KR100825864B1

KR100825864B1 - 피부 유래 줄기세포를 함유하는 신경질환 치료용세포치료제

Info

Publication number: KR100825864B1
Application number: KR1020060091798A
Authority: KR
Inventors: 강수경
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2006-09-21
Filing date: 2006-09-21
Publication date: 2008-04-28
Also published as: US20100022003A1; WO2008035908A1; EP2063902A4; EP2063902A1; KR20080026786A; JP2010503727A

Abstract

본 발명은 피부 유래 줄기세포를 함유하는 신경질환 치료용 세포치료제에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 피부조직으로부터 분리된 피부 유래 줄기세포를 함유하는 신경질환 치료용 세포치료제 및 상기 피부 유래 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 신경질환 치료용 세포치료제는, 신경세포 손상에 의하여 일어나는 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측면경화증 및 뇌졸증, 국소빈혈 및 척수손상에 의한 신경질환 등의 치료에 효과적이며, 자가세포의 이식이 가능하여 부작용을 최소화시킬 수 있다.

줄기세포, 피부 유래 줄기세포, 신경세포, 척추손상, 신경질환

Description

피부 유래 줄기세포를 함유하는 신경질환 치료용 세포치료제{Therapeutic Cell Medicine Comprising Skin Tissue Derived Stem Cell}

도 1은 본 발명에 따른 피부 유래 줄기세포의 계대배양에 따른 생장시간 변화를 그래프로 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 피부 유래 줄기세포의 분화능을 확인한 것이다. A는 지방세포로의 분화를 확인한 것이고, B는 Von Kosa 염색을 통하여 골세포로의 분화를 확인한 것이고, C는 사프라닌 O 염색을 통하여 연골세포로의 분화를 확인한 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 피부 유래 줄기세포의 신경세포로의 분화능을 면역화학적 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 피부 유래 줄기세포의 신경세포로의 분화능을 RT-PCR 방법으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 본 발명에 따른 피부 유래 줄기세포를 이식한 척추손상 마우스 모델의 회복 정도를 나타낸 것으로, A는 BBB 스코어를 나타낸 것이고, B는 상처부위의 부피변화를 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명에 따른 피부 유래 줄기세포를 이식한 척추손상 마우스 모델 의 조직을 관찰한 사진으로, A는 전자현미경으로 관찰한 사진이며, B는 H & E 염색한 조직을 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명에 따른 피부 유래 줄기세포를 이식한 척추손상 마우스 모델의 조직을 면역화학적인 방법으로 확인한 것이다.

발명의 분야

본 발명은 피부 유래 줄기세포(SPCs)를 함유하는 신경질환 치료용 세포치료제에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 피부조직으로 부터 분리된 피부 유래 줄기세포를 함유하는 신경질환 치료용 세포치료제 및 상기 피부 유래 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.

발명의 배경

줄기세포는 자가 생장할 수 있는 능력과 장기적인 생존력 및 여러 종류의 세포나 조직으로 분화할 수 있는 잠재력을 가지고 있는 세포이다. 배 발생 단계에서 얻어지는 전분화능(pluripotent)을 가지는 배아세포(ES cells)는 분화잠재력은 무한하지만 기형종을 유발할 수 있다는 위험성과 윤리적인 문제뿐만 아니라, 세포치료제로서의 활용할 때 발생되는 면역학적 문제 등 앞으로 극복해야될 문제들이 산 재하여 있다. 다행히 배아줄기 세포의 성능에 견줄 수 있는 성체 줄기 세포가 인체의 여러 장기에서 발견되었으며, 중배엽성 기원의 골수, 지방, 제대혈 등에서 중간 엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)등이 분리되어 활발하게 보고되고 있다. 그러나, 중간엽 줄기세포의 경우 신경세포로의 전분화 효율이 상당히 낮은 큰 단점이 있다.

현재 국내외적으로 줄기세포를 이용한 난치병에 대한 세포치료 연구가 활발하게 진행되고 있는데 줄기세포가 파킨슨이나 알츠하이머와 같은 뇌질환과 척추손상, 간경화, 당뇨, 심근경색증 등등 광범위하게 연구 결과들이 보고되고 있는 실정이다.

척추 손상 질환은 일종의 미엘린 파괴성 중추신경계 질환 중의 하나로 분류된다. 손상된 미엘린은 자가 올리고 전구세포계열 또는 자가 신경 줄기세포의 증식, 분화, 이동 등으로 회복이 가능하다. 그러나 이러한 자발적 과정은 손상된 부위를 충분히 회복하기에는 부족하여, 완전한 회복을 위하여는 올리고 전구세포 또는 분화된 미엘린 생성 신경 전구세포를 외부에서 주입하는 세포치료과정이 필수적이다. 신경세포 또는 신경전구 세포의 증식과 분화 이동의 조절은 체외에서의 세포배양 방법의 최적화과정에 의해서 효율적으로 수행될 수 있다. 한편 이의 치료효율을 극대화시키기 위해 특정 싸이토카인을 과발현시킬 수 있는 벡터를 개발 및 이용하여 유전자 및 세포치료 방법을 함께 적용하는 방법도 있다.

피부 유래 줄기세포는 신경세포와 함께 외배엽성 기간세포에 속하며, 조직 손상을 입은 당사자의 피부 조직으로부터 세포 채취가 가능하고 분리 배양법이 까 다롭지 않은 장점이 있다. 뿐만 아니라 피부 유래로부터 분리한 줄기세포는 상당량의 세포수를 배양과정을 통해서 안정적으로 증식시켜 얻을 수 있고 배양한 기질세포는 중배엽성 조직뿐만 아니라 간, 신경 세포 등의 외내배엽성 조직으로도 분화가 가능한 것으로 알려져 있다. 이러한 피부줄기 세포의 무한한 분화가능성을 잘 활용하여 이를 이용한 질환의 치료에의 접근을 위해 체외 배양 또는 분화 조건을 적절하게 조절하고 더 나아가 확립한 실험동물 질환 모델을 대상으로 세포 및 유전자를 동반한 세포 치료방법을 구축하는데 중요한 재료로 활용할 수 있을 것이나, 지금까지 피부 줄기세포를 이용하여 질환치료에 사용한 예는 피부줄기세포를 분리하여 인공피부를 제조하는 것이 보고되어 있으나(대한민국특허공개 10-2004-0065027), 신경세포로의 분화를 유도하여 신경질환치료에 적용한 예는 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기 줄기세포를 이용하여, 신경질환을 치료하고자 예의 노력한 결과, 피부유래 줄기세포를 마우스 척수손상 모델에 이식할 경우, 높은 신경세포 분화능을 나타내어, 효율적으로 척수손상이 회복되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 신경세포로의 전분화 효율이 높은 피부 유래의 줄기세포를 함유하는 신경질환 치료용 세포치료제를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 피부 유래의 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피부조직으로부터 분리된 피부 유래 줄기세포를 함유하는 신경질환 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 피부조직으로부터 피하지방을 제거하고, 피부 유래 줄기세포를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 피부 유래 줄기세포를 B27, BDNF 및 bFGF로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 분화촉진 인자를 함유하는 신경분화 배지에서 배양하여 신경세포로 분화시키는 단계를 포함하는 피부 유래 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 분화된 신경세포는 Nestin, GFAP, TuJ, MAP2, NSE, NeuN, BDNF, SDF1, NGF, GDNF, bFGF, EGF, FGFR2 및 MBP로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 피부 유래 줄기세포에서 분화된 신경세포 및 상기 신경세포를 함유하는 신경질환 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 신경질환은 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측면경화증 및 뇌졸증, 국소빈혈 및 척수손상에 의한 신경질환으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서, 신경세포 또는 신경전구세포로의 분화는 신경세포 분화표 식 인자인 Nestin, GFAP, TuJ, MAP2, NSE, NeuN, BDNF, SDF1, NGF, GDNF, bFGF, EGF, FGFR2 또는 MBP를 코딩하는 유전자의 발현 또는 상기 단백질의 생산에 의해 확인하였다.

본 발명에서 "피부 유래 줄기세포(skin tissue-derived progenitor cell; SPC)"는 동물의 피부에서 분리한 자가 피부 유래 줄기세포로 지방세포, 조골세포, 연골세포, 신경세포 등의 다양한 조직의 세포로 분화가 가능한 세포를 의미한다.

본 발명에서 "올리고 세포"는 신경세포 (성상세포, 신경, 올리고세포)에 속하는 하나의 하위 그룹으로 향후 신경세포를 둘러싸고 있는 구조의 미엘린을 형성하는 전구세포를 의미하며, 미엘린 층이 파괴되어 운동신경세포가 사멸되는 것에 의하여 발생하는 질환인 척추질환의 경우, 올리고세포를 이용한 미엘린의 재형성 유도가 중요하다.

본 발명에서는 마우스 유래의 피부 유래 줄기세포를 (mouse skin tissue-derived progenitor cells, mSPCs)를 분리 배양하여 배양된 피부 유래 줄기세포의 배양 및 증식 특성을 규명하고, 외배엽성 신경세포로의 효율적인 분화조건을 확립하였다.

확립된 분화조건 및 배양 방법으로 올리고 전구 세포로 효율적으로 전 분화시킨 피부줄기세포 유래 신경전구 세포를 이용한 미엘린 파괴성 질환의 치료 효과를 평가하기 위해 척추 손상 질환 모델을 수립하였다.

상기 확립된 척추 손상 마우스 모델에 피부 유래 줄기세포를 이식하는 방법은 통상적으로 사용되는 세포 이식 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 정맥주 입과 척추 내 직접 주입하는 방법을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 정맥주사하는 방법을 사용할 수 있다.

척추 질환 생쥐 모델에서의 세포 이식 및 치료결과에 따르면 세포이식 후 상당히 증상의 호전 효과가 나타났고 이식한 상당수의 세포들이 성숙한 신경세포(신경세포 및 미엘린)로 분화된 결과를 나타내었다. 뿐만 아니라, 이식한 피부 유래 줄기세포의 또 다른 역할로 주변에 존재하는 척추 유래의 신경줄기세포의 손상부위로의 이동에 아주 중요한 역할을 하는 물질을 분비하여 이들의 이동, 분화 및 나아가 이들의 신경 세포적 기능을 가지는 성숙세포로 효율적으로 유도하여 척추 손상 질환의 기능회복에도 상당한 기여를 하는 것으로 판단된다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

이하, 실시예에서는 피부에서 분리한 줄기세포를 직접 척추손상 마우스 모델에 이식하여, 치료효과를 확인하였으나, 피부 유래 줄기세포를 신경세포 또는 신경전구세포로 분화시킨 후, 척추손상 마우스 모델에 이식하여도 유사한 효과를 얻을 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

실시예 1: 자가 피부 조직으로부터 줄기세포의 분리 및 배양

마우스에서 피부 유래 줄기세포를 분리하기 위하여, 마우스(6주령 ICR, 효창 사이언스, 한국)의 복부 및 등에서 피부조직을 적출하였다. 적출된 피부조직에서 피하지방을 제거한 후, 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 세척하였다.

피하지방이 제거된 피부조직에 0.075%의 콜라겐분해효소를 첨가하여 37℃, 30분간 반응시켜 피부조직에서 세포를 분리시켰다.

반응이 끝난 세포액에 10% FBS(GIBCO, 미국)을 포함하는 DMEM (α-Dulbecco's Modified Eagle's Medium)를 첨가하여 원심 분리하여, 기질세포층을 10% 혈청(우 태아혈청)을 포함하는 DMEM에 부유시켜 일차배양 세포가 70-80%의 밀도에 이를 때까지, 48~72 시간 동안 배양한 후, 0.025% 트립신 용액을 이용하여 계대 배양하여, 피부조직 유래 줄기세포를 수득하였다. 하기의 실시예 들에는 일정하게 5~6 계대한 피부줄기세포를 사용하였다.

도 1은 계대 배양 횟수에 따른 PD (passage doubling) 기간의 변화를 나타낸 그래프이다. 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 방법으로 분리한 피부 유래 줄기세포는 상당량의 세포수를 배양과정을 통해서 안정적으로 증식시켜 얻을 수 있다는 것을 알 수 있다.

실시예 2: 피부조직 유래 줄기 세포의 중 배엽성 세포로의 분화 능 확인

실시예 1에서 수득된 피부 유래 줄기세포가 지방세포, 골세포, 연골세포 등의 중배엽성 세포로 분화할 수 있는 지를 확인하기 위하여, 상기 피부 유래 줄기세 포를 조직 특이적으로 분화를 유도하는 분화 배지에서 배양하여 분화를 유도하였다.

지방세포로의 분화능을 확인하기 위하여는 지방분화 인자인 인슐린(insulin, Sigma, 미국)과 덱사메타존(dexamethasone, Sigma, 미국)이 함유된 지방 분화 배지에서 배양하여 분화를 유도시켰고, 골세포로의 분화능을 확인하기 위하여는, 뼈분화 인자인 글리세로포스페이트(glycerophosphate, Sigma, 미국), 아스코빅산(ascorbic acid, Sigma, 미국), 덱사메타존(dexamethasone, Sigma, 미국) 이 함유된 골 분화 배지에서 배양하여 분화를 유도시켰으며, 연골세포로의 분화능을 확인하기 위하여는 연골분화 인자인 인슐린(insulin), TGF-beta (Sigma, 미국), 아스코빅산 (Sigma, 미국) 이 함유된 연골 분화 배지에서 배양하여 분화를 유도하였다.

지방세포의 분화정도는 지방세포에서 생성된 지방 방울을 현미경에서 관찰하여 확인하였다 (도 2의 A). 골세포의 분화정도는 Von Kosa 염색에 의하여, Ca+ 미네랄이 침착된 bone nodule이 생성되는 것을 통하여 확인하였고(도 2의 B), 연골세포의 분화정도는 사프라닌 O로 염색된 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans)의 존재를 통하여 확인하였다 (도 2의 C).

그 결과, 실시예 1에서 분리한 피부 유래 줄기세포는 중배엽성 조직인 지방, 연골 및 뼈로의 분화능을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 피부조직 유래 줄기 세포의 in vitro 신경세포 분화 유도

실시예 1에서 수득된 피부 유래 줄기세포를 미엘린 파괴성 질환인 척추 손상 을 치료를 위한 세포치료제로 사용하기 위하여, 피부 유래 줄기세포의 신경세포로의 분화능을 확인하였다.

상기 피부 유래 줄기세포를 Neurobasal(NB) 배지(GIBCO, 미국)에 B27 supplement(GIBCO)가 함유되어 있는 신경세포 배지에, 10㎍/ml의 BDNF(Brain-Derived Neurotrophic Factor-뇌 유래 신경성장인자, Sigma, 미국) 및 20㎍/ml의 bFGF(basic fibroblast growth factor, Sigma, 미국) 성장인자를 처리하여, 4일간 부유 배양하여 신경구(Neurosphere) 형성을 유도하였다. 상기 형성된 신경구를 기질이 코팅된 배양접시에 스프레딩하고, 올리고 세포로의 분화효율을 확인하였다.

올리고 세포로의 분화효율의 평가는 실시간 RT-PCR 및 특이적인 항체를 이용한 면역화학적 방법을 이용하여, 특이적으로 발현되는 전사체 및 단백질을 정성, 정량하여 상대적 효율을 분석하여 최적화하였다 (도 3 및 도 4).

전사체 분석에 활용한 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다.

유전자	Forward Sequence (5'-3')	Reverse Sequence (5'-3')
GAPDH	CATGACCACAGTCCATGCCATCACT (서열번호 1)	TGAGGTCCACCACCCTGTTGCTGTA (서열번호 2)
Nestin	AACTGGCACACCTCAAGATGT (서열번호 3)	TCAAGGGTATTAGGCAAGGGG (서열번호 4)
GFAP	TCCGCCAAGCCAAGCACGAAG (서열번호 5)	CATCCCGCATCTCCACAGTCT (서열번호 6)
Tuj	CCTTTGGACACCTATTCAGG (서열번호 7)	GTGAGTGTGTCAGCTGGAAG (서열번호 8)
BDNF	ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGT (서열번호 9)	TCTTCCCCTTTTAATGGTCAGTGTAC (서열번호 10)
SDF-1	GTCCTCTTGCTGTCCAGCTC (서열번호 11)	GAAGGGCACAGTTTGGAGTG (서열번호 12)
NGF	CCAAGGACGCAGCTTTCTAT (서열번호 13)	CTCCGGTGAGTCCTGTTGAA (서열번호 14)
GDNF	ATTTTATTCAAGCCACCATTA (서열번호 15)	GATACATCCACACCGTTTAGC (서열번호 16)
bFGF	AACGGCGGCTTCTTCCTG (서열번호 17)	AGCAGACATTGGAAGAAACA (서열번호 18)
EGF	ACCAGACGATGATGGGACAG (서열번호 19)	GCCAGCACACACTCATCTAT (서열번호 20)
FGFR2	GAGGCTGTCTCAGAGCCTGT (서열번호 21)	CTTGCCGCTGTCCACTTATC (서열번호 22)
MAP2	TCAGACTTCCACCGAGCAG (서열번호 23)	AGGGGAAAGATCATGGCCC (서열번호 24)

분화된 신경 세포의 면역화학적 분석을 위한 일차항체로 TuJ (Sigma, 미국), GFAP (DAKO, 미국)를 사용하였다 .

그 결과, 피부유래 줄기세포에서 유도된 신경구가, 신경세포 특이 유전자를 발현하는 것을 확인하였으며, 피부 유래 줄기세포가 신경 전구세포와 유사하게 신경구를 형성할 뿐만 아니라 면역화학적 방법에 의해 TUJ, MAP2ab를 생체내, 외에서 다량 발현함을 확인할 수 있어 신경세포로의 분화 효율이 높음을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, MBP를 발현하는 미엘린으로 분화, 성숙할 수 있는 능력을 가지는 것을 척수 질환 조직의 면역조직화학적 분석 결과 알 수 있었다.

실시예 4: 마우스를 이용한 척추 손상 동물 모델의 확립

실시예 3에서 제작한 피부 유래 줄기세포에서 분화유도된 신경세포가 미엘린 및 운동신경 파괴성 질환에서 신경조직을 회복시킬 수 있는 지를 확인하기 위하여, 척추 손상 마우스 모델을 확립하였다.

X-ray 조사 및 EB 주사 방법을 이용한 척추 손상 질환 동물 모델 확립은 자발적인 손상회복 가능성을 최소화할 수 있는 방법으로 평가가 되고 있다.

운동신경 및 미엘린 파괴성 질환을 유발한 마우스 (성체 암컷 ICR, 6 주령)를 대상으로 하여 X-선 조사 후, 에티듐브로마이드(etidium bromide, EB)를 투여하는 방법에 따라 수행하였으며(Kocsis et al., J. Neuroscience, 1996), 40 Grays의 X선을 조사하고 3일 후, 척수 T10 부위를 절개하여 0.3 mg/ml 농도의 EB 0.5μl를 직접 주사하거나, T10 부위에 대해 물리적 손상을 유도하여 미엘린 및 운동신경 세포의 파괴를 유도하였다.

운동신경이 파괴된 마우스의 체중 감소량과 여러 항목의 임상 점수를 비롯한 B.B.B 스코어 (표 2)를 매일 체크를 하여 미엘린 파괴 정도를 간접적으로 평가하였다.

손상 유도 후에 나타나는 과도한 면역반응에 의한 이식세포의 생존률 저하를 피하기 위해 상기 확립된 마우스 모델은 척추 손상 유도 후 일률적으로 3일이 지난 후에 줄기세포를 이식하였다.

실시예 5: 척추손상 마우스 모델로의 피부 유래 줄기세포의 이식

실시예 4에서 확립된 척추손상 마우스 모델에 실시예 1에서 분리한 피부 유래 줄기세포를 이식하기 위하여, 형광 추적마커(CFDA)로 상기 피부 유래 줄기세포를 표지하였다.

상기 형광 마커로 표지된 피부 유래 줄기세포를 상기 척추손상 마우스 모델의 꼬리 정맥으로 이식하였다. 이식은 세포를 25-게이지 주사 바늘을 이용하여 꼬리 정맥에 주사하여 이식하였다 (1x 10⁶개세포). 세포이식 후, 치료 효율을 검정하기 위해 일정한 기간 동안 마우스 모델의 체중과 임상 점수 또는 BBB 스코어(0~20 점)를 매일 일정 시간에 측정하여 정상 마우스 및 이식하지 않은 마우스 모델과 상호 비교 분석하여 기능회복 추이를 확인하였다. 그 결과, 피부 유래 줄기세포를 이식한 마우스 모델의 경우는 이식 4주 후, BBB 점수의 20점 만점에 17점에 해당되는 상당히 호전된 결과를 나타내어, 마비 상태였던 하반신이 뒷다리를 이용하여 자유자제로 보행이 가능한 상태로 호전되었다. 이와는 대조적으로, 마우스 모델에 완충액을 주입한 음성 대조군의 경우는 질환의 호전 상태가 전혀 나타나지 않음을 알 수 있었다 (도 5의 A).

뿐만 아니라, 피부 유래 줄기세포를 이식한 마우스 모델의 경우는 이식 후 척추 환부의 크기가 대조군에 비해 크게 감소되었음을 알 수 있었다 (도 5의 B).

실시예 6: 피부유래 줄기세포를 이식한 마우스 모델의 조직학적 분석

피부유래 줄기세포를 이식한 마우스의 뇌, 척추 및 그외 기관을 조직학적으로 분석하였다.

피부유래 줄기세포를 이식한 마우스 모델, 세포를 이식하지 않은 마우스 모델 및 정상 마우스를 대상으로 뇌, 척추 및 그외 기관을 4% 파라포름 알데하이드 로 고정시킨 후, 적출하여 일정한 크기(5μm)로 자른 조직을 전자 현미경 하에서 비교, 관찰하였다. 한편 상기 조직을 파라핀으로 고정하고, 일정하게 잘라 헤마토실린-에오신으로 염색을 하고 미엘린 파괴 정도 및 완화 또는 회복 정도를 관찰하였다 (도 6).

또한, 이식된 세포의 분화정도를 관찰하기 위하여, 특정 성숙한 세포 유형에 따른 특이적인 항체인 GFAP (DAKO, 미국), MAP2ab (Sigma, 미국), MBP (Sigma, 미국) 및 CFDA (Molecular Probe, 미국)를 이용하여 면역화학적 방법으로 표지한 후, 공초점 주사현미경를 이용하여 분석하였다 (도 7).

이와 아울러 특정 신경조직 관련 특이적인 단백질의 발현을 양적으로 비교 정량하기 위해 트리졸을 이용하여 조직의 전체 RNA을 추출, 정제한 후 실시간 RT-PCR 을 수행하여 비교 분석하였다.

그 결과, 꼬리 정맥을 통해서 이식한 세포는 아주 빠른 시간 내 혈류를 타고 주입 세포의 45 % 가량의 아주 높은 비율로 척추 손상 부위로 이동하였고, 이외 다른 기관 즉, 뇌, 폐, 신장, 간 등의 기관에서도 발견되었다. 척추 손상 부위로 이동한 이식 세포의 대부분은 손상 부위의 내강 내에 위치하여 scar 형성에 기여를 하였고, 손상부위에서 가까운 주변 조직에서도 발견되었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 손상 주변 조직에서의 이식 세포의 신경세포 또는 올리고 세포로의 분화능이 비교적 높게 나타났다. 이러한 결과로 미루어 보아 피부 유래 줄기세포의 신경세포로의 전분화에 따른 효과뿐만 아니라, 피부 유래 줄기세포가 가지는 성장인자의 분비 등에 의한 간접적인 기능에 의해서도 척추 손상 회복에 유리한 영향을 주는 것으로 판단된다.

본 발명은 신경세포로의 전분화 효율이 높은 피부 유래의 줄기세포를 함유하는 신경질환 치료용 세포치료제를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 신경질환 치료용 세포치료제는, 신경세포 손상에 의하여 일어나는 파킨슨씨병, 알츠하이머 병, 헌팅톤병, 근위축성 측면경화증 및 뇌졸증, 국소빈혈 및 척수손상에 의한 신경질환 등의 치료에 효과적이며, 자가세포의 이식이 가능하여 부작용을 최소화시킬 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(a) 피부조직으로부터 피하지방을 제거하고, 콜라겐분해효소액를 첨가하여 피부조직에서 세포를 분리시키는 단계;

(b) 상기 콜라겐 분해효소액을 원심분리하여 기질 세포층을 수득하는 단계; 및

(c) 상기 기질세포층을 48~72시간 배양한 후, 트립신 용액을 이용하여 계대배양하여 피부유래 줄기세포를 수득하는 단계를 거쳐 수득되고, 지방세포, 골세포, 연골세포 및 신경세포 또는 신경전구세포로의 분화능을 가지는 피부유래 줄기세포를 함유하는 신경질환 치료용 세포치료제.
삭제
다음 단계를 포함하는 피부 유래 줄기세포를 신경세포 또는 신경전구세포로 분화시키는 방법:

(a) 피부조직으로부터 피하지방을 제거하고, 피부 유래 줄기세포를 수득하는 단계;

(b) 상기 분리된 피부 유래 줄기세포를 분화촉진 인자 BDNF(brain-derived neurotrophic factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 함유하는 신경분화 배지에서 배양하여 신경구를 형성시키는 단계; 및

(c) 상기 신경구를 배양하여 신경세포 또는 신경전구세포로 분화시키는 단계.
제3항에 있어서, 분화된 신경세포 또는 신경전구세포는 Nestin, GFAP(glial fibrillary acid protein), TuJ(neuron-specific classIII β-tublin), TrkB(tropomyosin-related kinase B), MAP2(microtubule-associated protein 2), NSE(neuron specific enolase), NeuN(neuronal nuclei), BDNF(brain-derived neurotrophic factor), SDF1(stromal cell-derived factor 1), NGF(nerve growth factor), GDNF(glial cell line-derived neurotrophic factor), bFGF(basic fibroblast growth factor), EGF(epidermal growth factor), FGFR2(fibroblast growth factor receptor 2) 및 MBP(maltose binding protein)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
제3항의 방법으로 피부 유래 줄기세포에서 분화된 신경세포 또는 신경전구세포.
제5항의 신경세포 또는 신경전구세포를 함유하는 신경질환 치료용 세포치료제.
제6항에 있어서, 신경질환은 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측면경화증 및 뇌졸증, 국소빈혈 및 척수손상에 의한 신경질환으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 세포치료제.