherin 및 Cyclin-D1 중 어느 하나 이상인, 피부 재생 및 상처 치유용 조성물.
  12. 삭제
  13. 제9항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 엑소좀이 106 개/ml 내지 1014개/ml 농도로 포함된, 피부 재생 및 상처 치유용 조성물.
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