KR102260122B1 - 간엽줄기세포 활성화제, 활성화된 간엽줄기세포 및 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

[과제] 치료 효과가 상실 또는 감소, 또는 오히려 질환 악화 효과가 있는 비정상적인 간엽줄기세포를 세포 이식 요법에 적합한 상태로 활성화시키는 것을 목적으로 하는 것이다. [해결수단] 본 발명은 간엽줄기세포 활성화제, 상기 활성화제에 의해 활성화된 간엽줄기세포 및 그의 제조 방법, 및 활성화된 간엽줄기세포를 포함하는 의약에 관한 것이다.

Description

간엽줄기세포 활성화제, 활성화된 간엽줄기세포 및 그 제조 방법{Activator for mesenchymal stem cells, activated mesenchymal stem cells, and method for producing same}

본 발명은 간엽줄기세포 활성화제, 상기 활성화제에 의해 활성화된 간엽줄기세포 및 그의 제조 방법 및 활성화된 간엽줄기세포를 포함하는 의약에 관한 것이다.

당뇨병 환자 수는 전 세계적으로 증가 일로를 걷고 있으며, 당뇨병이 초래하는 만성적인 고혈당으로 인해 발생하는 다양한 합병증은 환자의 QOL과 생명을 위협하는 심각한 문제가 되고 있다.

당뇨병의 삼대 합병증으로 불리는 당뇨병 신증, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경병증은 모두 모세혈관을 중심으로 한 좁은 혈관에 일어나는 병적 변화이다. 가늘고 작은 혈관 장애로 인해 장기의 장애가 되어 발병한다. 이러한 합병증은 식이 요법과 약물 요법 등으로 적절하게 혈당을 조절함으로써 어느 정도 방지할 수 있지만, 다른 한편으로 합병증이 중증화하는 경우는 근본적인 치료법은 존재하지 않는다 .

간엽줄기세포(Mesenchymal stem cell, 이하 MSC라고도 함)는 간엽 세포뿐만 아니라 배엽을 넘어 다양한 세포로 분화할 수 있는 세포이며, 조직 발생 및 복구·재생을 제어하는 능력을 가진 것으로 알려져 있다.

간엽줄기세포는 분리 배양이 쉽고 증식능이 왕성하고 단기간에 이식 가능한 세포 수를 확보할 수 있는 면역 거부 없는 자가 이식이 가능하고, 윤리적 문제도 적으며, 낮은 면역원성으로 전 처치를 필요로 하지 않고 동종 이식이 현실적이기 때문에 이상적인 세포 이식 요법의 재료로 다양한 질환에 대한 치료 응용의 검토가 진행되고 있다.

예를 들어, 위의 당뇨병과 그 합병증 (비특허문헌 1 및 2) 외에 뇌·심혈관 질환 (특허문헌 1), 자가면역질환 (비특허문헌 3), 다발성 경화증의 실험적인 자기 면역 뇌척수염 모델 (비특허문헌 4), 염증성 질환 (폐 섬유증 모델에 대해 비특허문헌 5, 염증성 장 질환에 대한 비특허문헌 6) 등의 질환에서 간엽줄기세포의 치료 효과가 확인되고 있다.

질환의 치료에 사용하는 경우, 일정한 품질을 유지한 간엽줄기세포를 신속하고 대량으로 준비할 필요가 있다. 도너로부터 채취한 간엽줄기세포를 생체 외에서 증식시키기 위해 성장 촉진 물질이나 배양기재 등의 다양한 검토가 이루어지고 있으며, 예를 들면 특허문헌 2에서는 탯줄 추출물이 무혈청 배지에서 줄기세포 배양시 혈청 대체재로 사용 가능함이 개시되어 있다. 또한 세포의 품질에 관해서는, 예를 들면 특허문헌 3에서 계대 배양시 간엽줄기세포의 노화를 억제하기 위한 세포 증식배지가 개시되어 있다.

그러나, 특허문헌 2에 개시된 탯줄 추출물은 혈청 대체재에 지나지 않고, 또한 특허문헌 3은 생체 외 증식에서 간엽줄기세포의 품질을 유지 또는 열화의 정도를 억제하는 것을 목적으로 한 것이며, 채취 시점에서 치료 용도에 적합하지 않은 이른바 저품질의 간엽줄기세포의 품질을 향상 또는 변경하는 것은 아니었다.

국제공개 WO2005/007176호 팜플렛 국제공개 WO2013/009100호 팜플렛 일본특허공개공보 제2006-325444호

Ezquer, F. E. et al. , Biol Blood Marrow Transplant 2008; 14 (6) : 631-40 Lee, R. H. et al. , Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103 (46) : 17438-43 Djouad, F. et al. , Arthritis Rheum 2005; 52 (5) : 1595-1603 Zappia E. et al. , Blood 2005; 106 : 1755-1761 Ortiz, A. L. et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 2003; 100 (14) : 8407-8411 Tanaka H. et al. , J Gastroenterol 2011; 46 : 143-152

본 발명자들은 당뇨병이나 관절염이 발병한 대상에서 채취한 간엽줄기세포는 정상인 대상 유래의 간엽계 줄기세포에 비해 당뇨병과 그 합병증이나 류마티스 관절염에 대한 치료 효과가 열등하고 오히려 그 질환을 악화하는 효과도 있는 것을 발견하였다.

이것은 당뇨병이나 관절염이 발병하고 특히 중증화 한 후 그 대상에서 간엽줄기세포를 채취하여 자가 세포 이식 요법를 하더라도 그 효과는 기대할 수 없음을 의미한다. 따라서 유효한 자가 세포 이식 요법를 위해서는 발병 이전 또는 간엽계 줄기세포가 이상화(異常化)되고 치료 효과를 잃기 전에 자기의 간엽줄기세포를 미리 채취해 둘 필요가 있는 것이다. 그러나 간엽줄기세포의 채취는 침습적이며, 건강한 사람에게 신체적으로도 경제적으로도 큰 부담이 된다. 또한 당뇨병과 같은 초기 자각 증상이 거의 없이 진행하는 질환의 경우 진단시에 이미 간엽계 줄기세포가 이상화되고 있기 때문에 전술한 이유로 자가 세포 이식 요법이 적용되지 않을 수 있다.

따라서 본 발명은 이렇게 치료 효과가 상실 또는 감소, 또는 오히려 질환 악화 효과가 있는 비정상적인 간엽줄기세포를 세포 이식 요법에 적합한 상태로 활성화시키는 것을 목적으로 하는 것이다.

본 발명자들은 포유류의 태아 부속물의 추출물이 비정상적인 간엽줄기세포를 활성화시키는 것을 발견하고 다음 각 발명을 완성시켰다.

(1) 포유동물의 태아 부속물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 비정상적인 간엽줄기세포의 활성화제.

(2) 태아 부속물이 탯줄 조직, 태반 조직 또는 난막인 (1)에 기재된 활성화제.

(3) 상기 추출물은 상기 포유동물 유래의 증식능을 갖는 세포를 포함하지 않는 (1) 또는 (2)에 기재된 활성화제.

(4) 상기 비정상적인 간엽줄기세포가 골수 유래 간엽줄기세포인, (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 활성화제.

(5) 상기 비정상적인 간엽줄기세포가 질환 대상에서 분리된 것인, (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 활성화제.

(6) 상기 질환이, 당뇨병, 자가면역질환, 만성 염증성 질환, 알레르기성 질환이나 골다공증인, (5)에 기재된 활성화제.

(7) 상기 질환이 당뇨병이나 관절염인, (5)에 기재된 활성화제.

(8) 대상에서 분리된 비정상적인 간엽줄기세포를 포유동물의 태아 부속물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 활성화제로 처리하는 공정을 포함하는, 활성화된 간엽줄기세포의 제조 방법.

(9) 상기 비정상적인 간엽줄기세포가 골수 유래 간엽줄기세포인, (8)에 기재된 간엽줄기세포의 제조 방법.

(10) 상기 대상이 질환을 가진 대상인, (8) 또는 (9)에 기재된 간엽줄기세포의 제조 방법.

(11) 상기 질환이, 당뇨병, 자가면역질환, 만성 염증성 질환, 알레르기성 질환이나 골다공증인 (10)에 기재된 간엽줄기세포의 제조 방법.

(12) 상기 질환이 당뇨병이나 관절염인, (10)에 기재된 간엽줄기세포의 제조 방법.

(13) (8)에서 (12) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된 질환 치료 및/또는 예방용의 간엽줄기세포.

(14) 상기 질환이 당뇨병이나 그 합병증, 면역 질환, 만성 염증성 질환, 알레르기성 질환이나 골다공증인, (13)에 기재된 간엽줄기세포.

(15) 상기 질환이 당뇨병 신증, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경 장애 또는 류마티스 관절염인 (13)에 기재된 간엽줄기세포.

(16) (13) 내지 (15) 중 어느 한 항에 기재된 간엽줄기세포 및/또는 그의 배양물을을 포함하는 질환 치료 및/또는 예방용 의약.

본 발명에 따르면 대상에서 채취된 비정상적인 간엽줄기세포를 세포 이식 요법에 적합한 상태로 활성화시킬 수 있다. 이로써 자기의 간엽줄기세포가 이상화되어 자가 세포 이식 요법이 부적합했던 환자에게 자가 세포 이식 요법을 적용하는 것이 가능하게 된다. 또한, 본 발명의 활성화제는 태아 부속물 도너인 포유동물에서 유래한 증식능을 갖는 세포를 포함하지 않는다. 따라서 활성화 처리 후 도너 유래 세포의 제거가 불필요하고, 여분의 세포 가공 공정을 수반하지 않는 장점이 있다.

도 1은 태아 부속물에서 추출물의 일례인 탯줄 조직 추출물(WJ)의 위상차 현미경 관찰상 (A) 및 전자 현미경 관찰상 (B)이다.
도 2는 탯줄 조직 추출물에서 증식 인자 함유량(A), 히알루론산 함유량(B) 및 L-글루타민산 함유량(C)을 나타내는 그래프이다.
도 3은 탯줄 조직 추출물의 점도를 나타내는 그래프이다.
도 4는 탯줄 조직 추출물의 엑소솜의 전자 현미경 영상(A), 항 CD9 항체 및 항 HSP70 항체를 이용한 웨스턴 블랏 (B) 및 항 CD9 항체를 이용하여 측정한 엑소솜 함유량을 나타내는 그래프(C)이다. 도 4B의 # 1 ~ # 6은 각각 로트(lot)가 다른 6 개의 탯줄 조직 추출물 유래의 엑소솜 분획에 해당한다.
도 5는 로트가 다른 탯줄 조직 추출물의 배양상을 나타내는 도면이다.
도 6은 탯줄 조직 추출물에서 활성화 처리를 실시한 스트렙토조토신(STZ) 유도 I 형 당뇨병 모델 랫트 간엽줄기세포 (DM-MSC-WJ (+)) 및 활성화 처리를 하지 않은 STZ 유도 I 형 당뇨병 모델 랫트 간엽줄기세포 (DM-MSC-WJ (-))의 MTT 어세이 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 정상 랫트의 간엽줄기세포 (Control-MSC) DM-MSC-WJ (-) 및 DM-MSC-WJ (+)의 위상차 현미경 관찰상이다.
도 8은 Control-MSC DM-MSC-WJ (-) 및 DM-MSC-WJ (+)의 전자 현미경 관찰상 (약 확대)이다.
도 9는 Control-MSC DM-MSC-WJ (-) 및 DM-MSC-WJ (+)의 전자 현미경 관찰상 (강 확대)이다.
도 10은 Control-MSC DM-MSC-WJ (-) 및 DM-MSC-WJ (+)의 Ki67 염색 결과를 나타낸다. 상단은 형광 현미경 관찰상이며, 하단은 DAPI 양성 세포 및 Ki67 양성 세포의 수로부터 산출되는 한 시야 당 전체 세포 수 및 Ki67 양성 세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 11은 DM-MSC-WJ (-) 및 DM-MSC-WJ (+)의 ERK1/2의 활성을 나타내는 웨스턴 블롯이다. 레인 1은 DM-MSC-WJ (-), 레인 2-8은 로트가 다른 7 개의 탯줄 조직 추출물에 의해 활성화하게 처리한 DM-MSC-WJ (+)에 해당한다.
도 12는 DM-MSC-WJ (-) 및 DM-MSC-WJ (+)의 소포체 스트레스 관련 단백질의 발현을 나타내는 웨스턴 블롯이다. 레인 1은 DM-MSC-WJ (-), 레인 2-6은 로트가 다른 5 개의 탯줄 조직 추출물에 의해 활성화하게 처리한 DM-MSC-WJ (+)에 해당한다.
도 13은 Control-MSC DM-MSC-WJ (-) 및 DM-MSC-WJ (+)의 증식 인자, 분화 관련 인자 및 사이토카인·케모카인의 유전자 발현량의 비율을 나타내는 그래프이다. 사선의 막대 그래프는 DM-MSC-WJ (-)의 유전자 발현량/Control-MSC의 유전자 발현량을, 검은 색의 막대 그래프는 DM-MSC-WJ (+)의 유전자 발현량/DM-MSC-WJ (- )의 유전자 발현량을 나타낸다.
도 14는 DM-MSC-WJ (-) 및 DM-MSC-WJ (+)의 지방 세포로의 분화를 나타내는 명 시야 현미경 관찰상이다.
도 15는 DM-MSC-WJ (+)의 표면 항원의 발현을 분석한 유동 세포 계측법 결과를 나타내는 도면이다. 점선은 이소타입 콘트롤(isotype control), 실선은 표적 항체에 해당한다.
도 16은 탯줄 조직 추출물에서 활성화 처리를 실시한 STZ 유도 I 형 당뇨병 모델 랫트 간엽줄기세포의 MTT 어세이 결과 (A) 및 위상차 현미경 관찰상 (B)이다. B의 각 사진 상의 문자는 활성화 처리의 탯줄 조직 추출물의 첨가 농도 (mg/mL)을 나타낸다.
도 17은 탯줄 조직 추출물에서 활성화 처리한 OLETF II 형 당뇨병 모델 랫트 간엽줄기세포의 MTT 어세이 결과 (A) 및 위상차 현미경 관찰상 (B)이다. B의 각 사진 상의 문자는 활성화 처리의 탯줄 조직 추출물의 첨가 농도 (mg/mL)을 나타낸다.
도 18은 소 태아 혈청 (FBS) 첨가의 유무 및 탯줄 조직 추출물의 첨가 농도를 바꾸어 활성화 처리를 실시한 STZ 유도 I 형 당뇨병 모델 랫트 간엽줄기세포의 MTT 어세이 결과 (A), 위상차 현미경 관찰상 (B) 및 JNK1/3 및 α-SMA 단백질의 발현을 분석한 웨스턴 블롯 (C)이다. B의 각 사진 상의 문자는 활성화 처리의 탯줄 조직 추출물의 첨가 농도(mg/mL)을 나타낸다.
도 19는 FBS 첨가의 유무 및 탯줄 조직 추출물의 첨가 농도를 바꾸어 활성화 처리를 한 OLETF II 형 당뇨병 모델 랫트 간엽줄기세포의 MTT 어세이 결과 (A), 위상차 현미경 관찰상 (B) 및 JNK1/3 및 α-SMA 단백질의 발현을 분석한 웨스턴 블롯 (C)이다. B의 각 사진 상의 문자는 활성화 처리의 탯줄 조직 추출물의 첨가 농도 (mg/mL)을 나타낸다.
도 20은 FBS 첨가의 유무 및 탯줄 조직 추출물의 첨가 농도를 바꾸어 활성화 처리를 한 II 형 당뇨병 환자 유래 간엽줄기세포의 MTT 어세이 결과 (A) 및 위상차 현미경 관찰상 (B)이다. B의 각 사진 상의 문자는 활성화 처리의 탯줄 조직 추출물의 첨가 농도 (mg/mL)을 나타낸다.
도 21은 FBS 존재 탯줄 조직 추출물의 첨가 농도 1.0mg/mL에서 II 형 당뇨병 환자 골수액의 배양에 의해 얻어진 각 계대에서의 총 세포 수를 나타내는 그래프이다.
도 22는 탯줄 조직 추출물에서 활성화 처리를 한 I 형 당뇨병 환자 유래 간엽줄기세포의 MTT 어세이 결과 (A) 및 위상차 현미경 관찰상 (B)이다. B의 각 사진 상의 문자는 활성화 처리의 탯줄 조직 추출물 첨가의 유무를 나타낸다. 또한 아랫 줄의 사진은 정상인 유래의 간엽줄기세포이다.
도 23은 태아 부속물의 추출물의 다른 일례인 태반 조직 추출물 (P) 및 난막 추출물 (PM)에서 제조한 엑소솜 분획의 항 HSP70 항체를 이용한 웨스턴 블랏이다.
도 24는 태반 조직 추출물 및 난막 추출물의 배양상을 나타내는 도면이다.
도 25는 태반 조직 추출물 또는 난막 추출물에서 활성화 처리를 실시한 STZ 유도 I 형 당뇨병 모델 랫트 간엽줄기세포의 MTT 어세이 결과 (A), 위상차 현미경 관찰상 (B) 및 JNK1/3 및 α- SMA 단백질의 발현을 분석한 웨스턴 블롯 (C)이다.
도 26은 L-글루타민산을 첨가한 또는 첨가하지 않은 배지에서 배양한 DM-MSC-WJ (-)의 MTT 어세이 결과 (A), 위상차 현미경 관찰상 (B) 및 전자 현미경 관찰상 (C)이다.
도 27은 히알루론산을 첨가한 또는 첨가하지 않은 배지에서 배양한 또는 히알루론산 미소화 탯줄 조직 추출물 또는 히알루론산 미소화되지 않은 탯줄 조직 추출물을 첨가한 배지에서 배양한 DM-MSC-WJ (-)의 MTT 어세이 결과 (A), 위상차 현미경 관찰상 (B) 및 전자 현미경 관찰상 (C)이다.
도 28은 탯줄 조직 추출물 또는 그 엑소솜 분획을 첨가한 배지에서 배양한 DM-MSC-WJ (-)의 MTT 어세이 결과 (A), 위상차 현미경 관찰상 (B) 전자 현미경 관찰상 (C) 및 JNK1/3 및 α-SMA 단백질의 발현을 분석한 웨스턴 블롯 (D)이다.
도 29는 태반 조직 추출물 또는 그 엑소솜 분획을 첨가한 배지에서 배양한 DM-MSC-WJ (-)의 MTT 어세이 결과 (A), 위상차 현미경 관찰상 (B) 및 JNK1/3 및 α-SMA 단백질 발현을 분석한 웨스턴 블롯 (C)이다.
도 30은 STZ 유도 I 형 당뇨병 신증 모델 마우스 (STZ 마우스)에 대한 치료 효과의 평가 (실시예 9의 9-1)에 사용한 DM-MSC-WJ (+)의 활성화 프로토콜을 나타내는 도 (A) 및 치료 시험 계획을 나타내는 도 (B)이다.
도 31은 STZ 마우스의 치료 시험(실시예 9의 9-1)에서의 체중 변화율의 그래프이다.
도 32는 STZ 마우스의 치료 시험(실시예 9의 9-1)에서의 혈당 그래프이다.
도 33은 STZ 마우스의 치료 시험 (실시예 9의 9-1)에서의 소변 중 알부민/크레아티닌 비율 그래프이다.
도 34는 STZ 마우스에 대한 치료 효과의 평가(실시예 9의 9-2)에 사용한 DM-MSC-WJ (+)의 활성화 프로토콜을 나타내는 도 (A) 및 치료 시험 계획을 나타내는 도 (B)이다.
도 35는 STZ 마우스의 치료 시험(실시예 9의 9-2)에서의 체중 변화율의 그래프이다.
도 36은 STZ 마우스의 치료 시험 (실시예 9의 9-2)에서 혈당 그래프이다.
도 37은 STZ 마우스의 치료 시험 (실시예 9의 9-2)의 소변 중 알부민/크레아티닌 비율 그래프이다.
도 38은 STZ 유도 I 형 당뇨병 신증 모델 랫트 (STZ 랫트)에 대한 치료 효과의 평가 (실시예 10의 10-1)에 사용한 DM-MSC-WJ (+)의 활성화 프로토콜을 나타내는 도 (A) 및 치료 시험 계획을 나타내는 도 (B)이다.
도 39은 STZ 랫트의 치료 시험 (실시예 10의 10-1)의 소변 중 알부민/크레아티닌 비율 그래프이다.
도 40은 OLETF II 형 당뇨병 신증 모델 랫트 (OLETF 랫트)에 대한 치료 효과의 평가 (실시예 10의 10-2)에 사용한 OLETF II 형 당뇨병 모델 랫트 간엽줄기세포 (OLETF-DM-MSC-WJ (+))의 활성화 프로토콜을 나타내는 도 (A) 및 치료 시험 계획을 나타내는 도 (B)이다.
도 41은 OLETF 랫트의 치료 시험 (실시예 10의 10-2)의 소변 중 알부민/크레아티닌 비율 그래프이다.
도 42는 탯줄 조직 추출물에서 활성화 처리를 실시한 류마티스 관절염 모델 랫트 (RA 랫트) 간엽줄기세포 (RA-MSC-WJ) 및 활성화 처리를 하지 않은 RA 랫트 간엽줄기세포 (RA-MSC)의 MTT 어세이 결과 (A) 및 위상차 현미경 관찰상 (B)이다.
도 43은 RA 랫트에 대한 치료 효과의 평가 (실시예 11의 11-3)에 사용한 RA 랫트 간엽줄기세포의 활성화 프로토콜을 나타내는 도 (A) 및 치료 시험 계획을 나타내는 도 (B)이다.
도 44는 RA 랫트의 치료 시험에서의 족부 부피의 그래프이다.
도 45는 RA 랫트의 치료 시험에서의 관절염 스코어 그래프이다.
도 46은 RA 랫트의 치료 시험에서의 혈청 CRP 값의 그래프이다.
도 47은 Control-MSC (A) 및 이 MSC의 배양상청액(MSC-CM) (B)의 STZ 마우스에 대한 치료 시험 계획을 나타내는 그림이다 (참고예 1의 1-1).
도 48은 Control-MSC (A) 및 MSC-CM (B) STZ 마우스에 대한 치료 시험에서의 소변 중 알부민/크레아티닌 비율 그래프이다 (참고예 1의 1-1).
도 49는 Control-MSC와 MSC-CM의 STZ 마우스에 대한 치료 시험에서의 신장 조직 절편의 PAS 염색 이미지 및 Azan 염색 이미지이다 (참고예 1의 1-1).
도 50은 Control-MSC (A) 및 MSC-CM (B)의 고지방식 유도 II 형 당뇨병 신증 모델 마우스 (HFD 마우스)에 대한 치료 시험 계획을 나타내는 그림이다 (참고예 1의 1-2).
도 51은 Control-MSC (A) 및 MSC-CM (B) HFD 마우스에 대한 치료 시험에서의 소변 중 알부민/크레아티닌 비율 그래프이다 (참고예 1의 1-2).
도 52는 Control-MSC와 MSC-CM의 HFD 마우스에 대한 치료 시험에서의 신장 조직 절편의 PAS 염색 이미지 및 Azan 염색 이미지이다 (참고예 1의 1-2).

본 발명의 첫 번째 측면은 포유동물의 태아 부속물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 비정상적인 간엽줄기세포의 활성화제에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 두 번째 측면은 대상에서 분리된 비정상적인 간엽줄기세포를 상기 첫 번째 측면의 활성화제로 처리하는 공정을 포함하는 활성화된 간엽줄기세포의 제조 방법에 관한 것이다.

<추출물>

태아 부속물은 임신시 자궁 내에서 형성되는 태아의 발육을 지원하는 역할을 담당하는 기관이며, 태반, 탯줄, 난막 (양막, 융모막 탈락 막의 3층으로 됨) 및 양수로 구성되어 있다. 태반은 태아와 모체 사이의 물질 교환을 실시하는 장소로서 기능하는 융모 조직으로서 다양한 증식 인자와 사이토카인을 포함하고 호르몬 생산도 하고 있다. 탯줄은 태아와 태반을 연결하는 기관이며, 2 개의 탯줄 동맥과 1 개의 탯줄 정맥, 와튼 교질, 제대 간질이라는 결합 조직 및 그 주변을 덮는 양막초로 구성된다.

와튼 교질은, 소량의 세포와 콜라겐, 글리코사미노글리칸, 뮤신 등의 세포 외 매트릭스를 포함한다. 와튼 교질 중의 글리코사미노글리칸은 그 대부분을 히알루론산이 차지하고, 그 밖에 케라탄 황산, 콘드로이틴-6- 황산, 헤파란 황산 등의 황산화 글리코사미노글리칸이 포함된다.

또한 와튼 교질에는 IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-1), PDGF (Platelet-Derived Growth Factor), EGF (Epidermal Growth Factor), FGF (Fibroblast Growth Factor) 등의 증식인자가 포함될 수 있는 것도 알려져 있다 (K.Sobolewski et al., Placenta (2005), 26,747-752).

본 발명에서 사용하는 태아 부속물은 태아 출산 후 후산으로 모체에서 나오거나 또는 제왕절개에 의해 모체에서 적출된 것이다. 본 발명의 추출물은 모체에서 얻은 태아 부속물 전체에서 준비할 수 있다. 혹은 태아 부속물의 일부, 즉 태아 부속물을 구성하는 기관 또는 조직 중 하나 이상을 추출 재료로 사용될 수 있다. 이 경우 활성화 활성 및 추출 효율의 관점에서 추출 재료에는 탯줄 조직, 태반 조직 또는 난막이 포함되는 것이 바람직하다. 태아 부속물은 채취 후 즉시 추출물의 제조에 사용하여도 좋고, 또는 오염 물질의 혼입을 방지하기 위해 멸균 용기에 넣어 냉장 또는 냉동으로 보존한 후 사용할 수도 있다.

태아 부속물은 포유동물에서 채취할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예 중 하나로 태아 부속물은 인간에서 채취된 것이지만, 인간 이외의 동물 (예를 들어, 침팬지 등의 영장류, 마우스, 쥐, 기니피그, 햄스터 등의 설치류, 소, 염소, 양, 돼지 등 우제목, 말 등의 기제목, 토끼, 개, 고양이 등)에서 채취된 태아 부속물을 이용하는 것도 가능하다.

또한 태아 부속물은 다음 세포 이식 요법시의 안전성을 고려하면 간엽줄기세포를 투여하는 개체와 동종 또는 근연종의 개체에서 채취하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 추출물은 전술한 바와 같이 채취된 태아 부속물에서 추출 매체로 추출하여 제조할 수 있다. 태아 부속물은 부착되어 있는 여분의 성분을 생리식염수 등으로 씻어낸 후 추출에 사용하는 것이 바람직하다.

세척 후 태아 부속물은 그대로의 형태로 추출에 이용해도 좋지만, 추출 효율을 높이기 위해 절단 또는 파쇄하여 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 동결시킨 태아 부속물을 믹서로 파쇄하여 보다 간편한 조작으로 추출이 가능해진다. 또한 탯줄 조직을 이용하는 경우의 본 발명의 바람직한 실시예 중 하나에서는 후술하는 바와 같이 탯줄 조직을 적당히 절단하여 얻은 3 차원 구조가 실질적으로 유지된 탯줄 조직을 추출에 사용한다.

본 명세서에서 「3 차원 구조가 실질적으로 유지된 탯줄 조직」은 호모제나이즈 등의 조직을 파쇄 또는 균일화하는 처리를 수반하지 않고, 메스, 가위, 핀셋 기타 절단 수단 또는 손을 사용하여 탯줄 조직을 추출에 적합한 형상 또는 크기로 절단하여 얻은 탯줄 조직을 말한다.

호모제나이즈 등에 의해 탯줄 조직의 3 차원 구조를 파괴하여 추출을 실시했을 경우, 추출물이 거품이 일고 그 결과, 기구 및 용기 등에 대한 점성 성분의 부착이 증가하고, 추출 효율이 떨어질 우려가 있다. 탯줄 조직을 3 차원 구조가 실질적으로 유지되도록 절단함으로써 유효성분의 효율적인 추출과 바람직하지 않은 발포의 회피를 동시에 실현할 수 있다.

또한 탯줄 조직의 3 차원 구조가 유지되는 한, 절단 방향은 한정되지 않지만, 탯줄 조직 구조상 탯줄의 장축 방향을 따라 절단하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 추출 매체는 태아 부속물 중에 포함되는 유효성분의 활성에 부정적인 영향을 주지 않는 한, 생화학 분야에서 일반적으로 사용되는 매체인 것이 가능하고, 수성 매체가 바람직하다. 세포 배양 및 제조에 통상적으로 사용되는 수성 매체가 보다 바람직하고, 예를 들면, 증류수, 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수나 세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지, 예를 들면 α-MEM 배지, DMEM 배지 등을 들 수 있다.

추출 매체는 그 후의 세포 이식 요법시의 안전성을 고려하면 수혜자인 개체에 불리한 영향을 미칠 수 있는 성분을 포함하지 않는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 바람직한 실시예 중 하나에서 간엽줄기세포의 활성화는 추출물 자체를 배지로 사용하여 간엽줄기세포를 배양함으로써 이루어진다. 이 경우 당업자는 추출 매체로 태아 부속물 중 유효성분을 충분히 추출할 수 있고 한편 간엽계 줄기세포의 배양에 적합한 세포 배양용 배지를 적절하게 선택할 수 있다.

추출은 태아 부속물을 추출 매체에 침지하고 24 시간 ~ 144 시간, 바람직하게는 48 시간 ~ 96 시간, 보다 바람직하게는 72 시간 동안 온도 2 ℃ ~ 25 ℃, 바람직하게는 2 ℃ ~ 8 ℃, 보다 바람직하게는 4 ℃에서 정치 또는 진탕함으로써 이루어진다. 진탕 속도는 추출되는 액체를 지나치게 발포시킨 않을 정도로 설정된다. 사용하는 추출 매체의 양은 태아 부속물의 습윤 중량 1g 당 0.2mL ~ 100mL 선호 0.5mL ~ 20mL, 더욱 바람직하게는 1mL ~ 10mL이며, 이 양은 태아 부속물의 절단 정도 및 추출 온도, 진탕 속도 등에 따라 적절하게 조절된다.

추출 후 태아 부속물을 포함한 추출액은 정치 또는 원심 분리한 후 얻어진 상청 분획을 회수하여 또는 여과 후 여과액을 회수하여 태아 부속물 유래 불필요한 고형분을 제거하여 사용할 수 있다.

추출 후 태아 부속물은 유효성분을 추출되는 한에서 재사용할 수 있다. 즉, 유효성분을 추출한 후 태아 부속물에 다시 추출 매체를 추가하여 상기 추출 처리를 실시하고, 새로운 추출물을 얻는 것도 가능하다. 이렇게 여러 번 추출함으로써 유효성분의 수율을 높일 수 있다.

이렇게 얻어진 추출물은 그대로 액체 상태로 사용할 수 있다. 혹은 추출물은 그 속에 함유된 유효성분의 활성을 손상하지 않도록 농축 또는 건조시켜 농축액 또는 건조물로 한 후 사용시 희석 또는 적당한 액체에 용해시켜 사용할 수도 있다. 또한 추출물은 제조 후 즉시 사용하여도 좋고, 또는 냉장 또는 냉동으로 보존한 후에 사용하여도 좋다.

본 발명의 바람직한 실시예 중 하나에서 추출물은 태아 부속물의 기증자인 포유동물 유래의 증식능을 갖는 세포를 포함하지 않는다. 도너 유래의 증식능을 갖는 세포가 혼입되어 있는 경우 활성화 처리 사이에 원하는 간엽줄기세포와 함께 도너 유래의 세포도 증식할 가능성이 있어, 이것을 세포 이식 요법에 사용하면 레시피언트 개체에 대해 거부 반응이나 이식편 대 숙주 병 등의 바람직하지 않은 작용을 초래할 수 있기 때문이다.

이러한 증식능을 갖는 세포를 포함하지 않는 추출물은 예를 들어, 태아 부속물에 대해 방사선 조사 등의 세포 사멸 처리를 수행하여 얻을 수 있다. 또한, 이러한 추출물은 3 차원 구조가 실질적으로 유지된 탯줄 조직을 이용한 전술한 바와 같은 추출 방법에 의해 세포 제거 처리를 필요로 하지 않고 얻을 수 있다.

추출물 중의 증식능을 갖는 세포의 유무는 세포 증식능·생존율을 평가하는 공지의 방법, 예를 들어 적절한 증식 배지를 이용한 세포 배양 시험과 MTT 어세이과 같은 생화학적 시험 등으로 확인할 수 있다.

<간엽줄기세포>

간엽줄기세포는 간엽 조직의 간질 세포 중에 미량으로 존재하는 다분화능 및 자기 복제 능력을 갖는 줄기세포이며, 골아세포, 연골세포, 지방세포, 근세포 등 간엽계에 속하는 세포로 분화할뿐만 아니라 신경세포나 간세포 등에도 배엽을 넘어 분화할 수 있다. 또한 간엽줄기세포는 더욱 자신이 생산하는 체액성 인자에 의한 파라클라인 효과 및 세포 부착 상호 작용도 가진 것으로 알려져 있다.

간엽줄기세포는 이러한 작용에 따라 표적 조직이나 세포의 복구·재생 기능 및 항염증 등의 면역 제어 기능을 발휘하고 그 결과 다양한 질환에 대한 치료가 초래되는 것으로 생각되고 있다.

본 발명에서 「비정상적인 간엽줄기세포」는 상기와 같은 다양한 능력을 상실하거나 이러한 능력이 정상적인 간엽줄기세포에 비해 감소된 결과로 질환 치료 효과를 잃거나 치료 효과가 정상적인 간엽줄기세포에 비해 감소한 간엽줄기세포를 말한다. 본 발명자들은 또한 비정상적인 간엽줄기세포는 치료 효과를 가지지 않을 뿐만 아니라 오히려 질환을 악화하는 효과조차 가지는 것을 확인하고 있다. 이러한 질환 악화 효과를 갖는 간엽줄기세포도 본 발명에서 말하는 「비정상적인 간엽줄기세포」에 포함된다.

본 발명자들은 당뇨병이나 관절염을 가진 개체에서 채취한 간엽줄기세포가 이상화(異常化)되고 있음을 밝혔다. 이러한 이상화는 자가면역질환, 만성 염증성 질환, 알레르기 질환 등의 질환을 가진 개체와 노화된 개체에서도 발생하는 것으로 추측된다. 또한 간엽줄기세포의 이상화는 건강한 한 개체라도 생길 수 있는 것으로 생각되지만, 이러한 건강한 개체 유래의 이상 세포도 본 발명에 따른 활성화가 가능하다.

간엽줄기세포가 이상화되는 질환으로는, 구체적으로는 I 형 당뇨병 및 II 형 당뇨병; 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 다발성 근염, 피부 근염, 피부 경화증, 갑상선 기능 항진증, 갑상선 기능 저하증, 자가 면역성 부신 기능 장애, 진정 적혈구성 빈혈, 다발성 경화증 및 면역 간염 등의 자가면역질환; 만성 간염, 간경변, 만성 폐쇄성 폐 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 베체트병 등의 만성 염증성 질환; 아토피성 피부염, 기관지 천식 등의 알레르기성 질환; 골다공증을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 비정상적인 간엽줄기세포는 대상에서 채취된다. 본 명세서에서 「대상」은 간엽줄기세포를 갖는 모든 동물을 의미하며, 바람직하게는 포유동물의 개체, 예를 들어, 인간, 침팬지 등의 영장류, 마우스, 쥐, 기니피그, 햄스터 등의 설치류, 소, 염소, 양, 돼지 등 우제목, 말 등의 기제목, 토끼, 개, 고양이 등의 개체이며, 더욱 바람직하게는 인간의 개체이다.

본 발명의 실시예 중 하나에서 대상은 상기의 간엽줄기세포가 이상화되는 질환을 가진 개체 또는 노화된 개체이다. 다른 실시예에서, 질환은, 당뇨병, 자가면역질환, 만성 염증성 질환, 알레르기성 질환이나 골다공증인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 당뇨병이나 관절염이다.

간엽줄기세포는 그 후의 세포 이식 요법의 안전성을 고려하면 세포를 투여하는 개체와 동종 또는 근연종의 개체에서 채취하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 인간의 개체에 세포 이식을 할 경우 바람직하게는 동종인 사람에서 채취된 세포가, 보다 바람직하게는 투여를 받는 동일한 인간 개체에서 채취된 세포, 즉 자기 간엽줄기세포가 이용된다 .

간엽줄기세포는 포유동물의 골수액, 지방 조직, 태아 부속 조직, 치수 등의 시료에서 일반적인 방법으로 채취할 수 있으며, 예를 들면, 시료로서 골수액을 사용하는 경우,밀도 구배 원심분리, 골수 파종법 등의 공지의 방법에 의해, 간엽줄기세포를 분리하는 것이 가능하다.

비정상적인 간엽줄기세포는 생체에서 채취한 후, 인 비트로에서 계대 배양된 것이어도 좋다.

본 발명의 바람직한 실시예 중 하나에서 비정상적인 간엽줄기세포로 골수 유래의 세포가 이용된다.

채취한 간엽줄기세포가 정상인지 비정상인지 여부의 판정은 질환을 반영한 평가 시스템, 예를 들면 질환 모델 동물과 질환 모델 동물 유래 세포 등을 이용하여 세포의 질환 치료 효과를 평가함으로써 할 수 있다.

이상성 판정을 위한 평가 시스템으로 이용하는 질환은 정상적인 간엽줄기세포에 의해 치료될 수 있는 질환이면 좋지만, 채취한 간엽줄기세포를 활성화된 후 치료 용도로 사용하는 것을 예정하고 있는 경우 치료 계획의 질환과 동일하거나 관련이 있는 질환에 대한 평가 시스템을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 간엽줄기세포를 당뇨병 신증의 치료에 이용하는 것을 예정하고 있는 것이라면, 채취한 간엽줄기세포의 이상성 평가는 당뇨병성 신증을 반영한 평가 시스템에서 실시하는 것이 바람직하다.

채취한 간엽줄기세포가 치료 효과를 가지지 않거나 정상적인 간엽줄기세포의 그것보다 낮은 치료 효과를 가지는 경우, 또는 질환 악화 효과를 가지는 경우, 그 간엽줄기세포는 이상(비정상)이라고 판정할 수 있다.

또한 간엽줄기세포의 이상성 판정은 후술의 시험예와 같이 세포 및 세포 내 소기관의 형태, 세포 증식능, 분화능, 및 증식 인자, 분화 관련 인자 및 사이토카인·케모카인 등 각종 인자의 단백질 발현량, 유전자 발현량, 세포외 분비량 등의 평가 지표를 이용함으로써도 할 수 있다.

비정상적인 간엽줄기세포는, 일례로 정상적인 간엽줄기세포와 다른 다음과 같은 성질을 가진다.

[표 1]

이들의 평가는 세포 생물학 및 분자 생물학 분야에서 통상적으로 사용되는 방법으로 할 수 있다. 구체적으로는 세포와 세포 내 소기관의 형태는 현미경 관찰에 의해, 세포 증식능은 적절한 증식 배지를 이용한 세포 배양 시험과 MTT 어세이과 같은 생화학적 시험을 통해, 분화능은 적절한 분화 유도 배지를 이용한 분화 유도 시험에 의해, 단백질 발현량은 ELISA와 웨스턴 블랏법 등의 단백질 정량법에 따라, 유전자 발현량은 정량적 PCR이나 노던 블랏법 등의 유전자 정량법에 따라 평가할 수 있다.

채취한 간엽줄기세포가 상술한 바와 같은 평가 지표 중 하나 또는 복수에 대해 정상적인 간엽줄기세포와 다른 거동을 나타내는 경우 그 간엽줄기세포는 비정상이라고 판정할 수 있다.

<본 발명의 활성화제 및 활성화된 간엽줄기세포의 제조 방법>

본 발명의 활성화제는 비정상적인 간엽줄기세포를 활성화시킬 수 있다.

본 명세서에서 「활성화」는 비정상적인 간엽줄기세포에 다양한 능력의 적어도 일부를 회복시켜 질환 치료 효과를 발휘할 수 있는 상태로 만드는 것을 말한다. 비정상적인 간엽줄기세포는 활성화로 정상적인 간엽줄기세포의 그것과 같은 정도로, 혹은 그 이상의 치료 효과를 발휘하게 된다. 또한 정상적인 간엽줄기세포와 동일한 정도까지 도달 않지만, 활성화 이전보다 치료 효과가 향상된 상태로 하는 것도, 본 발명의 「활성화」에 포함된다.

본 발명의 활성화제는 포유동물의 태아 부속물의 추출물을 유효성분으로 함유한다. 활성화제는 전술한 방법으로 얻은 추출물을 그대로 또는 세포 배양 및 제조에 통상적으로 사용되는 수성 매체로 희석하여 사용할 수 있다. 희석에 사용하는 수성 매체로는 예를 들면, 증류수, 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수나 세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지, 예를 들면 α-MEM 배지, DMEM 배지 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명은 대상에서 분리된 비정상적인 간엽줄기세포를 포유동물의 태아 부속물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 활성화제로 처리하는 공정을 포함하는 활성화된 간엽줄기세포의 제조 방법에 관한 것이다.

간엽줄기세포를 활성화제로 처리하는 공정, 즉 활성화 공정은 비정상적인 간엽줄기세포의 배지에 본 발명의 활성화제를 첨가하여 24 시간 ~ 144 시간, 바람직하게는 24 시간 ~ 72 시간,보다 바람직하게는 48 시간 동안 배양함으로써 이루어진다. 활성화 처리 온도 및 가스 농도는 간엽줄기세포의 배양에 통상적으로 사용 온도 및 가스 농도의 범위 내이면 좋고, 온도는 예를 들어 25 ℃ ~ 37 ℃, 바람직하게는 30 ℃ ~ 37 ℃, 보다 바람직하게는 37 ℃이며, 산소 농도는 예를 들어 2 % ~ 30 %, 바람직하게는 2 % ~ 20 %이다. 활성화 처리는 충분한 활성화가 달성될 때까지 여러번 할 수 있다.

활성화 처리의 활성화제의 농도는 활성화가 달성하는 범위 내에서 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 활성화제는 태아 부속물의 추출물 0.01mg/mL ~ 25mg/mL, 바람직하게는 0.05mg/mL ~ 10mg/mL, 더욱 바람직하게는 0.1mg/mL ~ 5mg/mL를 포함한다. 또한, 본 발명의 활성화제는 간엽줄기세포의 증식에 필요한 성분, 예를 들어 혈청 성분과 간엽줄기세포용 배지 등과의 공존 하에서 간엽줄기세포를보다 효율적으로 활성화 시킨다. 따라서, 본 발명의 활성화제는 이러한 성분과 함께 이용하는 것이 바람직하다.

당업자는 세포의 활성화된 상황을 보면서 활성화제의 농도, 활성화 처리 온도, 시간, 횟수를 적절하게 조절할 수 있다.

또한 활성화 처리는 생체 시료로부터 분리된 상태의 비정상적인 간엽줄기세포뿐만 아니라 생체 시료 유래의 세포 집단에 포함된 상태의 비정상적인 간엽줄기세포에 대해서도 할 수 있다. 예를 들어, 골수 유래 간엽줄기세포의 경우 채취한 골수액을 그대로 활성화 처리에 제공함으로써, 골수액에 포함된 세포 집단 중의 비정상적인 간엽줄기세포를 활성화시키는 것이 가능하다.

비정상적인 간엽줄기세포가 활성화된 여부의 판정은 전술한 바와 같이 질환을 반영한 평가 시스템을 이용하여 활성화 처리 후 세포가 가지는 치료 효과를 평가함으로써 할 수 있다. 활성화 처리 후의 간엽줄기세포가 활성화 처리 전과 비교하여 질환 악화 효과를 상실한 경우 및/또는 치료 효과가 증대하고 있는 경우 그 간엽줄기세포는 활성화된 경우로 판정된다.

또한 활성화된 간엽줄기세포는 치료 효과가 정상적인 간엽줄기세포의 그것과 같은 정도로까지 회복하지 않을 수 있다. 그러나 활성화 처리에 의해 치료 효과가 증대하는 한 그러한 간엽줄기세포는 본 발명에서 사용하는 것이 가능하다.

또한 활성화의 판정은 앞의 이상성 판정과 유사한 세포 생물학적 지표, 즉 세포 또는 세포 내 소기관의 형태, 세포 증식능, 분화능 각종 인자의 단백질과 유전자의 발현량, 세포외 분비량 등의 지표를 사용함으로써도 할 수 있다. 활성화 처리 후 간엽줄기세포가 이러한 평가 지표 중 하나 또는 복수에 대해 정상적인 간엽줄기세포와 동일하거나 이에 가까운 성질을 나타낸 경우 그 간엽줄기세포는 활성화된 것으로 판정할 수 있다.

간엽줄기세포는 활성화와 동시에 또는 활성화된 후 인 비트로에서 계대 배양하여 증식시켜도 좋다.

또한 활성화된 간엽줄기세포는 미분화 상태로 유지해도 좋고, 혹은 원하는 세포로 분화시켜도 좋다. 활성화된 후 세포를 어떠한 분화 상태로 할지는, 치료 대상 질환 및 치료 방법 등의 세포의 용도에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택된다.

간엽줄기세포의 미분화 상태의 유지는 미분화 상태의 유지에 적합한 배지, 예를 들어 HyClone AdvanceSTEM Mesenchymal Stem Cell Expansion Kit (써모 피셔 사이언티픽) MesenCult (상표) MSC Basal Medium (STEMCELL Technology) , Stromal Cellutions (상표) Media (DV Biologics), 간엽줄기세포 전용 배지 kit (MSCGM BulletKit, Lonza) 등을 이용하여 간엽줄기세포를 배양함으로써 할 수 있다.

간엽줄기세포의 분화는 원하는 세포로의 분화 유도 작용을 가지는 인자를 추가한 분화 유도 배지에서의 배양 등의 일반적으로 알려진 방법으로 할 수 있다. 예를 들어, 골아세포로의 분화에서는 Bone Morphogenetic Proteins (BMP) 4, BMP2 등이, 지방세포로의 분화에 있어서 덱사메타손, 3- 이소부틸-1-메틸크산틴 인슐린 등이 분화 유도 인자로서 사용된다.

간엽줄기세포의 분화를 확인하는 방법은 분화시킨 세포의 종류에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 골아세포로의 분화의 확인은 세포의 알칼리 포스파타아제를 검출하는 방법, 예를 들어 알칼리 포스파타아제 염색 등이 이용되고, 지방세포로의 분화의 확인은 세포의 중성 지방을 검출하는 방법, 예를 들어 Oil Red O 염색 등이 이용된다.

활성화 처리가 생체 시료 유래의 세포 집단에 포함된 상태의 비정상적인 간엽줄기세포에 대해 수행된 경우, 필요에 따라 활성화된 후 세포 집단에서 목적의 간엽줄기세포를 분리 또는 농축해도 좋다.

간엽줄기세포의 분리 또는 농축은 간엽줄기세포가 선택적으로 증폭된 배지에서의 배양이나 간엽줄기세포에 특이적인 1 또는 복수의 세포 표면 항원 (예를 들어, CD29, CD73, CD90, CD105, CD166 등)에 따른 유동세포계측법 및 셀 소팅으로 할 수 있다.

간엽줄기세포는 활성화, 증식 배양, 분화 유도 배양 등의 처리 전후에서 동결 보존 등의 일반적인 방법에 의하여 보존할 수 있다. 예를 들어, 활성화된 간엽줄기세포를 배양하여 증식시킨 후 일정한 세포 수가 되도록 나누어 보존했다가 투여마다 필요량을 해동하여 사용하는 것이 가능하다.

<본 발명의 간엽줄기세포의 용도>

본 발명의 세 번째 측면은 상기 두 번째 형태의 제조 방법에 의해 제조된 질환 치료 및/또는 예방용의 간엽줄기세포 및 상기 간엽줄기세포 및/또는 그의 배양물을을 포함하는 질환 치료 및/또는 예방용 의약에 관한 것이다.

본 발명의 제조 방법에 의해 얻어지는 활성화된 간엽줄기세포는 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 또한 본 발명은 활성화된 간엽줄기세포 및/또는 그의 배양물을을 포함하는 질환 치료 및/또는 예방용 의약에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 활성화된 간엽줄기세포를 이용한 또는 이들을 포함하는 의약을 이용한 질환의 치료 방법 및/또는 예방 방법을 제공한다.

치료 및/또는 예방되는 질환은 간엽줄기세포 치료 및/또는 예방이 알려진 임의의 질환일 수 있다.

본 발명의 실시예 중 하나에서 활성화된 간엽줄기세포는 당뇨병이나 그 합병증, 면역 질환, 만성 염증성 질환, 알레르기성 질환이나 골다공증의 치료 및/또는 예방을 위해 사용 수 있다. 이러한 질환으로는 구체적으로, I 형 당뇨병 및 II 형 당뇨병 및 그 합병증, 예를 들어 당뇨병성 신증, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경 장애, 뇌경색, 뇌졸중, 심근 경색, 협심증, 말초 혈관 질환 등; 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 다발성 근염, 피부 근염, 피부 경화증, 갑상선 기능 항진증, 갑상선 기능 저하증, 자가 면역성 부신 기능 장애, 진정 적혈구성 빈혈, 다발성 경화증 및 면역 간염 등의 자가면역질환; 만성 간염, 간경변, 만성 폐쇄성 폐 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 베체트병 등의 만성 염증성 질환; 아토피성 피부염, 기관지 천식 등의 알레르기성 질환; 골다공증을 들 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 치료 및/또는 예방되는 질환은 당뇨병 신증, 당뇨병성 망막증이나 당뇨병성 신경 장애이다. 활성화된 간엽줄기세포는 가늘고 작은 혈관 장애를 개선함으로써 이러한 당뇨병 합병증을 치료 및/또는 예방할 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 후술하는 실시예에 기재된 바와 같이, 류마티스 관절염 역시 활성화된 간엽줄기세포에 의해 바람직하게 치료 및/또는 예방되는 질환이다.

본 발명의 의약은 유효량의 활성화된 간엽줄기세포를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 「유효량」은 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 효과적인 양을 의미한다. 이러한 유효량은 질환의 종류, 증상의 심각도, 환자 기타 의학적 요인에 의해 적절하게 조절된다.

본 발명의 의약의 바람직한 실시예에서, 간엽줄기세포의 유효량은 투여되는 개체의 체중 1kg 당 10⁶ 개 ~ 10⁹ 개, 바람직하게는 10⁷ 개 ~ 10⁹ 개이다.

본 발명의 의약은 또한 유효량의 활성화된 간엽줄기세포의 배양물을 포함할 수 있다. 배양물은 바람직하게는 간엽줄기세포의 배양 상청액이다. 간엽줄기세포의 배양 상청액에는 간엽줄기세포가 생산하는 다양한 체액성 인자가 포함되어 있으며, 간엽줄기세포와 마찬가지로 질환 치료 효과를 갖는 것으로 알려져 있다 (일본 특허 공개 2013-018756 호 공보 및 Watanabe, S.et al., J Gastroenterol.2013; Epub ahead of print, PMID : 24217964). 또한 아래의 참고예에서도 간엽줄기세포 배양 상청액의 치료 효과가 밝혀지고 있다.

배양물은 간엽줄기세포의 배양에 통상적으로 사용되는 배지, 예를 들면 α-MEM 배지, DMEM 배지 등에서 활성화된 간엽줄기세포를 배양함으로써 얻을 수 있다.

본 발명의 의약의 바람직한 구체예에서, 간엽줄기세포 배양물의 유효량은 투여되는 개체의 체중 1kg 당 0.1mg ~ 100mg, 바람직하게는 0.2mg ~ 50mg, 보다 바람직하게는 0.5mg ~ 20mg 이며, 이것을 1 회 또는 여러 번에 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 의약은 보통 주사제, 점적제 등의 비경구 제제의 형태로 사용된다. 비경구 제제에 사용할 수 있는 담체로는 예를 들면, 생리 식염수나 포도당, D- 소르비톨 등을 포함하는 등장액과 같은 수성 담체를 포함한다.

본 발명의 의약은 또한 약학적으로 허용되는 완충제, 안정제, 보존제 기타 성분을 포함하는 조성물이어도 좋다. 약학적으로 허용되는 성분은 당업자에 있어서주지이며, 당업자가 일반적으로 수행 능력의 범위 내에서, 예를 들어 제16판 일본 약전 기타 규격서에 기재된 성분으로 제제의 형태에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 의약의 투여 방법은 특별히 제한되지 않지만, 비경구 제제인 경우, 예를 들어 혈관 내 투여 (바람직하게는 정맥 투여), 복강 내 투여, 장관 내 투여, 피하 투여 등을 들 수 있다. 바람직한 실시예 중 하나에서, 본 발명의 의약은 정맥 내 투여에 의해 생체에 투여된다. 또한, 본 발명의 의약은 치료 및/또는 예방되는 질환에 따라 기타 의약과 병용하여 사용하여도 좋다.

본 발명의 네 번째 측면은 상기 세 번째 형태의 간엽줄기세포 및/또는 그 배양 물의 유효량을 포함하는 의약을 대상으로 투여하는 것을 포함하는 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법에 대한 것이다. 이러한 네번째 측면에서 각 용어의 의미는 상기 세 번째 예에서 설명한 바와 같다.

이하의 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로서, 본 발명의 기술적 범위는 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

< 실시예 1 탯줄 조직 추출물의 조제>

탯줄 조직은 모체에 합병증 없이 제왕 절개 수술을 시행한 인간 증례 (n = 20)의 태반이 나온 직후 탯줄 근부에서 절단하여 채취하였다. 채취한 탯줄 조직을 멸균 용기에 회수하고 얼음에 보관하였다.

탯줄 조직에서 추출의 준비는 다음과 같이 실시하였다. 모든 조작은 클린 벤치 내에서 실시하였다.

1) 생리 식염수로 탯줄 조직에 묻은 혈액과 혈관의 혈액을 최대한 씻어 내었다.

2) 유리 배양 접시에 무혈청 및 항생제 비첨가의 α-MEM 세포 배양용 배지를 10 ~ 30mL 분취하였다.

3) 세척한 탯줄 조직을 습윤 중량 약 5g 단위로 분할하여 배양 접시 1 장당 약 5g의 탯줄 조직을 넣었다.

4) 배양 접시의 배지에서 핀셋과 첨예한 가위를 이용하여 양막초를 장축 방향으로 절개하였다.

5) 또한 장축 방향으로 주행하는 탯줄 동맥, 탯줄 정맥을 핀셋으로 와튼 교질에서 박리하였다.

6) 또한 와튼 교질 및 양막을 핀셋을 이용하여 5mm 정도의 폭으로 장축 방향으로 세절하였다.

7) 5)와 6)에서 얻은 탯줄 혈관, 와튼 교질 및 양막초 모두를 포함하는 배지를 50mL의 샘플 관에 회수하였다.

8) 7)을 4 ℃의 냉장고에서 진탕기 위에 수평으로 놓고 70 ~ 100 rpm의 강도로 72 시간 왕복 진탕시켰다.

9) 72 시간 후 샘플 관을 4 ℃, 2000rpm (300 × g)에서 5 분간 원심 분리하였다.

10) 9)의 상청액을 회수하여 탯줄 조직 추출물 (이하 "WJ"이라고도 함)을 얻었다. 추출물은 멸균 용기에서 4 ℃ 또는 -80 ℃에서 저장하고 이후의 실시예 및 참고예에서 사용하였다. 또한 별도의 표시가 없는 한, 위 2)에서 사용된 α-MEM 배지의 양은 20mL이며, 추출물은 4 ℃에서 보존하였다.

< 실시예 2 탯줄 조직 추출물의 분석>

실시예 1에서 조제된 탯줄 조직 추출물에 대해 다음 분석을 실시하였다.

2-1. 형태 관찰

추출물에 대하여, 형광 현미경 (위상차 관찰 포함) BZ9000 (키엔스) 또는 TE200 (니콘)를 이용한 위상차 현미경 관찰을 실시하였다. 그물코 모양의 세포 외 매트릭스 성분 외에도 제대혈에서 유래한 것으로 여겨지는 적혈구가 발견되었지만 그 외의 증식능을 갖는 세포의 존재는 인정되지 않았다 (도 1A).

또한 다음과 같이 전자 현미경 관찰용 시료를 제작하여 추출물의 전자 현미경 관찰을 실시하였다. 추출물을 2.5 % 글루타르알데히드에서 24 시간 고정하였다. 그 후, 시료를 0.1M PBS로 세척하고 1 % 사산화 오스뮴산 수용액으로 고정 후 에탄올로 탈수하였다. 시료를 프로필렌 옥사이드에 담근 후 에폭시 수지를 이용하여 포매하여 가열 중합하였다. 시료의 초박 절편을 울트라 마이크로톰 MT-X (RMC)를 이용하여 제작하고 전자 염색 후 투과 전자 현미경 H-7650 (히타치 하이 테크놀로지)으로 관찰하였다. 세포 외 매트릭스로 여겨지는 섬유 모양의 물질의 존재가 인정되었다 (도 1B).

2-2. 증식 인자, 히알루론산 및 글루탐산 함량

추출물에 포함된 증식 인자 (IGF-1, EGF, PDGF-AB, FGFb) (16 로트의 추출물을 사용), 히알루론산 (8 로트의 추출물을 사용), L-글루타민산 (19 로트의 추출 물을 사용)의 양을 ELISA로 측정하였다. 측정시 IGF-1은 Human IGF-I Quantikine ELISA Kit (R & D Systems), EGF는 Human EGF Quantikine ELISA Kit (R & D Systems), PDGF-AB는 Human PDGF-AB Quantikine ELISA Kit (R & D Systems) FGFb은 Human FGF basic Quantikine ELISA Kit (R & D Systems), 히알루론산은 Hyaluronan Quantikine ELISA Kit (R & D Systems), L-글루타민산은 F- 키트 L-글루타민산 측정 키트 (J.K.International)를 사용하였다. 또한 히알루론산과 L-글루타민산은 4 ℃의 외에도 -80 ℃에서 보존한 추출물에 대해서도 측정을 실시하였다. L-글루타민산은 10mL, 20mL 또는 30mL 추출 매체 (α-MEM 배지)를 사용하여 제조된 추출물에 대한 측정을 실시하였다.

결과를 도 2에 나타낸다. 추출 매체의 양을 증가시키면 추출물의 L-글루타민산 농도는 약간 감소하였다 (도 2C). 또한 추출물의 저장 온도는 측정 성분의 함유량에 큰 영향을 주지 않았다 (도 2B, C).

2-3. 점도

10mL, 20mL 또는 30mL의 추출 매체 (α-MEM 배지)를 사용하여 조제하고 4 ℃ 및 -80 ℃에서 보존한 추출물 (각각 15 로트)의 점도를 음차형 진동식 점도계 SV-1A ( A & D)로 측정하였다. 결과를 도 3에 나타낸다. L-글루타민산 함유량의 결과와 마찬가지로, 사용한 추출 매체의 양에 의존하여 점도는 감소하며 보존 온도는 점도에 영향을 주지 않았다.

2-4. 엑소솜 함유량

탯줄 조직 추출물에서 Total Exosome Isolation Kit (Invitrogen)을 이용하여 엑소솜 분획을 추출하였다. 엑소솜 분획을 펠렛으로 회수 후 전자 현미경 관찰을 실시하였다.

또한 회수된 펠렛을 완충액으로 추출하여 항 사람 CD9 항체 (시스템 생명 과학) 및 항 인간 HSP70 항체 (시스템 생명 과학)을 이용한 웨스턴 블랏 법으로, CD9 및 HSP70의 발현을 표지로 엑소솜의 존재를 확인하였다. 또한, 항 사람 CD9 항체를 이용한 ELISA (CD9, Exosome, ELISA Kit, ExoELISA 시스템 생명 과학)에 의해 엑소솜의 함유량을 정량하였다.

전자 현미경 관찰상을 도 4A에, 6 로트의 탯줄 조직 추출물에 대한 웨스턴 블롯 결과를 도 4B에, 15 로트의 탯줄 조직 추출물에 대한 ELISA 정량 결과를 도 4C에 나타낸다. 탯줄 조직 추출물은 평균 약 17 × 10⁸ 개/mL의 엑소솜을 포함하였다.

2-5. 배양 시험

탯줄 조직 추출물(6 로트, 4 ℃에서 14 ~ 90 일간 보존한 것)에 FBS를 최종 농도 10 %가 되도록 첨가한 후, 배양 접시에 분주하여 37 ℃, 5 % CO₂ 하에서 96 시간의 배양을 수행하였다. 배양 후 위상차 현미경 관찰상을 도 5에 나타낸다. 추출물 중에 포함된 콜라겐 섬유와 적혈구 등이 관찰되었지만 배양 접시에 부착되어 증식하는 세포는 관찰되지 않았다. 이 점에서 추출물은 탯줄 조직 유래의 증식능을 갖는 세포를 포함하지 않는 것으로 나타났다.

< 실시예 3 탯줄 조직 추출물에 의한 당뇨병 동물 유래 간엽줄기세포의 활성화>

3-1. 간엽줄기세포의 채취

8 주령의 웅성 Sprague Dawley (SD) 랫트 (일본 SLC)에 40mg/kg에 상당하는 양의 STZ를 함유하는 STZ 구연산 완충액 용액 500μL를 꼬리 정맥 내 투여하였다. 랫트의 혈당치는 STZ를 투여한 1 주 후부터 600mg/dL 이상인 고혈당 상태가 되었다. STZ 투여 8 주 후 랫트를 희생시키고, 장관골을 채취하였다. 장관골에서 전체 골수 세포를 회수하고 150cm²의 배양 접시에 분주하여 배양하였다. 배양은 15 % FBS, 1 % 페니실린, 1 % 스트렙토마이신, 100mg/dL 포도당을 함유하는 α-MEM 배지를 이용하여 20 % O₂ 하에 37 ℃에서 실시하였다. 72 시간 후에 배지를 교환하고, 비접착세포를 제거함으로써 골수 유래 간엽줄기세포(DM-MSC, Passage0 (P0))을 접착 세포로 얻었다. 또한 이후 숫자와 함께 사용되는 「Passage」또는 「P」는 세포의 계대 횟수를 의미한다. 예를 들어 P0 세포는 계대 횟수가 제로회, 즉 계대를 하지 않은 초대 배양 세포를 나타내고, P1 세포는 계대 횟수가 1 회 세포를 나타낸다.

대조로서 정상 랫트 유래 간엽줄기세포 (Control-MSC, P0)는 STZ 용액 대신 구연산 완충액을 투여한 것을 제외하고는 DM-MSC와 같은 방법으로 채취하였다.

3-2. 활성화 처리

실시예 1의 추출물을 1.0mg/mL가 되도록 첨가한 α-MEM 배지 (15 % FBS, 1 % 페니실린, 1 % 스트렙토마이신을 함유)에서 P1의 DM-MSC를 20 % O₂ 하 37 ℃에서 48 시간 ~ 96 시간 배양함으로써 활성화 처리를 실시하였다. 배양 접시에 부착한 세포가 85 % ~ 90 % 컨플루언스가 된 시점까지 계대하고 추출물 첨가 배지를 이용하여 마찬가지로 배양하였다. 이와 같이 계대 배양한 P3의 세포를 DM-MSC-WJ (+)하였다.

또한 활성화 처리를 하지 않은 대조의 DM-MSC-WJ (-)는 P1의 DM-MSC를 실시예 1의 추출물을 포함하지 않는 α-MEM 배지 (15 % FBS, 1 % 페니실린 1 % 스트렙토마이신을 함유)을 이용하여 DM-MSC-WJ (+)와 마찬가지로 조제하였다.

또한 대조인, 정상 랫트 유래 Control-MSC는 3-1. 에서 채취한 P1의 Control-MSC를 상술한 DM-MSC-WJ (-)와 마찬가지로 추출물을 포함하지 않는 배지에서 계대 배양하여 제조하였다.

3-3. 활성화 처리된 간엽줄기세포의 평가

상기 3-1. 및 3-2. 에서 얻은 간엽줄기세포에 대해 다음 평가를 실시하였다.

(1) MTT 어세이

각각의 간엽줄기세포를 96 웰 멀티 웰 배양 접시에 분주하여 24 시간 후에 실시예 1의 추출물 (15 로트)를 0.5 ~ 1.0mg/mL가 되도록 첨가한 또는 비첨가의 α-MEM 배지를 이용하여 48 시간 배양하였다. 첨가 개시 시간을 0으로 하여, 24 시간 또는 48 시간 후에 WST8 (Water soluble Tetrazolium salts, DOJINDO)를 각 웰에 첨가하였다. 포르마잔 색소로 환원 효소 활성을 측정하고 세포의 증식률을 분석하였다(도 6). 활성화 처리 후 DM-MSC-WJ (+)은 DM-MSC-WJ (-)에 비해 높은 증식능을 보여 주었다.

(2) 세포 형태

실시예 2와 마찬가지로 위상차 현미경 관찰을 실시하였다. DM-MSC-WJ (-)은 돌기가 적은 평탄한 섬유아세포 모양의 세포였다. 한편 DM-MSC-WJ (+)는 Control-MSC 이상으로 돌기 수가 많고, 또한 세포의 두께가 증가하는 것으로 나타났다 (도 7).

(3) 세포 내 소기관의 형태

실시예 2와 동일하게 전자 현미경 관찰을 실시하였다. DM-MSC-WJ (-)는 미토콘드리아의 수가 Control-MSC에 비해 감소하였다(도 8). 또한 DM-MSC-WJ (-)는 미토콘드리아의 크리스테의 팽창뿐만 아니라, 소포체 스트레스 상태를 나타내는 소포체의 현저한 확장이 인정되었다(도 9). 이러한 형태 이상은 DM-MSC-WJ (+)에서 개선이 인정되었다.

(4) 증식능

세포의 증식능을 Ki67 염색 및 세포 증식, 분화, 생존 촉진 작용 등을 매개하는 인산화 효소인 신호 전달 인자 ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase) 1/2의 활성화로 더 평가하였다.

1) Ki67 염색

각각의 간엽줄기세포를 챔버 슬라이드에 파종한 후, 실시예 1의 추출물 (1 로트)을 1.0mg/mL가 되도록 첨가한 또는 비첨가의 α-MEM 배지를 이용하여 48 시간 배양하였다. 배양 후 4 % 파라포름알데하이드로 고정하고 Cy3로 표지된 항 Ki67 항체 (abcam)을 이용한 Ki67 염색을 실시하였다. 세포 핵은 DAPI (DOJINDO)로 염색하였다. 공 초점 레이저 스캐닝 현미경 시스템 LSM 510 META (ZEISS)을 이용하여 관찰하고 DAPI 양성 세포 및 Ki67 양성 세포의 수를 계산하였다. 결과를 도 10에 나타낸다. 일정 기간 동안 증식한 전체 세포 수에 있어서는, 활성화 처리 후 DM-MSC-WJ (+)는 DM-MSC-WJ (-)에 비해 유의하게 증가하였다. 한편, 증식 활성을 나타낸 Ki67 양성 세포의 비율은 DM-MSC-WJ (-)는 Control-MSC에 비해 유의하게 낮고, 활성화 처리 후 DM-MSC-WJ (+)에서 Control-MSC와 같은 정도로 회복하였다. 즉, 실시예 1의 추출물에 의해 세포가 활성화된 것이 나타났다.

2) ERK1/2의 활성화

각각의 간엽줄기세포를 파종한 후, 실시예 1의 추출물 (7 로트)을 1.0mg/mL가 되도록 첨가한 또는 비첨가의 α-MEM 배지를 이용하여 48 시간 배양하였다. 세포를 회수하여 통상적인 방법에 따라 단백질을 추출하여 웨스턴 블랏법으로 분석하였다. ERK1/2 항 ERK1/2 항체 (SantaCruz), 인산화 ERK1/2 항 p-ERK1/2 항체 (Cell Signaling Technology), β-액틴 항 β-액틴 항체 (Sigma)를 이용하여 검출하였다. 결과를 도 11에 나타낸다. 활성화 처리 후 DM-MSC-WJ (+)는 DM-MSC-WJ (-)에 비해 인산화된 ERK1/2의 발현이 상승한 것으로부터, 활성화 처리에 의해 ERK1/2가 활성화된 것으로 나타났다.

(5) 소포체 스트레스

각각의 간엽줄기세포를 파종한 후, 실시예 1의 추출물 (5 로트)을 1.0mg/mL가 되도록 첨가한 또는 비첨가의 α-MEM 배지를 이용하여 48 시간 배양하였다. 세포를 회수하여 통상적인 방법에 따라 단백질을 추출하여 소포체 스트레스 관련 단백질의 발현을 웨스턴 블롯법으로 분석하였다. BiP (Binding immunoglobulin Protein)는 항 BiP 항체 (Cell Signaling Technology), CHOP (C/EBP-Homologous Protein)는 항 CHOP 항체 (Cell Signaling Technology), Ero1-L (Ero1-Like protein) α는 항 Ero1-Lα 항체 (Cell Signaling Technology), JNK (c-Jun N-terminal Kinase) 1/3은 항 JNK1/3 항체 (SantaCruz)를 이용하여 검출하였다. 결과를 도 12에 나타낸다. 활성화 처리 후 DM-MSC-WJ (+)는 DM-MSC-WJ (-)에 비해 BiP, CHOP 및 JNK1/3의 발현이 감소하고 Ero1-Lα의 발현이 증가하였다. 이 결과는 세포의 전자 현미경 관찰에서 인정받은 결과뿐만 아니라 활성화 처리에 의해 소포체 스트레스가 억제되는 것을 나타내고 있다.

(6) 증식 인자, 분화 관련 인자 및 사이토카인·케모카인의 유전자 발현

각각의 간엽줄기세포에서 mRNA를 추출하였다(시약; TRI reagent, Molecular Research Center, Inc). 표 2에 나타낸 인자의 발현을 실시간 PCR 법 (시약; Power SYBR (등록 상표) Green PCR Master Mix, Applied Biosystems 장비; Applied Biosystems7500 실시간 PCR 시스템)으로 분석하였다. 또한, 각 인자의 발현량을 정규화하기 위한 대조군으로 글리세르 알데히드 3 인산 탈수소 효소 (GAPDH)를 사용하였다.

[표 2]

결과를 도 13에 나타낸다. α-SMA, TNFα, IL-1β, IFNγ, IL-2 및 RANTES의 발현량은 DM-MSC-WJ (-)에서 Control-MSC에 비해 증가하는 반면, DM-MSC-WJ (+)에서는 DM-MSC-WJ (-)에 비해 감소하였다. IGF-1은 반대의 경향을 보였다.

(7) 지방 세포로의 분화능

각각의 간엽줄기세포를 지방 분화 유도 배지 (시약; Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit R & D Systems) 중에서 배양하고 14 일간 분화 유도를 실시하였다. 그 후, 세포를 Oil red O (SIGMA)로 염색하였다. 명 시야 현미경 관찰상을 도 14에 나타낸다. DM-MSC-WJ (+)에서는 DM-MSC-WJ (-)에 비해 세포 수가 증가하고 있지만, 전체 세포에서 차지하는 Oil red O 양성 세포의 비율은 비슷하였다. 따라서 활성화 처리는 간엽줄기세포가 본래 보유하는 지방 분화능에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다.

(8) 세포 표면 항원

DM-MSC-WJ (+)의 표면 항원의 발현을 항 CD90 항체 (Immunotec), 항 CD44 항체 (Immunotec), 항 CD45 항체 (Immunotec), 항 CD43 항체 (Immunotec), 항 CD31 항체 (Immunotec), 항 CD11b 항체 (Immunotec), 항 HLA-DR 항체 (abcam)를 이용하여 유동 세포 계측법으로 분석하였다(장비; BD FACSCalibur flow cytometer). 도 15과 같이 DM-MSC-WJ (+)에서는 간엽줄기세포의 표지자인 CD90를 발현하고 네거티브 마커인 CD44, CD45, CD43, CD31, CD11b, HLA-DR를 발현하지 않았다. 이 점에서 활성화 처리는 간엽줄기세포의 세포 표면 항원에 영향을 주지 않는 것을 시사하였다.

< 실시예 4 탯줄 조직 추출물의 농도 검토 및 혈청 성분 비존재하에서의 활성화 기능의 평가>

I 형 당뇨병 모델인 STZ 투여 랫트 및 II 형 당뇨병 모델인 OLETF 랫트를 이용하여 활성화하는 데 필요한 탯줄 조직 추출물의 농도를 고려하여 총 혈청 성분의 존재가 탯줄 조직 추출물의 활성화능에 미치는 영향을 평가하였다.

4-1. 추출물 첨가 농도 검토

STZ 투여 랫트와 OLETF 랫트(6 월령)에서 실시예 3의 3-1.과 마찬가지로 조제한 간엽줄기세포에 대해 추출물 첨가 농도를 0.1mg/mL ~ 2.0mg/mL의 범위로 설정하고, 3-2.와 마찬가지로 활성화 처리를 실시하였다. MTT 어세이 및 세포 형태 관찰의 결과에서 어느 당뇨병 랫트의 간엽줄기세포에서도 0.5mg/mL 이상의 추출물 첨가 농도에서 충분한 활성화를 확인하였다 (도 16 및 도 17).

4-2. 혈청 성분 비존재하에서의 추출물의 활성화능

FBS를 제외한 α-MEM 배지를 사용하여 4-1.과 마찬가지로 STZ 투여 랫트와 OLETF 랫트의 간엽줄기세포를 배양하여 MTT 어세이 및 세포 형태 관찰을 실시하였다. 결과를 도 18 및 도 19에 나타낸다. FBS 비첨가하고 추출물 첨가 하에서 배양한 세포는 FBS 첨가하고 추출물 첨가 하에서 배양한 세포에 비해 극도로 증식능이 저하되고, 세포 형태에 거의 변화가 없었다.

또한 활성화된 지표의 하나로서 JNK1/3, α-SMA의 단백질 발현의 변화를 평가하였다. 실시예 3의 3-3.과 마찬가지로, 웨스틴 블랏팅법에 의해 분석을 실시하여, JNK1/3은 항 JNK1/3 항체 (SantaCruz)를, α-SMA는 항 α-SMA 항체 (abcam)를 이용하여 검출하였다. 도 18C 및 도 19C에 나타낸 바와 같이, 당뇨병 랫트 간엽줄기세포에서 발현이 항진하였던 JNK1/3 및 α-SMA는 FBS 첨가하고 추출물 첨가 하에서 단백질량의 감소가 관찰되었다. 그러나 FBS 비 첨가 하에서는 단백질 함량의 변화는 인정되지 않거나 인정되더라도 약한 것이었다.

이상의 결과에서 탯줄 조직 추출물은 FBS의 존재 하에서 이상화된 간엽줄기세포를 효율적으로 활성화시키는 것으로 나타났다.

< 실시예 5 당뇨병 환자에서 분리된 간엽줄기세포의 활성화>

II 형 당뇨병 환자(69 세 여성 HbA1c 수치 6.8 %)에서 채취한 골수액에서 실시예 3과 같은 방법으로 간엽줄기세포를 제조하고 이를 이용하여 탯줄 조직 추출물의 첨가 농도 검토 및 혈청 성분 비존재 하에서의 활성화능의 평가를 실시예 4와 동일하게 하였다.

결과를 도 20에 나타낸다. FBS를 첨가한 경우 인간 당뇨병 환자의 간엽줄기세포에서도 당뇨병 랫트의 간엽줄기세포와 마찬가지로 추출물 첨가 농도 0.5mg/mL 이상에서 세포 증식능 항진 및 세포 형태의 변화가 관찰되었지만, FBS 비첨가의 경우 큰 변화는 없었다. 또한 FBS 존재하에 추출물 첨가 농도 0.5mg/mL의 활성화 처리의 총 세포 수의 추이를 도 21에 나타낸다. 추출물을 첨가한 경우 2차 계대 배양시 세포 수가 현저하게 증가하였다.

DV 바이오로직스에서 구입한 I 형 당뇨병 환자 유래의 간엽계 줄기세포에 대해 FBS 존재하에 추출물 첨가 농도 1.0mg/mL의 활성화 처리를 실시한 결과, 세포 증식능 항진 및 세포 형태는 II 형 당뇨병 환자 유래의 간엽줄기세포와 마찬가지로 변화하였다 (도 22).

< 실시예 6 태반 조직 및 난막에서 추출물의 제조 및 추출물에 의한 간엽줄 기세포의 활성화>

태반은 제왕 절개 수술 시행 인간 증례 (n = 2)로부터 적출 후 멸균 백에 넣고 4 ℃에서 이송 및 저장을 실시하였다. 이송 후 24 시간 이내에 조직을 냉동 보존(-80 ℃)한 후 또는 동결하지 않고 그대로 다음과 같이 각 조직을 분리하여 추출물을 제조하였다.

1) 태반을 멸균 백에서 꺼내 식염수로 추가 성분을 가급적 세척하였다.

2) 태반을 평 트레이에 옮기고 난막과 막을 박리한 모체 측 태반 조직으로 분리하였다.

3) 난막 및 모체 측 태반 조직 각각의 습윤 중량을 측정하여 습윤 중량 50g에 100mL의 비율로 무혈청 배지 (α-MEM)를 원뿔 튜브 (225mL)에 넣고 무게에 따라 필요한 갯수를 준비하였다.

4) 난막 및 모체 측 태반 조직들을 각각 가위를 이용하여 모든 5mm 각으로 세절하고 3)에서 준비한 원뿔형 튜브에 넣었다.

5) 4) 원뿔형 튜브를 밀봉하여 입 부분을 파라 필름으로 피복한 후 옆에 눕히고 진탕기에 고정하고 4 ℃에서 8 의 자진(字振)으로, 80rpm에서 72 시간 진탕하였다.

6) 72 시간 후, 5)의 원뿔형 튜브를 4 ℃에서 1000xg, 5 분간 원심 분리하여 상청액을 새로운 원뿔형 튜브에 회수하였다.

7) 6)에서 회수한 상청액을 다시 4 ℃에서 1000xg, 5 분간 원심 분리하여 상청액을 회수하여 적혈구 성분 태반 조직 등의 협잡물을 제거하였다.

8) 7)에서 회수한 상청액을 적당히 분주 후 사용시까지 -80 ℃에서 냉동 보존하였다.

얻어진 태반 조직 추출물 (P) 및 난막 추출물 (PM)의 평균 단백질 농도는 각각 9.405mg/mL, 10.511mg/mL였다. 또한 동일한 도너로부터 얻은 탯줄 조직 추출물의 평균 단백질 농도는 3.074mg/mL였다 (모두 n = 2).

태반 조직 추출물 (P) 및 난막 추출물 (PM) 또한 위 2)의 분리 조작 이전 일체로 한 태반 조직에서 마찬가지로 제조한 추출물 (P + PM)을 이용하여 실시예 2의 2-4.와 마찬가지로 엑소솜 분획을 조제하여 웨스턴 블랏 법으로 HSP70의 발현을 분석하고 어느 추출물에서도 엑소솜가 존재하는 것을 확인하였다 (도 23).

또한, 이들 추출물에 대해, 실시예 2의 2-5.와 동일한 방법으로 배양 시험을 실시하였다. 배양 후 위상차 현미경 관찰을 실시하여 배양 접시에 부착되어 증식하는 세포가 없는 것, 즉 추출물 태반 조직 및 난막 유래의 증식능을 갖는 세포를 포함하지 않는 것을 확인하였다 (도 24)

상기의 태반 조직 및 난막 추출물 대해 STZ 랫트의 간엽계 줄기세포에 대한 활성화능을 평가하였다. 평가는 탯줄 조직 추출물 대신 태반 조직 추출물 또는 난막 추출물을 최종 농도 0.5mg/mL 또는 1.0mg/mL로 사용한 점을 제외하고 실시예 3에 기재된 방법을 이용하여 하였다.

MTT 어세이 결과를 도 25A에 나타낸다. 태반 조직 추출물 및 난막 추출물은 탯줄 조직 추출물에 준하는 STZ 랫트 간엽줄기세포를 증식시켰다. 또한 위상차 현미경 이미지를 도 25B에 나타낸다. 추출물을 가하지 않고 배양한 간엽줄기세포는 돌기가 적고 평탄한 다각형의 섬유아세포 모양의 세포이며, 그 내부에는 스트레스 섬유가 관찰되었다. 태반 조직 추출물 또는 난막 추출물을 첨가하여 배양한 경우 간엽줄기세포의 모양은 방추형으로, 라멜리포디아(lamellipodia)(위족)의 발달을 인정하였다. 또한 스트레스 섬유는 현저히 감소하였다.

활성화된 지표의 하나인 JNK1/3, α-SMA의 단백질 발현의 변화를 평가한 결과를 도 25C에 나타낸다. 탯줄 조직 추출물 (레인 2,3) 태반 조직 추출물 (레인 4,5), 난막 추출물 (레인 6 ~ 8) 중 하나를 이용한 경우도 STZ 랫트 간엽줄기세포에서 발현이 항진하였던 JNK1/3 및 α-SMA 단백질량의 감소가 관찰되었다. 또한 추출시의 형상을 직사각형 모양으로 한 난막 추출물 (레인 7)은, 세절하여 얻은 난막 추출물(레인 8)과 동등한 활성을 나타내었다.

< 실시예 7 탯줄 조직 추출물 성분에 의한 활성화의 검토>

탯줄 조직 추출물에 포함된 성분인 L-글루타민산, 히알루론산, 엑소솜에 대해 간엽줄기세포의 활성화능을 평가하였다.

실시예 3의 3-2. 에서 얻은 DM-MSC-WJ (-)를 표 3의 성분을 첨가한 또는 비 첨가의 α-MEM 배지 (15 % FBS, 1 % 페니실린, 1 % 스트렙토마이신을 함유) 중 20 % O₂ 하 37 ℃에서 48 시간 배양한 후 위상차 현미경 및 전자 현미경으로 관찰하였다.

[표 3]

결과를 도 26 내지 도 28에 나타낸다. L-글루타민산 또는 히알루론산을 첨가한 배지에서 배양한 경우, 이것들을 첨가하지 않은 배지에서 배양한 경우와 비교하여 간엽줄기세포의 증식능 및 세포 형태에 큰 변화는 없었다 (도 26 및 도 27). 또한 히알루론산을 분해시킨 실시예 1의 추출물을 첨가한 배지에서 배양한 경우, 히알루론산을 분해시키지 않은 실시예 1의 추출물을 첨가한 배지에서 배양한 경우와 마찬가지로, 간엽줄기세포는 높은 증식능과 활성화된 세포 형태를 보였다 (도 27). 따라서, L-글루타민산 또는 히알루론산 단독으로는 실시예 1의 추출물과 동등한 간엽줄기세포의 활성화 효과를 나타내지 않으며, 실시예 1의 추출물에서 히알루론산을 분해시키고도 간엽계 줄기세포의 활성화 효과에 영향을 주지 않는 것으로 밝혀졌다.

한편, 엑소솜 분획을 첨가한 배지에서 배양한 DM-MSC-WJ (-)는 증식능의 항진이 인정되고(도 28A) 또한 세포의 돌기의 수와 두께가 증가하여 실시예 1의 추출 물을 첨가한 경우와 유사한 세포 형태를 보였다(도 28B). 또한 엑소솜 분획의 첨가는 소포체의 확장을 억제하였다(도 28C). JNK1/3 및 α-SMA 단백질은 실시예 1의 추출물을 첨가한 경우보다 약하기는 하지만 발현량의 감소가 관찰되었다 (도 28D).

< 실시예 8 태반 조직 추출물 및 난막 추출물의 엑소솜 분획에 의한 활성화>

태반 조직 추출물 및 난막 추출물의 엑소솜 분획에 의한 간엽줄기세포의 활성화에 대하여 실시예 7과 마찬가지로 평가하였다. 결과를 도 29에 나타낸다. 태반 조직 추출물 또는 난막 추출물의 엑소솜 분획에서 활성화된 간엽줄기세포는 증식 능, 세포 형태, JNK1/3 및 α-SMA 발현량의 모두 탯줄 조직 추출물의 엑소솜 분획 의 경우와 비슷한 경향을 보였다. 실시예 7 및 실시예 8의 결과에서 태아 부속물의 추출물에서 엑소솜 분획은 간엽줄기세포의 활성화에 기여하는 성분 중 적어도 하나인 것이 나타났다.

< 실시예 9 활성화된 간엽줄기세포의 당뇨병 신증에 대한 치료 효과 (마우스 모델)>

실시예 1의 추출물에 의해 활성화된 간엽줄기세포 (MSC)에 대해, 당뇨병성 신증 모델 마우스를 이용하여 치료 효과를 평가하였다.

9-1. P1의 세포에만 활성화 처리한 MSC의 치료 효과

사용된 MSC를 다음에 나타낸다.

Control-MSC 및 DM-MSC-WJ (-) : 실시예 3의 3-2. 에서 얻은 P3의 세포를 사용하였다.

DM-MSC-WJ (+) : P1의 DM-MSC 만 추출물 첨가 배지에서 배양한 뒤, 그 후 추출물을 포함하지 않는 배지를 이용한 것을 제외하고는 실시예 3의 3-2.와 마찬가지로 계대 배양한 P3 세포를 이용하였다(도 30A).

시험은 도 30B에 나타내는 시험 계획에 따라 실시하였다. 8 주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 150mg/kg에 상당하는 양의 STZ를 함유하는 STZ 구연산 완충액 용액 200μL를 복강 내 투여하고 STZ 유도 I 형 당뇨병 모델 마우스 (STZ 마우스)를 제작하였다. 정상군의 마우스는 STZ 용액 대신 구연산 완충액을 투여하였다. 투여 4 주 후 STZ 마우스를 4 군으로 나누어 STZ-Control-MSC 군은 Control-MSC를 1x10⁴ 개/g (체중) 포함 인산 완충액을 250μL, STZ-DM-MSC 군은 DM-MSC -WJ (-)를 1x10⁴ 개/g (체중) 포함 인산 완충액을 250μL, STZ-DM-MSC-WJ 군은 DM-MSC-WJ (+)를 1x10⁴ 개/g (체중) 포함 인산 완충액을 250μL, STZ-Vehicle 군은 비히클로 인산 완충액을 250μL 꼬리 정맥에서 단회 투여하였다. MSC 또는 비히클의 투여 후 4 주 간격으로 체중 측정, 채혈, 채뇨를 실시하였다. 8 주째에 마우스를 해부하고 신장을 채취하였다. 혈당은 혈당 측정 기기 안토 센스 III (HORIBA Medical)을 이용하여 신장 기능의 지표인 소변의 알부민과 크레아티닌을 각각 면역 비탁법, 효소법에 의해 측정하였다. 채취한 신장은 가늘고 작은 혈관 장애 등 장기 장애의 평가에 사용하였다.

MSC 또는 비히클 투여 시작시의 체중을 1로 했을 경우의 체중 변화율을 도 31에 나타낸다. STZ-Vehicle 군에서는 정상군에 비해 약간의 체중 감소가 관찰되었다. 한편, 당뇨병 마우스 Control-MSC를 투여 한 STZ-Control-MSC 군에서는 체중 변화는 정상군과 비슷한 수준까지 회복하였다. 또한 STZ-DM-MSC 군에서는 STZ-Vehicle 군에 비해 체중이 감소한 반면, STZ-DM-MSC-WJ 군에서는 정상군과 STZ-Control-MSC 군과 동일한 정도까지 체중 감소가 억제 되었다.

혈당치의 결과를 도 32에 나타낸다. STZ-Vehicle 군은 정상군에 비해 혈당이 상승했지만, STZ-Control-MSC 군에서는 혈당 상승이 억제되었다. 또한 STZ-DM-MSC 군은 STZ-Vehicle 군보다 혈당이 높아졌지만, STZ-DM-MSC-WJ 군은 STZ-DM-MSC 군보다 혈당 상승이 완만하였다.

소변 중 알부민/크레아티닌 비(도 33)는 STZ-Vehicle 군에서 가장 높았고 STZ-Control-MSC 군에서는 시간에 따른 감소가 관찰되었다. 또한 STZ-DM-MSC-WJ 군에서는 STZ-DM-MSC 군보다 값이 감소하였다.

9-2. P1 ~ P3의 세포에 활성화 처리를 수행한 MSC의 치료 효과

실시예 3의 3-2. 에서 얻은 P3의 Control-MSC DM-MSC-WJ (-) 및 DM-MSC-WJ (+) (활성화된 프로토콜을 도 34A에 표시)를 이용하여 상기 9-1.과 마찬가지로 치료 효과를 평가하였다 (도 34B). 결과를 도 35 내지 도 37에 나타낸다.

체중 변화, 혈당, 소변 중 알부민/크레아티닌 비율도 9-1.과 동일한, 또는 보다 명확한 경향을 보여 주었다. 또한 STZ-Vehicle 군 및 STZ-DM-MSC 군에서 투여 후 8 주 동안 소변 중 알부민/크레아티닌 비의 대폭적인 감소가 관찰되었으나, 이 두 그룹의 마우스가 악액질의 결과로 저단백혈증을 일으키고, 그 결과 소변에서 단백질이 배설되지 않았기 때문으로 생각된다.

< 실시예 10 활성화된 간엽줄기세포의 당뇨병 신증에 대한 치료 효과 ( 랫트 모델)>

실시예 1의 추출물에 의해 활성화된 MSC 대한 당뇨병 신증 모델 랫트를 이용하여 치료 효과를 평가하였다. 다음에 별도로 명시되지 않은 한, 실시예 3의 3-1. 및 3-2. , 및 실시예 9에 기재된 방법을 이용하였다.

10-1. I 형 당뇨병에 의한 당뇨병성 신증에 대한 치료 효과

웅성 STZ 유도 I 형 당뇨병 랫트의 골수 세포를 추출물을 포함하지 않는 배지에서 2 회, 추출물을 포함하지 않는 배지 또는 추출물 0.5mg/mL 첨가 배지에서 1 회 계대 배양하여 얻은 P3 의 MSC (각각 DM-MSC-WJ (-) 및 DM-MSC-WJ (+))를 다음의 시험에 사용하였다 (도 38A).

시험은 도 38B에 나타내는 시험 계획에 따라 실시하였다. 8 주령의 수컷 SD 랫트에 55mg/kg에 상당하는 양의 STZ를 함유하는 STZ 구연산 완충액 용액 500μL를 꼬리 정맥에서 정맥 내 투여하고 STZ 유도 I 형 당뇨병 신증 모델 랫트를 제작하였다. 투여 4 주 후 랫트를 3 그룹으로 나누어 STZ-DM-MSC 군은 DM-MSC-WJ (-)를 1x10⁴ 개/g (체중) 포함 α-MEM 배지 (혈청 성분, 항생제를 포함하지 않음)를 1000μL, STZ-DM-MSC-WJ 군은 DM-MSC-WJ (+)를 1x10⁴ 개/g (체중) 포함 α-MEM 배지를 1000μL, STZ-Vehicle 군은 비히클로 α-MEM 배지를 1000μL 꼬리 정맥에서 단회 투여하였다. MSC 또는 비히클의 투여 후 0, 1, 4, 7 주에 채뇨를 실시하여, 소변 중 알부민과 크레아티닌을 측정하였다.

소변 중 알부민/크레아티닌 비율의 변화를 도 39에 나타낸다. 소변 중 알부민/크레아티닌 비는 STZ-DM-MSC 군에서는 STZ-Vehicle 군과 마찬가지로 추이했지만, STZ-DM-MSC-WJ 군에서는 저하가 인정되어 신장 기능의 개선을 시사하였다.

10-2. II 형 당뇨병에 의한 당뇨병성 신증에 대한 치료 효과

6 월령 수컷 OLETF II 형 당뇨병 모델 랫트의 골수 세포를 추출 물질을 포함하지 않는 배지에서 2 회, 추출물을 포함하지 않는 배지 또는 추출물 0.5mg/mL 첨가 배지에서 1 회 계대 배양하여 P3 의 MSC (각각 OLETF-DM-MSC-WJ (-)와 OLETF-DM-MSC-WJ (+))을 얻었다. 또한 컨트롤로 정상 야생주 랫트의 골수 세포를 추출물을 포함하지 않는 배지에서 3 회 계대 배양하여 P3의 MSC (Control-MSC)를 얻었다 (도 40A). 이 MSC를 다음의 시험에 사용하였다.

시험은 도 40B에 나타내는 시험 계획에 따라 실시하였다. 6.5 월령 수컷 OLETF 랫트를 4 군으로 나누어 OLETF-Control-MSC 군은 Control-MSC를 1x10⁴ 개/g (체중) 포함 α-MEM 배지를 1000μL, OLETF-DM-MSC 군은 OLETF -DM-MSC-WJ (-)를 1x10⁴ 개/g (체중) 포함 α-MEM 배지를 1000μL, OLETF-DM-MSC-WJ 군은 OLETF-DM-MSC-WJ (+)를 1x10⁴ 개/g (체중) 포함 α-MEM 배지를 1000μL, OLETF-Vehicle 군은 비히클로 α-MEM 배지를 1000μL 꼬리 정맥에서 단회 투여하였다. MSC 또는 비히클의 투여 후 1, 3, 6 주째에 체중 측정, 채혈, 채뇨를 실시하여, 혈당 및 소변 중 알부민과 크레아티닌을 측정하였다.

소변 알부민/크레아티닌 비율의 변화를 도 41에 나타낸다. 위의 시험과 마찬가지로 OLETF-Control-MSC 군 및 OLETF-DM-MSC-WJ 군에서 소변 중 알부민/크레아티닌 비율의 저하, 즉 신장 기능의 개선이 인정되었다.

실시예 9 및 10의 결과에서, 정상 동물 유래의 Control-MSC는 당뇨병과 당뇨병 신증의 치료 효과가 있는 반면, 당뇨병 동물 유래의 DM-MSC는 치료 효과가 약하거나 오히려 이러한 질환을 악화하는 효과를 가지며, DM-MSC는 탯줄 조직 추출물을 이용한 활성화 처리에 의해 치료 효과를 복구하는 것으로 나타났다.

< 실시예 11 탯줄 조직 추출물에 의한 류마티스 관절염 모델 동물 유래 간엽 줄기세포의 활성화 및 활성화된 간엽줄기세포의 류마티스 관절염에 대한 치료 효과 >

11-1. 간엽줄기세포의 채취 및 활성화 처리

7 ~ 9 주령의 자성 Lewis 랫트 (일본 SLC)를 이용하여 류마티스 관절염 (RA) 쥐를 제작하였다. 관절염의 감작에는 완전 프로인트 보조제 (결핵 사균 20mg/mL, Chondrex) 및 소 II 형 콜라겐 용액 (II 형 콜라겐 2mg/mL, Chondrex)을 각각 등량 혼합하여 에멀젼을 제조하고, 한 마리 당 결핵 사균 2mg 및 II 형 콜라겐 0.2mg을 포함 에멀젼을 능선부에 투여하였다. 또한 같은 농도의 에멀젼을 7 ~ 10 일 간격으로 4 ~ 5 회 계속 투여하여 관절염을 발병시켰다.

관절염의 발병은 좌우 족부의 종창, 즉 족부의 용적 변화에 따라 판정하였다. 정밀 전자만 (정확도 0.01g, A & D)에 물을 넣은 투명한 플라스틱 용기를 설치하여 랫트의 다리 관절 위에 걸린 마커의 위치까지 뒷다리 족부를 물에 넣고 정지시켜 무게 mg (질량 m, 중력 가속도 g) (N)을 측정하였다. 무게 mg 및 족부에 걸릴 부력 F (N) 동일하다면, F = mg = ρVg이기 때문에 물의 밀도 ρρ = 0.9999 (g/cm³)로 족부 부피 (cm³)를 산출하였다. 좌우 족부 체적의 합계 4.5cm³ 이상을 관절염 증세로 하였다.

실시예 3의 3-1. 및 3-2. 에 기재된 방법을 이용하여 에멀젼 첫 투여 6 주 ~ 9 주 후에 관절염 발병 RA 랫트 또는 정상 랫트에서 골수 세포를 준비하고 추출물을 포함하지 않는 배지에서 2 회 이후에 추출물을 포함하지 않는 배지 또는 실시예 1의 추출물 1.0mg/mL를 포함하는 배지에서 1 회 계대 배양하였다 (도 43A). 얻어진 P3의 MSC (RA-MSC 및 RA-MSC-WJ)를 다음의 시험에 사용하였다. 또한 7 주령의 정상 야생 주 랫트의 골수 세포를 추출물을 포함하지 않는 배지에서 3 회 계대 배양하여 얻은 P3의 MSC (Control-MSC)도 함께 사용하였다.

11-2. 간엽줄기세포의 평가

RA 랫트 간엽줄기세포의 이상화를 확인하기 위해 11-1. 에서 RA 랫트 또는 정상 쥐에서 채취한 골수 세포를 별도 10cm² 배양 접시에 1x10⁶ 개 파종하고 P0로 배양하였다. 10 일 후에 각각의 배양 접시를 메탄올 고정하고 Wright-Giemsa 염색을 실시하여 직경 2mm 이상의 콜로니 수를 측정하였다. 콜로니 형성 수는 Control-MSC (7 주령)가 26 개, Control-MSC (12 주령)가 20 개, RA-MSC (14 주령)이 3 개이며, RA-MSC에서 콜로니 형성능의 저하를 인정하였다.

다음으로, 본 발명의 추출물에 의한 간엽줄기세포의 활성화를 확인하기 위해 파종 후 48 시간 및 72 시간 (추출물 첨가 후 24 시간 및 48 시간)의 P3의 RA-MSC, RA-MSC- WJ의 증식능을 실시예 3의 3-3. 에 기재된 방법을 이용하여 MTT 어세이에 의해 평가하였다. 추출물 첨가 후 24 시간 및 48 시간 중에서도 RA-MSC-WJ는 RA-MSC보다 증식능이 높았다 (도 42A).

또한 마찬가지로 제조한 P3의 MSC 대해 추출물 첨가 후 48 시간에서 위상차 현미경에 의한 형태 관찰을 실시하였다. RA-MSC는 Control-MSC보다 세포의 형상이 널리 평평하고 세포 수가 적었다. RA-MSC-WJ에서는 Control-MSC님께 세포의 형상이이 좁아 방추형의 MSC를 많이 인정하였다 (도 42B).

또한 P2 세포를 150cm² 배양 접시에 2.7 ~ 3x10⁶ 개에 파종한 점 이외는 마찬가지로 제조한 P3의 MSC 대해 추출물 첨가 후 48 시간 트립신 처리하여 세포를 박리시키고 각각의 총 세포 수를 측정하였다. 총 세포 수는 Control-MSC가 4.1 × 10⁶ 개, RA-MSC가 2.6 × 10⁶ 개, RA-MSC-WJ가 6.4 × 10⁶ 개이며, RA-MSC는 Control-MSC보다 적고, RA-MSC-WJ는 RA-MSC보다 많았다.

11-3. 류마티스 관절염에 대한 치료 효과

11-1.과 마찬가지로 제작한 에멀젼 첫회 투여 30 일 후에 관절염 발병 RA 랫트 12 마리를 4 군 (n = 3)으로 나누어 RA-Vehicle 군 Control-MSC 군, RA-MSC 군, RA-MSC-WJ 군으로 처리하였다 (도 43B). P3로 배양한 Control-MSC, RA-MSC, RA-MSC-WJ는 1x10⁴ 개/g (체중)을 1mL의 α-MEM 배지에 현탁 꼬리 정맥에서 투여하였다. Vehicle 군은 α-MEM 배지만 1mL 꼬리 정맥 투여하였다. 처치 후 6 일에는 에멀젼을 처음 감작의 반을 투여하였다. 처리 후 0 일을 기준으로, 처리 후 3 일, 5 일, 11 일의 족부 종창을 측정하였다. 또한 다리 관절부 (상단, 후면, 족근부), 족지부(Metatarsophalangeal : MTP 관절, Proximal Inter-phalangeal; PIP 관절)의 육안 관찰하고, 종창 및 변형이 인정된 경우 각각 0.1를 가산함으로써 그 합계 점수로 관절 스코어를 산출하였다. 또한 Rat C-Reactive Protein ELISA Kit (eBioscience)에 의해 혈청 CRP 수치를 측정하였다.

도 44에 족부 체적의 변화를 나타낸다. 족부 종창은 처치 후 3 일에서 Control-MSC 군 및 RA-MSC-WJ 군에서 감소하고, 처치 후 5 일, 11 일에도 낮은 값을 유지하였다. 한편, RA-MSC 군 및 RA-Vehicle 군에서는 족부 종창은 변화를 인정하지 않았다. RA-MSC-WJ 군에서는 처치 후 0 일에 비해 3 일, 5 일, 11 일에서 유의하게 종창이 감소하였다. 관절염 스코어에서도 처치 후에 11 일에서 Control-MSC 군 및 RA-MSC-WJ 군에서 RA-MSC 군에 비해 유의하게 관절염은 감소하였다 (도 45 참조). CRP 값은 처치 후 11 일에서 Control-MSC 군 및 RA-MSC-WJ 군에서 감소하였다 (도 46).

이상의 결과에서 정상 동물 유래의 Control-MSC는 류마티스 관절염의 치료 효과가 있는 반면, 류마티스 관절염 동물 유래의 RA-MSC는 치료 효과가 없는 것, RA-MSC는 탯줄 조직 추출물을 이용한 활성화 처리에 의해 치료 효과를 회복하는 것으로 나타났다.

< 참고예 1 간엽줄기세포 배양 상청액의 당뇨병 신증에 대한 치료 효과>

실시예 3의 3-2. 에서 얻은 P3의 Control-MSC 및 이 MSC의 배양 상청액 (MSC-CM)에 대해 당뇨병성 신증에 대한 치료 효과를 평가하였다. MSC-CM은 P3의 배양액을 원심 분리하여 얻은 상청액을 사용하였다.

참고예 1-1. STZ 유도 I 형 당뇨병 모델 마우스의 평가

시험은 도 47에 나타내는 시험 계획에 따라 실시하였다. 실시예 9의 9-1.과 마찬가지로 제작한 STZ 투여 마우스를 3 군으로 나누어 STZ-Control-MSC 군은 Control-MSC를 1x10⁴ 개/g (체중) 포함 인산 완충액 250μL를 4 주 간격으로 2 회 투여하고 STZ -MSC-CM 군은 2mg/kg (체중)의 MSC-CM을 1 일 1 회, 주 5 일 투여하였다. 또한 STZ-Vehicle 군은 비히클로 인산 완충액 250μL를 4 주 간격으로 2 회 또는 1 일 1 회, 주 5 일간 투여하였다. 실시예 9의 9-1.과 마찬가지로 8 주 치료 시험을 실시하여 각종 측정을 실시하였다. 또한 채취한 신장 조직 절편을 제작하고, PAS 염색 및 Azan 염색을 실시하였다.

소변 중 알부민/크레아티닌 비율의 결과를 도 48에 나타낸다. STZ-MSC-CM 군에서는 정상군과 비슷한 수준으로 소변 중 알부민/크레아티닌 비율이 감소하였다. 또한 신장 조직 절편 염색 현미경 관찰상을 도 49에 나타낸다. STZ-Vehicle 군은 정상군에 비해 사구체 혈관 사이 영역의 확대, 세포 침윤 및 세뇨관 간질의 염증 세포 침윤과 세뇨관의 PAS 염색 양성의 변성된 세뇨관을 인정하였다. 또한 사구체 주위 및 세뇨관 간질에 Azan 염색 양성인 섬유화를 인정하였다. 이러한 변화는 STZ-Control-MSC 군 및 STZ-MSC-CM 군에서 억제되었다.

참고예 1- 2. 고지방식이 유도 II 형 당뇨병 모델 마우스의 평가

시험은 도 50에 나타내는 시험 계획에 따라 실시하였다. 8 주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 60 % 라드를 함유하는 고지방식이 (High-Fat Diet 32 일본 클레어)를 급이하고 당뇨병을 유도하였다. 급이 시작 후 28 주 후, 제작한 고지방식이 유도 II 형 당뇨병 모델 마우스를 3 군으로 나누어 HFD-Control-MSC 군은 Control-MSC를 1x10⁴ 개/g (체중) 포함 인산 완충액 250μL를 2 주 간격으로 4 회 투여하고 HFD-MSC-CM 군은 2mg/kg (체중)의 MSC-CM을 1 일 1 회, 주 5 일 투여하였다. 또한 HFD-Vehicle 군은 비히클로 인산 완충액 250μμL를 2 주 간격으로 4 회 또는 1 일 1 회, 주 5 일간 투여하였다. 8 주간의 치료 시험을 실시하여 실시예 9의 9-1.와 마찬가지로 각종 측정을 실시하였다.

소변 중 알부민/크레아티닌 비율의 결과를 도 51에 나타낸다. MSC-CM은 Control-MSC와 마찬가지로 소변 중 알부민/크레아티닌 비율을 감소시켰다. 또한 신장 조직 절편 염색 현미경 관찰상을 도 52에 나타낸다. HFD-Vehicle 군은 정상군에 비해 사구체 혈관 사이 기질의 증생과 PAS 염색 양성 미만성 물질의 침착, 사구체 모세 혈관 벽과 기저막의 비후, 수출입 동맥 및 세동맥벽 유리 모양 변화를 인정하였다. 또한, 근위 세뇨관 상피의 책자연의 변성(불균일화)을 인정하였다. 이러한 변화는 HFD-Control-MSC 군과 HFD-MSC-CM 군에서 억제되었다.

상기 참고예 1-1. 및 1-2. 에서 MSC-CM은 Control-MSC와 같은 당뇨병성 신증 치료 효과가 있음이 시사되었다.

본 발명에 의하면, 질환 치료 효과가 상실 또는 감소, 또는 오히려 질환 악화 효과가 있는 비정상적인 간엽줄기세포를 활성화시킬 수 있다. 활성화된 간엽줄기세포는 각종 질환의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Sapporo Medical University <120> Mesenchymal stem cell activators, activated mesenchymal stem cells and methods for producing them <130> P13018WO <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 atgggtgtga accacgagaa a 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 ggatacattg ggggtaggaa 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 tacttcaaca agcccacagg c 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 tcagcggagc acagtacatc tc 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 tccctggaga agagctacga ac 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 ccaatgaaag atggctggaa g 21 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 tgtacctggg aggagtcttc ca 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 cagtcgcttc acagagcaat g 21 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 ctgacagacc ccaaaagatt aagg 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 cttgtcgaga tgctgctgtg a 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 gccaaggcac actcattgaa a 21 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 cttttgccag ttcctccaga tatc 24 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 13 caggccacag aattgaaaca tc 22 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 ccagcgtctt ccaagtgaaa g 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 tatggctcgg acaccactcc 20 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 16 gacaaagacg actgcaaggt tg 22

Claims (16)

1. 포유동물의 태아 부속물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 비정상적인 간엽줄기세포의 활성화제로서,
   상기 태아 부속물이 탯줄 조직, 태반 조직 또는 난막이고,
   상기 비정상적인 간엽줄기세포는 정상적인 간엽줄기세포에 비해 감소된 치료 효과를 가지거나, 치료 효과를 가지지 않거나, 질환을 악화시키는 효과를 갖는 간엽줄기세포이며,
   상기 비정상적인 간엽줄기세포의 활성화제가 상기 비정상적인 간엽줄기세포의 치료 효과를 개선시키는 것인
   비정상적인 간엽줄기세포의 활성화제.
2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 상기 포유동물 유래의 증식능을 갖는 세포를 포함하지 않는 비정상적인 간엽줄기세포의 활성화제.
3. 제1항에 있어서, 상기 비정상적인 간엽줄기세포가 골수 유래 간엽줄기세포인 비정상적인 간엽줄기세포의 활성화제.
4. 제1항에 있어서, 상기 비정상적인 간엽줄기세포가 질환 대상에서 분리된 것인 비정상적인 간엽줄기세포의 활성화제.
5. 제4항에 있어서, 상기 질환이 당뇨병, 자가면역질환, 만성 염증성 질환, 알레르기성 질환이나 골다공증인 비정상적인 간엽줄기세포의 활성화제.
6. 제4항에 있어서, 상기 질환이 당뇨병이나 관절염인 비정상적인 간엽줄기세포의 활성화제.
7. 대상에서 분리된 비정상적인 간엽줄기세포를 포유동물의 태아 부속물의 추출물을 유효성분으로 함유하는 활성화제로 처리하는 공정을 포함하고:
   상기 태아 부속물이 탯줄 조직, 태반 조직 또는 난막이고,
   상기 비정상적인 간엽줄기세포는 정상적인 간엽줄기세포에 비해 감소된 치료 효과를 가지거나, 치료 효과를 가지지 않거나, 질환을 악화시키는 효과를 갖는 간엽줄기세포이며,
   상기 비정상적인 간엽줄기세포의 활성화제가 상기 비정상적인 간엽줄기세포의 치료 효과를 개선시키는 것인
   활성화된 간엽줄기세포의 제조 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 비정상적인 간엽줄기세포가 골수 유래 간엽줄기세포인 간엽줄기세포의 제조 방법.
9. 제7항에 있어서, 상기 대상이 질환 대상인 간엽줄기세포의 제조 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 질환이 당뇨병, 자가면역질환, 만성 염증성 질환, 알레르기성 질환이나 골다공증인 간엽줄기세포의 제조 방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 질환이 당뇨병이나 관절염인 간엽줄기세포의 제조 방법.
12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조된 질환 치료 및/또는 예방용의 간엽줄기세포.
13. 제12항에 있어서, 상기 질환이 당뇨병이나 그 합병증, 면역 질환, 만성 염증성 질환, 알레르기성 질환이나 골다공증인 간엽줄기세포.
14. 제12항에 있어서, 상기 질환이 당뇨병 신증, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경 장애 또는 류마티스 관절염인 간엽줄기세포.
15. 제12항에 기재된 간엽줄기세포 및/또는 그의 배양물을을 포함하는 질환 치료 및/또는 예방용 의약.
16. 삭제

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