KR101753630B1

KR101753630B1 - 줄기세포의 분화 촉진 및 세포의 증식 촉진용 조성물과 그 제조방법

Info

Publication number: KR101753630B1
Application number: KR1020160100842A
Authority: KR
Inventors: 이원종; 최은욱; 김형기; 강홍석
Original assignee: (주)프로스테믹스
Priority date: 2015-08-12
Filing date: 2016-08-08
Publication date: 2017-07-04
Also published as: KR20170020244A

Abstract

본 발명은 성체 줄기세포가 다양한 체세포로 분화할 수 있도록 그 분화를 촉진하고, 세포의 증식을 촉진하는 조성물과 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 조성물은 줄기세포가 다양한 체세포로 분화되는 효율을 높일 수 있으며, 더 나아가서는 성체 줄기세포를 모발의 성장에 중요한 역할을 하는 모유두 세포로의 분화를 촉진하고, 모낭 형성을 촉진하여 탈모 방지 및 모발 생장에 뛰어난 효과가 있으며, 줄기세포와 모유두 세포를 이용하므로 피부에 대한 자극이나 부작용이 없고 안전하다. 또한, 본 발명에서 제공하는 조성물은 지방유래 줄기세포를 목적하는 체세포로 분화될 수 있도록 유도 및 촉진할 수 있을 뿐만 아니라, 각각 목적하는 질병의 치료 용도로 활용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 제공하는 조성물은 세포의 증식을 효과적으로 촉진 시킬 수 있다.

Description

줄기세포의 분화 촉진 및 세포의 증식 촉진용 조성물과 그 제조방법{COMPOSITION FOR PROMOTING THE DIFFERENTIATION OF STEM CELL AND PROLIFERATION OF CELL AND THE METHOD OF MANUFACTURING THE SAME}

본 발명은 성체 줄기세포가 다양한 체세포로 분화할 수 있도록 그 분화를 촉진하고, 세포의 증식을 촉진하는 조성물과 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

줄기세포(Stem cell)란, 각종 세포로 분화(differentiation)할 수 있는 줄기성(stemness)을 가지고 있는 미분화 세포들을 총칭하며, 줄기세포는 특정 분화 인자 및/또는 환경에 의해 특정 세포로의 분화가 진행된다. 줄기세포의 종류에는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 배아생식세포(embryonic germ cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 암줄기세포(cancer stem cell) 등이 있다. 최근에는 다양한 세포로 분화가 가능한 줄기세포를 이용하여 손상된 조직의 재생, 당뇨병, 백혈병, 파킨슨병, 심장병, 척수외상 등을 비롯한 다양한 질환을 치료하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있고, 이에 따라 줄기세포를 특정 세포로 분화시키고자 하는 연구들이 시도되고 있다. 또한, 분화가 끝난 세포를 역분화 과정을 통해 줄기세포로 만든 역분화줄기세포(induced Pluripotent Stem Cell, iPS) 등도 세포분화에 사용되고 있다.

성체줄기세포로는 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells) 및 신경줄기세포(neural stem cells) 등이 존재한다고 알려져 있다. 특히 중간엽 줄기세포의 한 종류로 지방으로부터 유래된 줄기세포(Adipose-derived stem cells: ASCs)는 효소 절단(digestion) 방법 등에 의하여 지방조직(adipose tissue) 으로 부터 분리하여 얻을 수 있으며, 다양한 세포로의 분화능 및 조직 재생산(regeneration) 등의 잠재력을 갖는다고 알려져있다(Journal of Nippon Medical School Vol. 76 (2009) No. 2 P 56-66).

일반적으로 줄기세포의 분화를 유도하는 방법으로는 분화 촉진제를 이용하는 방법들이 사용되고 있다. 대표적으로는 레티온산(retionic acid)을 이용하여 배아줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법(Dev. Dyn. (2007) 236: 3255-3266), 액티빈 A(activin A)를 이용하여 간세포로 분화시키는 방법(Nat. Biotechnol. (2005) 23: 1534-1541), 아스코르브산(ascorbic acid)을 이용하여 심근세포로 분화시키는 방법(Circulation (2003) 107: 1912-1916) 등이 있다.

그러나 종래의 기술은 사이토카인(cytokine)과 같은 고가의 시약을 사용하기 때문에 비용이 많이 든다는 단점뿐 아니라, 낮은 분화율 및 특정 세포로의 분화만을 촉진하여 다양한 세포로의 분화에 적용이 어렵다는 등의 한계점을 가지고 있다. 따라서 줄기세포의 분화 효율을 높이고, 다양한 세포의 분화에 광범위하게 적용 가능한 일반화된 방법을 개발할 필요가 있다.

이와 같이 줄기세포를 다양한 분야에서 효과적으로 이용하기 위해서는, 줄기세포를 다양한 세포로 분화시킬 수 있는 저렴하고 용이한 분화 유도 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 일 목적은 성체 줄기세포를 다양한 체세포로 분화시킬 수 있는 성체 줄기세포와 분화된 세포의 혼합 배양액을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 상이한 두 종류의 세포로, 상기한 성체 줄기세포와 분화된 세포를 안정적으로 혼합 배양할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 성체 줄기세포를 다양한 체세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있는 엑소좀을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기한 혼합 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 발명자들은 성체 줄기세포와 분화된 세포의 혼합 배양액 또는 그로부터 분리한 엑소좀을 사용하여 성체 줄기세포를 배양하는 경우 성체 줄기세포를 혼합 배양 시 사용된 분화된 세포로의 분화를 촉진 시키며, 줄기세포 또는 분화된 세포 등 다양한 세포의 증식 또한 촉진 시키는 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

단, 본 발명에서 상기 엑소좀은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미한다. 엑소좀의 직경은 대략 30 ~ 1,000 nm이며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다. 엑소좀의 대표적인 발현 마커는 HSP70, CD63 및 CD9에 해당한다. 본 발명의 일 구체예에서 상기 엑소좀은 세포주, 세포의 배양액 또는 생체 시료로부터 유래한 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포와 분화된 세포를 혼합 배양하여 얻어진 혼합 배양액을 제공한다.

본 발명에서 상기 성체 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 성체 세포로부터 유래된 중복성(multipotency)을 갖는 미분화 세포를 말하며, 예를 들어, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 지방(즉, 지방조직 또는 지방세포), 제대혈, 제대의 바르톤 젤리(Wharton's jelly) 등의 다양한 성체 세포로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 명세서에 있어서, 상기 "성체 줄기세포"는 성체 세포로부터 유래된 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 포함한다.

상기 성체 줄기세포로서, 통상적으로 흔히 시행되는 지방흡입 과정에서 폐기되는 지방조직을 사용하여 얻을 수 있어, 침습적 시술이 필요 없는 지방 유래 줄기세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 지방 유래 줄기세포는 인간을 포함한 포유동물, 바람직하게는 인간의 지방조직 또는 지방세포로부터 공지의 방법(예를 들어, 국제특허공개 제WO2000/53795호 및 제WO2005/042730호)에 개시된 바에 따라, 지방흡입(liposuction) 및 침강, 콜라게나제(collagenase) 등의 효소처리, 원심분리에 의한 적혈구 등의 부유 세포 제거 등의 과정을 통하여 얻을 수 있다. 상기 지방조직은 피하, 그물막, 내장, 유방 생식선 또는 그 밖의 지방 조직 부위로부터 유래된 갈색 또는 백색 조직을 포함하며, 통상의 지방흡입술로부터 손쉽게 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 분화된 세포는 분화 과정이 진행되어 일정 형태 및 기능을 가지게 된 세포를 말하며, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 체세포(somatic cell) 또는 전구세포(progenitor cell)일 수 있다. 또한, 바람직하게는 인간에게서 유래한 세포로, 예를 들어 내배엽 유래의 세포인 폐세포, 췌장세포, 간세포, 혈관세포 등이거나, 중배엽 유래인 모유두 세포, 진피 세포, 근육 세포, 골아세포, 파골 세포, 연골 세포, 근육 세포, 혈액 세포, 심근 세포, 신장 세포 등이거나, 외배엽 유래인 신경 세포, 성상교세포, 신경절 세포, 외피 세포, 각질 세포 등일 수 있고, 바람직하게는 폐세포, 연골세포, 신경세포, 모유두 세포 또는 성상교세포(astrocyte)중 어느 하나 일 수 있다.

단, 본 발명에서 용어 "분화"란 세포가 분열하여 증식하며 전체 개체가 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 말한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변하는 과정을 말한다. 예를 들어, 배아줄기세포와 같은 전능성 줄기세포는 외배엽, 중배엽, 및 내배엽 세포로 변하는 과정도 분화이며, 좁게는 조혈모세포가 적혈구, 백혈구, 혈소판 등으로 변하는 과정도 분화에 해당 된다.

또한, 본 발명에서 용어 "체세포"란 생식세포를 제외한 동식물을 구성하는 분화가 완결된 모든 세포를 뜻하며 염색체가 2n을 유지한다는 특성이 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포와 분화된 세포를 혼합 배양하여 혼합 배양액을 제조하는 단계를 포함하는, 혼합 배양액의 제조방법을 제공한다.

일반적으로 두 종류의 세포를 혼합 배양하는 경우 배양 환경을 제어하기 어려워 일관적인 결과물을 얻기 어려웠다. 하지만, 본 발명에서는 성체 줄기세포와 분화된 세포를 특정한 조건하에서 혼합 배양함으로써 배양 환경을 제어하여 반복적인 실시에도 불구하고 줄기세포의 분화를 촉진할 수 있는 혼합 배양액을 계속하여 생산할 수 있도록 한다.

본 발명의 바람직한 한 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양은 배양 플레이트 상에 성체 줄기세포 및 분화된 세포를 접종 및 배양하는 단계를 포함하는 직접 혼합 배양법에 의할 수 있다.

보다 바람직하게는, 성체 줄기세포를 배양 플레이트 상에 배양하고, 상기 성체 줄기세포 상에 분화된 세포를 접종하여 배양할 수 있다. 여기서 상기 분화된 세포를 성체 줄기세포 상에 단층 배양할 수 있으나, 분화된 세포를 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형의 형태로 응집시키며 배양한 뒤 이를 상기 배양 플레이트에 접종하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 바람직한 다른 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양은 배양 플레이트 상에 성체 줄기세포를 배양하는 단계; 및 고분자 필름상에 분화된 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있고, 추가로 상기 고분자 필름상에 배양된 분화된 세포를 배양 플레이트에 접촉시켜 혼합 배양하는 단계를 포함하는 간접 혼합 배양법에 의할 수 있다.

본 발명에서는 상기 고분자 필름상에 분화된 세포를 배양할 때 구형 (spheroid)으로 배양하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 분화된 세포를 직경이 50 ~ 150 ㎛ 크기인 구형의 형태로 응집시키며 배양한 뒤 이를 배양 플레이트에 접종할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 고분자 필름의 종류는 특별히 한정하지는 않지만, 예를 들어, 폴리염화비닐(Poly vinyl chloride) 필름, 폴리에틸렌테레프탈레이트(polyethylene terephthalate) 필름 또는 염화비닐리덴수지(Polyvinylidene Chloride) 필름을 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 상기 혼합 배양액으로부터 분리된 엑소좀을 제공한다.

본 발명에서 상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것이 성체 줄기세포의 분화 유도 효과를 더욱 향상시킬 수 있어 바람직하다.

보다 바람직하게는, 일 구체예에서 상기 엑소좀은 30 ~ 100 nm 의 크기를 갖는 것이 분화를 타겟팅하는 유전자의 발현을 조절하는 역할의 miRNA와 mRNA를 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 효과적으로 촉진 시킬 수 있다.

보다 바람직하게는, 다른 구체예에서 상기 엑소좀은 100 ~ 1,000 nm 의 크기를 갖는 것이 줄기세포의 분화에 직접적으로 관여하는 단백질 또는 지질 등을 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 더욱 효과적으로 촉진 시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 성체 줄기세포와 분화된 세포를 혼합 배양하여 혼합 배양액을 제조하는 단계; 및 상기 혼합 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는, 엑소좀의 제조방법을 제공한다.

상기 혼합 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법은 특별히 한정하지는 않지만, 예를 들어 염석 방법(salting out)에 의하는 것이 줄기세포의 분화를 촉진하는 엑소좀을 효과적으로 분리할 수 있어 바람직하다.

여기서 상기 염석 방법으로는 1 M 소디움아세테이트를 최종 농도가 0.05 ~ 0.2 M이 될 때까지 혼합 배양액에 첨가하고, 전하량 차이에 의해 엑소좀을 응축시킨 뒤 4,000 ~ 6,000 g로 5 ~ 15 분 동안, 바람직하게는 약 4,000g로 약 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거한 뒤 엑소좀을 침강시켜 분리할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 엑소좀은 30 ~ 1,000 nm의 크기를 갖는 것을 분리하는 것이 성체 줄기세포의 분화 유도 효과를 더욱 향상시킬 수 있어 바람직하다.

보다 바람직하게는 다른 구체예에서 상기 엑소좀은 100 ~ 1,000 nm 의 크기를 갖는 것이 줄기세포의 분화에 직접적으로 관여하는 단백질 또는 지질 등을 포함하고 있어 줄기세포의 분화를 더욱 효과적으로 촉진 시킬 수 있다.

본 발명에서는 상기한 바와 같이 성체 줄기세포와 분화된 세포를 혼합 배양함으로써 세포의 증식을 촉진 시킬 수 있고, 혹은 성체 줄기세포를 분화된 세포로의 분화를 촉진 시킬 수 있으며, 예를 들어 이에 제한되지 아니하지만 성체 줄기세포와 모유두 세포를 혼합 배양하는 경우 성체 줄기세포를 모유두 세포로, 성체 줄기세포와 성상교세포를 혼합 배양하는 경우 성체 줄기세포를 성상교세포로, 성체 줄기세포와 연골세포를 혼합 배양하는 경우 성체 줄기세포를 연골 세포로, 성체 줄기세포와 폐 상피세포를 혼합 배양하는 경우 성체 줄기세포를 폐 상피세포로, 성체줄기세포와 신경세포를 혼합 배양하는 경우 성체 줄기세포를 신경세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다.

본 발명에서 제공하는 혼합 배양액과 그로부터 분리한 엑소좀은 성체 줄기세포를 다양한 체세포로의 분화를 유도할 수 있고, 줄기세포 또는 분화된 세포 등 다양한 세포의 증식 또한 촉진할 수 있다.

또한, 본 발명에서 제공하는 상기 혼합 배양액과 엑소좀을 제조하는 방법은 상이한 종류의 세포들을 안정적으로 혼합 배양할 수 있도록 하여 동일한 특성을 갖는 배양액을 반복적으로 생산할 수 있도록 함으로써 대량생산이 가능하도록 한다.

또한, 본 발명에서 성체 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액과 그로부터 분리한 엑소좀은 모발의 성장에 중요한 역할을 하는 모유두 세포로의 분화를 촉진하고, 모낭 형성을 촉진하여 탈모 방지 및 모발 생장에 뛰어난 효과가 있으며, 성체 줄기세포와 모유두 세포를 이용하므로 피부에 대한 자극이나 부작용이 없고 안전하다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 모유두 세포를 지방 유래 줄기세포의 단일 배양액(ASC), 모유두 세포 배양액(DPC), 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액(co-CM) 및 PC 배양액(PC)에서 각각 배양한 뒤 배양된 세포 수를 비교하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 2 및 도 3은 본 발명의 실시예 2에서 지방 유래 줄기세포에 지방 유래 줄기세포의 단일 배양액(ASC), ASC 배양액과 조정 배지의 혼합물(ASC CM), 모유두 세포 배양액과 조정 배지의 혼합물(DPC CM), 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액(co-CM) 각각을 처리하여 상기 줄기세포의 분화를 유도한 후, RT-PCR 분석을 통하여 모유두 세포의 마커 유전자의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 실시예 2에서 지방 유래 줄기세포에 지방 유래 줄기세포의 단일 배양액(ASC), ASC 배양액과 조정 배지의 혼합물(ASC CM), 모유두 세포 배양액과 조정 배지의 혼합물(DPC CM), 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액(co-CM) 각각을 처리하여 상기 줄기세포의 분화를 유도한 후, 웨스턴 블럿 분석을 통해 모유두 세포와 모낭 형성 관련 마커의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양 모식도를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예 3에서 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포를 4가지 방법으로 혼합 배양한 후 그로부터 추출한 배양액으로 지방 유래 줄기세포를 배양하고, RT-PCR을 통해 모유두 세포의 마커 유전자인 BMP2, BAMBI, APOE, GLI-1, Ptc-1 발현량을 나타낸 것이다.
도 8 및 도 9는 본 발명의 실시예 4에서 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포를 직접 또는 간접 혼합 배양한 후 그로부터 추출한 엑소좀을 배지에 포함시켜 지방 유래 줄기세포를 배양하고, RT-PCR 분석을 통하여 모유두 세포의 마커 유전자의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10 및 도 11은 본 발명의 실시예 4에서 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포를 직접 또는 간접 혼합 배양한 후 그로부터 추출한 엑소좀을 배지에 포함시켜 지방 유래 줄기세포를 배양하고, 웨스턴 블럿 분석을 통하여 사이토케라틴-6의 단백질 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예 5에서 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액으로부터 추출한 엑소좀을 탈모 마우스의 탈모 부위에 도포한 후 시간이 경과함에 따른 육모의 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 실시예 5에서 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액으로부터 추출한 엑소좀을 탈모 마우스의 탈모 부위에 도포한 후 시간이 경과함에 따라 모발의 재생이 유도된 마우스 개체수의 변화를 그래프로 나타낸 것이다
도 14는 본 발명의 실시예 6에서 지방 유래 줄기세포에 지방 유래 줄기세포 단일 배양액(ASC)과 지방 유래 줄기세포와 연골세포 혼합 배양액(DM) 각각을 연골세포에 처리하여 줄기세포의 분화를 유도한 후, 알시안 염색(alcian stain)을 통한 분화 형태 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 실시예 6에서 지방 유래 줄기세포에 지방 유래 줄기세포 단일 배양액(ASC)과 지방 유래 줄기세포와 연골세포 혼합 배양액(DM) 각각을 연골세포에 처리하여 줄기세포의 분화를 유도한 후, RT-PCR 분석을 통하여 연골세포의 마커 유전자 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16는 본 발명의 실시예 7에서 지방 유래 줄기세포와 연골세포를 혼합 배양한 후 그로부터 추출한 엑소좀을 배지에 포함시켜 지방 유래 줄기세포를 배양하고, RT-PCR 분석을 통하여 연골세포의 마커 유전자 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17는 본 발명의 실시예 8에서 지방 유래 줄기세포와 폐 상피세포를 혼합 배양한 후 그로부터 추출한 엑소좀을 배지에 포함시켜 지방 유래 줄기세포를 배양하고, RT-PCR 분석을 통하여 폐 상피세포의 마커 유전자 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 실시예 9에서 지방 유래 줄기세포와 신경세포를 혼합 배양한 후 그로부터 추출한 엑소좀을 배지에 포함시켜 지방 유래 줄기세포를 배양하고, RT-PCR 분석을 통하여 신경세포의 마커 유전자 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시형태들을 설명한다. 그러나 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.

[ 실시예 1] 혼합 배양액의 분화세포 증식에 대한 영향 확인

본 발명에 따른 혼합 배양액이 분화된 세포의 증식에도 향상되는 효과를 갖는지 검증하기 위하여 모유두 세포를 준비하였다. 모유두 세포는 인간의 두피 진피로부터 분리한 초기 인간 모낭 모유두 세포로서 Promocell사에서 구매하여 계대배양을 실시하였다. 모유두 세포를 준비한 뒤, 지방 유래 줄기세포의 단일 배양액(ASC), 모유두 세포 배양액(DPC) 및 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액(co-CM)을 첨가하여 모유두 세포를 배양하였다. 단, 음성 대조군(Negative control, NC)으로는 무혈청 배지인 DMEM/F12 영양 배지만을 사용하여 모유두 세포를 배양하였다. 각 배양 조건에서 모유두 세포 수의 변화 및 증식률을 계산하여 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다. 이때, 상기 배양 과정에서 배지로는 DMEM/F12 영양 배지를 사용하였고, 배양액은 6웰 플레이트에 37℃, 5 % CO₂ 배양기 내에서 72시간 동안 배양을 실시하였다.

구분	세포 수	오차	증식률(%)
NC	12072.33	921.1853	100
ASC	15533.33	547.8209	128.6689
DPC	13527	272.5674	112.0496
co-CM	17057.67	824.5001	141.2955

상기 표 1 및 도 1에서 보는 바와 같이, 일반적으로 세포 증식에 효과가 있다고 알려진 ASC 단일 배양액에서 모유두 세포를 배양한 경우 대조군에 비하여 증식률이 약 28%가 증가하였지만, 모유두 세포의 단일 배양액에서는 큰 변화가 없었다. 반면 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액에서 배양한 결과, 증식률이 대략 41% 증가한 것을 볼 수 있다. 이를 통하여 기존의 ASC 배양액 보다 본 발명에 따른 혼합 배양액이 모유두 세포의 증식에 더욱 효과적인 것을 알 수 있다.

[ 실시예 2] 혼합 배양액의 지방유래 줄기세포의 모유두 세포 분화능에 대한 영향 확인

본 발명에 따른 혼합 배양액이 지방 유래 줄기세포의 모유두 세포로의 분화에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 지방 유래 줄기세포를 준비한 뒤, 지방 유래 줄기세포의 단일 배양액(ASC), ASC 배양액과 조정 배지의 혼합물(ASC CM), 모유두 세포 배양액과 조정 배지의 혼합물(DPC CM), 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액(co-CM) 각각에 첨가하여 14일 간 분화를 유도하였다. 다만, 배양조건 및 첨가 조건은 실시예 1과 동일하게 수행하였다.

이 후, RT-PCR 분석을 통하여 대조군(NC) 대비 모유두 세포의 마커 유전자인 APOE, BAMBI 및 BMP2의 발현 정도를 확인하여 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다. 또한, 웨스턴 블럿 분석을 통하여 상기한 모유두 세포의 마커와 모공(hair follicle) 형성과 관련된 단백질인 베르시칸(versican), 트롬보스폰딘 1(trombospondin 1, TBP-1) 및 사이토케라틴 6/75(cytokeratin 6/75)의 발현을 확인하여 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5에서 보는 바와 같이, 대조군이나 ASC 배양액과 조정 배지의 혼합물(ASC CM) 및 모유두 세포 배양액과 조정 배지의 혼합물(DPC CM)과 대비해 볼 때, 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양액(co-CM)에서 지방 유래 줄기세포를 배양한 경우 모유두 세포와 모낭 형성 관련 마커인 베르시칸의 발현량이 증가한 것을 볼 수 있고, 그 외의 단백질로 트롬보스폰딘 1과 사이토케라틴 6/75 모두 현저히 증가한 것을 볼 수 있다. 이때, 상기 베르시칸은 모유두 세포와 모낭 형성 마커에 해당하며, 트롬보스폰딘 1은 신생혈관을 억제하는 마커이며, 사이토 케라틴 6은 모유두 세포 및 케라틴 발현 마커에 해당한다.

따라서 상기한 결과를 통하여 본 발명에 따른 혼합 배양액은 기존의 지방 유래 줄기세포 배양액에 비하여 지방 유래 줄기세포의 모유두 세포로의 분화를 현저하게 유도하고, 모유두 세포의 증식 또한 증가시키며 모낭의 형성을 촉진하는 것을 알 수 있다.

[ 실시예 3] 상이한 혼합 배양방법에 따른 배양액으로부터 지방유래 줄기세포를 배양한 경우 모유두 세포의 마커 유전자의 발현 정도 확인

지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양 방법에 따른 효과를 확인하기 위하여, 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포를 다양한 방법으로 혼합 배양하였다.

도 6은 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양 모식도를 나타낸 것으로, 우선 혈청을 포함하는 ASC 배양액을 준비하고, 모유두 세포는 직경이 100㎛인 구형(spheroid)을 이루도록 응집 및 배양시켜 준비하였다.

그 후, 혼합 배양을 위하여 첫 번째로, 상기 ASC 배양액에 단층의 모유두 세포를 접종하여 직접 혼합 배양을 수행하고(제조예 1, DM), 두 번째로 ASC 배양액에 구형의 모유두 세포 응집을 접종하여 직접 혼합 배양을 수행하였으며 (제조예 2, DS), 세 번째로 단층의 모유두 세포를 PVC 필름에 단층으로 접종한 뒤 모유두 세포가 ASC 배양액에 접하도록 PVC 필름을 ASC 배양액 상에 위치시켜 혼합 배양하였고 (제조예 3, IM), 마지막으로 구형의 모유두 세포 응집을 PVC 필름에 접종한 뒤 모유두 세포가 ASC 배양액에 접하도록 PVC 필름을 ASC 배양액 상에 위치시켜 혼합 배양하였다 (제조예 4, IS).

상기와 같은 4가지 방법으로 7일간 지방 유래 줄기세포의 분화를 유도한 후 조정 배지(conditioned media, CM)를 수집하고, 수집한 각 배양액으로 지방 유래 줄기세포를 배양한 후, RT-PCR을 통해 모유두 세포의 마커 유전자인 BMP2, BAMBI, APOE, GLI-1, Ptc-1 발현량을 RT-PCR을 통하여 확인해 그 결과를 도 9에 나타내었다. 단, 대조군으로는 DMEM/F12 영양 배지에서 배양한 지방 유래 줄기세포(ASC)와 모유두 세포(DPC)에서의 상기 단백질 발현량을 분석하였다.

도 7에서 보는 바와 같이, 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 혼합 배양 시 DPC 마커 유전자들의 발현이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 특히 직접 혼합 배양 중 구형의 모유두 세포 응집 접종에 의한 혼합 배양인 제조예 2와 간접 혼합 배양 중 구형의 모유두 세포 응집을 접종에 혼합 배양인 의한 제조예 4에 의한 경우 더욱 유의적인 결과를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 4] 혼합 배양액으로부터 분리한 엑소좀으로 지방유래 줄기세포를 배양한 경우 모유두 세포의 마커 유전자의 발현 정도 확인

상기 실시예 3에서 효과가 좋았던 직접 혼합 배양에 의한 제조예 2와 간접 혼합 배양에 의한 제조예 4를 통해 얻어진 혼합 배양액으로부터 다음과 같은 염석 방법에 의해 엑소좀을 추출하였다. 각 혼합 배양액에 1 M 소디움 아세테이트를 최종 농도가 0.1 M이 되도록 처리하고 45 분간 4℃에 정치시킨 뒤 5 분간 37℃에 정치시킨 후 4,000 g에서 10분간 원심 분리하여 엑소좀을 분리하였다.

이렇게 추출된 엑소좀을 배지에 포함시켜 지방 유래 줄기세포를 배양한 후, RT-PCR을 통해 모유두 세포의 마커 유전자인 LEF1, BAMBI 및 BMP2의 발현을 확인하여 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다. 또한 웨스턴 블럿 분석을 통하여 베르시칸, 트롬보스폰딘 1 및 사이토케라틴 6/75과, 모유두 세포 표면 마커인 a-SMA의 발현을 확인하여 그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다. 단, 대조군으로는 DMEM/F12 영양 배지에서 배양한 지방 유래 줄기세포(ASC)와 모유두 세포(DPC)에서의 상기 단백질 발현량을 분석하였다.

도 8 및 도 9에서 보는 바와 같이, 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 직접 혹은 간접 혼합 배양액 내 엑소좀을 처리하여 지방 유래 줄기세포를 배양한 결과, LEF1, BAMBI 및 BMP2의 발현이 모유두 세포 이상으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한 도 10 및 도 11에서 보는 바와 같이, 지방 유래 줄기세포와 모유두 세포의 직접 혹은 간접 혼합 배양액 내 엑소좀을 처리하여 지방 유래 줄기세포를 배양한 결과, 베르시칸, 트롬보스폰딘 1, 사이토케라틴 6/75 및 a-SMA 모두가 일반적인 모유두 세포만큼 증가한 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여 본 발명에 따른 혼합 배양액에서 추출한 엑소좀이 지방 유래 줄기세포를 모유두 세포로 분화를 유도하거나 모낭 형성을 유도하였음을 알 수 있었다.

[ 실시예 5] 혼합 배양액의 생체 내 탈모 효과 확인

본 발명에 따른 혼합 배양액의 생체 내(in- vivo) 효과를 확인하기 위하여 탈모 마우스 모델을 이용하였다. 구체적으로는 C3H 마우스의 모낭형성 주기를 이용하여 탈모를 유도한 뒤, 상기 실시예 3에서 제조예 2의 직접 혼합 배양액으로부터 추출한 엑소좀(co CMEX)과 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 추출한 엑소좀(ASC CMEX)을 탈모 부위에 도포하여 42일 동안의 변화 양상을 도 12 및 도 13에 나타내었다.

도 12 및 13에서 보는 바와 같이, 혼합 배양액으로부터 추출한 엑소좀(co CMEX)을 도포한 경우 약 28일이 경과하였을 때 전체적으로 모발이 자라는 양상을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 기존에 양모 및 육모 효과가 있다고 알려진 지방 유래 줄기세포 배양액으로부터 추출한 엑소좀(ASC CMEX)을 도포한 경우 42일이 지나서야 비로소 일부 탈모 부위에서 모발 형성이 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 6] 연골 세포 혼합 배양액의 지방유래 줄기세포의 분화능에 대한 영향 확인

본 발명에 따른 혼합 배양액이 지방 유래 줄기세포의 연골세포로의 분화에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 지방 유래 줄기세포에 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군(NC), 연골세포와 지방유래 줄기세포의 혼합 배양액(DM)을 각각 첨가하여 14일간 분화를 유도하였다. 다만, 배양 조건 및 첨가 조건은 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 상기 연골세포는 인간연골육종 세포주인 SW1353 세포로서 ATCC사에서 구매 하여 계대배양 하였다.

이후, 알시안 염색(alcian stain)을 통하여 현미경을 통해 각 세포의 연골세포 분화 형태를 확인하여 그 결과를 도 14에 나타내었다. 또한, RT-PCR 분석을 통하여 대조군(NC) 대비 연골세포의 마커 유전자인 MMP-1, MMP-3, MMP-13, aggrecan, sox-9(YUEH-HSUN YANG. 2012. STEM CELLS TRANSLATIONALMEDICINE 참고)의 발현 정도를 확인하여 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 14에서 보는 바와 같이, 대조군(NC)에 비하여 지방유래 줄기세포와 연골세포의 혼합 배양액에서 그 형태에서 메스(mass) 형성이 도드라지게 일어나는 것을 확인 할 수 있었다.

또한, 도 15에서 보는 바와 같이, 대조군에 비하여 MMP-1, MMP-3, MMP-13, aggrecan, sox-9의 유전자 발현이 증가 되는 것을 확인 할 수 있었다. 특히 압축 하중에 저항 할 수 있는 능력을 갖는 추간판(intervertebral disc) 및 척추간연골(invertebral carilage)를 제공할 수 있는 aggrecan의 경우 무혈청 배지인 DMEM/F12 영양 배지만을 사용하여 배양한 음성 대조군(NC)에 비하여 높은 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 상기한 결과를 통하여 본 발명에 따른 혼합 배양액은 기존의 지방유래 줄기세포 배양액에 비하여 지방 유래 줄기세포의 연골세포로의 분화를 현저하게 유도를 촉진하는 것을 알 수 있다.

[ 실시예 7] 혼합 배양액으로부터 분리한 엑소좀으로 지방유래 줄기세포를 배양한 경우 연골 세포의 마커 유전자의 발현 정도 확인

본 발명에 따른 혼합 배양액이 지방 유래 줄기세포의 연골 세포로의 분화에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 인간 연골육종유래인 SW-1353 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양한 뒤, ASC 배양액에 단층의 연골 육종 유래 세포를 접종하여 직접 혼합 배양하여 배양액을 얻고, 구형의 폐 상피세포 응집을 PVC 필름에 접종한 뒤 연골 육종 유래 세포가 ASC 배양액에 접하도록 PVC 필름을 ASC 배양액 상에 위치시켜 혼합 배양한 배양액을 얻었다. 두 배양액으로부터 상기 실시예 4의 염석 방법에 의해 엑소좀을 추출하였다. 또한, 대조군으로 지방 유래 줄기세포 및 연골 육종 유래 세포 각각의 단독 배양액으로부터 상기 염석 방법에 의해 엑소좀을 추출하였다.

이렇게 추출된 엑소좀은 지방 유래 줄기세포를 준비한 뒤, 지방 유래 줄기세포 단독 배양액에서 분리된 엑소좀(ASC-EV), 연골세포 단독 배양액에서 분리된 엑소좀(SW1353-EV), 지방 유래 줄기세포와 연골육종유래 세포의 혼합 배양액에서 추출된 엑소좀(coCM-EV)을 각각 첨가하여 14일 간 분화를 유도하였다. 단, 배양조건은 실시예 1과 동일하게 수행하였다. SW1353세포는 ATCC사에서 구매하여 계대배양을 실시하였다.

PT-PCR을 통해 연골 세포의 마커 유전자인 MMP-1, MMP-3, MMP-13, aggrecan, sox-9 의 발현을 확인하여 그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16에서 보는 바와 같이, 지방 유래 줄기세포와 연골 세포의 혼합 배양액 내 엑소좀을 처리하여 지방 유래 줄기세포를 배양한 결과 음성 대조군(NC)과 비교하였을 때, 지방 유래 줄기세포 단독 배양액으로부터 분리된 엑소좀(ASC-EV) 처리군 및 연골육종 유래 세포 단독 배양액으로부터 분리된 엑소좀(SW1353-EV) 처리군과 비교하여 지방유래 줄기세포와 연골육종 유래 세포 공동 배양액으로부터 분리된 엑소좀(coCM-EV) 처리군에서 MMP-1, MMP-3, MMP-13, aggrecan, sox-9 의 발현이 유의성 있게 높은 것을 알 수 있었다. 특히 압축 하중에 저항할 수 있는 능력을 갖는 추간판(intervertebral disc)과 척추간연골(invertebral carilage)을 제공할 수 있도록 하는 유전자인 aggrecan의 경우 연골육종 유래 세포(SW1353) 단독 배양보다 높은 비율로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

이를 통하여 본 발명에 따른 혼합 배양액에서 추출한 엑소좀이 지방 유래 줄기세포를 연골 세포로 분화할 수 있도록 유도하였음을 알 수 있었다. 따라서, 이러한 결과는 지방 유래 줄기세포와 연골 세포의 혼합 배양액에서 분리된 엑소좀을 줄기세포에 처리하였을 때, 연골 세포로의 분화를 촉진 시키는 것을 통해 연골 손상 질환 등의 치료 용도로 활용될 수 있음을 시사한다.

[ 실시예 8] 혼합 배양액으로부터 분리한 엑소좀으로 지방유래 줄기세포를 배양한 경우 내배엽 세포의 마커 유전자의 발현 정도 확인

본 발명에 따른 혼합 배양액이 지방 유래 줄기세포의 내배엽 세포로의 분화에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 인간의 폐 상피세포(A549)를 10% FBS가 포함된 RPMI-1640 배지에서 배양한 뒤, ASC 배양액에 단층의 폐 상피세포를 접종하여 직접 혼합 배양하여 배양액을 얻고, 구형의 폐 상피세포 응집을 PVC 필름에 접종한 뒤 폐상피세포가 ASC 배양액에 접하도록 PVC 필름을 ASC 배양액 상에 위치시켜 혼합 배양한 배양액을 얻었다. 두 배양액으로부터 상기 실시예 4의 염석 방법에 의해 엑소좀을 추출하였다. 또한, 대조군으로 지방 유래 줄기세포 및 폐 상피세포 각각의 단독 배양액으로부터 상기 염석 방법에 의해 엑소좀을 추출하였다.

이렇게 추출된 엑소좀은 지방 유래 줄기세포를 준비한 뒤, 지방 유래 줄기세포 단독 배양액에서 분리된 엑소좀(ASC-EV), 폐 상피세포 단독 배양액에서 분리된 엑소좀(A-549-EV), 지방 유래 줄기세포와 폐상피세포의 혼합 배양액에서 추출한 엑소좀(coCM-EV)을 각각 첨가하여 14일간 분화를 유도하였다. 다만, 배양 조건은 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 내배엽 신경세포는 인간의 폐 상피세포 A-549로서, ATCC사에서 구매하여 계대배양을 실시하였다.

이렇게 추출된 엑소좀을 배지에 포함시켜 지방유래 줄기세포를 배양한 후, RT-PCR을 통해 폐 상피세포의 마커인 유전자 cytokeratin-5(CK-5), cytokeratin-8(CK-8), zonula occludens-1(ZO-1)의 발현을 확인하여 그 결과를 도 17에 나타내었다.

도 17에서 보는 바와 같이, 지방유래 줄기세포 단독 배양액 및 폐 상피세포 단독 배양액에서 추출한 엑소좀을 처리한 군과 비교하였을 때 지방유래 줄기세포와 폐 상피세포 혼합 배양액으로부터 분리한 엑소좀을 처리한군에서 CK-5, CK-8, ZO-1의 유전자 발현이 높음을 확인하였다.

상기 결과를 통하여 지방유래줄기세포와 폐 상피세포의 혼합배양을 통해 얻어진 엑소좀이 특정한 종류의 세포에 국한되지 않고, 내배엽 세포에서도 그 분화유도가 가능함을 알 수 있었다.

이를 통하여 본 발명에 따른 혼합 배양액에서 추출한 엑소좀이 지방 유래 줄기세포를 폐 상피세포로 분화할 수 있도록 유도하였음을 알 수 있었다. 따라서, 이러한 결과는 지방 유래 줄기세포와 폐 상피세포의 혼합 배양액에서 분리된 엑소좀을 줄기세포에 처리 하였을 때, 폐 상피 세포로의 분화를 촉진시키는 것을 통해 섬유성 장애 등의 치료 용도로 활용될 수 있음을 시사한다.

[ 실시예 9] 혼합 배양액으로부터 분리한 엑소좀으로 지방유래 줄기세포를 배양한 경우 외배엽 세포의 마커 유전자의 발현 정도 확인

본 발명에 따른 혼합 배양액이 지방 유래 줄기세포의 외배엽 세포로의 분화에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 인간 신경모세포(IMR-32)를 30% FBS를 포함한 EMEM 배지에서 배양하였다. ASC 배양액에 단층의 신경모세포를 접종하여 직접 혼합 배양한 배양액 및 구형의 신경세포 응집을 PVC 필름에 접종한 뒤 신경세포가 ASC 배양액에 접하도록 PVC 필름을 ASC 배양액 상에 위치시켜 혼합 배양한 배양액으로부터 상기 실시예 4의 염석 방법에 의해 엑소좀을 추출하였다. 또한, 대조군으로 지방 유래 줄기세포 및 신경세포 각각의 단독 배양액으로부터 상기 염석 방법에 의해 엑소좀을 추출하였다.

이렇게 추출된 엑소좀은 지방 유래 줄기세포를 준비한 뒤, 지방 유래 줄기세포에서 분리된 엑소좀(ASC-EV), 신경세포에서 분리된 엑소좀(neural cell-EV), 지방 유래 줄기세포와 신경세포의 혼합 배양액에서 추출한 엑소좀(coCM-EV)을 각각에 첨가하여 14일 간 분화를 유도하였다. 다만, 배양조건 및 첨가 조건은 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 외배엽 신경세포는 신경모세포 IMR-32 로서, ATCC사에서 구매하여 계대배양을 실시하였다.

이렇게 추출된 엑소좀을 배지에 포함시켜 지방유래 줄기세포를 배양한 후, RT-PCR을 통해 신경세포의 마커인 유전자 MAP-1, MAP-2, NSE(neuron-specific enolase)의 발현을 확인하여 그 결과를 도 18에 나타내었다.

도 18에서 보는 바와 같이, 신경 생성 단계에 필수적인 마이크로튜블(microtubule) 에 포함되는 MAP-1, MAP-2 의 발현이 지방 유래 줄기세포와 신경모세포의 혼합 배양액에서 추출한 엑소좀(coCM-EV) 그룹에서 양성 대조군인 신경세포(neural cell)의 발현양과 유사한 정도로 음성대조군(NC)에 비하여 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 뿐만아니라, 신경모세포 이외의 모든 종류의 신경세포에서 발현이 확인되는 NSE도 양성대조군과 유사할 정도로 높게 발현되는 것을 확인 할 수 있었다.

상기 결과를 통하여 지방유래줄기세포와 신경모세포의 혼합배양을 통해 얻어진 엑소좀이 특정한 종류의 세포에 국한되지 않고, 외배엽 세포인 신경모세포에서도 그 분화 유도가 가능함을 알 수 있었다. 따라서, 이러한 결과는 지방 유래 줄기세포와 신경세포의 혼합 배양액에서 분리된 엑소좀을 줄기세포에 처리하였을 때, 신경세포로의 분화를 촉진 시키는 것을 통해 신경질환 등의 치료 용도로 활용될 수 있음을 알 수 있다.

이상, 본 발명을 상기 실시예를 중심으로 하여 설명하였으나 이는 예시에 지나지 아니하며, 본 발명은 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 다양한 변형 및 균등한 기타의 실시예를 이하에 첨부한 청구범위 내에서 수행할 수 있다는 사실을 이해하여야 한다.

Claims

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성체 줄기세포와, 직경이 50 ~ 150㎛인 구형(spheroid)으로 배양된 모유두 세포를 혼합 배양한 혼합 배양액으로부터 분리된 것으로 30 ~ 1,000nm의 크기를 갖는 엑소좀.
제 6항에 있어서,
상기 엑소좀은 혼합 배양액으로부터 염석 방법(salting out)에 의해 분리된 것인, 엑소좀.
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배양 플레이트 상에 성체 줄기세포를 배양하는 단계;
고분자 필름상에 직경이 50 ~ 150㎛인 구형으로 응집되어 배양 되어진 분화된 세포를 배양하는 단계;
상기 고분자 필름상에 배양된 분화된 세포를 배양 플레이트 상에 접촉시킨 뒤, 배양하여 혼합 배양액을 제조하는 단계; 및
상기 혼합 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하며,
상기 엑소좀은 30 ~ 1,000nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 하고,
상기 분화된 세포는 모유두 세포인 것인, 엑소좀의 제조방법.
제 20항에 있어서,
상기 엑소좀은 혼합 배양액으로부터 염석 방법(salting out)에 의해 분리되는, 엑소좀의 제조방법.
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