CN115461447A - 含有来自于脂肪源性干细胞的调制培养基的蛋白质浓缩物的美容组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了从脂肪源性干细胞的调制培养基制备的抗衰老美容组合物。所述美容组合物优选为即混型组合物，其包含两种独立组分：充当所述产品的美容活性成分的干燥形式的蛋白质组分，其包含从脂肪源性干细胞调制培养基纯化的蛋白质级分；重构组分，用于在即将施用到皮肤之前重构所述冻干的蛋白质组分。

Description

含有来自于脂肪源性干细胞的调制培养基的蛋白质浓缩物的 美容组合物
技术领域
本发明涉及从脂肪源性干细胞的调制培养基制备的抗衰老美容产品，其特别有效并且还具有长保质期和长期稳定性的特征。本发明的抗衰老美容产品是基于从所述调制培养基纯化并用美容赋形剂配制的蛋白质浓缩物。本发明的美容产品可以被提供为双组分美容组合物，其包含干燥形式的源自于所述调制培养基的蛋白质组合物以及用于在使用前重构的重构介质。
背景技术
皮肤衰老的特征在于老年斑、细纹和皱纹、体积和弹性减少以及皮肤质地的变化。
各种不同的非处方抗衰老美容产品可用于改善诸如肤色、皮肤外观等的参数，并维持更健康、外表更年轻的皮肤。这些产品通常含有脂肪酸和醇类，各种不同的维生素和维生素衍生物，填充剂例如胶原蛋白和透明质酸，以及植物提取物。随着化妆品工业的发展，新的美容成分被开发出来。
已开发出基于干细胞调制培养基的抗衰老美容组合物，包括精华素、霜剂、乳液、爽肤水和清洁剂。此类产品被综述在例如Amirthalingam和Seetharam(2016)MJMS.,1(2):46-52中。其他的示例性产品包括ADIOStemTM(Celprogen Inc.)，它是一种含有脂肪源性干细胞调制培养基、纯化水和甘油的保湿霜(产品说明书，www.celprogen.com)。
EP 2257272公开了一种对个体皮肤老化进行美容性预防或治疗的方法，所述方法包括向所述个体施用美容活性量的牙龈成纤维细胞衍生的产品，例如牙龈成纤维细胞全细胞、牙龈成纤维细胞培养物和牙龈成纤维细胞调制培养基。
US 7,160,726公开了组合物，其包含由在三维培养中生长的细胞特别是真皮成纤维细胞、角化细胞、上皮细胞、软骨细胞、平滑肌细胞和肌细胞调制的细胞培养基。所述调制细胞培养基可用于美容应用、药妆应用和药物应用等中的至少一者。
US 8,101,167公开了至少一种调制细胞培养基或其提取物的用途，其用于制备用于治疗炎症和/或免疫紊乱的症状的组合物，所述培养基能够通过与消化道细胞的至少一种培养物和至少一种益生微生物接触来获得。
US 8,361,485公开了调制细胞培养基组合物和使用方法。所述培养基可以用基质细胞、实质细胞、间充质干细胞、肝储备细胞、神经干细胞、胰腺干细胞和/或胚胎干细胞调制。所述细胞可以被遗传修饰。三维组织构建物是优选的。所述调制培养基的物理实施方式包括液体或固体、冷冻、冻干或干燥成粉剂。将所述培养基与可药用载体一起配制作为内部给药的载体，直接施用到食品或产品，与药膏或软膏一起配制用于局部施用，或者例如制成手术胶或添加到手术胶中以加速侵入性手术后缝合处的愈合。所述培养基可以被进一步加工以浓缩或减少所述培养基中包含的一种或多种因子或组分。
US 8,586,540公开了用于羊水中的胎儿来源的间充质干细胞的培养基。还公开了一种用于改善皮肤病症的组合物，其包含所述羊水中的胎儿来源的间充质干细胞的培养基作为活性成分，其中所述待改善的皮肤病症包括变白、皱纹、由紫外线引起的皮肤损伤或皮肤提升。
US 9,109,045公开了一种能够通过在适合的培养基和条件下培养从人类脂肪细胞提取的脂肪源性干细胞来大量合成人类生长因子的方法。此外，根据所述发明的方法生产的干细胞培养基和从所述培养基分离的人类生长因子可以有利地用作药物和化妆品的原材料。
转让给本发明的申请人的WO 2018/211498尤其公开了用于获得脂肪源性干细胞(ADSC)的方法，其与目前使用的方法相比成本效益更高并提供更高的产率。
大多数美容产品、特别是基于天然存在的成分的美容产品具有有限的保质期和稳定性，并且通常一旦打开在室温下最多只能保存12个月，在许多情况下最多只有6个月。
对于对嫩肤、改善皮肤外观、肤色等有效且有用，并且还具有在各种不同储存条件下具有长保质期和改善的稳定性的特征的美容组合物，存在着需求。
发明内容
本发明提供了从脂肪源性干细胞的调制培养基制备的抗衰老美容组合物。本发明的美容组合物是基于从所述调制培养基纯化并用美容赋形剂配制的蛋白质浓缩物。在某些实施方式中，本发明的美容组合物被提供成即混型组合物，其包含两种分开的组分：干燥(例如冻干)形式的蛋白质组分，其充当所述产品的美容活性成分，包含从脂肪源性干细胞调制培养基纯化的蛋白质级分；和重构组分，用于在即将施用到皮肤之前重构所述干燥的蛋白质组分。所述两种组分在生产、运输和储存期间保持分开，并在使用之前直接混合。通过提供由两种分开的组分构成的产品(所述组分是稳定的并在即将使用前混合以形成用于局部施用的组合物)，本发明克服了美容组合物的不稳定性和保质期有限的问题。
有利的是，保持所述干燥的蛋白质组合物与所述重构介质分开作为两种独立组分，即使在升高的湿度和/或温度条件下也提供引人注目的稳定性，同时维持所述活性蛋白质级分的效力。正如下文中示例的，稳定性测定显示所述干燥的蛋白质组合物和重构组合物当在40℃/75％RH下储存时至少6个月都是稳定的，这等同于在室温下的标准储存条件下至少1.5年的保质期。
根据本发明的某些实施方式，所述蛋白质级分从用脂肪源性干细胞调制的细胞培养基纯化，所述脂肪源性干细胞在含血清培养基中生长，随后在无血清培养基中生长至少48小时，然后收集所述培养基。所述蛋白质级分通过浓缩所述调制培养基并除去小于1kDa的组分来获得。在某些实施方式中，所述蛋白质级分通过除去小于3kDa的组分来获得。优选地，所述蛋白质级分用美容赋形剂配制并且基本上不含所述细胞培养基的组分。
在某些示例性实施方式中，所述蛋白质级分通过使用具有适合的分子量截留值(例如1kDa或3kDa)的切向流过滤(TFF)浓缩和过滤所述调制培养基，以获得作为渗余物的蛋白质级分来获得。在某些实施方式中，将所述得到的蛋白质级分针对包含可美容用赋形剂的水性制剂渗滤，以获得从细胞培养基组分纯化并用所述美容赋形剂配制的蛋白质级分。
正如下文中示例的，所述用美容赋形剂配制的蛋白质级分基本上不含所述细胞培养基的组分，例如各种不同的金属。有利情况下，所述配制的蛋白质级分也基本上不含在干细胞生长期间使用的任何抗生素。这与以前描述的基于调制培养基的美容产品相反，在以前的产品中收集调制培养基并用各种不同的赋形剂配制，而不对培养基组分进行任何纯化或分离。
正如下文中示例的，发现根据本发明的蛋白质级分在体外有效提高人类角化细胞的生存力并诱导其增殖。当人类受试者使用时，发现在将根据本发明的干燥的蛋白质组分与重构介质混合后获得的重构美容组合物是安全且无刺激的，并且此外在使用6周后已显示出更光滑的皮肤和皱纹深度的减小。在使用12周后也观察到皱纹深度的减小。此外，在使用6周后观察到皮肤的软化，其在使用12周后持续。
因此，本发明提供了对嫩肤、改善皮肤外观、肤色等特别有效且有用，并且还具有改善的稳定性和延长的保质期特征的美容组合物。
根据一个方面，本发明提供了一种粉剂形式的美容组合物，其包含从人类脂肪源性干细胞调制培养基纯化的干燥的蛋白质级分和至少一种可美容用赋形剂，其中所述蛋白质级分包含在除去小于1kDa的组分后剩余的蛋白质和粒子。
在某些实施方式中，所述蛋白质级分包含在除去小于3kDa的组分后剩余的蛋白质和粒子。
在某些实施方式中，所述美容组合物包含至少109个外泌体/mg蛋白质。
在某些实施方式中，所述蛋白质级分基本上不含所述人类脂肪源性干细胞所生长的细胞培养基的组分。
在某些实施方式中，将所述人类脂肪源性干细胞在含血清培养基中生长至少24小时，随后在无血清培养基中生长至少48小时，然后收集所述培养基。
在某些实施方式中，所述干燥的蛋白质级分是冻干的蛋白质级分。
在某些实施方式中，所述组合物的蛋白质含量为至少0.2μg/mg粉剂。
在某些实施方式中，所述组合物含有少于5％wt的残留水。
在某些实施方式中，所述美容组合物通过包括下述步骤的方法获得：(a)获得人类脂肪源性干细胞(hADSC)；(b)将所述hADSC在含血清培养基中培养至少24小时；(c)将所述hADSC在无血清培养基中传代培养至少48小时以获得调制培养基；(d)分离所述hADSC和细胞碎片并收集所述调制培养基；(e)使用切向流过滤(TFF)浓缩并过滤所述调制培养基，以除去小于1kDa的组分并获得作为渗余物的蛋白质级分；(f)使用包含至少一种可美容用填充剂和任选的至少一种另外的可美容用赋形剂的水性制剂渗滤所述蛋白质级分，以获得从细胞培养基组分纯化并用所述水性制剂配制的蛋白质级分；以及(g)干燥所述得到的蛋白质级分。
在某些实施方式中，所述美容组合物通过包括下述步骤的方法获得：(a)获得人类脂肪源性干细胞(hADSC)；(b)将所述hADSC在含血清培养基中培养至少24小时；(c)将所述hADSC在无血清培养基中传代培养至少48小时以获得调制培养；(d)分离所述hADSC和细胞碎片并收集所述调制培养基；(e)使用切向流过滤(TFF)浓缩并过滤所述调制培养基，以除去小于3kDa的组分并获得作为渗余物的蛋白质级分；(f)使用包含至少一种可美容用填充剂和任选的至少一种另外的可美容用赋形剂的水性制剂渗滤所述蛋白质级分，以获得从细胞培养基组分纯化并用所述水性制剂配制的蛋白质级分；以及(g)干燥所述得到的蛋白质级分。
在某些实施方式中，所述水性制剂包含2％-10％(w/v)之间的所述至少一种填充剂。在某些实施方式中，所述填充剂包含甘露醇。在某些实施方式中，所述水性制剂还包含至少一种稳定剂和至少一种张度剂。在某些实施方式中，所述水性制剂包含0.01-1％(w/v)之间的所述至少一种稳定剂。在某些实施方式中，所述至少一种稳定剂包含EDTA。在某些实施方式中，所述水性制剂包含0.1-1％(w/v)之间的所述至少一种张度剂。在某些实施方式中，所述至少一种张度剂包含氯化钠。
在某些实施方式中，所述培养基通过由包含下述步骤的方法获得的人类脂肪源性干细胞来调制：(a)将脂肪抽吸物冷冻；(b)将所述脂肪抽吸物解冻并使用组织解离酶或通过机械破碎进行解离；(c)通过离心使包含ADSC的细胞级分沉淀，并任选地用能够支持细胞生存的悬浮介质清洗所述沉淀物并对所述悬液进行至少一次另外的离心；(d)将所述在步骤(c)中得到的沉淀物重悬于能够支持细胞生存的悬浮介质中，并从所述重悬的沉淀物中的细胞群体选择ADSC；(e)在所述ADSC选择之前任选地进行至少一次过滤；以及(f)任选地将所述ADSC培养至少3次传代。
在某些实施方式中，所述培养基通过人类脂肪源性干细胞的群体调制，所述群体的特征在于至少90％的细胞阳性表达CD73、CD90和CD105，并且少于5％的细胞阳性表达CD45。
根据另一方面，本发明提供了一种改善至少一种与衰老相关的皮肤病症的方法，所述方法包括：提供本文中所公开的美容组合物；重构所述组合物以获得适合于施用到皮肤的组合物；以及施用到皮肤。
根据另一方面，本发明提供了一种双组分美容产品，其包含下述组合物作为分开的即混型组合物：
(a)粉剂形式的干燥的蛋白质组合物，其包含从人类脂肪源性干细胞调制培养基纯化的蛋白质级分和至少一种可美容用赋形剂，其中所述蛋白质级分包含在除去小于1kDa的组分后剩余的蛋白质和粒子；和
(b)水性重构组合物，其包含水和至少一种可美容用赋形剂，用于重构所述冻干的蛋白质组合物以形成适合于局部施用到受试者皮肤的组合物，
其中所述两种组分保持分开并在使用前混合。
在某些实施方式中，所述蛋白质级分包含在除去小于3kDa的组分后剩余的蛋白质和粒子。
在某些实施方式中，所述干燥的蛋白质组合物包含至少109个外泌体/mg蛋白质。
在某些实施方式中，所述蛋白质级分基本上不含所述人类脂肪源性干细胞所生长的细胞培养基的组分。
在某些实施方式中，将所述人类脂肪源性干细胞在含血清培养基中生长至少24小时，随后在无血清培养基中生长至少48小时，然后收集所述培养基。
在某些实施方式中，所述干燥的蛋白质组合物的蛋白质含量为至少0.2μg/mg粉剂。
在某些实施方式中，所述干燥的蛋白质组合物含有少于5％wt的残留水。
在某些实施方式中，所述干燥的蛋白质组合物通过包含下述步骤的方法来获得：使用切向流过滤(TFF)浓缩并过滤所述调制培养基，以除去小于1kDa的组分并获得作为渗余物的蛋白质级分；使用包含至少一种可美容用填充剂和任选的至少一种另外的可美容用赋形剂的水性制剂渗滤所述蛋白质级分，以获得从细胞培养基组分纯化并用所述水性制剂配制的蛋白质级分；以及干燥所述配制的蛋白质级分。
在某些实施方式中，所述干燥的蛋白质组合物通过包含下述步骤的方法来获得：使用切向流过滤(TFF)浓缩并过滤所述调制培养基，以除去小于3kDa的组分并获得作为渗余物的蛋白质级分；使用包含至少一种可美容用填充剂和任选的至少一种另外的可美容用赋形剂的水性制剂渗滤所述蛋白质级分，以获得从细胞培养基组分纯化并用所述水性制剂配制的蛋白质级分；以及干燥所述配制的蛋白质级分。
在某些实施方式中，所述水性制剂包含2％-10％(w/v)之间的所述至少一种填充剂。在某些实施方式中，所述填充剂包含甘露醇。在某些实施方式中，所述水性制剂还包含至少一种稳定剂和至少一种张度剂。在某些实施方式中，所述水性制剂包含0.01-1％(w/v)之间的所述至少一种稳定剂。在某些实施方式中，所述至少一种稳定剂包含EDTA。在某些实施方式中，所述水性制剂包含0.1-1％(w/v)之间的所述至少一种张度剂。在某些实施方式中，所述至少一种张度剂包含氯化钠。
在某些实施方式中，所述培养基通过由包含下述步骤的方法获得的人类脂肪源性干细胞来调制：(a)将脂肪抽吸物冷冻；(b)将所述脂肪抽吸物解冻并使用组织解离酶或通过机械破碎进行解离；(c)通过离心使包含ADSC的细胞级分沉淀，并任选地用能够支持细胞生存的悬浮介质清洗所述沉淀物并对所述悬液进行至少一次另外的离心；(d)将所述在步骤(c)中得到的沉淀物重悬于能够支持细胞生存的悬浮介质中，并从所述重悬的沉淀物中的细胞群体选择ADSC；(e)在所述ADSC选择之前任选地进行至少一次过滤；以及(f)任选地将所述ADSC培养至少3次传代。
在某些实施方式中，所述培养基通过人类脂肪源性干细胞的群体调制，所述群体的特征在于至少90％的细胞阳性表达CD73、CD90和CD105，并且少于5％的细胞阳性表达CD45。
在某些实施方式中，所述干燥的蛋白质组合物是冻干的蛋白质组合物。
在某些实施方式中，在与所述干燥的蛋白质组合物混合之前所述重构组合物的黏度参数如下：12RPM：1800-2700cP；18RPM：1400-2000cP；60RPM：700-1000cP；100RPM：500-800cP，其在室温下使用Brookfield黏度计测量。
在某些实施方式中，所述水性重构组合物包含蒸馏水和包含至少一种乳化剂和至少一种润肤剂的可美容用赋形剂。在某些实施方式中，所述水性重构组合物包含2-10％(w/w)之间的所述至少一种乳化剂，例如2-5％(w/w)之间的所述至少一种乳化剂。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，所述水性重构组合物包含2-10％(w/w)之间的所述至少一种润肤剂，例如2-5％(w/w)之间的所述至少一种润肤剂。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，所述水性重构组合物还包含至少一种另外的可美容用赋形剂，其选自保湿剂、pH调节剂、增稠剂和防腐剂。
在某些实施方式中，所述干燥的蛋白质组合物与水性重构组合物之间的重量比为至少1:20，例如至少1:25，在1:20至1:100的范围内，在1:20–1:50的范围内。每种可能性代表本发明的独立实施方式。在某些实施方式中，所述干燥的蛋白质组合物与水性重构组合物之间的重量比在1:20至1:50的范围内。
在某些实施方式中，在混合后，所述干燥的(例如冻干的)蛋白质组合物在30秒以内，例如在20秒以内重构。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
在某些实施方式中，在与所述水性重构组合物混合之前，所述干燥的蛋白质组合物的pH在7.0-7.6的范围内。
在某些实施方式中，在与所述干燥的蛋白质组合物混合之前，所述水性重构组合物的pH在7.0-7.6的范围内。
在某些实施方式中，在混合所述两种组合物后所述重构的组合物的pH在7.0-7.6的范围内。
应该理解，所述在混合后获得的最终的重构的组合物优选为等渗的。
所述适合于局部施用的重构的组合物通常采取选自乳液、霜剂和凝胶的形式。每种可能性代表独立的实施方式。在目前优选的实施方式中，所述重构的组合物是乳液。
本发明的美容组合物适合于施用到任何皮肤部位，包括例如面部、颈部、手臂和手。
在某些实施方式中，所述美容产品被提供为预充式注射器，其中所述注射器包含：包含所述水性重构组合物的第一区室，包含所述干燥的蛋白质组合物的第二区室，和柱塞，其中在移动所述柱塞后，所述水性重构组合物从所述第一区室递送到第二区室中并与所述干燥的蛋白质组合物混合，用于重构。
根据另一方面，本发明提供了一种改善与衰老相关的至少一种皮肤病症的方法，所述方法包括：提供本文所公开的双组分美容产品；将所述干燥的蛋白质组合物与水性重构组合物混合，以形成适合于施用到皮肤的重构的组合物；以及施用到皮肤。
从下面的详细描述、实施例和权利要求书，本发明的这些和其他方面和特点将变得显而易见。
附图说明
图1.蛋白质级分的配制——填充剂的选择。F1-F17制剂的组成。值代表％w/v。
图2.填充剂表征。组合物F1-F7的冻干过程中的材料损失、冻干后质地和重构时间。
图3.填充剂表征。组合物F8-F17的冻干后残留水含量和重构时间。
图4.组合物F8-F17的(A)重构时间和(B)冻干后残留水含量的图形表述。
图5.蛋白质级分的示例性水性制剂。值指示如文中指定的从相应的储用溶液取出的体积。
图6.调制培养基(“CM”)对原代表皮角化细胞的增殖的影响；正常人类成年(NHPEK)细胞。(A，B)细胞的相对增殖，分别为100k/ml或50k/ml NHPEK细胞；(C，D)群体增量，分别为100k/ml或50k/ml NHPEK细胞；(E，F)倍增时间，分别为100k/ml或50k/ml NHPEK细胞；(G，H)存活率(MPI)，分别为100k/ml或50k/ml NHPEK细胞。
图7.调制培养基(“CM”)和配制的蛋白质级分(“F19”)对NHPEK细胞增殖的影响。(A)细胞的相对增殖；(B)群体增量；(C)倍增时间；(D)存活率(MPI)。
图8.通过过滤进行的生长培养基清除。
图9.稳定性测定。根据本发明的冻干的蛋白质组合物的(A)长期稳定性测定和(B)加速稳定性测定。根据本发明的重构组合物的(C)长期稳定性测定和(D)加速稳定性测定。
图10.根据本发明的美容产品的消费者认知——调查问卷答复。(A)问题1-12；(B)问题13。
图11.根据本发明的某些实施方式的作为预充式注射器提供的美容产品。
图12.产品表征——外泌体含量。(A)外泌体标志物表达的流式细胞术分析的示意图；(B)外泌体标志物表达结果；(C)使用NanoSightTM的外泌体定量
具体实施方式
本发明提供了从脂肪源性干细胞的调制培养基制备的抗衰老美容产品，其具有保质期长和长期稳定的特征。根据某些实施方式，通过提供由两种分开的组分组成的产品(所述组分是稳定的并在即将使用之前混合以形成用于局部施用的组合物)，本发明克服了美容组合物的不稳定和保质期有限的问题。
更具体来说，在某些实施方式中，由本发明提供的美容组合物是即混型组合物，包含两种分开的组分：干燥形式(例如冻干形式)的蛋白质组合物，其充当所述产品的美容活性成分，包含从脂肪源性干细胞调制培养基纯化的蛋白质级分；和重构组合物，用于在即将施用到皮肤之前重构所述干燥的蛋白质组分。所述两种组分在生产、运输和储存期间保持分开，并在使用前直接混合。
本发明的蛋白质组合物包含蛋白质级分，所述蛋白质级分包含在浓缩和分离以除去小于1kDa的组分后剩余的蛋白质和粒子。在某些实施方式中，所述蛋白质级分包含在浓缩和分离以除去小于3kDa的组分后剩余的蛋白质和粒子。在某些特定实施方式中，所述蛋白质级分使用具有适合的分子量截留值(例如1kDa或3kDa)的切向流过滤(TFF)从脂肪源性干细胞调制培养基获得。发现根据本发明所述的蛋白质级分在使用6周后，在软化皮肤和减小皱纹深度方面非常有效。
因此，本发明提供了具有改善的稳定性和延长的保质期的有效的抗衰老美容产品。
脂肪源性干细胞分离和调制培养基的制备
在下面的实施例章节中描述了从皮下脂肪获得脂肪源性干细胞(ADSC)的示例性方法。通常，ADSC可以通过包括下述步骤的方法从皮下脂肪获得：
(a)获得脂肪抽吸物；
(b)使用组织解离酶或通过机械破碎解离所述脂肪抽吸物；
(c)通过离心使包含ADSC的细胞级分沉淀，并任选地用能够支持细胞生存的悬浮介质(例如使用等渗缓冲液或培养基)清洗所述沉淀物并对所述悬液进行至少一次另外的离心；
(d)将所述在步骤(c)中得到的沉淀物重悬于能够支持细胞生存的悬浮介质(例如等渗缓冲液或培养基)中，并从所述重悬的沉淀物中的细胞群体选择ADSC；
(e)在所述ADSC选择之前任选地进行至少一次过滤；以及
(f)任选地将所述ADSC培养至少3次传代。
在某些实施方式中，使用新鲜的脂肪抽吸物。在其他实施方式中，使用冷冻的脂肪抽吸物。根据这些实施方式，获得ADSC可以包括下述步骤：
(a)将脂肪抽吸物冷冻；
(b)将所述脂肪抽吸物解冻并使用组织解离酶或通过机械破碎进行解离；
(c)通过离心使包含ADSC的细胞级分沉淀，并任选地用能够支持细胞生存的悬浮介质(例如使用等渗缓冲液或培养基)清洗所述沉淀物并对所述悬液进行至少一次另外的离心；
(d)将所述在步骤(c)中得到的沉淀物重悬于能够支持细胞生存的悬浮介质(例如等渗缓冲液或培养基)中，并从所述重悬的沉淀物中的细胞群体选择ADSC；
(e)在所述ADSC选择之前任选地进行至少一次过滤；以及
(f)任选地将所述ADSC培养至少3次传代。
本发明利用脂肪源性间充质干细胞，特别是人类脂肪源性间充质干细胞。当在本文中使用时，术语“脂肪源性间充质干细胞”或“脂肪源性干细胞”缩写为“ADSC”或“hADSC”(即人类脂肪源性干细胞)，是指从脂肪组织收获的粘附塑料的多能细胞群体。所述细胞群体的特征在于至少90％的细胞阳性表达CD73、CD90和CD105并且少于5％的细胞阳性表达CD45。所述人类脂肪源性干细胞的群体通常进一步具有至少70％的存活率和成纤维细胞样形态的特征。
细胞表面标志物表达的表征可以通过本领域中已知的方法来进行，例如使用荧光激活细胞分拣(FACS)。FACS流程被综述在例如“流式细胞术流程》(Flow CytometryProtocols)，Methods in Molecular Biology，第699卷，2011，主编：Teresa S.Hawley,Robert G，Hawley Humana Press中。示例性程序在下文描述。
根据本发明的ADSC优选地未被遗传修饰。
根据本发明的实施方式的ADSC源自于人类皮下脂肪。根据特定实施方式，所述细胞源自于通过吸脂抽吸术获得的人类皮下脂肪。ADSC可以通过身体各个不同区域中的吸脂手术获得，包括胃、髋、大腿、手臂、颈部和臀部。根据本发明，可以使用任何吸脂程序来获得ADSC，包括但不限于激光、超声和通过腹部整形术去除脂肪。
对脂肪组织进行处理以分离所述脂肪源性干细胞。制备方法通常包括下述步骤：用缓冲液例如PBS和盐水和/或用生长培养基(通常不含任何添加物例如外部细胞因子或生长因子)例如DMEM、StemMACSTM或Plasma-Lyte清洗所述组织，和使用组织解离酶例如胶原酶处理所述组织和/或对所述组织进行非酶促法机械破碎，例如使用诸如Tulip NanoTransferTM的装置。样品的酶消化也可以使用分散酶和胶原酶的组合来进行。通常聚集的脂质体，可以通过离心与包括干细胞和其他细胞例如红细胞、内皮细胞和成纤维细胞的游离基质细胞分离开。可以使用适合的裂解缓冲液从悬浮的沉淀物中裂解红细胞，剩余的细胞可以被过滤或离心。
在某些实施方式中，所述ADSC可以在不施加缓冲液以引起最初存在于脂肪抽吸物中的红细胞裂解的情况下获得。因此，在某些实施方式中，在不施加红细胞裂解缓冲液的情况下对所述脂肪抽吸物进行处理以分离脂肪源性干细胞。在不使用红细胞裂解缓冲液的情况下分离脂肪源性干细胞的一种方法包括在进一步加工之前冻融所述脂肪组织，正如在转让给本发明的申请人的WO 2018/211498中所描述的。在其他实施方式中，在通过离心将包含hADSC的细胞级分沉淀之后并在从所述细胞群体选择hADSC之前施加红细胞裂解缓冲液。
根据某些实施方式，脂肪抽吸物的冷冻如下进行：将脂肪抽吸物置于冻存袋中，并以10％的终浓度添加DMSO。将所述冻存袋置于冷冻罐中，并将样品在-80℃保持过夜(～24小时)。然后将冷冻的样品转移到气相液氮罐中。可以在储存期间进行稳定性测试。对于解冻来说，根据某些实施方式，将样品取出并在室温下放置几分钟，通常为5-10分钟。然后将样品在37℃的水浴中解冻几分钟，通常在5-10分钟之间或直至大部分样品解冻。然后在37℃下用能够支持细胞生存的悬浮介质清洗样品，所述介质在本文中被定义为适合于间充质干细胞的等渗缓冲液或培养基，例如缓冲液如PBS。样品通常被清洗两次。
在某些实施方式中，所述方法包括进行至少一次过滤。在某些实施方式中，通过100微米筛网，随后通过40微米筛网进行过滤，以便进一步解离组织并促进SVF级分的收集。
为了从SCF级分中的细胞群体中分离ADSC，通常使用诸如通过贴附到细胞培养容器(例如通过塑料贴附)和/或通过珠子/抗体进行选择的方法。任选地，可以通过细胞分拣或免疫组织化学来分离细胞。Bunnell等，(2008)Methods.,45(2):115–120综述了用于分离ADSC的方法。
通过贴附到培养容器进行选择通常如下进行：将SVF细胞接种到含有适合的培养基并且没有任何涂层的培养瓶(例如塑料培养瓶)中；将所述接种的细胞温育过夜(在某些实施方式中至少12小时或24-48小时之间)；清洗所述培养瓶以除去未贴附细胞和组织碎片；以及向培养瓶添加新鲜培养基。可以将所述贴附细胞(ADSC)培养至所需的汇合水平，然后可以收集它们并储存或传代培养以继续传代。通常，所述细胞被传代培养3-10之间、优选地3-5或3-4之间的传代数。可以将所述细胞冷冻储存直至使用。
为了产生调制培养基，将冷冻细胞的样品解冻，将所述细胞接种在细胞培养容器中并在细胞培养基中培养，首先在含血清细胞培养基中，随后在无血清细胞培养基中。所述细胞培养基是充分针对所培养的细胞的营养需求的培养基。用于间充质干细胞的培养基是可商购的。例如，所述培养基可以基于添加或不添加血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)。作为血清，可以添加胎牛血清(FBS)。不添加FBS使用的DMEM是无血清培养基。可以向DMEM培养基添加FBS以及L-谷氨酰胺和抗生素(例如硫酸庆大霉素)，以获得“完全血清培养基”或“完全培养基”。
在某些实施方式中，将所述细胞在含血清培养基中培养大约24小时，然后将培养基更换成无血清培养基。所述无血清培养基优选为无动物制品的培养基(无异种蛋白)。
所述细胞培养优选地在35-39℃的温度和5±1％CO2的条件下在温箱中进行。所述细胞培养通常是二维细胞培养。
一旦所述培养基与细胞温育，它被本领域技术人员称为“用过的”或“调制培养基”。调制培养基含有所述培养基的许多原始组分以及各种不同的细胞代谢物和分泌蛋白，例如生物活性生长因子。
将所述细胞在无血清培养基中培养至少48小时并且优选地不超过72小时，然后收集所述培养基。在某些实施方式中，将所述细胞在无血清培养基中培养48-96小时，然后收集所述培养基。在其他实施方式中，将所述细胞在无血清培养基中培养48-72小时，然后收集所述培养基。在所述无血清培养基中温育后，从所述培养基分离出细胞和任何细胞碎片(例如通过离心或过滤)并收集所述调制培养基。所述收集的调制培养基可以在收集后立即进行处理，或冷冻储存直至使用。
蛋白质级分的纯化和干燥的蛋白质组合物的生产
本发明的蛋白质级分通过处理所述调制培养基以除去小于1kDa的组分、优选地通过除去小于3kDa的组分来获得。所述蛋白质级分优选地从所述细胞培养基的成分纯化并用美容赋形剂配制。下面的章节描述了根据本发明的某些实施方式的蛋白质级分的纯化，其基于使用切向流过滤(TFF)系统的浓缩、过滤和渗滤。本领域技术人员将会认识到用于纯化蛋白质级分的其他方法可以与本发明一起使用，包括例如离心过滤、透析、沉淀及其组合。
优选地对所述调制培养基(新鲜或解冻的)进行浓缩，以获得所需体积的浓缩的调制培养基。取决于所述调制培养基的初始体积，浓缩倍数通常在2-10的范围内。所述调制培养基的浓缩可以在所述蛋白质级分的纯化之前或期间进行。
在某些实施方式中，使用切向流过滤(TFF)系统处理所述调制培养基，以浓缩所述调制培养基并除去小于1kDa的组分，优选地除去小于3kDa的组分。所述纯化的蛋白质级分作为渗余物获得。在某些实施方式中，使用分子量截留值为1kDa的TFF系统处理所述调制培养基。在其他实施方式中，使用分子量截留值为3kDa的TFF系统处理所述调制培养基。在某些实施方式中，可以使用高达10kDa的更高的分子量截留值(例如5kDa截留值或10kDa截留值)。
所述渗余物(纯化的蛋白质级分)包含蛋白质(包括各种不同生长因子)和外泌体。在某些实施方式中，所述蛋白质级分的外泌体含量为每1mg总蛋白至少109个外泌体。在其他实施方式中，所述蛋白质级分的外泌体含量为每1mg总蛋白至少108个外泌体。
在某些实施方式中，对所述渗余物(蛋白质级分)进行渗滤以便将所述调制培养基用包含美容赋形剂的液体制剂代替，并获得用所述美容赋形剂配制的纯化的蛋白质级分。
在某些实施方式中，为了从调制培养基纯化所述蛋白质级分，使用具有1kDa分子量截留值的过滤系统进行过滤，以获得已从中除去小于1kDa的分子和粒子的渗余物。在某些实施方式中，使用具有3kDa分子量截留值的过滤系统进行过滤，以获得已从中除去小于3kDa的分子和粒子的渗余物。在某些实施方式中，可以使用高达10kDa的更高的分子量截留值(例如5kDa截留值或10kDa截留值)。
在某些实施方式中，所述蛋白质级分是使用1kDa的分子量截留值通过过滤从所述人类脂肪源性干细胞调制培养基纯化的蛋白质级分。在某些实施方式中，所述蛋白质级分是使用3kDa的分子量截留值通过过滤从所述人类脂肪源性干细胞调制培养基纯化的蛋白质级分。在某些实施方式中，可以使用高达10kDa的更高的分子量截留值(例如5kDa截留值或10kDa截留值)。
所述纯化的蛋白质级分在本文中也被称为“间充质生长因子(MGF)级分”、“MGF制备物”等。
本文中公开的纯化的蛋白质级分基本上不含源自于细胞培养基的组分，例如下文中示例的各种不同金属。例如，所述蛋白质级分基本上不含Mg、Ca和K。因此，本发明的干燥的(例如冻干的)蛋白质组合物基本上不含Mg、Ca和K。当在本文中使用时，“基本上不含”表明量低于可检测的量，例如对于Ca和K来说低于1mg/kg，对于Mg来说低于0.2mg/kg。
然后对所述包含纯化的蛋白质级分和美容赋形剂的液体制剂进行干燥例如冻干(也被称为“冷冻干燥”)，以获得粉剂形式的干燥的(例如冻干的)蛋白质组合物。根据本发明的干燥的蛋白质组合物优选地含有少于5％wt的残留水。在某些实施方式中，所述干燥的蛋白质组合物含有少于2％wt的残留水。
在某些实施方式中，本文提供了一种生产美容组合物的方法，所述美容组合物包含从人类脂肪源性干细胞调制培养基纯化的蛋白质级分的，所述方法包括：获得人类脂肪源性干细胞(hADSC)；将所述hADSC在含血清培养基中培养至少24小时；将所述hADSC在无血清培养基中传代培养至少48小时以获得调制培养基；分离所述hADSC(包括细胞碎片)并收集所述调制培养基；浓缩所述调制培养基并除去小于1kDa的组分以获得蛋白质级分；用美容赋形剂配制所述蛋白质级分；以及干燥(例如冻干)所述配制的蛋白质级分。
在某些实施方式中，本文提供了一种生产美容组合物的方法，所述美容组合物包含从人类脂肪源性干细胞调制培养基纯化的蛋白质级分的，所述方法包括：获得人类脂肪源性干细胞(hADSC)；将所述hADSC在含血清培养基中培养至少24小时；将所述hADSC在无血清培养基中传代培养至少48小时以获得调制培养基；分离所述hADSC(包括细胞碎片)并收集所述调制培养基；浓缩所述调制培养基并除去小于3kDa的组分以获得蛋白质级分；用美容赋形剂配制所述蛋白质级分；以及干燥(例如冻干)所述配制的蛋白质级分。
在某些实施方式中，浓缩所述调制培养基并除去小于1kDa的组分使用分子量截留值为1kDa的过滤系统来进行。在某些实施方式中，浓缩所述调制培养基并除去小于1kDa的组分使用分子量截留值为1kDa的切向流过滤(TFF)系统来进行。
在某些实施方式中，浓缩所述调制培养基并除去小于3kDa的组分使用分子量截留值为3kDa的过滤系统来进行。在某些实施方式中，浓缩所述调制培养基并除去小于3kDa的组分使用分子量截留值为3kDa的切向流过滤(TFF)系统来进行。
在某些实施方式中，用美容赋形剂配制所述蛋白质级分使用透析来进行。在某些实施方式中，用美容赋形剂配制所述蛋白质级分使用渗滤来进行。
在某些实施方式中，本文提供了一种美容组合物，其通过本发明的方法来生产。
在某些实施方式中，本文提供了一种双组分美容产品，其包含通过本发明的方法获得的干燥的(例如冻干的)蛋白质组合物和重构组合物。
干燥的(例如冻干的)蛋白质组合物
术语“蛋白质组合物”或“蛋白质组分”在本文中可互换使用，并且是指本发明的蛋白质级分(即从脂肪源性干细胞调制培养基纯化的蛋白质级分)与一种或多种可美容用赋形剂的制备物，所述赋形剂被设计用于维持稳定性并便于重构，以将所述蛋白质级分施用到受试者的皮肤。根据本发明，所述受试者通常是人类受试者。
术语“可美容用赋形剂”当在本文中使用时是指不对皮肤造成显著刺激并且不废除本发明的蛋白质级分的有益活性和特性的赋形剂。
在某些实施方式中，本发明的美容产品被提供为一对小瓶，即含有所述干燥的(例如冻干的)蛋白质组合物的蛋白质小瓶和含有所述重构组合物的重构小瓶，其中每个小瓶中的量适合于混合和重构，以获得适合于施用到皮肤的美容组合物。在其他实施方式中，本发明的美容产品被提供为预充式注射器，正如在图11中所示。在所述图示的实例中，所述预充式注射器包含：包含所述水性重构组合物的第一区室；包含所述干燥的(例如冻干的)蛋白质组合物的第二区室；和柱塞，其中在移动所述柱塞后，所述水性重构组合物从所述第一区室递送到第二区室中并与所述干燥的蛋白质组合物混合，用于重构。
在某些实施方式中，根据本发明的干燥的(例如冻干的)蛋白质组合物的蛋白质含量为至少0.2μg/mg粉剂。在其他实施方式中，所述干燥的(例如冻干的)蛋白质组合物的蛋白质含量为至少0.25μg/mg粉剂。在某些实施方式中，所述干燥的(例如冻干的)蛋白质组合物的蛋白质含量在0.2-0.5μg/mg粉剂的范围内。
本发明的即混型干燥的(例如冻干的)蛋白质组合物的蛋白质含量优选为至少0.2μg/mg粉剂，意味着准备与重构组合物混合的干燥的蛋白质组合物的等分试样(例如包含所述冻干的蛋白质组合物的小瓶或包含所述蛋白质组合物的注射器区室)的蛋白质含量为至少0.2μg/mg粉剂。在其他实施方式中，所述干燥的蛋白质组合物的蛋白质含量为至少0.25μg/mg粉剂。在某些实施方式中，所述干燥的蛋白质组合物的蛋白质含量在0.2-0.5μg/mg粉剂的范围内。
在某些实施方式中，本发明的蛋白质组合物不含非人类动物的蛋白质。
包含在所述蛋白质组合物中的赋形剂通常包括填充剂。填充剂通常用于增加干燥的(例如冻干的)制剂的质量。填充剂可能对所述干燥的(例如冻干的)饼的物理结构、均匀性和稳定性有贡献。术语“饼”是指当如本文中所述将液体制剂干燥(例如冻干)时产生的干燥沉淀物。对于每个小瓶仅需少量的强效生物制剂来说，填充剂是特别需要的。通常，填充剂也可以在所述制剂中提供额外的功能，例如稳定剂和/或张度剂。
适用于肽和/或蛋白质的干燥制剂的填充剂的实例包括糖类例如甘露醇、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖。每种可能性代表本发明的独立实施方式。用于肽和/或蛋白质的干燥制剂的填充剂的其他实例包括氨基酸，例如组氨酸、精氨酸和甘氨酸。每种可能性代表本发明的独立实施方式。它们中的一些也可以充当缓冲剂和/或稳定剂。白蛋白是又一种可以充当填充剂和稳定剂的赋形剂。根据某些优选实施方式，在本发明的蛋白质组合物中使用的填充剂不是蛋白质。在某些实施方式中，所述填充剂包含糖。在某些实施方式中，所述填充剂是糖。
包含在所述蛋白质组合物中的赋形剂通常还包括张度剂。通常希望本发明的美容组合物在混合后和施用到皮肤之前是等渗的。氯化钠是张度剂的实例。应该对最终的组成和重构体积进行选择以实现等渗。
在某些实施方式中，本发明的蛋白质组合物包含糖作为填充剂，其也充当张度剂。例如，甘露醇是一种也充当张度剂的糖填充剂。在某些实施方式中，所述蛋白质组合物包含糖填充剂和至少一种张度剂例如氯化钠。
可以添加/包含在本发明的蛋白质组合物中的其他赋形剂包括：稳定剂(例如EDTA)，缓冲剂例如柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)、磷酸盐(例如单水合磷酸二氢钠)、Tris和乙酸盐，抗氧化剂(例如抗坏血酸、柠檬酸)，表面活性剂例如非离子型表面活性剂(例如聚山梨醇酯)，及其组合。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
在某些实施方式中，根据本发明的蛋白质组合物中的至少一种可美容用赋形剂包括至少一种填充剂、至少一种稳定剂和至少一种张度剂。
正如上文提到的，在某些实施方式中，将所述蛋白质级分从所述调制培养基纯化并在包含所述美容赋形剂的液体制剂(水性制剂)中配制，随后对所述液体制剂进行干燥(例如冻干)。在某些实施方式中，对所述从调制培养基纯化的蛋白质级分进行渗滤，以便用所述水性制剂配制所述蛋白质级分。
在某些实施方式中，所述水性制剂包含2％-10％(w/v)之间的填充剂或填充剂的组合，例如2％-5％(w/v)之间的填充剂或填充剂的组合，包括所述指定范围内的每个值。在某些实施方式中，在干燥(例如冻干)后，所述干燥的(例如冻干的)蛋白质组合物包含70％-85％(w/w)之间的所述填充剂或填充剂的组合。
在某些实施方式中，所述水性制剂包含0.01-1％(w/v)之间的稳定剂例如EDTA，例如0.025-0.5％(w/v)之间的所述稳定剂，包括所述指定范围内的每个值。在某些实施方式中，在干燥(例如冻干)后，所述干燥的(例如冻干的)蛋白质组合物包含1.0％-1.5％(w/w)之间的所述稳定剂。
在某些实施方式中，所述水性制剂包含0.1-1％(w/v)之间的张度剂，例如0.25％-1％(w/v)之间的张度剂，包括所述指定范围内的每个值。在某些实施方式中，在干燥(例如冻干)后，所述干燥的(例如冻干的)蛋白质组合物包含10％-15％(w/w)之间的所述张度剂。
基于蛋白质/肽的产品的配制和冻干被综述在例如下述文献中：Costantino和Pikal主编，《生物药物的冻干》(Lyophilization of Biopharmaceuticals)，SpringerScience&Business Media,2004；Pearlman和Wang主编，《蛋白质和肽类药物的稳定性和表征：案例历史》(Stability and Characterization of Protein and Peptide Drugs:CaseHistories)，Springer Science&Business Media,，2013年6月29日。
重构组合物
术语“重构组合物”或“重构介质”等在本文中可互换使用，并且是指包含一种或多种便于所述干燥的蛋白质组合物的重构和向受试者皮肤施用的可美容用赋形剂的水性组合物。
包含在所述重构组合物中的赋形剂通常包括乳化剂和润肤剂，并且任选地还包括增稠剂、缓冲剂或pH调节剂、保湿剂及其组合。每种可能性代表独立的实施方式。可以包括的其他赋形剂包括表面活性剂、抗氧化剂、香料、着色剂及其组合。每种可能性代表独立的实施方式。本发明的重构组合物通常包含抗微生物防腐剂。
适合的乳化剂包括但不限于硬脂酸的聚乙二醇醚例如硬脂醇聚醚-2、硬脂醇聚醚-4、硬脂醇聚醚-6、硬脂醇聚醚-7、硬脂醇聚醚-10、硬脂醇聚醚-11、硬脂醇聚醚-13、硬脂醇聚醚-15和硬脂醇聚醚-20、硬脂酸甘油酯、硬脂醇、鲸蜡醇、鲸蜡硬脂醇、山嵛醇、二乙醇胺、卵磷脂、聚乙二醇及其组合。每种可能性代表独立的实施方式。乳化剂的组合是可商购的，例如在商标Dow
Figure BDA0003852300010000231
5225C(DC 5225C)、MontanovTM68、
Figure BDA0003852300010000232
Delta下。
适合的润肤剂包括有助于施用和黏附、产生光泽并提供封闭性保湿的脂肪、油、脂肪醇、脂肪酸和酯。实例包括但不限于硅油(例如可以在商标Dow
Figure BDA0003852300010000233
245(DC 245)和Dow
Figure BDA0003852300010000234
246(DC 246)下获得的那些)、甘油、烃油和蜡，包括矿物油、凡士林、石蜡、纯白地蜡、地蜡、微晶蜡、聚乙烯和全氢角鲨烯；甘油三酯脂肪和油，包括源自于植物、动物和海洋来源的那些，包括荷荷巴油和乳木果油；乙酰甘油酯，例如乙酰化甘油单酯；乙氧基化甘油酯，例如乙氧基化甘油单硬脂酸酯；脂肪酸、脂肪醇及其衍生物，例如肉豆蔻酸异丙酯。每种可能性代表独立的实施方式。
适合的增稠剂包括但不限于各种不同的聚合物，例如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、丙烯酰胺共聚物、丙烯酸钠共聚物、海藻酸钠、海藻酸钙、海藻酸镁、海藻酸、透明质酸、聚葡萄糖醛酸(聚-α-和-β-1,4-葡萄糖醛酸)、硫酸软骨素、角叉藻胶、羧甲基纤维素、聚羧酸、卡波姆、膨润土、几丁质、壳聚糖、羧甲基几丁质和可以在商标
Figure BDA0003852300010000235
下获得的交联聚丙烯酸酯材料，以及聚合物例如羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮、PVP)、聚乙烯醇、中高分子量聚乙二醇(PEG-3350、PEG-6000等)、葡萄糖苷、依替膦酸四钠。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
适合的缓冲或pH调节剂包括但不限于酸性缓冲剂例如短链脂肪酸、柠檬酸、乙酸、盐酸、硫酸和延胡索酸；以及碱性缓冲剂例如tris、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾和氢氧化镁。每种可能性代表独立的实施方式。
适合的保湿剂包括但不限于二醇类例如三甘醇、三丙二醇、丙二醇、聚丙二醇、丁二醇、聚乙二醇、糖醇例如山梨糖醇、己烯、尿素和胶原蛋白。每种可能性代表独立的实施方式。
可美容用抗微生物防腐剂的实例包括甲醛释放剂(例如咪唑烷基脲)、对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、异噻唑啉酮类(例如卡松)、苯氧乙醇(例如optiphen)和有机酸(例如苯甲酸/苯甲酸钠、山梨酸/山梨酸钾)。每种可能性代表本发明的独立实施方式。
本发明的美容组合物和产品可用于嫩肤、改善皮肤外观、肤色等。特别地，本发明的美容组合物和产品可用于改善各种不同的皮肤病症，包括例如皱纹、细纹、皮肤瑕疵、包括雀斑或日晒斑在内的皮肤斑点、不均匀的肤色或质地、紫外线辐射引起的皮肤损伤或皮肤光损伤、皮肤色素沉着过度或黄褐斑、皮肤干燥、皮肤松弛、皮肤粗糙及其任何组合。
提供了下述实施例以便更全面地说明本发明的某些实施方式。然而，它们决不应被解释为限制本发明的广泛范围。在不背离本发明的范围的情况下，本领域的技术人员可以容易地设计出本文公开的原理的许多变化和修改。
实施例
实施例1
根据本发明的蛋白质级分的生产
1.脂肪抽吸物组织冷冻保存
脂肪抽吸物组织的制备
获取脂肪抽吸物样品并除去容器底部处(漂浮组织下方)的水性层。将剩余的组织转移到500ml/1000ml无菌瓶中。
脂肪抽吸物组织的清洗
估算组织体积(ml)，并向含有组织的瓶中添加等体积的冷PBS。将瓶关闭、倒置并轻轻旋转以促进层分离并协助清洗过程。然后将瓶直立放置，允许两相分离。接下来，除去在脂肪组织下方形成的水性层。将上述用PBS的清洗再重复3次。
脂肪抽吸物组织冻存袋
小心地吸出在组织顶部形成的黄色薄层(如果有的话)并丢弃。测量实际脂肪组织体积(ml)并据此计算所需冻存袋的数量。接下来，将150ml(或其他剩余体积)的脂肪组织转移到每个冻存袋。不将组织块收集到注射器中以避免阻塞。舍弃任何剩余的组织。
DMSO溶液制备
如下计算所需的50％DMSO溶液体积：
DMSO溶液体积＝0.27ml x实际脂肪组织体积
所需体积的50％DMSO溶液通过将等体积的均处于22±5℃下的100％DMSO和PBS混合来制备。将得到的50％DMSO溶液保持在冰中直至使用。
DMSO溶液添加
向每个冻存袋中每1ml组织缓慢添加0.25ml冷50％DMSO溶液(即对于150ml组织来说添加37.5ml 50％DMSO溶液)。在添加DMSO的同时，轻轻地用手按压和按摩冻存袋，使DMSO均匀分布。将冷冻袋的管子在～2cm和～4cm处密封两次，并在第二个密封点后切割。将每个冻存袋放入相应的冷冻袋中，并密封二级冷冻袋。将每个冷冻袋转移到冷冻罐中，置于-80℃冰箱中保存18-24小时。
对于长期储存来说，将冷冻罐从-80℃冰箱转移到气相氮气储存容器中。
2.脂肪抽吸物组织的解冻和基质血管级分(SVF)的分离
溶液的制备
(在PBS中)制备5％的胶原酶储用溶液(50mg/ml)。
细胞培养基制备
通过向DMEM LG中添加L-谷氨酰胺、FBS和硫酸庆大霉素来制备DMEM LG完全培养基。将制备的DMEM LG完全生长培养基保持在2-8℃下直至使用。
通过向DMEM LG中仅添加L-谷氨酰胺和硫酸庆大霉素来制备不含FBS的DMEM LG培养基。将制备的生长培养基保持在2-8℃下直至使用。
脂肪抽吸物组织的解冻
将PBS在37±1℃水浴中加温。将含有待解冻的冻存袋的罐从蒸气氮罐/-80℃冰箱取出并打开。从罐中取出冻存袋并在室温保持5±0.5分钟。然后将冻存袋在37±1℃水浴中放置5±0.5分钟。接下来，将每个冻存袋干燥并打开。将组织转移到500ml无菌瓶中，并用等体积预加温的PBS清洗两次。
组织处理和基质血管级分(SVF)分离
将清洗过的组织转移到500ml离心管。记录粗略的组织体积(ml)。对于150ml组织来说，向无菌瓶中添加7.5ml 5％胶原酶储用溶液。接下来，向含有胶原酶的瓶中添加0.6ml1M CaCl2储用溶液和142ml PBS(终体积150ml)。将所述含有胶原酶的瓶在37±1℃水浴中加温～15分钟。然后将瓶中的胶原酶溶液以1:1v/v的比例(胶原酶：组织)添加到含有组织的离心管，并将离心管旋转～10秒。然后将离心管置于37±1℃水浴中振摇(130rpm)～35分钟。接下来，将离心管从水浴取出，并在RT下添加不含FBS的DMEM LG培养基(每150ml初始组织200ml不含FBS的DMEM LG培养基)。关上离心管并在500xg、21±2℃下离心10分钟。离心后除去大部分上清液，留下～5ml，通过上下吸打将沉淀物重悬，随后转移到50ml锥形管中。接下来，向所述50ml锥形管添加45ml不含FBS的DMEM L/G，并使用台式离心机将锥形管在500xg、21±2℃下离心10分钟。离心后，取出上清液并舍弃。将细胞沉淀物重悬于10ml红细胞裂解缓冲液中，并在室温温育10±1分钟。接下来添加20ml PBS(RT)，并将样品在500xg、21±2℃下离心10分钟。将细胞沉淀物重悬于5ml不含FBS的DMEM LG培养基中。将100μm细胞过滤器置于新的50ml管顶上并过滤悬液。使用台式离心机将滤液在500xg、21±2℃下离心10分钟。舍弃上清液并将细胞沉淀物重悬于5ml不含FBS的DMEM LG培养基中。然后通过将40μm细胞过滤器放置在新的50ml管顶上并过滤悬液，进行第二次过滤。将过滤器用额外5ml不含FBS的DMEM LG培养基冲洗，并使用台式离心机将滤液在500xg、21±2℃下离心10分钟。舍弃上清液并将细胞沉淀物重悬浮在5ml完全DMEM LG培养基(～37℃)中。得到的样品被称为基质血管级分(SVF)。
SVF细胞计数
在Eppendorf管中，通过将20μl细胞悬液转移到180μl完全DMEM LG中，制备200μl1:10稀释的细胞悬液样品，并对细胞进行计数。
SVF接种
将细胞以～3.5x105个细胞/cm2的浓度接种在没有任何包被的细胞培养瓶中：
-对于175cm2瓶来说，接种6x106个细胞
-对于75cm2瓶来说，接种2.6x106个细胞
向每个175cm2瓶中添加35ml完全DMEM LG。向每个75cm2瓶中添加15ml完全DMEMLG。将瓶在温箱中，在5±1％CO2、37±2.5℃下温育过夜，以选择塑料贴附细胞(脂肪源性干细胞，ADSC)。
培养基更换
将完全DMEM LG和PBS瓶在37±1℃水浴中预加温30±5分钟。将细胞瓶从温箱取出并从瓶中吸出培养基。通过小心地向每个75cm2瓶中添加5ml或向每个175cm2瓶中添加10ml温热的PBS，然后使用无菌移液管吸出PBS，将细胞清洗两次以除去未贴壁细胞和组织碎片。接下来向每个75cm2瓶中添加15ml或向每个175cm2瓶中添加35ml完全DMEM LG，并将瓶在温箱中，在5±1％CO2、37±2.5℃下温育。
每2-3天更换培养基，将细胞生长至70％-100％细胞汇合。
3.间充质干细胞的收获和重新培养
生长培养基制备
通过向
Figure BDA0003852300010000271
中添加L-谷氨酰胺、
Figure BDA0003852300010000272
增补剂和硫酸庆大霉素来制备
Figure BDA0003852300010000273
生长培养基。将制备的
Figure BDA0003852300010000274
生长培养基在37±1C°水浴中加温30±5分钟。
细胞培养瓶的包被
通过用无菌PBS 1:100溶解浓附着溶液来制备MSC附着溶液(BiologicalIndustries)，其由无菌、亲和纯化的支持在无血清培养基中培养的人类间充质干细胞(hMSC)附着和蔓延的人类纤连蛋白(hFN)组成。将所述制备的附着溶液保持在室温并在培养瓶包被的当天使用。将所述制备的附着溶液转移到175cm2瓶(10ml)或75cm2瓶(5ml)。通过轻轻倾斜培养瓶验证所述附着溶液良好地分散在瓶上。将所述包被的瓶转移到5±1％CO2、37±2.5℃温箱至少30分钟。
细胞的收获
将所述制备的
Figure BDA0003852300010000281
生长培养基从水浴中取出。将含有细胞的培养瓶小心地从温箱取出并从瓶中吸出培养基。将每个瓶用PBS(对于175cm2瓶来说10ml PBS，对于75cm2瓶来说5ml PBS)清洗，随后吸出PBS。接下来，通过在室温下向每个瓶中添加TrypLETM(对于175cm2瓶来说10ml，对于75cm2瓶来说5ml)并将所述瓶在5±1％CO2、37±2.5℃温箱中温育至多10分钟，将细胞进行胰蛋白酶处理。然后将瓶从温箱取出，并在显微镜下观察是否大多数细胞被分离。如果不是，轻轻敲击瓶以分离剩余的细胞。如有必要，重复胰蛋白酶消化。在胰蛋白酶消化后，将
Figure BDA0003852300010000285
生长培养基添加到每个瓶中(每个175cm2瓶10ml，每个75cm2瓶5ml)，并轻轻上下吸移悬液以清洗组织培养瓶。然后将悬液转移到50ml管中，将管在400x g、21±2℃下离心10分钟。离心后，小心吸出上清液，用5ml
Figure BDA0003852300010000286
生长培养基重悬细胞沉淀物并对细胞进行计数。仅在细胞存活率>75％时才会继续进行程序。
细胞的重新培养
每个瓶的接种体积如下计算：
Figure BDA0003852300010000282
Figure BDA0003852300010000283
将所述预包被的细胞培养瓶从温箱取出，并吸出附着溶液。然后将每个瓶在室温下用PBS清洗(对于175cm2瓶来说10ml PBS，对于75cm2来说5ml)，吸出PBS，并向每个瓶中添加
Figure BDA0003852300010000284
生长培养基(对于175cm2瓶来说35ml，对于75cm2瓶来说15ml)。按照上述计算将细胞接种在每个瓶中，并将瓶转移到5±1％CO2、37±2.5℃培养箱。
细胞生长评估
将含有细胞的瓶小心地从温箱取出，并在显微镜下评估细胞的生长。具体来说，检查细胞的均匀分布、成纤维细胞样形态和70-80％的汇合度。如果细胞均匀分布和/或70-80％汇合，则如上所述收获它们并重新培养。如果细胞不是70-80％汇合，则更换生长培养基并将瓶放回温箱中。如果细胞不具有成纤维细胞样形态和/或表现出深度聚集，则停止所述过程并处理掉细胞。将细胞传代培养至第3-5代。将所述细胞在液氮中冷冻储存直至使用。
4.调制培养基生产
生长培养基制备
通过向
Figure BDA0003852300010000291
添加L-谷氨酰胺、MSC
Figure BDA0003852300010000292
增补剂和硫酸庆大霉素来制备
Figure BDA0003852300010000293
生长培养基。将所述制备的
Figure BDA0003852300010000294
生长培养基在37±1℃水浴中加温30±5分钟。
通过向DMEM LG添加FBS、L-谷氨酰胺和硫酸庆大霉素来制备DMEM LG完全生长培养基。将所述制备的生长培养基保持在2-8℃下直至使用。
通过向DMEM LG添加L-谷氨酰胺和硫酸庆大霉素来制备饥饿培养基。将所述制备的饥饿培养基保持在2-8℃下直至使用。
细胞培养瓶的包被
通过将浓附着溶液用无菌PBS 1:100溶解来制备MSC附着溶液(BiologicalIndustries)。将所述制备的附着溶液保持在室温并在培养瓶包被的当天使用。将所述制备的附着溶液转移到175cm2瓶(10ml)或75cm2瓶(5ml)。通过轻轻倾斜培养瓶验证所述附着溶液良好地分散在瓶上。将所述包被的瓶转移到5±1％CO2、37±2.5℃温箱至少30分钟。
细胞样品解冻
将所述预加温的
Figure BDA0003852300010000295
生长培养基转移到15ml试管中(每管8ml)。将含有待解冻细胞的冻存管(含有总共15·10^6个细胞)从液氮容器中取出，并立即放置在37±1℃水浴中。将冻存管轻轻旋转。当大多数培养基融化时(仍剩余一些冷冻的材料)，将冻存管从水浴中取出，并在室温下向每个冻存管逐滴添加1ml
Figure BDA0003852300010000301
生长培养基。将细胞悬液轻轻转移回含有培养基的试管中(总体积～9ml)。然后将冻存管用另外1ml
Figure BDA0003852300010000302
生长培养基清洗，并将培养基转移到15ml试管中。15ml试管中的总体积为～10ml。接下来，将15ml试管以400xg在21±2℃下离心10分钟。吸出上清液，将细胞沉淀物用5ml
Figure BDA0003852300010000303
生长培养基轻轻重悬，对细胞进行计数。下一阶段，通过向Eppendorf管添加180μl PBS或
Figure BDA0003852300010000304
生长培养基并与20μl细胞悬液混合来制备200μ1:10稀释的细胞悬液。对细胞再次进行计数。仅在细胞存活率>75％时才会继续进行程序。
细胞接种
每个瓶的接种体积如下计算：
Figure BDA0003852300010000305
Figure BDA0003852300010000306
将所述预包被的细胞培养瓶从温箱取出，并吸出附着溶液。然后将每个瓶在室温下用PBS清洗(对于175cm2瓶来说10ml PBS，对于75cm2来说5ml)，吸出PBS，并向每个瓶中添加
Figure BDA0003852300010000307
生长培养基(对于175cm2瓶来说35ml，对于75cm2瓶来说15ml)。按照上述计算将细胞接种在每个瓶中，并将瓶转移到5±1％CO2、37±2.5℃培养箱。将所述细胞温育过夜(不超过24小时)。
生长培养基更换
将
Figure BDA0003852300010000308
生长培养基在37±1℃水浴加温30±5分钟。将细胞培养瓶小心地从温箱取出，并从瓶中吸出培养基。将每个瓶用PBS(对于75cm2瓶来说5ml PBS，对于175cm2瓶来说10ml)清洗，吸出PBS，并添加
Figure BDA0003852300010000309
生长培养基(对于75cm2瓶来说15ml，对于175cm2瓶来说35ml)。将瓶转移回到5±1％CO2、37±2.5℃温箱，并将细胞生长3-5天或直至细胞达到～80％汇合度。
细胞的收获和在DMEM LG完全培养基中重新生长
将DMEM LG完全生长培养基在37±1℃水浴中加温30±5分钟。将含有细胞的瓶小心地从温箱取出，并从瓶中吸出培养基。将每个瓶用PBS(对于175cm2瓶来说10ml PBS，对于75cm2瓶来说5ml PBS)清洗，随后吸出PBS。接下来，通过在室温下向每个瓶中添加TrypLETM(对于175cm2瓶来说10ml，对于75cm2瓶来说5ml)并将所述瓶在5±1％CO2、37±2.5℃温箱中温育至多10分钟，将细胞进行胰蛋白酶处理。然后将瓶从温箱取出，并在显微镜下观察是否大多数细胞被分离。如果不是，轻轻敲击瓶以分离剩余的细胞。如有必要，重复胰蛋白酶消化。在胰蛋白酶消化后，将DMEM LG完全生长培养基添加到每个瓶中(对于75cm2瓶来说5ml，对于175cm2瓶来说10ml)，并轻轻上下吸移悬液以清洗组织培养瓶。然后将悬液转移到50ml管中，将管在400xg、21±2℃下离心10分钟。重复所述清洗步骤，并将50ml管在400xg、21±2℃下离心10分钟。小心吸出上清液，用5ml DMEM LG完全培养基重悬细胞沉淀物并对细胞进行计数。仅在细胞存活率>75％时才会继续进行程序。
细胞样品接种
向细胞培养瓶中添加DMEM LG完全培养基(对于75cm2瓶来说10ml，对于175cm2瓶来说23.3ml)。每个瓶的接种体积如下所述来计算并将细胞接种：
Figure BDA0003852300010000311
Figure BDA0003852300010000312
将瓶转移到5±1％CO2、37±2.5℃温箱～24hr。
用饥饿培养基(无血清)代替生长培养基
将DMEM LG饥饿培养基在37±1℃水浴中加温30±5分钟。将细胞培养瓶从温箱取出并从瓶中吸出培养基。将一个细胞培养瓶留在温箱中用于细胞计数。将从温箱取出的每个瓶用PBS清洗(对于75cm2瓶来说5ml，对于175cm2瓶来说10ml)，吸出PBS并添加DMEM LG饥饿培养基(向75cm2瓶添加7.5ml，向175cm2瓶添加17.5ml)。将瓶转移到5±1％CO2、37±2.5℃温箱～48hr。
取出留在温箱中的细胞培养瓶进行细胞计数分析，以便评估在饥饿过程开始时的细胞数量。细胞计数如上所述来进行(培养基吸出，用PBS清洗，通过胰蛋白酶处理收获细胞，悬浮在DMEM LG饥饿培养基中并进行细胞计数)。
调制培养基收集
将细胞培养瓶小心地从温箱取出。将培养基收集在50ml管中并在400xg、21±2℃下离心10分钟。将上清液(调制培养基)收集在500ml瓶中。为了避免从沉淀物收集细胞和碎片，将移液器的尖头置于试管侧面并且不收集所有上清液。在收集调制培养基后将瓶旋转。将QC样品(例如总蛋白的测量)等分入Eppendorf管中。将剩余的调制培养基等分入50ml管中并在-80±10℃下保持冷冻直至使用。
5.间充质生长因子(MGF)的纯化、渗滤、冻干和包装
溶液的制备
制备0.05N氢氧化钠(NaOH)溶液，通过0.22μm过滤瓶过滤并保持在室温。
制备MGF配方溶液(2L)，其含有2.5-3.5％填充剂(例如甘露醇)、0.045-0.055％稳定剂(例如EDTA)、0.45-0.55％张度剂(例如NaCl)和灌溉用水。测量MGF配方溶液的pH，并通过用0.5N NaOH滴定调整到7.4±0.2。接下来，将1L MGF配方溶液通过两套1L、0.22μm过滤瓶过滤。将MGF配方溶液保持在2-8℃下直至使用。
MGF的纯化、渗滤和配制
将调制培养基(200-1000ml)在冰上解冻。将调制培养基浓缩至100ml(即2-10的浓缩倍数)，并将MGF蛋白质级分纯化，随后使用CogentμScale TFF系统(EMD Millipore)用如上所述的MGF配方溶液配制。
在浓缩过程中，将所述调制培养基在Cogent系统中从进料罐(在4±2℃下温育)循环到处于1.0±0.2巴压力水平下的3kDa过滤盒中，并返回到进料罐。携带小于3kDa的粒子的滤液流入废液罐中。渗余物是MGF蛋白质级分。循环和过滤持续到在进料罐中剩余100ml浓缩的MGF蛋白质级分。
将100ml 4±2℃的MGF配方溶液添加到进料罐中的100ml浓缩的MGF蛋白质级分中开始渗滤和配制。然后将溶液在Cogent系统中在1.5±0.5巴压力水平下循环，以清理掉100ml体积。将该过程重复10次，以产生210稀释倍数的调制培养基，并用MGF配方溶液代替它。得到的液体制剂中的蛋白质级分浓度优选地在0.015-0.025％(w/v)的范围内。
根据本发明的某些实施方式的包含MGF级分的液体制剂的示例性组成如下：
表1–冻干前MGF的液体制剂的组成
材料 范围
甘露醇 2.5-3.5％
蛋白质级分(MGF) 0.015-0.025％
EDTA 0.045-0.055％
NaCl 0.45-0.55％
取配制的MGF(F-MGF)的样品用于QC分析(例如总蛋白的测量和任选的活性测定)，并将其余的F-MGF储存在2-8℃下直至冻干。在总蛋白分析的基础上确定以mg/ml为单位的F-MGF浓度。
冻干制剂
将真空水平设置到0.02±0.002毫巴，将预冷冻水平设置到-75±7℃。在装置运行后监测温度和真空水平，直至获得所需的温度。
部分分配
将F-MGF溶液分发到小瓶中(每个小瓶2ml)并将小瓶密封。
冻干预冷冻
停止冻干机的真空，将含有F-MGF溶液的小瓶置于冻干机的搁板上。将小瓶预冷冻12±4小时(或过夜)
F-MGF冻干
将搁板温度设定到-40±4℃，并且验证真空被设定到0.02±0.002毫巴。当达到所需值时，将小瓶冷冻干燥72±4小时。
在冻干后，取样进行QC分析(微生物测试、外观、pH和蛋白质含量)，并将其余冻干的F-MGF储存在2-8℃下。
实施例2
蛋白质级分的配制–填充剂的选择
目的：为了测试几种候选填充剂在冻干后的性质和它们在重构后溶解的能力，以便为含有蛋白质级分的制剂选择填充剂。
方法
通过将每种组合物的成分在纯化水中混合来制备图1中指定的组合物F1-F17。将含有5ml每种组合物的两份平行样小瓶通过放置在-80℃下的异丙醇浴中立即冷冻。将所有盖子部分打开以防止真空。一旦所有组合物冷冻，将小瓶转移到预冷冻的冻干机中并冷冻干燥3-4天。然后将小瓶取出，称重，通过Karl Fisher测定法测试残留水含量并测量在PBS中的重构时间。
结果
通过分析三种候选材料进行填充剂表征：甘露醇，组氨酸和BSA。首先，将每种材料单独测试(组合物F1-F7)。通过称量冻干后组合物的重量并将所述重量与每种材料的初始重量进行比较来评估冻干过程中的材料损失。此外，记录每种组合物的冻干后质地。最后，记录在PBS中的重构时间，并且小于90秒的重构时间被确定为成功的重构。结果概述在图2中。
结果显示，在冻干组合物的制备过程中基本上没有材料损失。甚至有迹象表明在大多数组合物中冻干后材料的重量高于每种材料的初始重量。这可能是由于冻干组合物中剩余的残留水，但在本实验中未测量冻干组合物的水含量。
接下来，测试了较低浓度的单独的每种材料以及三种材料之间的不同组合(组合物F8-F14)。此外，测试了含有EDTA(作为稳定剂、螯合剂)和氯化钠(作为等渗剂)的组合物(组合物F15-F17)。
测试了所有组合物在冻干后的残留水含量和冻干后重构时间(在PBS中)。低于5％的残留水含量和少于20秒的重构时间被确定为成功。结果概述在图3中。图4A-B提供了结果的图形表示。在冻干后残留水含量和重构时间两方面均成功的组合物是F8、F9和F15(在图中突出显示)。由于F10的两份平行样之一在冻干期间被破坏，因此未测量F10的水含量。
结论
组合物优选地应该含有不超过5％w/v的每种填充剂，因为它影响冻干前溶解填充剂的时间和冻干的组合物的重构时间。
发现在测试的条件下组氨酸不太适合作为填充剂。尽管5％相当成功，但3％的组氨酸作为单一填充剂或与另一种填充剂组合，都不能成功地重构。含有组氨酸的最成功的组合物是与1％BSA组合的1％组氨酸，其达到～30秒的重构时间。
最快的重构主要通过含有甘露醇、特别是3％甘露醇的组合物实现。显示出缓慢重构的唯一的含有甘露醇的组合物是F10，其也含有组氨酸。
所有组合物的残留水含量均为成功的冻干过程提供了良好指示。然而，只有表现出<5％残留水的组合物被确定是成功的。
含有BSA的组合物F11、F12和F16在冻干后显示出最高的水含量。这些组合物含有单独的BSA或其与组氨酸或EDTA和NaCl的组合。在残留水含量方面最成功的含有BSA的组合物是F9，其也含有甘露醇。因此，在所测试的条件下，BSA当与甘露醇组合时可用作填充剂。
总而言之，基于甘露醇的组合物在冻干后残留水含量和重构时间两方面产生最好的值。唯一的例外是其中将甘露醇与组氨酸混合的基于甘露醇的组合物，其可能不能实现完全冻干，并且也显示出长的重构时间。测试的另外两种材料BSA和组氨酸在所测试的条件下，在冻干后水含量和/或重构时间方面显示出较差的结果，并且如果对蛋白质稳定性至关重要，则应该重新校准。
实施例3
蛋白质级分的配制–其他赋形剂
图5中提供了蛋白质级分的几种水性制剂。所述制剂可以如下制备：
将中空纤维过滤系统用DW清洗，随后用不含FBS的DMEM F12清洗。首先将如上所述获得的调制培养基过滤并浓缩10倍，然后用3％(w/v)甘露醇清洗两次，以获得配制在3％(w/v)甘露醇中的纯化的蛋白质级分。在每个过滤步骤中，分析滤液和渗余物溶液的蛋白质浓度。
根据表2制备储用溶液。制备含3％(w/v)甘露醇的纯化水，随后将所有其他配方材料溶解在所述3％甘露醇溶液中。
表2.储用溶液
Figure BDA0003852300010000361
Figure BDA0003852300010000371
制备了如图5中所指定的组合物F19-F28。表中的数字指示从相应储用溶液取出的体积。
接下来，将配制在3％(w/v)甘露醇中的纯化的蛋白质级分添加到每种组合物F19-F28，以在每种组合物中获得2x10-3％(w/v)的蛋白质浓度。
实施例4
ADSC调制培养基(CM)和配制的MGF(F-MGF)的活性测定法
下述实验测试了收集后的ADSC调制培养基(CM)和配制的MGF(缩写为“F-MGF”)对正常成年人类原代表皮角化细胞(NHPEK)(
Figure BDA0003852300010000372
PCS-200-011TM)细胞的增殖的影响。实施例3中描述的制剂F19被用于所述测定法。
首先，将传代数为2或3的NHPEK细胞用真皮细胞完全培养基(DMEM-F12+真皮细胞基础培养基，1:1(Biological Industries,Israel))稀释，以获得50k和100k个细胞/ml储用溶液。将每种储用溶液在96孔板中分成一式三份，每孔100μl。将板中剩余的孔装入PBS以维持潮湿环境并避免样品蒸发。将板在37℃、5％CO2温育过夜。
第二天，将培养基吸出，并将孔用200μl PBS清洗。在吸出PBS后，添加50μl/孔的TrypLETM，并将板在37℃、5％CO2下温育10min。接下来，在板的侧面敲击几下，并在显微镜下检查孔以确保细胞完全分离。然后向孔添加150μl完全真皮培养基，并使用自动细胞计数器对细胞进行计数。
从储用溶液(2μg/ml，含0.1％BSA的PBS，保持在-80℃下)制备10ng/ml KGF。将KGF用真皮细胞基础培养基和DMEM-F12培养基(分别为50％和50％)稀释。
将CM(基于DMEM-F12)用真皮细胞基础培养基和DMEM-F 12培养基(分别为50％和50％)稀释，以获得10％CM。
将含有NHPEK的孔如表3中所示进行处理，并将板在37℃、5％CO2温育过夜。
表3–NHPEK处理
Figure BDA0003852300010000381
在温育过夜后，将孔抽吸并用200μl PBS清洗。在吸出PBS后，添加50μl/孔的TrypLETM，并将板在37℃、5％CO2温育10min。从侧面敲击板几次，并在显微镜下检查孔以确保细胞完全分离。然后向孔中添加150μl完全真皮培养基，并使用自动计数器对细胞计数。在处理之前和之后的细胞计数的基础上计算每个处理组和未处理的细胞的相对细胞增殖(％)、群体增量和倍增时间。
结果概述在图6A-H中。与未处理组相比，调制培养基(“10％CM”)显著诱导NHPEK增殖，并呈现出与KGF处理的对照组相近的值(图6A-B)。调制培养基对两种浓度的NHPEK细胞(100K或50K/ml)的影响相似。
群体增量值之间的比较显示在未处理组中NHPEK分裂不佳，而KGF和CM处理导致总群体增加(图6C-D)。尽管在100K/ml下KGF诱导的增殖与CM相近，但在低NHPEK浓度(50K/ml)下，CM与KGF相比呈现出更高的群体增量。
CM不仅诱导NHPEK增殖，而且显著降低它们的倍增时间(图6E-F)。在一种测定中，100K/ml下的未处理组不增殖，甚至开始死亡，因此未给出它们的倍增时间值。
最后，细胞Moxi群体指数(MPI)这种细胞健康评估指数，在KGF和CM处理下呈现出相对更好的存活率，尽管结果不是统计显著的(图6G-H)。
进一步的实验比较了CM和配制的MGF(F-MGF)对NHPEK细胞增殖的影响。用于所述测定的F-MGF是实施例3中描述的F19。所述测定如上所述进行，其中F19的数据在第0天(“F19第0天”)并随后在室温下7天和30天后(分别为“F19第7天”和“F19第30天”)测量。使用10ng/ml KGF的处理被用作阳性对照。使用不含MGF的F19的组分(“配方”)的处理被用作阴性对照。结果被概述在图7A-D中。
结果显示：
1.F-MGF效能在至少30天内稳定，正如通过NHPEK增殖测定所检测的。
2.F-MGF提高了NHPEK细胞的细胞存活率并减少它们的倍增时间。
3.F-MGF中的蛋白质的组合比单独的KGF增殖因子更加高效(更高的增殖率)。
实施例5
通过过滤清除生长培养基
下面的实验演示了在模拟MGF蛋白质级分生产期间的调制培养基处理的过程中细胞培养基组分的清除。具体来说，所述实验演示了当所述过程从未处理的细胞培养基(商品化细胞培养基DMEM-F12)进行时，通过过滤和稀释(清洗)的几个步骤清除所选金属。
方法
安装中空纤维过滤系统
Figure BDA0003852300010000401
并通过蠕动泵连接。流速设定为4.00。过滤速度校准到～0.5ml/min。将所述系统放置在4℃冰箱中并用DDW清洗。接下来，将400ml商品化生长培养基DMEM F12过滤以获得40ml渗余物。保留5ml原始生长培养基的两份平行样，作为阳性对照用于分析。将5ml 3％甘露醇的两份平行样用作阴性对照。
在过滤后，收集5ml渗余物的两份平行样并送去分析。向剩余的30ml渗余物中添加270ml 3％甘露醇以获得300ml稀释的渗余物，其在本文中被称为“DMEM F12清洗液1”。
将DMEM F12清洗液1用中空纤维过滤系统过滤，以获得30ml渗余物。保留5ml DMEMF12清洗液1渗余物的两份平行样用于分析。向剩余的20ml渗余物中添加180ml 3％甘露醇以获得200ml稀释的渗余物，其在本文中被称为“DMEM F12清洗液2”。
将DMEM F12清洗液2用中空纤维过滤系统过滤，以获得20ml渗余物。保留5ml DMEMF12清洗液2渗余物的两份平行样用于分析。
将剩余的DMEM F12用3％甘露醇1:50稀释(将10ml渗余物与490ml3％甘露醇溶液混合，以产生500ml稀释的溶液)以模拟蛋白质级分的基础制剂，并将两份5ml平行样送去分析(在本文中被称为“配方”)。
将所有样品送去进行ICP质谱分析，以跟踪钙、钾和镁的存在。
结果
结果概述在表4和图8中。
表4–样品中存在的金属
呈现的值以mg/kg为单位。粗体值低于检测极限。
Figure BDA0003852300010000411
所有三种所选金属在配方样品中均未检测到，其代表了产品制备过程中的最后处理阶段。
与其他金属组分相比，钾在商品化DMEM F12中具有最高的初始值。正如从表和图中明显看出的，在细胞培养基的处理过程中即使是K也被清除到低于可检测水平。
实施例6
用于美容产品的MSC的免疫表型
制备或商品化获得含有PBS、EDTA和FBS的MACS缓冲液。
如下所述进行细胞染色：
将含有5x105个细胞的样品在4±2℃下以300x g离心5min。舍弃上清液并将沉淀物用0.5ml冷MACS缓冲液重悬。将100ul(1x105个细胞)的等分试样分发到四个带标签的Eppendorf管。根据表5向每个管中添加抗体。
表5–抗体染色
管号 抗体名称* 抗体体积(μl)
1 IgG<sub>1</sub>-PE 2.5
2 CD73-PE 2.5
3 CD90-PE 2.5
4 CD45-PE 2.5
*全名：藻红蛋白(PE)小鼠IgG1同型对照，PE小鼠抗人类CD73抗体，PE小鼠抗人类CD90抗体，PE小鼠抗人类CD45抗体
将每个管简短涡旋振荡并将管用铝箔包裹以避光。将管在2-8℃温育30分钟或在RT温育15分钟。
在温育后，向每管中添加1ml冷MACS缓冲液，并将管在4±2℃下以300x g离心5min。舍弃上清液并将沉淀物重悬于400μl冷MACS缓冲液中。
将细胞悬液从每个Eppendorf管转移到相应的12x75mm试管，并通过流式细胞术分析试管。
表6概述了根据本发明使用的MSC细胞的值。
表6–MSC的数据分析
抗体名称 值
IgG<sub>1</sub>-PE NA
CD73-PE ≥95％
CD90-PE ≥95％
CD45-PE ≤2％
实施例7
根据本发明的重构溶液的配制
测试了重构组合物的不同制剂，以便获得在高达40℃的温度下具有所需黏度、质地、pH和稳定性的组合物。
表7示出了根据本发明的某些实施方式的重构组合物的配制。
表7–重构组合物
Figure BDA0003852300010000431
表8示出了根据本发明的其他实施方式的重构组合物的配制。
表8–重构组合物
Figure BDA0003852300010000432
表9示出了根据本发明的实施方式的重构组合物的黏度参数，其使用Brookfield黏度计在室温下测量。
表9–黏度参数
测试的RPM 范围(cP)
12 2000-2500
18 1400-2000
60 700-1000
100 500-700
测量重构组合物的pH并用0.5N NaOH或1N HCl调整到7.2-7.6，在室温下储存直至使用/包装。
对于使用/包装来说，将所述重构组合物等分到小瓶中，例如每瓶含有3ml所述组合物(净重为2.5-3.5g)。
实施例8
双组分美容产品
表10-11示出了根据本发明的某些实施方式的最终产品组合物的产品规格。
NLT＝不少于
表10–小瓶A-干粉
Figure BDA0003852300010000441
表11–小瓶B-重构组合物
Figure BDA0003852300010000442
Figure BDA0003852300010000451
为了测量小瓶A中配制的蛋白质级分的pH，将一个小瓶的内含物溶解在500μl水中并测量pH。重构溶液的pH通过原样使用小瓶B的内含物来测量。
为了测量小瓶A中配制的蛋白质级分的蛋白质含量，将一个小瓶的内含物溶解在100μl DMEM中。蛋白质含量使用Quick StartTM Bradford x1染料试剂如下所述进行：
将染料试剂从冷藏(2-8℃)取出并允许其达到室温。在使用前将染料试剂颠倒几次。样品按照表12一式三份制备在96孔板中，将200μl染料试剂分发到每个孔。然后将板在室温温育5-15min。
表12–用于总蛋白定量的样品制备
Figure BDA0003852300010000452
Figure BDA0003852300010000461
在温育后，将ELISA读板器设置到595nm，测量并记录每个样品的吸收值。
通过将595nm值(y-轴)对以μg/ml为单位的BSA标准品的浓度(x-轴)作图并生成线性回归方程来产生标准曲线。标准曲线的接受标准是R2≥0.95。
如下所述使用标准曲线确定未知样品的浓度：
Figure BDA0003852300010000462
实施例9
双组分美容产品的稳定性测定
在本实施例中，“加速稳定性测定法”是指测试美容产品在极端条件下的稳定性，以便评估所述美容产品在标准储存条件下的稳定性的测定法。对于旨在室温储存的美容产品例如本发明的美容产品来说，加速稳定性测定在40±2℃/75±5％RH下进行。在0、3和6个月时测试稳定性。
“长期稳定性测定法”是指在模拟产品的推荐储存条件的条件下进行的稳定性测定。对于旨在室温储存的美容产品来说，长期稳定性测定在25±2℃/60±5％RH下进行。在0、3、6、9、12、18和24个月时测试稳定性。
评估和测量了下述参数：外观，pH，总含量(总重量)和蛋白质含量。
除了评估产品稳定性的物理化学测试之外，也进行了微生物(无菌性)测试：肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，总微生物计数，酵母/霉菌。
图9A-B示出了根据本发明的实施方式的冻干的蛋白质组合物的长期稳定性测定(图9A)和加速稳定性测定(图9B)的结果。图9C-D示出了根据本发明的实施方式的重构组合物的长期稳定性测定(图9C)和加速稳定性测定(图9D)的结果。
正如可以从结果看到的，两种组合物当在25℃/60％RH下储存至少6个月时是稳定的。值得注意的是，两种组合物当在加速稳定性测定的极端储存条件(40℃/75％RH)下至少6个月时也是稳定的，这等同于在室温下的标准储存条件下1.5年的保质期。
实施例10
安全性评估–体外
A.MatTek公司EpiDermTM皮肤模型
目的：利用MatTek公司的EpiDermTM体外毒性测试系统来评估测试材料的刺激性潜力。
这种模型系统由正常的人类来源的表皮角化细胞(NHEK)构成，所述细胞已被培养以形成人类表皮的多层、高度分化的模型。角化细胞在特殊制备的可渗透的细胞培养插件上培养。所述程序利用了水溶性黄色四唑盐(MTT{3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基-溴化四唑})，其被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原成紫色、不溶性甲臜衍生物。破坏这种线粒体酶的物质抑制所述四唑盐的还原。因此，被培养物还原的MTT的量与活细胞的数量成正比。
方法：
在适合的组织培养后，向含有EpiDermTM样品的Millicells中添加各100微升的下述物质：(i)根据本发明的重构的组合物；(ii)Triton X-100(1％)(阳性对照)；和(iii)蒸馏水(阴性对照)。然后将板在37℃、5％二氧化碳和>90％湿度下温育。
在适当的暴露期(参见下面的表13)后，将每个插件单独地从其板中取出，用PBS漂洗两次以除去任何残留材料。抖掉多余的液体，并将每个EpiDermTM样品置于300微升MTT溶液中。然后将所述EpiDermTM样品放回温箱。
在3小时MTT暴露后，取出每个插件并用PBS轻柔漂洗，以除去任何残留MTT溶液。从每个插件抖掉多余的PBS，然后使用纸巾将其在底部吸干。然后将所述插件各自放置在24孔提取板的一(1)个孔中。然后将每个插件在两(2)毫升提取溶液中浸泡过夜。在暴露后，将每个插件内的液体倒回到取出它的孔中。然后将剩余的提取剂溶液搅拌，并取出每个提取物的200微升等分试样用于评估。使用BioTek 800TS微孔板读板器在570nm下确定每个提取物的吸光度。将阴性对照的吸光度定义为100％，确定测试材料和阳性对照的吸光度百分数。下面列出的百分率与EpiDermTM样品中的细胞代谢直接相关。
结果：
结果概述在表13中：
Figure BDA0003852300010000481
对于每种制品来说，使用半对数标度将线性y轴上的存活率百分数对log x轴上的给药时间作图。通过插值并在可能的情况下，估算存活率百分数为50％(ET-50)的时间。
根据本发明的重构的组合物引起大于24小时的ET-50。Triton X-100参比/阳性对照制品引起大约7.6小时的ET-50。根据MatTek公司，作为一般性准则，下述分组可用于在使用MatTek’s EpiDerm获得的ET-50结果的基础上分派预期体内刺激性反应：
Figure BDA0003852300010000491
在这个测试的条件下，根据本发明的重构的组合物具有在无刺激性范围内的预期体内皮肤刺激性潜力。
B.母鸡蛋测试-绒毛尿囊膜(HET-CAM)
目的：利用HET-CAM测试来评估测试材料的刺激性潜力。
鸡胚的绒毛尿囊膜(CAM)是具有来自于所有生殖细胞层的类器官要素的完整组织。绒毛膜上皮是外胚层的，尿囊上皮是内胚层的。这些上皮之间的中胚层是一个完整的结缔组织，包括动脉、毛细血管、静脉和淋巴管。CAM以完全炎症应答对损伤做出响应，与在兔眼试验中诱导的响应相当。
方法：
获得白色来亨鸡蛋并将其放置在Kuhl加湿温箱中。温箱使得鸡蛋每小时自动旋转一次。温度控制在37℃(+2℃)。在第八(8)天，将鸡蛋翻转使锐角端朝下。
在第十(10)天，将每个鸡蛋从温箱取出并置于有机玻璃工作外壳中。这个外壳已经过预热和加湿，使其环境接近于温箱。在每个鸡蛋的较大端气囊所在处制造一个切口。使用配备
Figure BDA0003852300010000503
切割轮(No.409)的
Figure BDA0003852300010000504
Moto-Flex工具(型号232-5)制造每个切口。然后使用镊子将壳向下移至壳膜连接处。然后用温热的生理盐水溶液使内卵膜水合。在暴露两(2)至五(5)分钟后去除盐水。然后使用尖头镊子，小心地去除内卵膜以露出CAM。
然后将根据本发明的重构的美容组合物或参比制品以十分之三毫升(0.3ml)的液体剂量施用到4个CAM中的每一个。使用的参比制品是Nivea Visage脂质体眼部轮廓凝胶和含有维生素E的Pond’s焕活眼部凝胶。20秒后，使用5毫升生理盐水将所述重构的美容组合物或参比制品从每个CAM上洗下。在即将施用测试材料之前和暴露到所述测试材料后30秒、两(2)分钟和五(5)分钟观察CAM。如下所详述地检查所述CAM、包括毛细血管在内的血管和白蛋白的反应并对刺激效应进行评分。
Figure BDA0003852300010000501
对于每个CAM，将数值表示的、时间依赖性评分进行总计。对于每个CAM来说，每种反应类型只能记录一次，因此每个CAM的最高评分为32。为所有类似测试的CAM确定平均评分。
结果：
结果概述在表14A-C中。
表14A–重构的组合物(50％)
Figure BDA0003852300010000502
Figure BDA0003852300010000511
表14B–参比制品Nivea Visage脂质体眼部轮廓凝胶(50％)
Figure BDA0003852300010000512
表14C–参比制品含有维生素E的Pond’s焕活眼部凝胶(50％)
Figure BDA0003852300010000513
然后如下所示将每种制品分类：
Figure BDA0003852300010000514
Figure BDA0003852300010000521
以前的研究显示，与兔眼相比，鸡蛋的CAM对液体刺激物更加敏感。因此，使用测试材料和参比制品的50％稀释液以逼近它们的100％的刺激潜力。
所述参比制品以前当以100％给药并使用Draize眼刺激方法(Draize量表：0–110)测试时，已被分类为几乎没有刺激，在24小时时引起的评分接近0。
在这种测试的条件下，结果表明本发明的重构的美容组合物以100％在体内几乎没有眼刺激潜力。
实施例11
安全性评估–临床–重复伤害贴片测试
目的：通过重复的表皮接触来确定测试材料诱导原发性或累积性刺激和/或过敏性接触致敏的潜力。
参与者：合格的受试者(n＝108)，男性和女性，年龄在19岁至79岁的范围内。参与者不具有可能与来自于测试材料的皮肤反应相混淆的可见的皮肤病。在研究开始前至少7天，参与者禁止使用局部或全身类固醇和/或抗组胺药。
方法：
在每次测试当天，如下所述制备测试材料：
打开含有冻干的蛋白质组合物的小瓶和含有重构组合物的小瓶。使用吸管从小瓶抽出重构组合物并将它转移到含有蛋白质的小瓶。通过抽吸和释放重构组合物来混合所述组合物，直至所有蛋白质粉剂溶解并获得重构的蛋白质组合物。使用吸管抽出所述重构的组合物(大约0.2ml)并施用到透明胶黏性敷料的1”x 1”的吸收垫部分。然后将所述胶黏性敷料施用到肩胛骨之间的上背部以形成半封闭贴片。从混合起12小时内进行向皮肤的施用。
诱导期：
贴片每周施用三(3)次，总共九(9)次施用。对部位进行标记以确保贴片施用的连续性。在监督取下第一幅诱导贴片并评分后，指示参与者在家在施用后24小时取下所有后续诱导贴片。在即将再次施用之前对治疗区域做出评估。
除了第一次受监督的诱导贴片读数之外，如果在诱导期间治疗区域表现出中度(2级)反应，则将施用移动到邻近区域。如果在新的治疗区域上观察到中度(2级)反应，则在剩余的测试期中停止施用。如果注意到显著(3级)或重度(4级)反应性，也将停止施用。每次贴片去除后的休息期为1或2天。
激惹期：
在最后一次诱导贴片施用后大约两(2)周，按照为诱导所描述的相同程序，将激惹贴片施用到与原始诱导贴片部位相邻的新的治疗部位。在施用后第1天和第3天，在诊所取下贴片并对治疗区域评分。
评估标准(红斑及其他皮肤后遗症)：
Figure BDA0003852300010000531
根据该符号说明对红斑进行数字评分。其他皮肤后遗症，如果存在，则用适合的字母代码和严重程度的数值表示。
结果：
在整个测试间隔期中观察结果保持阴性。测试材料没有表现出皮肤刺激或过敏性接触致敏的潜力。
实施例12
功效评估
试验目标
遵照每周一次的使用方案，在为期12周的使用过程中，评估美容产品在减少皱纹和肤色不均的出现以及增加皮肤的紧致度和水合方面的功效。
在每周一次共12周的使用后，利用调查问卷确定抗衰老产品的消费者感受。
受试者的选择和退出
受试者数量
35位女性受试者完成了所述研究。满足所有纳入标准并且没有任一项排除标准的受试者具有资格。
纳入标准
1.受试者必须是年龄为45至65岁(含)的女性；
2.受试者必须具有Fitzpatrick皮肤光照型I、II、III或IV：
Figure BDA0003852300010000541
3.受试者面部必须具有皱纹和肤色不均；
4.受试者必须同意在第0天前连续7天和测试期中使用提供的调理期清洁剂；
5.受试者必须在每次访问测试机构时预先洗脸(在家)，不使用保湿霜或化妆；
6.受试者必须同意在试验期间每天避免其面部或身体直接暴露于紫外线辐射，不论是天然的(太阳)还是人造的(日光浴床)；
7.受试者必须同意在测试期间每次访问测试机构时对其面部进行测量；
8.受试者必须阅读包括HIPAA声明的知情同意书并在其上签名和签署日期；
9.受试者必须阅读摄影授权书并在其上签名和签署日期；并且
10.受试者必须被认为是可靠的并且能够遵循指示。
排除标准
1.由PI确定的健康状况不佳的受试者；
2.正在服用避孕药之外的其他药物的受试者，例如任何全身或局部皮质类固醇、免疫抑制剂、消炎药、抗组胺药、抗生素或在研究人员看来可能影响试验的目的、完整性或结果的其他药物
3.患有可能与对测试材料的反应混淆的任何可见疾病的受试者；
4.吸烟的受试者；
5.具有可能干扰照片或测量的面部纹身、瘢痕或穿孔的受试者；
6.在3个月内在面部使用过处方或OTC类维生素A或抗衰老治疗的受试者；
7.在试验开始前1周内接受过面部护理(例如面部换肤、深层清洁、微晶换肤等)的受试者；
8.在试验过程中妊娠、计划妊娠或哺乳的受试者；
9.对化妆品、OTC药物或其他个人护理产品具有不良反应或过敏史的受试者；或
10.在试验过程中引入使用任何新的化妆品、盥洗品或个人护理产品的受试者。
受试者退出
根据世界医学协会赫尔辛基宣言(经修订)和贝尔蒙报告的原则，受试者可以在任何时间以任何理由自由撤回其对参与试验的同意。PI也有出于安全性、缺乏有效性或行政原因从试验中撤出受试者的权利。
受试者可能退出试验的可能原因包括以下：
1.经历严重或不可忍受的AE；
2.在试验过程中发生排除标准中列出的症状或状况，包括妊娠；
3.服用排除标准中所描述的禁忌药物；
4.导致违反协议，例如未能遵守指定的治疗方案或未能遵守访问时间表；或
5.由于以下原因要求提前中断：
-PI认为没必要从试验中移除的临床反应；
-其他(非特定的)受试者引发的原因。
退出的受试者的处置
将受试者从试验退出的日期和终止试验的原因记录在案例报告表(CRF)上。在受试者从试验退出后，尝试尽可能快地进行计划对最终试验访问进行的所有评估。当受试者未能返回所计划的试验访问时，PI做出合理的努力来联系所述受试者并确定受试者未能返回的原因。此信息将记录在CRF上。当受试者从试验退出(不论何种原因)时，PI鼓励所述受试者完成所有可能是必要的评估，以确保所述受试者没有不良影响，并寻求适合的随访以解决任何持续存在的问题。
方法
每位潜在受试者在参与试验之前提供知情同意书。
设计
这是一项为期13周的单中心、一元、随机、基线对照临床试验设计。
试验时间点的描述如下所示：
Figure BDA0003852300010000561
Figure BDA0003852300010000571
仪器
环境控制房。使用带有DX-100控制器的Johnson Control
Figure BDA0003852300010000572
系统使环境控制房维持在70±5℉的温度和40±5％的相对湿度下。每分钟将以电子方式记录温度和湿度读数。
在所有测量和照相之前，每位受试者在环境控制房中平衡至少30分钟。所有测量值都在这些条件下获取。
Figure BDA0003852300010000573
数字成像(Canfield Scientific,Inc.，Parsippany，新泽西州)。
Figure BDA0003852300010000574
在受控照明环境内拍摄一系列标准化、可重现的数字面部图像。受试者定位很关键，必须在每个时间点重复。维持诸如凳子高度和受试者下巴和前额小心置于成像装置中等项目。此外，使受试者的头发离开其面部，除去首饰，并用黑色帷幔规范服装。
使用下述照明参数，在受试者轻轻闭眼时捕获她们的前、左和右视图：
·标准1-通用白光
·标准2-平面照明
·交叉偏振–过滤掉表面反射，获得表面下细节的卓越可视化
·惯例–皱纹的可视化
使用
Figure BDA0003852300010000581
训练有素的生物仪器技术人员在基线(施用前)、第6周和第12周访问时捕获面部的标准化数字图像。将这些图像用于在每个评估间隔评估肤色的均匀度。
PRIMOS 3D(GFMesstechnik GmbH，Tetlow，德国)。使用Primos Optical 3D测量装置获取右眼或左眼(随机)外眦的图像。所述装置使用微型镜系统将平行条纹图案投射到皮肤表面，并投射到高分辨率相机的CCD芯片上以生成3D图像。定位受试者使得外眦垂直于相机，图像的一个边缘与眶周窝对齐。她们的确切头部位置被固定在约束装置中，并记录所述位置以供后续图像捕获使用。内部软件包括聚焦系统，以确保捕获的图像在相机的3mm景深范围内。使用PRIMOS 3D，训练有素的生物仪器技术人员在基线(施用前)、第6周和第12周访问时捕获面部的数字图像。
Figure BDA0003852300010000582
MPA580探头孔径：2mm(Courage+Khazaka，
Figure BDA0003852300010000583
德国)。对右上或左上脸颊(随机)进行一次皮肤弹性仪测量。测量原理是基于抽吸和伸长。使用450mbar的负压。使用一致的施用压力将探头放置在测试部位。待测量的皮肤区域被恒定的负压吸入探头的孔中。该抽吸时间是测量周期的第一部分，称为“接通时间”，持续时长为3秒。随后关闭负压(0mbar)，皮肤恢复原状。这被称为松弛时间或“断开时间”，持续时长也为3秒。将每个3秒的“接通时间”和“断开时间”的循环重复3次。探头保留在皮肤上，直到测量循环结束。抽吸阶段曲线的第一部分被认为是弹性分量。所述曲线的第二部分表征皮肤的粘弹性(塑性分量)。测量值被记录为拉伸和回弹。使用
Figure BDA0003852300010000584
经过培训的生物仪器技术人员在基线(施用前)、第6周和第12周访问时捕获测量值。
Figure BDA0003852300010000585
(Delfin Technologies Ltd.，Kuopio，芬兰)。
Figure BDA0003852300010000586
以任意单位测量表皮层与厚度变化的角质层的干燥层之间存在的介电常数。提高所述介电常数导致阻抗降低以及电导和电容增加。所述值越高，角质层(皮肤的最上层)的水合程度越大。在每个评估间隔内，在测试部位处捕获五个
Figure BDA0003852300010000588
测量值并平均。所有
Figure BDA0003852300010000587
测量值都是在测试部位处捕获的，此时受试者在环境控制房中采取坐姿。在基线(第0周)、第6周和第12周时捕获
Figure BDA0003852300010000591
测量值。
调理期(第-7天)
潜在的受试者到测试机构报到，此时预先洗脸(在家)，不使用保湿霜或化妆，并完成ICF和摄影授权书。完成ICF的人变成受试者。受试者不戴假睫毛。受试者完成病历表以确定初始资格。
在试验的测试期前7天，受试者停止在面部使用任何类型的保湿产品。受试者每天用测试机构提供的非保湿型洁面乳
Figure BDA0003852300010000592
洗脸两次。要求受试者在试验的调理期和测试期都只使用所提供的洁面乳。
向每位受试者提供每日日记，以记录每次面部清洁。
测试期(第0周)
受试者在计划的预约时间到测试机构报到，此时预先洗脸(在家)，不使用保湿霜或化妆。
受试者的每日日记由测试机构收回，审查顺从性并保留。
专家评定人员使用下述评估符号说明来评估每位受试者面部的红斑、浮肿和干燥的迹象和其他异常情况：
评估符号说明：
0＝无
0.5＝几乎无法察觉
1＝轻度
2＝中度
3＝显著
4＝重度
对红斑和浮肿表现出中度(2)或更高评分的受试者失去资格。对干燥表现出至少轻度(1)的评分的受试者获得试验资格。所有评估评分记录在CRF上。
专家评定人员还使用前面提到的评估符号说明对每位受试者面部的皱纹和肤色不均进行了评估。对每一项表现出至少轻度(1)的评分的受试者获得试验资格。
如上所述，有资格的受试者在环境控制房中平衡至少30分钟。在平衡后，如上所述，由生物仪器技术人员完成下述程序：
·每位受试者面部的
Figure BDA0003852300010000601
图像。
·在随机分组后，每位受试者外眦的PRIMOS 3D图像。
·在随机分组后，每位受试者的上颊的
Figure BDA0003852300010000602
测量。
·
Figure BDA0003852300010000603
测量。
向受试者提供12周供应量的测试材料和用于记录使用的每日日记。指导每位受试者如何使用所述测试材料，如下所述：
1.通过向上拉动塑料圆盘打开含有乳液的小瓶，丢弃铝制密封盖。
2.从含有乳液的小瓶取下橡胶塞并丢弃。
3.通过向上拉动塑料圆盘打开含有蛋白质的小瓶，丢弃铝制密封盖。
4.从含有蛋白质的小瓶取下橡胶塞并丢弃。
5.找到所提供的一次性移液器，并将它的开口端插入到含有乳液的小瓶中。
6.用力按压移液器尖端并松开，将乳液吸入移液器中。
7.将移液器转移到含有蛋白质的小瓶中，并通过按压移液器的尖端放出乳液。
8.通过抽取和释放润肤露几次充分混合，直至所有蛋白质粉剂全都溶解。
9.用移液器抽出含有蛋白质的乳液并局部施用到皮肤上。
10.在所述蛋白质乳液混合后，在12小时内使用。
11.方案：每周一次
对于每位受试者来说，测试材料的首次使用在测试机构在临床监督下进行。
受试者可以继续使用她们的常规面部化妆品。在试验过程中，受试者不得引入使用任何新的化妆品、盥洗品或个人护理产品。
测试期(第6周)
受试者在其计划的预约时间向测试机构报到，此时预先洗脸(在家)，不使用保湿霜或化妆。受试者将她们的每日日记报告给测试机构。审查每日日记以检查顺从性，并将它们归还给每位受试者。
如上所述，受试者在环境控制房中平衡至少30分钟。在平衡后，如上所述，由生物仪器技术人员完成下述程序：
·每位受试者面部的
Figure BDA0003852300010000611
图像。
·在随机分组后，每位受试者外眦的PRIMOS 3D图像。
·在随机分组后，每位受试者的上颊的
Figure BDA0003852300010000612
测量。
·
Figure BDA0003852300010000613
测量。
测试期(第12周)
受试者在其12周的使用期后在计划的预约时间向测试机构报到，此时预先洗脸(在家)，不使用保湿霜或化妆。交回任何未使用的测试材料和完成的每日日记。
如上所述，受试者在环境控制房中平衡至少30分钟。在平衡后，如上所述，由生物仪器技术人员完成下述程序：
·每位受试者面部的
Figure BDA0003852300010000614
图像。
·在随机分组后，每位受试者外眦的PRIMOS 3D图像。
·在随机分组后，每位受试者的上颊的
Figure BDA0003852300010000615
测量。
·
Figure BDA0003852300010000616
测量。
由每位受试者完成调查问卷。在受试者遣散之前对调查问卷和每日日记进行完整性审查。
方案顺从性
在试验的83天测试期后，在计划的访问日期的2天内按计划访问测试机构被认为顺从了方案。
统计分析
对从生物仪器设备(
Figure BDA0003852300010000621
成像分析、PRIMOS 3D、
Figure BDA0003852300010000622
和
Figure BDA0003852300010000623
)收集的数据进行统计分析。在进行分析之前，对数据进行诊断测试以确定是否保持数据方差的正态性和/或同质性。如果上述条件得以维持，则执行参数Student’s t-检验或方差分析。如果上述任何条件都没有得以维持，则使用上述统计测试的非参数等效物。如果观察到统计学显著性并且需要进一步统计比较，则进行多重比较测试并相应地对p值进行适当调整。
除了上述分析之外，还对问卷数据进行了统计分析。每个适用的评级参数/问题的答复分为两类，“成功”和“失败”。表明受试者喜欢所述测试材料或同意关于所述测试材料的正面陈述的答复被认为是“成功”。表明受试者不喜欢所述测试材料或不同意对所述测试材料的正面陈述的答复被认为是“失败”。对于任何中点答复(即既不喜欢也不是不喜欢；既不同意也不反对)来说，一半的中点答复被算作“成功”，一半被算作“失败”。如果存在奇数个中点答复，则“成功”类别将获得额外的中点答复。每个评分参数/问题的“成功”和“失败”的比例通过用“成功”和“失败”的数量除以答复的总数来确定。对这些比例进行比较，并使用每个评级参数/问题的比例z-检验来确定统计学显著差异。
对于上述所有分析来说，在95％的置信水平达到统计学显著性(p<0.050)。
安全性
仔细监测每位受试者的任何不良事件(AE)的发展。PI评估所有AE与测试材料(或其他原因)的关系或关联性及它们的强度。
调查问卷
使用调查问卷评估消费者对抗衰老产品的认知，在所述调查问卷中每位受试者对她对下述陈述的同意程度进行评分，其中“1”表示“非常同意”，“5”表示“中立/无意见”，“9”表示“非常不同意”：
1.我使用乳液产品的总体体验是正面的。
2.所述乳液在皮肤上具有令人愉悦、光滑的质地。
3.所述乳液易于施用。.
4.所述乳液的颜色对我有吸引力。
5.在使用所述乳液后，我的皮肤显得肤色更加均匀。
6.使用所述乳液改善我的皮肤质地。
7.定期使用所述乳液让我的皮肤看起来更年轻。
8.使用所述乳液有助于减少皱纹。
9.当我使用所述乳液时，它刺激我的皮肤，具有焕然一新的外观。
10.当我使用所述乳液时，感觉它减少了衰老的外观。
11.使用所述乳液使我的皮肤看起来更有弹性。
12.使用所述乳液让我的皮肤焕然一新。
13.我会向朋友推荐这款产品。
结果
如上所述使用PRIMOS、Cutometer和
Figure BDA0003852300010000631
分析皮肤的光滑度、紧致度和水合作用表明，在使用6周后皮肤已经变得更光滑并且皱纹深度减小(p<0.01)。在使用12周后也观察到皱纹深度减小(p<0.02)。此外，在使用6周后观察到皮肤软化，在使用12周后持续如此(p<0.001)。值得注意的是，使用PRIMOS很少能实现统计学显著的皮肤粗糙度降低(更光滑的皮肤)和皱纹深度的降低，进一步强调了本发明的美容产品的有益效果。
调查问卷答复总结在图10A-B中。将答复合并为两个类别：“成功”，代表对测试材料属性选择1(“非常同意”)至4的受试者；和“失败”，代表对测试材料属性选择6至9(“非常不同意”)的受试者。选择5(“中立”)的受试者在这两个类别之间平均分派。如果未定的答复分布不均匀，则“成功”类别会收到额外的未定答复。
正如可以在图中看到的，答复显示出消费者对产品的高度正面的看法。
实施例13
产品表征–外泌体含量
测量了如实施例1中所述制备的根据本发明的用美容赋形剂配制的蛋白质级分中的外泌体含量。所述蛋白质级分以其冻干形式提供为本发明的美容产品的“小瓶A”。测量包括外泌体标志物表达的FACS分析和使用纳米粒子追踪分析仪(NanoSightTM)的外泌体定量。
流式细胞术流程
使用MACSPlexTM试剂盒(Miltenyi Biotec)，按照制造商的说明书进行外泌体标志物表达的流式细胞术分析。所分析的标志物是CD81、CD63和CD9，即外泌体阳性标志物。用于分析的流式细胞仪是Beckman Coulter GalliosTM。
所述分析是基于外泌体与标志物特异性抗体包被的珠子群体的结合。所述试剂盒含有各种不同荧光标记的珠子群体的混合物，每个群体包被有结合特定外泌体表面标志物的特定抗体。总共包含39个珠子群体，它们可以通过流式细胞术根据不同的荧光强度来区分。所述试剂盒还含有特异性针对每种标志物的APC偶联的抗体，用于检测外泌体与珠子的结合。
程序的示意图示出在图12A中。将分析样品与抗体包被的珠子温育。随后或并行地，将与珠子结合的外泌体用APC偶联的抗体标记。在本实施例中，使用CD81、CD63和CD9特异性的APC偶联的抗体。
使用流式细胞仪，基于珠子和标记抗体的荧光评估所述珠子-外泌体-标记抗体复合物的形成。包被有感兴趣的标志物的珠子群体中的阳性APC信号表明在外泌体群体中存在感兴趣的标志物。
将下述样品用于分析：
-缓冲液背景(阴性对照)
-60μg纯化的ADSC外泌体(阳性对照)。按照如下所述的标准差速离心方案，从ADSC生长后收集的调制培养基纯化ADSC外泌体：
1.通过三次离心来澄清调制培养基，然后过滤并收集上清液：
·在4℃下以300G离心10分钟；
·在4℃下以2000G离心10分钟；
·在4℃下以10,000G离心30分钟；
·通过0.22μm滤器的真空辅助过滤。
2.将澄清的上清液在4℃下以100,000G超速离心2小时。
3.收集沉淀物并装载在分子过滤装置
Figure BDA0003852300010000651
Ultra 100kDa上。
4.将保留的>100kDa的级分用PBS清洗5次：用PBS将体积补足至0.5ml，并将装置以15000G离心10分钟或直至体积减小到<100μl。
5.将洗过的外泌体储存在-80℃下。
-小瓶A 100kDa沉淀物120μg
-小瓶A 100kDa穿流液
“小瓶A 100kDa沉淀物120μg”和“小瓶A 100kDa穿流液”如下所述制备：
1.将美容产品的小瓶A的内含物(冻干的蛋白质组合物)溶解在PBS中并装载在分子过滤装置
Figure BDA0003852300010000652
Ultra 100kDa上。
2.收集穿流级分(<100kDa)并作为“小瓶A 100kDa穿流液”保存。
3.将保留的>100kDa的级分用PBS清洗5次：用PBS将体积补足到0.5ml并将装置以15000G离心10分钟或直至体积减小到<100μl。
4.将洗过的保留级分标识为“小瓶A100kDa沉淀物120μg”，并储存在-80℃直至分析。
结果概述在图12B中，该图示出了在对照和测试样品中为三种外泌体标志物中的每一者检测到的APC荧光信号的流式细胞术密度图。竖直条标出了APC信号的阳性率。在本发明的蛋白质组合物中检测到了CD81、CD63和CD9的阳性表达，表明在所述组合物中存在外泌体。
NanoSightTM分析
使用纳米粒子追踪分析仪NanoSightTM测量了本发明的蛋白质组合物中外泌体的数目和平均直径。
将下述样品用于分析：
-“美容产品”——将小瓶A的内含物溶解在PBS中。将样品装载到NanoSightTM仪器上，包括来自于27个小瓶的10ml，这等于～1.5个小瓶的体积。
-“60μg纯化的ADSC外泌体”——如上所述。
结果概述在图12C中。结果表明外泌体以每个小瓶108个外泌体的量存在于所述组合物中，这反映出每1mg总蛋白有109个外泌体的含量。外泌体的平均直径约为130nm。
具体实施方式的上述描述如此充分地揭示了本发明的一般性质，使得其他人可以通过应用当前知识容易地修改和/或改编这些特定实施方式以适应于各种不同的应用，而无需过度实验并且不背离一般性概念，并且因此，这样的改编和修改应当并且旨在理解为所公开的实施方式的等同物的含义和范围之内。应当理解，本文中使用的短语或术语是出于描述而非限制的目的。在不背离本发明的情况下，用于执行各种公开的功能的手段、材料和步骤可以采用各种不同的替代形式。

Claims (50)

1.一种粉剂形式的美容组合物，其包含从人类脂肪源性干细胞调制培养基纯化的干燥的蛋白质级分和至少一种可美容用赋形剂，其中所述蛋白质级分包含在除去小于1kDa的组分后剩余的蛋白质和粒子。
2.权利要求1所述的美容组合物，其中所述蛋白质级分包含在除去小于3kDa的组分后剩余的蛋白质和粒子。
3.权利要求1或权利要求2所述的美容组合物，其包含至少109个外泌体/mg蛋白质。
4.前述权利要求中的任一项所述的美容组合物，其中所述蛋白质级分基本上不含所述人类脂肪源性干细胞所生长的细胞培养基的组分。
5.前述权利要求中的任一项所述的美容组合物，其中将所述人类脂肪源性干细胞在含血清培养基中生长至少24小时，随后在无血清培养基中生长至少48小时，然后收集所述培养基。
6.前述权利要求中的任一项所述的美容组合物，其中所述干燥的蛋白质级分是冻干的蛋白质级分。
7.前述权利要求中的任一项所述的美容组合物，其中所述组合物的蛋白质含量为至少0.2μg/mg粉剂。
8.前述权利要求中的任一项所述的美容组合物，其中所述组合物含有少于5％wt的残留水。
9.前述权利要求中的任一项所述的美容组合物，其通过包括下述步骤的方法获得：(a)获得人类脂肪源性干细胞(hADSC)；(b)将所述hADSC在含血清培养基中培养至少24小时；(c)将所述hADSC在无血清培养基中传代培养至少48小时以获得调制培养基；(d)分离所述hADSC和细胞碎片并收集所述调制培养基；(e)使用切向流过滤(TFF)浓缩并过滤所述调制培养基，以除去小于1kDa的组分并获得作为渗余物的蛋白质级分；(f)使用包含至少一种可美容用填充剂和任选的至少一种另外的可美容用赋形剂的水性制剂渗滤所述蛋白质级分，以获得从细胞培养基组分纯化并用所述水性制剂配制的蛋白质级分；以及(g)干燥所述得到的蛋白质级分。
10.前述权利要求中的任一项所述的美容组合物，其通过包括下述步骤的方法获得：(a)获得人类脂肪源性干细胞(hADSC)；(b)将所述hADSC在含血清培养基中培养至少24小时；(c)将所述hADSC在无血清培养基中传代培养至少48小时以获得调制培养；(d)分离所述hADSC和细胞碎片并收集所述调制培养基；(e)使用切向流过滤(TFF)浓缩并过滤所述调制培养基，以除去小于3kDa的组分并获得作为渗余物的蛋白质级分；(f)使用包含至少一种可美容用填充剂和任选的至少一种另外的可美容用赋形剂的水性制剂渗滤所述蛋白质级分，以获得从细胞培养基组分纯化并用所述水性制剂配制的蛋白质级分；以及(g)干燥所述得到的蛋白质级分。
11.权利要求9或权利要求10所述的美容组合物，其中所述水性制剂包含2％-10％(w/v)之间的所述至少一种填充剂。
12.权利要求11所述的美容组合物，其中所述填充剂包含甘露醇。
13.权利要求9-12中的任一项所述的美容组合物，其中所述水性制剂还包含至少一种稳定剂和至少一种张度剂。
14.权利要求13所述的美容组合物，其中所述水性制剂包含0.01-1％(w/v)之间的所述至少一种稳定剂。
15.权利要求13或权利要求14所述的美容组合物，其中所述至少一种稳定剂包含EDTA。
16.权利要求13-15中的任一项所述的美容组合物，其中所述水性制剂包含0.1-1％(w/v)之间的所述至少一种张度剂。
17.权利要求13-16中的任一项所述的美容组合物，其中所述至少一种张度剂包含氯化钠。
18.前述权利要求中的任一项所述的美容组合物，其中所述培养基通过由包含下述步骤的方法获得的人类脂肪源性干细胞来调制：(a)将脂肪抽吸物冷冻；(b)将所述脂肪抽吸物解冻并使用组织解离酶或通过机械破碎进行解离；(c)通过离心使包含ADSC的细胞级分沉淀，并任选地用能够支持细胞生存的悬浮介质清洗所述沉淀物并对所述悬液进行至少一次另外的离心；(d)将所述在步骤(c)中得到的沉淀物重悬于能够支持细胞生存的悬浮介质中，并从所述重悬的沉淀物中的细胞群体选择ADSC；(e)在所述ADSC选择之前任选地进行至少一次过滤；以及(f)任选地将所述ADSC培养至少3次传代。
19.前述权利要求中的任一项所述的美容产品，其中所述培养基通过人类脂肪源性干细胞的群体调制，所述群体的特征在于至少90％的细胞阳性表达CD73、CD90和CD105，并且少于5％的细胞阳性表达CD45。
20.一种改善至少一种与衰老相关的皮肤病症的方法，所述方法包括：提供前述权利要求中的任一项所述的美容组合物；重构所述组合物以获得适合于施用到皮肤的组合物；以及施用到皮肤。
21.一种双组分美容产品，其包含下述组合物作为分开的即混型组合物：
(a)粉剂形式的干燥的蛋白质组合物，其包含从人类脂肪源性干细胞调制培养基纯化的蛋白质级分和至少一种可美容用赋形剂，其中所述蛋白质级分包含在除去小于1kDa的组分后剩余的蛋白质和粒子；和
(b)水性重构组合物，其包含水和至少一种可美容用赋形剂，用于重构所述冻干的蛋白质组合物以形成适合于局部施用到受试者皮肤的组合物，其中所述两种组分保持分开并在使用前混合。
22.权利要求21所述的美容产品，其中所述蛋白质级分包含在除去小于3kDa的组分后剩余的蛋白质和粒子。
23.权利要求21或权利要求22所述的美容产品，其中所述干燥的蛋白质组合物包含至少109个外泌体/mg蛋白质。
24.权利要求21-23中的任一项所述的美容产品，其中所述蛋白质级分基本上不含所述人类脂肪源性干细胞所生长的细胞培养基的组分。
25.权利要求21-24中的任一项所述的美容产品，其中将所述人类脂肪源性干细胞在含血清培养基中生长至少24小时，随后在无血清培养基中生长至少48小时，然后收集所述培养基。
26.权利要求21-25中的任一项所述的美容产品，其中所述干燥的蛋白质组合物的蛋白质含量为至少0.2μg/mg粉剂。
27.权利要求21-26中的任一项所述的美容产品，其中所述干燥的蛋白质组合物含有少于5％wt的残留水。
28.权利要求21-27中的任一项所述的美容产品，其中所述干燥的蛋白质组合物通过包含下述步骤的方法来获得：使用切向流过滤(TFF)浓缩并过滤所述调制培养基，以除去小于1kDa的组分并获得作为渗余物的蛋白质级分；使用包含至少一种可美容用填充剂和任选的至少一种另外的可美容用赋形剂的水性制剂渗滤所述蛋白质级分，以获得从细胞培养基组分纯化并用所述水性制剂配制的蛋白质级分；以及干燥所述配制的蛋白质级分。
29.权利要求21-28中的任一项所述的美容产品，其中所述干燥的蛋白质组合物通过包含下述步骤的方法来获得：使用切向流过滤(TFF)浓缩并过滤所述调制培养基，以除去小于3kDa的组分并获得作为渗余物的蛋白质级分；使用包含至少一种可美容用填充剂和任选的至少一种另外的可美容用赋形剂的水性制剂渗滤所述蛋白质级分，以获得从细胞培养基组分纯化并用所述水性制剂配制的蛋白质级分；以及干燥所述配制的蛋白质级分。
30.权利要求28或权利要求29所述的美容产品，其中所述水性制剂包含2％-10％(w/v)之间的所述至少一种填充剂。
31.权利要求30所述的美容产品，其中所述填充剂包含甘露醇。
32.权利要求28-31中的任一项所述的美容产品，其中所述水性制剂还包含至少一种稳定剂和至少一种张度剂。
33.权利要求32所述的美容产品，其中所述水性制剂包含0.01-1％(w/v)之间的所述至少一种稳定剂。
34.权利要求32或权利要求33所述的美容产品，其中所述至少一种稳定剂包含EDTA。
35.权利要求32-34中的任一项所述的美容产品，其中所述水性制剂包含0.1-1％(w/v)之间的所述至少一种张度剂。
36.权利要求32-35中的任一项所述的美容产品，其中所述至少一种张度剂包含氯化钠。
37.权利要求21-36中的任一项所述的美容产品，其中所述培养基通过由包含下述步骤的方法获得的人类脂肪源性干细胞来调制：(a)将脂肪抽吸物冷冻；(b)将所述脂肪抽吸物解冻并使用组织解离酶或通过机械破碎进行解离；(c)通过离心使包含ADSC的细胞级分沉淀，并任选地用能够支持细胞生存的悬浮介质清洗所述沉淀物并对所述悬液进行至少一次另外的离心；(d)将所述在步骤(c)中得到的沉淀物重悬于能够支持细胞生存的悬浮介质中，并从所述重悬的沉淀物中的细胞群体选择ADSC；(e)在所述ADSC选择之前任选地进行至少一次过滤；以及(f)任选地将所述ADSC培养至少3次传代。
38.权利要求21-37中的任一项所述的美容产品，其中所述培养基通过人类脂肪源性干细胞的群体调制，所述群体的特征在于至少90％的细胞阳性表达CD73、CD90和CD105，并且少于5％的细胞阳性表达CD45。
39.权利要求21-38中的任一项所述的美容产品，其中所述干燥的蛋白质组合物是冻干的蛋白质组合物。
40.权利要求21-39中的任一项所述的美容产品，其中在与所述干燥的蛋白质组合物混合之前所述重构组合物的黏度参数如下：12RPM：1800-2700cP；18RPM：1400-2000cP；60RPM：700-1000cP；100RPM：500-800cP，其在室温下使用Brookfield黏度计测量。
41.权利要求21-40中的任一项所述的美容产品，其中所述水性重构组合物包含蒸馏水和包含至少一种乳化剂和至少一种润肤剂的可美容用赋形剂。
42.权利要求41所述的美容组合物，其中所述水性重构组合物包含2-10％(w/w)之间的所述至少一种乳化剂。
43.权利要求41或权利要求42所述的美容产品，其中所述水性重构组合物包含2-10％(w/w)之间的所述至少一种润肤剂。
44.权利要求21-43中的任一项所述的美容产品，其中所述干燥的蛋白质组合物与水性重构组合物之间的重量比为至少1:20。
45.权利要求44所述的美容产品，其中所述干燥的蛋白质组合物与水性重构组合物之间的重量比在1:20至1:50的范围内。
46.权利要求21-45中的任一项所述的美容产品，其中在与所述水性重构组合物混合之前，所述干燥的蛋白质组合物的pH在7.0-7.6的范围内。
47.权利要求21-46中的任一项所述的美容产品，其中在与所述干燥的蛋白质组合物混合之前，所述水性重构组合物的pH在7.0-7.6的范围内。
48.权利要求21-47中的任一项所述的美容产品，其中在混合所述两种组合物后所述重构的组合物的pH在7.0–7.6的范围内。
49.权利要求21-48中的任一项所述的美容组合物，其被提供为预充式注射器，其中所述注射器包含：包含所述水性重构组合物的第一区室，包含所述干燥的蛋白质组合物的第二区室，和柱塞，其中在移动所述柱塞后，所述水性重构组合物从所述第一区室递送到第二区室中并与所述干燥的蛋白质组合物混合，用于重构。
50.一种改善与衰老相关的至少一种皮肤病症的方法，所述方法包括：提供权利要求21-49中的任一项所述的双组分美容产品；将所述干燥的蛋白质组合物与水性重构组合物混合，以形成适合于施用到皮肤的重构的组合物；以及施用到皮肤。
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