IT201600109148A1 - Processo per isolare e liofilizzare vescicole extracellulari - Google Patents
Processo per isolare e liofilizzare vescicole extracellulariInfo
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Description
“Processo per isolare e liofilizzare vescicole extracellulari”
CAMPO DELL’INVENZIONE
La presente invenzione riguarda un processo per isolare e liofilizzare vescicole extracellulari presenti nei fluidi biologici. In particolare, l’invenzione riguarda un processo combinato di dialisi o ultrafiltrazione e liofilizzazione di fluidi biologici comprendenti microvescicole e/o esosomi che permette di ottenere un prodotto in polvere contenente microvescicole e/o esosomi. Inoltre, secondo un aspetto preferito, l’invenzione riguarda un processo per ottenere un prodotto in polvere di microvescicole e/o esosomi, contenenti a loro volta nanoparticelle caricate con una o più sostanze biologicamente attive.
STATO DELL’ARTE
Le cellule comunicano e si scambiamo informazioni con due modalità fondamentali, attraverso il diretto contatto tra cellule e attraverso la secrezione di sostanze biologicamente attive (meccanismi paracrini): il prodotto di secrezione cellulare nel suo complesso può essere definito secretoma. Il secretoma è costituito da fattori solubili (quali per esempio citochine) e da strutture non solubili quali esosomi e microvescicole.
Esosomi e micro vescicole sono particelle di dimensione nanometrica, con diametro medio generalmente compreso tra 30 e 1000 nm, delimitate da una membrana lipidica generalmente bistrato.
Microvescicole e esosomi contengono biomolecole, tra cui proteine, RNA messaggero e micro RNA e, grazie alla loro composizione, sono stati proposti come terapia innovativa in alternativa alle cellule di origine in quanto presentano molti vantaggi, tra i quali la minore propensione a stimolare il sistema immunitario, la diminuzione del rischio di tumorigenicità, la capacità di attraversare la barriera emato-encefalica, la minore propensione all’ostruzione vascolare.
Il secretoma è stato proposto nelle terapie di medicina rigenerativa per il trattamento di varie patologie come l'artrosi, malattie cardiovascolari, malattie neurologiche, malattie polmonari, diabete, e molte altre (Lener T., et al., “Applying extracellular vesicles based therapeutics in clinical trials - an ISEV position paper”, J Extracell Vesicles., Voi. 4, 2015, 30087). Negli studi riportati in letteratura il tasso dì successo e la durata dell’effetto sono stati molto variabili, principalmente a causa della talvolta insufficiente quantità di sostanze biologicamente attive (proteine, glicoproteine, acidi nucleici) che raggiungono inalterate il sito d’azione.
Anche se ad oggi ancora non esiste una normativa specifica, il secretoma, inclusivo di microvescicole ed esosomi, può essere considerato come medicinale biotecnologico, e per l’uso clinico devono essere stabilite preparazioni che soddisfano le norme di buona fabbricazione (NBF o GMP dall’inglese Good Manufacturing Practice), al fine di garantire sicurezza ed efficacia terapeutica, attraverso il controllo della qualità del prodotto (per esempio, ma non solo, uniformità quali/quantitativa) e del processo produttivo (per esempio, ma non solo, robustezza del processo e riproducibilità).
Vari metodi sono stati descritti per l'isolamento di microvescicole e/o esosomi, ma tutti solo su scala di laboratorio e, ad oggi, nessuno è stato realizzato su scala industriale/semi industriale seguendo le NBF.
Il metodo più comunemente usato è l’ultracentrifugazione, in cui i fluidi biologici sono sottoposti a centrifugazione ad alta velocità. Tuttavia, la resa di microvescicole e/o esosomi, nonché la qualità del prodotto finale possono essere influenzati dalle proprietà dello strumento (ad esempio, tipo di rotore, angolo dì sedimentazione del rotore e/o raggio della forza centrifuga) e dall'operatore. Inoltre, l'ultracentrifugazione può provocare l'aggregazione e/o la rottura delle microvescicole e/o esosomi a causa di forze centrifughe elevate, perdendo in questo modo l'integrità delle strutture vescicolari.
Per la produzione su larga scala delle microvescicole e/o esosomi sono state indagate nuove tecniche di isolamento, quali la cromatografia di esclusione molecolare e la filtrazione a flusso tangenziale. Recentemente, alcuni ricercatori hanno dimostrato che la combinazione di ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione molecolare permette di ottenere una resa significativamente maggiore di microvescicole e/o esosomi rispetto all’ultracentrifugazione, senza modificare le proprietà biofisiche ed il contenuto proteico del materiale d’origine (Nordin JZ, et al., “Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties”, Nanomedicine, Voi. 11, Issue 4, May 2015, 879-883).
Tecniche di isolamento di microvescicole e/o esosomi sono state descritte in brevetti e domande di brevetto di recente pubblicazione, come per esempio, US9347087, US8901284, US9005888, WO2016033695, WO2016022654, WO2015131153, e WO2012087241.
Un ulteriore problema noto neH’arte consiste nella conservazione delle microvescicole e/o esosomi. Ad oggi l’unico metodo di conservazione di microvescicole e/o esosomi è la crioconservazione ad una temperatura uguale o inferiore a -20°C, in assenza di crio-protettori (Zhou H, et al., “Collection, Storage, preservation, and normalization of human urinary exosomes for biomarker discovery”, Kidney Int., Voi. 69, Issue 8, 2006, 1471-1476). L’assenza di crioconservanti rappresenta un grosso limite perché i cristalli di acqua che si formano durante il processo di congelamento facilmente rompono le membrane biologiche di cui sono costituite le microvescicole e gli esosomi. Inoltre, il marcato stress osmotico cui è sottoposto il secretoma in fase di congelamento e scongelamento può danneggiare in modo irreversibile le membrane, il cargo contenuto al loro interno, nonché le proteine di membrana, le molecole di adesione e di homing e i recettori (Ohno S, et al., “Focus on extracellular vesicles: development of extracellular vesicle-based therapeutic systems”, Int. J. Mol. Sci., Voi. 17, 2016, 172).
Pertanto, nonostante i progressi ottenuti, esiste ancora l’esigenza di mettere a punto un processo di isolamento e conservazione di microvescicoie e/o esosomi realizzabile ed economicamente sostenibile in GMP, facilmente scalabile, riproducibile e, soprattutto, una preparazione farmaceutica stabile nel tempo.
RIASSUNTO DELL’INVENZIONE
La Richiedente ha trovato un processo di isolamento e conservazione di microvescicole e/o esosomi che permette di superare gli svantaggi dei metodi descritti in letteratura.
In particolare, la Richiedente ha ottimizzato un processo combinato di dialisi o ultrafiltrazione e liofilizzazione applicabile a fluidi biologici comprendenti microvescicole e/o esosomi (come il surnatante di cellule coltivate o fluidi corporei) che permette di ottenere un prodotto solido sotto forma di polvere liofilizzata.
La polvere liofilizzata ottenuta con il processo della presente invenzione può essere facilmente realizzata in appropriati locali per la produzione farmaceutica di prodotti sterili oppure può essere confezionata e resa sterile (per esempio, ma non solo, mediante irraggiamento), ottenendo un prodotto farmaceutico solido, finito (pronto all’uso o destinato a preparazione estemporanea) oppure un semilavorato per la preparazione di forme farmaceutiche solide, liquide o semisolide (soluzioni, sospensioni emulsioni, creme unguenti geli o paste, granulati, capsule, compresse) per la somministrazione di microvescicoie e/o esosomi.
La polvere liofilizzata ottenuta con il processo della presente invenzione può essere facilmente caratterizzata seguendo procedure validabili in GMP, quali per esempio (I) titolazione in proteine e fosfolipidi, (II) distribuzione dimensionale delle microvescicole o esosomi, (III) citotossicità in vitro, (IV) attività biologica in vitro (immunomodulazione e attività antiinfiammatoria).
La Richiedente ha osservato che conducendo la dialisi o l’ultrafiltrazione in presenza di particolari soluzioni tampone si poteva ottenere una maggiore concentrazione di microvescicole e/o esosomi preservando la loro integrità.
La Richiedente ha inoltre osservato che conducendo la liofilizzazione in presenza di un opportuno agente crio-protettivo era possibile ottenere un prodotto solido e stabile nel tempo con un elevato contenuto proteico, al contempo privo di citotossicità ed efficace nel ridurre l'infiammazione in un modello cellulare in vitro, mediante stimolazione di condrociti articolari.
La Richiedente ha infine osservato che l’aggiunta dì nanoparticelle caricate con una sostanza biologicamente attiva durante la fase di coltura delle cellule permetteva di ottenere in un primo tempo cellule caricate con tali nanoparticelle, e quindi microvescicole e/o esosomi a loro volta caricati con tali nanoparticelle.
Pertanto, un primo aspetto della presente invenzione riguarda un processo di produzione di microvescicole e/o esosomi caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti fasi:
(i) prelevare un fluido biologico comprendente microvescicole e/o esosomi,
(ii) dializzare o ultrafiltrare detto fluido biologico utilizzando una membrana avente un valore di soglia (cut-off) uguale o inferiore a 500.000 Dalton ed un fluido di dialisi od ultrafiltrazione, (iii) aggiungere un crio-protettore alla soluzione dializzata o ultrafiltrata ottenuta dalla fase (ii), e
(iv) liofilizzare la soluzione risultante dalla fase (iii).
Preferibilmente, il fluido biologico è il surnatante di cellule in coltura, vantaggiosamente cellule staminali, o un fluido corporale, come per esempio, ma non solo, plasma, siero o liquido amniotico.
Secondo un aspetto preferito, il surnatante viene prelevato da cellule coltivate in un mezzo di coltura per almeno 4 ore.
Secondo un aspetto ulteriormente preferito, le cellule sono coltivate in un mezzo di coltura contenente nanoparticelle caricate con una sostanza biologicamente attiva.
In un secondo aspetto, la presente invenzione riguarda un prodotto sotto forma di polvere liofilizzata comprendente microvescicole e/o esosomi aventi diametro compreso tra 20 e 5.000 nm e diametro medio compreso tra 50 e 200 nm.
Secondo un aspetto preferito, le microvescìcole e/o esosomi comprendono nanoparticelle caricate con una sostanza biologicamente attiva.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
La Figura 1 illustra il grafico della distribuzione delle dimensioni delle microvescicole e/o esosomi descritte nell’esempio 4.
La Figura 2 mostra una fotografia al SEM (12.000x) delle microvescicole e/o esosomi descritte nell'esempio 4.
La Figura 3 mostra una fotografia al TEM delle microvescicole e/o esosomi descritte nell’esempio 4.
La Figura 4 mostra i risultati del saggio di immunomodulazione descritto nell'esempio 5.
La Figura 5 mostra i risultati del saggio di captazione delle nanoparticelle descritto nell’esempio 6.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Con il termine ‘'microvescicole e/o esosomi” si intende definire particelle circondate da una membrana lipidica, mono- o bi-strato, aventi dimensioni comprese tra 20 nm e 1.000 nm secrete da cellule e presenti in un fluido biologico.
Con il termine “fluido biologico” si intende definire un surnatante di cellule in coltura o un fluido corporeo.
Con il termine “mezzo (o terreno) di coltura minimo" si intende definire un terreno di coltura comprendente il minimo di nutrienti possibile dove tali nutrienti, generalmente limitati ad una sorgente energetica di carbonio (per esempio zuccheri) e alcuni sali, sono definiti in termini sia qualitativi sia quantitativi, e privo di siero.
Con il termine “disturbo” si intende definire qualunque alterazione della normale funzionalità di un organo, apparato o sistema di un essere umano o animale vivente causato da agenti esterni patogeni e/o traumatici, da agenti interni, e/o da fenomeni degenerativi causati dall’invecchiamento.
Le microvescicole e/o esosomi possono essere presenti in differenti fluidi corporei (ad esempio, ma non solo, plasma, saliva, urina, siero, liquido sinoviale, fluido follicolare, liquido amniotico, liquido cefalo-rachidiano) oppure possono essere presenti nel surnatante di coltura di differenti linee cellulari (come ad esempio, ma non solo, adipociti, astrociti, cellule beta, linfociti, cellule endoteliali, cellule tumorali, cardiomiociti, cellule dendritiche, cellule staminali, cellule epiteliali, eritrociti, epatociti, cheratinociti, macrofagi, monociti, oligodendrociti, piastrine, linfociti T).
Il fluido biologico preferibilmente utilizzato nel processo della presente invenzione è rappresentato dal surnatante di coltura di cellule, in particolare di cellule staminali. Le cellule utili nella presente invenzione sono preferibilmente cellule staminali mesenchimali.
Le cellule staminali mesenchimali (CSM) hanno origine dal mesoderma, il foglietto embrionale della blastocisti tra ectoderma e endoderma. Le CSM sono cellule staminali multipotenti auto-rinnovabili che possono differenziare in diverse linee cellulari, tra le quali sono inclusi osteoblasti, condrociti, miociti e adipociti, dando origine a vari tessuti cellulari come, per esempio, ossa, cartilagini, tendini, muscoli e tessuto adiposo. Le CSM sono distribuite in tutto il corpo nei mammiferi e sono responsabili della rigenerazione tissutale. L’isolamento delle CSM è stato effettuato da molteplici distretti tessutali, tra cui il midollo osseo, dal cordone ombelicale e, recentemente ed in misura sempre maggiore, dal tessuto adiposo, che contiene una quantità elevata di CSM.
Oltre alla loro capacità di differenziazione, le CSM hanno dimostrato di modulare la risposta immunitaria e l'infiammazione e promuovere meccanismi protettivi e riparativi tissutali, rendendole utilizzabili nella terapia di svariate patologie (Caplan Al “What’s in a name?” Tissue Engineering Part A. August 2010, Voi. 16, No. 8: 2415-2417). I medicinali a base di CSM sottoposte a manipolazione rilevante sono definiti Prodotti Medicinali per le Terapie Avanzate.
Le CSM possono essere isolate dalla componente stromale del midollo osseo (dove rappresentano circa lo 0,01% di tutte le cellule nucleate), dal sangue del cordone ombelicale, dalla placenta, dal sangue periferico e dal tessuto adiposo (tessuto grasso).
Preferibilmente, le CSM sono isolate dal tessuto adiposo. Il tessuto adiposo contiene una frazione stromale vascolare da cui possono essere isolate cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (AD-CSM). Le AD-CSM possiedono fenotipo e profilo di espressione genica simile a quello delle cellule staminali del midollo osseo. Le AD-CSM hanno la capacità di auto-rinnovamento e di crescita a lungo termine e sono in grado di differenziarsi in tipi di cellule diverse, quali adipociti, osteoblasti e condrociti.
Le AD-CSM sono isolate dal tessuto adiposo mediante lavaggio con soluzione tampone e digestione con enzimi.
Il lavaggio e/o la digestione possono essere effettuati con qualsiasi soluzione tampone nota nell’arte come, per esempio, tampone fosfato salino (PBS - Phosphate-Buffered Saline), tampone borato salino (BBS - Borate Buffered Saline), e tampone TRIS salino (TBS - TRIS Buffered Saline).
La digestione può essere effettuata con qualsiasi enzima noto nell'arte in grado di degradare e progressivamente separare le cellule dalla matrice extracellulare per rottura dei legami peptidici presenti nel collagene. Tipicamente per tale operazione vengono impiegate collagenasi come, per esempio, collagenasi AFA, collagenasi tipo I, collagenasi tipo II, collagenasi tipo III, collagenasi tipo IV, e collagenasi CLSPA.
Vantaggiosamente, la digestione viene condotta in presenza di antibiotici come, per esempio, penicillina, streptomicina e amfotericina, in concentrazione inferiore al 5% p/v, preferibilmente inferiore al 3% p/v.
La frazione stromale vascolare, contenente le CSM, può essere separata dal mezzo di digestione per filtrazione e/o centrifugazione, e quindi posta in terreno di coltura, preferibilmente in condizioni monostrato, fino al raggiungimento della sub-confluenza.
La coltura cellulare viene effettuata in piastre di adesione in terreno di coltura minimo come, per esempio, il terreno DMEM (Dulbecco's modified Eagle's Medium), il terreno IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Media), il terreno Ham’s F10, il terreno Ham’s F12, il terreno MEM (Minimal Essential Medium), il terreno G-MEM (Glasgow Minimal Essential Medium), il terreno BME (Basai Medium Eagle), o terreni misti come DMEM/Ham's F12 (in rapporto 1:1), Advanced DMEM/Ham's F12 e IMDM/MEM.
Preferibilmente, il terreno di coltura minimo viene addizionato con siero di origine animale come, per esempio, siero fetale bovino (FBS - Fetal Bovine Serum), siero fetale vitello (FCS - Fetal Calf Serum), o sostituti di siero di origine artificiale e disponibili commercialmente come, per esempio siero Knockout™ SR (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), X-Vivo™10 e X-Vivo™20 (Lonza Walkersville, Ine, Walkersville, MD, USA), Lipumin™ 10x e SerEx 10* (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria), SR3 (Sigma, St Louis, MO, USA), serum substitute supplement (SSS) (Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA) e Plasmanate (Bayer Healthcare, West Haven, CT, USA) oppure lisato piastrinico disponibile in commercio (Lyset™, Carlo Erba Reagents, Italy).
Le CSM vengono quindi trattate con una soluzione di distacco cellulare, tipicamente tripsina-EDTA, e nuovamente piastrate a 37°C ed in atmosfera di anidride carbonica al 5% in condizioni monostrato. Il procedimento (espansione cellulare) viene ripetuto più volte, preferibilmente da 1 a 12 volte, più preferibilmente da 1 a 3 volte.
Le CSM in adesione sono quindi coltivate in un terreno di coltura minimo per un periodo di almeno 4 ore, preferibilmente di almeno 12 ore, e preferibilmente di almeno 18 ore. Secondo un aspetto maggiormente preferito, la coltura avviene per un periodo inferiore a 96 ore, preferibilmente inferiore a 48 ore. Vantaggiosamente, la coltura avviene per un periodo di circa 24 ore.
La Richiedente ha osservato che, in queste condizioni, le CSM producono una quantità considerevole e riproducibile di microvescicole e/o esosomi che vengono rilasciati nel mezzo di coltura.
La Richiedente ha inoltre osservato che l'aggiunta di nanoparticelle caricate con una sostanza biologicamente attiva durante la fase di coltura delle CSM permetteva di ottenere, in un primo tempo, cellule caricate con tali nanoparticelle, e quindi, dopo la coltura in terreno minimo, microvescicole e/o esosomi a loro volta caricati con tali nanoparticelle.
Il surnatante di coltura, contenente le microvescicole e/o esosomi, viene raccolto e le CSM vengono nuovamente trattate con una soluzione di distacco cellulare, tipicamente tripsina-EDTA.
Nel procedimento della presente invenzione, il fluido biologico (surnatante o fluido corporeo) viene sottoposto ad un processo di dialisi o ultrafiltrazione utilizzando una membrana avente un valore di soglia (cut-off) uguale o inferiore a 500.000 Dalton.
Preferibilmente, la membrana di dialisi o ultrafiltrazione utile nella presente invenzione ha un valore di soglia (cut-off) uguale o inferiore a 300.000 Dalton, più preferìbilmente uguale o inferiore a 100.000 Dalton, e ancora più preferibilmente uguale o inferiore a 10.000 Dalton.
Vantaggiosamente, la membrana di dialisi o ultrafiltrazione ha un valore di soglia (cut-off) uguale o inferiore a 5.000 Dalton.
Membrane di dialisi sono commercialmente disponibili da diversi fornitori come, per esempio, le membrane Spectra/Por® (Spectrum Laboratories, Ine, Rancho Dominguez, CA USA), Visking (Mediceli Membranes LTD, London, UK), SnakeSkin® (TermoFisher Scientific, Rockford, IL, USA).
Le attrezzature per ultrafiltrazione sono disponibili commercialmente dai medesimi fornitori, come per esempio il sistema di ultrafiltrazione TFF (Tangential Flow Filtration) della Spectrum Laboratories oppure le unità di ultrafiltrazione da centrifugare Amicon™ (Merk Millipore).
Il fluido biologico (surnatante o fluido corporeo) viene racchiuso all'interno di un contenitore (tubo o sacca di dialisi) realizzato con la membrana avente pori di dimensioni uguali o inferiori a 500.000 Dalton, ed il contenitore viene collocato in un opportuno fluido di dialisi o di ultrafiltrazione.
Il fluido di dialisi o ultrafiltrazione può essere acqua o una soluzione tampone con una concentrazione di sali inferiore alla concentrazione di sali del fluido biologico, in altre parole con una pressione osmotica inferiore alia pressione osmotica del fluido biologico.
Preferibilmente, la soluzione tampone è scelta nel gruppo che consiste di soluzioni di sali inorganici, come fosfato di sodio, cloruro di sodio, acetato di sodio, citrato di sodio, o di sali organici come trometamina cloridrato (HCI-TRIS), MOPS, MES, HEPES e TES. Miscele tampone come tampone fosfato salino (PBS) comprendente cloruro di sodio e potassio, disodio fosfato, e monopotassio fosfato possono vantaggiosamente essere usate.
Esempi di soluzioni tampone utili nel procedimento della presente invenzione sono una soluzione di Na2HP04<*>7H20 (10mM), una soluzione di trometamina cloridrato (TRIZMA 1,28M), una soluzione di NaCI (0,54M) e PBS privo di ioni Ca<2+>e Mg<2+>.
Vantaggiosamente, il fluido di dialisi comprende un poliossialchilene avente peso molecolare medio uguale o maggiore di 100 g/mol.
Preferibilmente, il poliossialchilene è un polietilenglicole (PEG) con un peso molecolare medio uguale o maggiore di 100 g/mol, preferibilmente uguale o maggiore di 300 g/mol, più preferibilmente uguale o maggiore di 500 g/mol.
Preferibilmente, il poliossialchilene utile nella presente invenzione è un polietilenglicole (PEG) con un peso molecolare medio uguale o minore di 4000 g/mol, preferibilmente uguale o minore di 3000 g/mol, più preferibilmente uguale o minore di 2500 g/mol.
Vantaggiosamente, il poliossialchilene utile nella presente invenzione è un polietilenglicole (PEG) con un peso molecolare medio compreso tra 1000 e 2000 g/mol.
La soluzione ottenuta mediante il processo di dialisi o ultrafiltrazione comprende una maggiore concentrazione di microvescicole e/o esosomi ed un ridotto contenuto di sali e/o impurezze. La soluzione dializzata o ultrafiltrata viene quindi sottoposta ad un processo di liofilizzazione mediante tecniche di liofilizzazione convenzionali per fornire un materiale in polvere che è adatto per una conservazione prolungata a temperatura ambiente o a temperature inferiori.
Secondo il procedimento della presente invenzione, la soluzione dializzata o ultrafiltrata viene addizionata di un crio-protettore.
Il crio-protettore è tipicamente rappresentato da uno zucchero, da amminoacidi, o da loro miscele. Esempi di zuccheri utili come crio-protettori nel procedimento della presente invenzione sono: mannitolo, lattosio, saccarosio, trealosio, sorbitolo, glucosio, maltosio, fruttosio, e raffinosio. Esempi di amminoacidi utili come crio-protettori nel procedimento della presente invenzione sono: arginina, alanina, glieina e istidina. Preferibilmente, mannitolo, glieina e loro miscele sono utilizzati come crioprotettori nella presente invenzione. L’aggiunta di crio-protettore può essere condotta solubilizzando il crio-protettore direttamente nel surnatante dializzato o ultrafiltrato oppure aggiungendo una soluzione acquosa del crioprotettore precedentemente preparata.
Il congelamento della soluzione dializzata o ultrafiltrata avviene a temperature inferiori a -50X, preferibilmente inferiori a -70°C, con l’ausilio di ghiaccio secco o azoto liquido. La soluzione dializzata o ultrafiltrata e congelata viene trasferita in un liofilizzatore, dove viene applicato il vuoto per abbassare la pressione atmosferica e permettere sublimazione del ghiaccio (cioè, la transizione di acqua dalla fase solida alla fase vapore senza passare attraverso la fase liquida).
Le apparecchiature di liofilizzazione (liofilizzatori) sono ampiamente disponibili in commercio. Un liofilizzatore consiste essenzialmente in una camera di essiccamento, un condensatore per raccogliere il vapore sublimato dal prodotto, un sistema di raffreddamento per la camera di essiccamento ed il condensatore, e una pompa da vuoto per ridurre la pressione nella camera di essiccamento e nel condensatore.
La liofilizzazione è vantaggiosa in quanto fornisce un prodotto in polvere, stabile e pronto per il confezionamento o già confezionato, contenente microvescicole e/o esosomi privo di cellule residue o microbi.
Il processo della presente invenzione permette di ottenere un prodotto sotto forma di polvere liofilizzata comprendente microvescicole e/o esosomi aventi diametro compreso tra 20 e 5.000 nm e diametro medio compreso tra 50 e 200 nm.
Secondo un aspetto preferito dell’invenzione, le microvescicole e/o esosomi comprendono nanoparticelle caricate con una sostanza biologicamente attiva.
Al pari delle CSM, il prodotto ottenuto secondo la presente invenzione può essere utile nelle terapie di medicina rigenerativa, per il trattamento di varie patologie quali (ma non solo) l'artrosi, malattie cardiovascolari, come l’insufficienza cardiaca, malattie neurologiche, come il morbo di Parkinson o di Alzheimer, il dolore, come il dolore cronico e/o neuropatico, l'insufficienza midollare, il diabete e il cancro, nei trattamenti di medicina estetica dei tessuti molli e cosmetici anti-invecchiamento cutanei.
Al contempo, l’introduzione di nanoparticelle caricate di sostanze biologicamente attive consente l'indirizzamento per mezzo di microvescicole e/o esosomi direttamente verso l’organo e/o apparato interessato all’effetto della sostanza biologicamente attiva.
Gli organi e/o apparati principalmente interessati comprendono per esempio (ma non solo) quelli del sistema cardiovascolare, del sistema respiratorio, del sistema gastrointestinale, del sistema tegumentario, del sistema muscolare, del sistema scheletrico e del sistema nervoso centrale e periferico.
La scelta della sostanza biologicamente attiva non è particolarmente limitata. Qualunque sostanza in grado di essere caricata in nanoparticelle ed efficace in un disturbo di uno dei sistemi sopra menzionati può essere compreso nell’ambito della presente invenzione.
A titolo di esempio, possono essere menzionati farmaci cardiovascolari (per esempio antiipertensivi, antiaritmici, diuretici), farmaci del sistema nervoso centrale e periferico (per esempio anestetici, ipnotici, sedativi, ansiolitici, anti-Parkinson), farmaci antidolorifici (per esempio antiinfiammatori e analgesici), farmaci antimicrobici (per esempio sulfamidici, antibiotici, antivirali e antifungini), chemioterapici, vaccini (per esempio vaccini antitumorali o vaccini antiinfluenzali), ormoni, vitamine, estratti vegetali, e fitocomplessi.
Il prodotto comprendente microvescicole e/o esosomi secondo la presente invenzione può essere somministrato ad un essere umano o animale vivente per mezzo di qualsiasi opportuna via di somministrazione, per esempio per via parenterale, inalatoria, topica, oftalmica, auricolare, e transmucosale (come ma non solo rettale, vaginale, e buccale).
Nel caso di somministrazione per via parenterale, il prodotto viene ricostituito per aggiunta ad una opportuna soluzione fisiologica iniettabile e somministrato per via parenterale, ad esempio sottocutanea o venosa, attraverso iniezione, fleboclisi, catetere o infusore intratecale. Nel caso di somministrazione per via respiratoria, il prodotto può essere formulato sotto forma di polvere per inalazione o solubilizzato per aerosol. Nel caso di somministrazione per via oftalmica, auricolare e transmucosale il prodotto può essere formulato sotto forma di soluzione, unguento, gel, o crema.
Nel caso di utilizzo cosmetico, il prodotto può essere formulato sotto forma dì unguento, crema, crema-gel, gel, lozione, pasta, o soluzione per applicazione topica, oftalmica, o per irrigazione.
Il prodotto comprendente microvescicole e/o esosomi secondo la presente invenzione può essere facilmente confezionato e reso sterile (per esempio, ma non solo, mediante irraggiamento come descritto in Sakar F. et al., "Nano drug delivery systems and gamma radiation sterilization", Pharmaceutical Development and Technology), ottenendo un prodotto farmaceutico solido per la somministrazione di microvescicole e/o esosomi.
La presente invenzione viene quindi ulteriormente illustrata con riferimento ai seguenti esempi non limitativi.
Esempio 1
Isolamento delle cellule staminali mesenchimali (CSM) da tessuto adiposo umano
I tessuti adiposi sono stati ottenuti da donatori informati. I campioni sono stati ripetutamente lavati con tampone fosfato salino (PBS) privo di ioni calcio (Ca<2+>) e magnesio (Mg<2+>) (Euroclone, Milano, Italia) e finemente sminuzzati con forbici chirurgiche. La digestione del tessuto è stata eseguita in un bagno termostatato a 37°C munito di agitatore utilizzando l'enzima collagenasi di tipo II (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) solubilizzata in PBS contenente ioni calcio (Ca<2+>) e magnesio (Mg<2+>) (Euroclone, Milano, Italia), addizionato con l’1% di penicillina / streptomicina (Euroclone, Milano, Italia) e Γ1 % di amfotericina B (Euroclone).
Dopo un’ora, alla sospensione cellulare sono stati aggiunti il terreno DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s Medium) ed il terreno Ham’s F12 in rapporto 1:1 (Euroclone, Milano, Italia) addizionato con il 10% di siero fetale bovino (FBS, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Milano, Italia).
Il tessuto digerito è stato filtrato su setaccio cellulare da 70pm (Greiner Bio-One, Milan, Italy) e centrifugato a 600 g per 5 minuti (M. Faustini et al, “Non-expanded mesenchymal stem cells for regenerative medicine: yield in stromal vascular fraction from adipose tissues”, Tissue Engineering, 2010, Voi. 16, Issue 6, 1515-21). La frazione stromale vascolare così recuperata è stata coltivata in condizioni monostrato (100.000 cellule/cm<2>) in terreno DMEM/F12 in rapporto 1:1 addizionato con il 10% di siero fetale bovino, Γ1 % di penicillina / streptomicina e Γ 1 % di amfotericina B.
Al raggiungimento della sub-confluenza, le CSM sono state rimosse per trattamento con tripsina-EDTA alio 0.05% (Euroclone, Milano, Italia) e seminate nuovamente in fiasca in condizioni monostrato (10.000 cellule/cm<2>) a 37°C in atmosfera di C02al 5%.
Isolamento e liofilizzazione delle microvescicole e/o esosomi
Quando le CSM avevano raggiunto la sub-confluenza, sono state trasferite e coltivate in terreno minimo DMEM/F12 per 4 o 24 ore. Quindi, il surnatante è stato prelevato e le CSM sono state rimosse per trattamento con tripsina-EDTA allo 0.05% (Euroclone, Milano, Italia) per valutare il numero di cellule e la loro vitalità. Il surnatante è stato dializzato per tre giorni utilizzando membrane di dialisi aventi cut-off di 3500 Dalton (Spectra/Por, Spectrum Laboratories, Milano, Italia) in presenza di diversi tipi di soluzioni tampone (acqua distillata ultrapura, Ν32ΗΡ04<*>7H20 10mM, TRIZMA 1.28M, NaCI 0.54M e PBS privo di ioni Ca<2+>e Mg<z+>) come illustrato nelle seguenti tabelle degli esempi 2 e 3.
Per concentrare il prodotto, il processo di dialisi è stato condotto in presenza di una soluzione tampone contenente il 5% p/v di polietilenglicole (PEG 1500, Merck Millipore, Milano, Italia).
Il prodotto dializzato è stato addizionato con un agente crio-protettore (glieina, mannitolo) da solo o in associazione, nelle quantità illustrate nelle seguenti tabelle degli esempi 2 e 3, congelato a -20°C, e quindi sottoposto al processo di liofilizzazione con vuoto inferiore a 1.33 mbar.
Esempio 2
I campioni ottenuti secondo la procedura dell’esempio 1 sono stati sottoposti al saggio BCA con il Protein Assay Kit della Thermo Scientific (Milano, Italia) per la quantificazione delle proteine contenute nel prodotto dializzato e liofilizzato, ed al saggio MTT per valutarne la citotossicità su fibroblasti umani.
Saggio BCA
II contenuto totale di proteine dei campioni di microvescicole e/o esosomi dializzati e liofilizzati ottenuti con la procedura dell’esempio 1 utilizzando il tampone ed il crio-protettore della seguente tabella 1 è stato determinato utilizzando il kit BCA-Protein Assay (Thermo Scientific, Milano, Italia), secondo le specifiche del produttore.
La curva di calibrazione assorbanza-concentrazione è stata generata utilizzando albumina serica bovina standard (BSA, Sigma Aldrich). La soluzione reagente di lavoro è stata aggiunta a ciascun campione o standard (rapporto 1:1) e gli insiemi sono stati quindi incubati a 37°C per 2 ore prima di misurare l'assorbanza a 562 nm con un lettore di micropiastre (Sinergy HT, BioTek, United Kingdom). La concentrazione di proteine è stata estrapolata da un grafico di concentrazione contro assorbenza ottenuto da soluzioni di proteine standard, utilizzando un'equazione polinomiale del terzo ordine, con r<2>0,99 per ogni saggio.
I risultati sono stati riassunti nella seguente tabella 1.
TABELLA 1
Campione Incubazione Tampone Glieina Mannitoio Proteine D.st.
in terreno di dialisi (% p/v) (% p/v) (pg/ml) minimo
(ore)
1A 4 Na2HP042 0 68,5 39,58
1B 24 Na2HP042 0 14,9 0,86
1C 24 NaCI 0,2 0 66,6 3,15
1D 24 NaCI 0 3 34,4 2,34
1E 24 NaCI 0,75 3 25,6 3,12
1F 24 TRIZMA 0,75 3 6,6 0,56
1G 24 PBS 0,75 3 24,5 6,68
1H 24 H20 0,75 3 42,3 5,98
11 24 Na2HP040,75 3 17,1 0,35
I risultati della tabella 1 hanno mostrato che il tempo di coltura delle CSM nel terreno minimo influenzava, a parità di tampone e agente crio-protettivo la quantità di proteine risultante, sebbene il dato ottenuto a 4 ore mostrasse valori con un’elevata dispersione, sintomo di un’alta variabilità tra i campioni analizzati.
A parità di tipo e quantità di agente crio-protettivo, la quantità di proteine risultante è influenzata dal tipo di tampone utilizzato, con valori più elevati per il tampone NaCI e PBS e più bassi per il tampone Na2HP04e TRIZMA. L'utilizzo di acqua ha mostrato sorprendentemente il miglior valore.
A parità di tampone, utilizzando NaCI, il mannitoio da solo forniva risultati migliori rispetto alla combinazione glicina-mannitolo.
Saggio MTT
Fibroblasti umani sono stati seminati (10.000 cellule/cm2) in una piastra a 96 pozzetti (Greiner Bio-One, Milano, Italia) e coltivati per 24 ore, a 37°C in atmosfera di C02al 5%, in terreno DMEM HG (ad alto glucosio), addizionato con il 10% di siero fetale bovino, Π% di penicillina / streptomicina e l’1% di amfotericina B.
I campioni di microvescicole e/o esosomi dializzati e liofilizzati ottenuti con la procedura dell’esempio 1 utilizzando il tampone ed il crio-protettore della seguente tabella 2 sono stati incubati con le cellule a tre concentrazioni (2,5, 1,25 e 0,6 mg/pozzetto) per 24 e 48 ore. Quindi, i campioni sono stati rimossi e, a ciascun pozzetto, sono stati aggiunti 100 μΙ di una soluzione contenente 0,5 mg/ml di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT, Sigma-Aldrich). Dopo tre ore, la soluzione di MTT è stata rimossa, e sono stati aggiunti 100 μΙ di DMSO (Sigma-Aldrich).
La densità ottica (DO) è stata misurata con lo strumento Synergy HT (Biotek, Winooski, VT, USA) alla lunghezza d’onda di 570 nm e alla lunghezza d’onda di riferimento di 670 nm. La vitalità cellulare è stata espressa come percentuale (%) del rapporto DOs/DOc, dove DOs è il valore medio della densità ottica dei campioni oggetto della prova, e DOc è il valore medio delle cellule non trattate.
I risultati sono stati riassunti nella seguente tabella 2.
TABELLA 2
Campione Tampone Glieina Mannitolo Tempo Concentrazione Vitalità D.st.
di dialisi (% p/v) (% p/v) d’incubazione (mg/pozzetto) (%)
(ore)
2A1 TRIZMA 0,2 0 24 2,5 45,1 4,48
2A2 TRIZMA 0,2 0 24 1,25 57,9 3,71
2A3 TRIZMA 0,2 0 24 0,6 62,4 5,26
2B1 TRIZMA 0,2 0 48 2,5 42,3 1,93
2B2 TRIZMA 0,2 0 48 1,25 59,9 10,02
2B3 TRIZMA 0,2 0 48 0,6 72,9 3,31
2C1 NaCI 0,2 0 24 2,5 51,9 4,49
2C2 NaCI 0,2 0 24 1,25 52,1 10,75 Campione Tampone Glieina Mannitolo Tempo Concentrazione Vitalità D.st. di dialisi (% p/v) (% p/v) d’incubazione (mg/pozzetto) (%)
(ore)
2C3 NaCI 0,2 0 24 0,6 60,0 5,56 2D1 NaCI 0,2 0 48 2,5 52,7 5,54 2D2 NaCI 0,2 0 48 1,25 59,9 9,07 2D3 NaCI 0,2 0 48 0,6 63,7 6,94 2E1 NaCI 0,75 0 24 2,5 54,8 4,81 2E2 NaCI 0,75 0 24 1,25 57,2 16,09 2E3 NaCI 0,75 0 24 0,6 72,4 6,68 2F1 NaCI 0,75 0 48 2,5 50,0 4,79 2F2 NaCI 0,75 0 48 1,25 53,1 4,26 2F3 NaCI 0,75 0 48 0,6 63,9 4,11 2G1 NaCI 0 3 24 2,5 73,1 1,95 2G2 NaCI 0 3 24 1,25 83,2 5,34 2G3 NaCI 0 3 24 0,6 92,0 5,88 2H1 NaCI 0 3 48 2,5 66,1 7,36 2H2 NaCI 0 3 48 1,25 71,9 4,98 2H3 NaCI 0 3 48 0,6 87,0 6,75 211 NaCI 0,75 3 24 2,5 81,7 16,26 2I2 NaCI 0,75 3 24 1,25 88,1 9,62 2I3 NaCI 0,75 3 24 0,6 93,5 7,38 2J1 NaCI 0,75 3 48 2,5 78,3 14,49 2J2 NaCI 0,75 3 48 1,25 83,3 18,29 2J3 NaCI 0,75 3 48 0,6 97,8 16,17 2K1 TRIZMA 0,75 3 24 2,5 89,9 11,10 Campione Tampone Glìcina Mannitolo Tempo Concentrazione Vitalità D.st. di dialisi (% p/v) (% p/v) d’incubazione (mg/pozzetto) (%)
(ore)
2K2 TRIZMA 0,75 3 24 1,25 93,8 4,23 2K3 TRIZMA 0,75 3 24 0,6 102,3 3,48 2L1 TRIZMA 0,75 3 48 2,5 92,6 11,19 2L2 TRIZMA 0,75 3 48 1,25 96,2 3,84 2L3 TRIZMA 0,75 3 48 0,6 102,4 4,66 2M1 PBS 0,75 3 24 2,5 82,6 15,16 2M2 PBS 0,75 3 24 1,25 85,1 11,10 2M3 PBS 0,75 3 24 0,6 89,6 11,03 2N1 PBS 0,75 3 48 2,5 74,7 7,15 2N2 PBS 0,75 3 48 1,25 85,2 13,08 2N3 PBS 0,75 3 48 0,6 82,1 12,13 201 H20 0,75 3 24 2,5 93,4 14,02 202 H2O 0,75 3 24 1,25 93,9 3,57 203 H2O 0,75 3 24 0,6 97,9 5,73 2P1 H2O 0,75 3 48 2,5 91,1 13,12 2P2 H2O 0,75 3 48 1,25 104,6 15,06 2P3 H2O 0,75 3 48 0,6 98,4 16,42 2Q1 Na2HP040,75 3 48 2,5 81,1 2,81 2Q2 Na2HP040,75 3 48 1,25 101,7 10,07 2Q3 Na2HP040,75 3 48 0,6 95,9 4,31
I risultati della tabella 2 hanno mostrato che la vitalità cellulare è influenzata dal tipo di tampone utilizzato, con valori più elevati per il tampone TRIZMA e Na2HP04e più bassi per il tampone NaCI e PBS. Anche in questo caso, l’utilizzo di acqua ha mostrato sorprendentemente il miglior valore.
Inoltre, a parità di tampone, utilizzando NaCI, il mannitolo forniva risultati migliori della glìcina, e confrontabili con quelli della combinazione glicinamannitolo.
Esempio 3
Per la valutazione dell’integrità delle microvescicole e/o esosomi i campioni ottenuti sono stati sottoposti al saggio di fluorescenza con il colorante Rosso Nilo (Nile Red).
I campioni liofilizzati ottenuti con la procedura dell’esempio 1 (con e senza dialisi) utilizzando il tampone ed il crio-protettore della seguente tabella 3 sono stati trattati con il colorante Rosso Nilo (90 pi di campione alla concentrazione 9 mg/ml in PBS e 10 pi di una soluzione di Rosso Nilo) ed esaminati con il lettore di piastre Synergy HT (BioTek, Milano, Italy) a lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione fisse (eccitazione 530/25; emissione 645/40).
TABELLA 3
Campione Dialisi Tampone Glicìna Mannitolo Intensità di D.st.
di dialisi (% p/v) (% p/v) fluorescenza
3A No - 2 0 16833 338,2
3B No - 0,2 0 22656 1329,4
3C No - 0,75 0 14877 625,3
3D No - 0,75 3 53563 42276,9
3E No - 0 3 89480 1993,7
3F Si Na2HP042 0 26819 5957,1
3G Si Na2HP042 0 43647 2406,7
3H Si TRIZMA 0,2 0 56541 22478,4
3I Si NaCI 0,2 0 76508 19940,5
3J Si NaCI 0,75 0 91696 617,2 3K Si NaCI 0 3 94419 1140,6
3L Si NaCI 0,75 3 95297 383,0
3M Si TRIZMA 0,75 3 67404 4914,8
3N Si PBS 0,75 3 93373 11637,5
30 Si H2O 0,75 3 57366 39860,8
3P Si Na2HP040,75 3 80851 7206,6
I risultati della tabella 3 hanno mostrato una maggiore intensità di fluorescenza per i campioni sottoposti a dialisi, dimostrando una maggiore integrità di microvescicole e/o esosomi.
Inoltre, l’intensità di fluorescenza era influenzata in modo sostanziale, a parità di crio-protettore, dal tipo di tampone usato. I risultati migliori erano ottenuti con il tampone NaCI e PBS, mentre in questo caso l’uso di acqua forniva i risultati meno soddisfacenti.
Al contrario, a parità di tampone, utilizzando NaCI non si sono riscontrate differenze significative nell’uso di mannitolo o glieina o loro miscele.
Infine, i campioni ottenuti con la coltura nel mezzo privo di siero per 24 ore hanno prodotto una maggiore intensità di fluorescenza, e quindi una maggiore integrità di microvescicole e/o esosomi, rispetto ai campioni ottenuti con la coltura nel mezzo privo di siero per sole 4 ore.
Esempio 4
I campioni ottenuti secondo l’esempio 2 sono stati analizzati per determinarne le dimensioni con la tecnica della diffusione di luce (light scattering) utilizzando un analizzatore DelsaMax CORE (Beckman Coulter, Krefeld, Germania), con un microscopio elettronico a scansione (SEM), il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) JEOL JEM 1200EX (Jeol, Tokyo, Japan), e il microscopio confocale a scansione laser TCS SP5 II (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania).
La Figura 1 illustra il grafico della distribuzione delle dimensioni delle microvescicole ottenuto con la tecnica della diffusione di luce (light scattering). La dimensione media è risultata essere 115 nm con un indice di polidispersione (PDI) pari a 0,255.
La caratterizzazione morfologica eseguita con microscopio elettronico a scansione (SEM) e con microscopio elettronico a trasmissione (TEM) ha confermato che le microvescicole mantenevano la loro struttura sferica con una superficie liscia, come illustrato in Figura 2 (SEM) ed in Figura 3 (TEM). Le immagini ottenute con il microscopio confocale a scansione laser su campioni trattati con il colorante Rosso Nilo (Nile Red) hanno confermato l’integrità delle microvescicole e/o esosomi dimostrando una fluorescenza ben definita.
Esempio 5
Infine, i campioni ottenuti sono stati valutati per la loro capacità di inibire la proliferazione di cellule mononucleate del sangue umano periferico indotta da fitoemoagglutinina (PHA) e di inibire l'infiammazione in un modello di infiammazione indotta da 1L-1 β su condrociti umani.
Saggio di immunomodulazione
Cellule mononucleate del sangue umano periferico (PBMC - Peripheral Blood Mononuclear Cells) sono state isolate dal sangue venoso eparinizzato di volontari sani per centrifugazione in gradiente di densità (Ficoll-Paque Plus). Le PBMC sono state contate e collocate in piastra a 96 pozzetti (Corning Costar, Celbio) in quantità di 100.000 cellule per pozzetto, in terreno RPMI 1640 (Sigma Aldrich) addizionato del 10% di siero fetale bovino (FBS) (Euroclone) con o senza campione di microvescicole e/o esosomi ottenuti seguendo la procedura dell’esempio 1 utilizzando acqua come tampone di dialisi e glicina/mannitolo come crio-protettore (0-30 mg/ml) e/o fitoemoagglutinina (PHA, 10 pg/ml) in doppio.
Dopo 72 ore i campioni sono stati raccolti e ne è stata valutata la proliferazione, la vitalità cellulare e la produzione di IL-6.
La proliferazione è stata valutata con il saggio di proliferazione con bromodeossiuridina (ELISA BrdU - Roche Life Science) seguendo le istruzioni del produttore. I risultati sono illustrati nella Figura 4, nella quale si può osservare un significativo effetto inibitorio della proliferazione di PBMC da parte del campione contenente microvescicole e/o esosomi dializzati e liofilizzati.
La vitalità cellulare è stata valutata mediante aggiunta del colorante resazurina (Alamar Blue) e misurazione della fluorescenza, dopo 4 ore di incubazione a 37°C, con lo spettrofotometro (Victor X3, Perkin Elmer) con lunghezza d'onda di eccitazione pari a 540 nm e lunghezza d'onda di emissione pari a 590 nm.
I risultati hanno confermato che l'esposizione di PBMC a diverse dosi di microvescicole e/o esosomi liofilizzati non ha avuto effetti tossici sulle cellule, mantenendo il valore di vitalità oltre il 90% in tutti i campioni analizzati.
La produzione di IL-6 è stata valutata con il saggio ELISA (Mabtech, limite di rivelazione 2 pg/ml, variazione intra-saggio 5%) in campioni di PBMC attivati con fitoemoagglutinìna (PHA), in presenza e in assenza di microvescicole e/o esosomi liofilizzati.
L’attivazione con PHA ha provocato un aumento significativo della concentrazione di IL-6 rispetto al controllo, raggiungendo valori superiori a 3000 pg/ml. In seguito all’aggiunta nel terreno di coltura di microvescicole e/o esosomi liofilizzati questo valore è stato significativamente ridotto, riportando la concentrazione di IL-6 intorno a 1740 pg/ml (- 58%).
Saggio IL-1B su colture condrocitarie
Cellule condrocitarie umane di derivazione articolare (ACC) sono state isolate da frammenti cartilaginei di scarto derivanti da artroplastica totale dell'anca mediante digestione enzimatica con coliagenasi di tipo II. Le ACC sono state coltivate per alcuni passaggi in coltura prima del trattamento con la citochina pro-infiammatoria IL-1 β, in assenza o presenza di microvescicole e/o esosomi ottenuti seguendo la procedura dell'esempio 1 utilizzando acqua come tampone di dialisi e glicina/mannitolo come crio-protettore (0-30 mg / mL).
Cellule e surnatanti sono stati raccolti dopo 48 ore di trattamento. L’espressione genica è stata valutata mediante RT-PCR e la produzione di marcatori catabolici, prò e anti-infiammatori è stata analizzata mediante saggio ELISA.
I risultati hanno mostrato una spiccata capacità inibitoria dell'infiammazione, osservando una down-regolazione di MMP-1, VEGF e TNFct ed una up-regolazione di TMP-1 TGFp e IL-1Ra.
Esempio 6
II procedimento descritto nell’esempio 1 per isolare le cellule staminali mesenchimali dal tessuto adiposo è stato ripetuto.
Le CSM così ottenute sono state seminate in una piastra da 96 pozzetti in monostrato con una densità di 10.000 cellule/cm<2>, ed incubate nel mezzo di coltura DMEM/F12 (rapporto 1:1) addizionato del 10% di siero fetale bovino (FBS) per 24 ore a 37°C in atmosfera con C02al 5%.
Quindi ad ogni pozzetto sono stati aggiunti 200 pg/ml di nanoparticelle caricate con curcumina secondo la seguente tabella 4 preparate con il metodo di desolvatazione in acetone (Seib FP et al, “pFI-Dependent anticancer drug release from silk nanoparticles” Adv Flealthc Mater. 2013 December ; 2/12), continuando l’incubazione per ulteriori 30, 60 o 120 minuti.
TABELLA 4
Nanoparticelle Concentrazione Curcumina D.st.
di curcumina in caricata (%)
acetone (mg/ml)
NpO 0 0 -
Np1 0,03 0,95 0,127
Np2 0,1 1,50 0,111
Np3 0,5 13,66 1,518
Np4 1,5 31,97 1,522
Ai tempi prestabiliti, le CSM sono state lavate con PBS e la captazione cellulare delle nanoparticelle è stata valutata in termini di intensità di fluorescenza, sfruttando la proprietà fluorescente della curcumina, misurata con un lettore di micropiastre (Sinergy HT, BioTek, United Kingdom) equipaggiato con un filtro di eccitazione a 485 nm ed un filtro di emissione a 528 nm. I risultati sono illustrati nella Figura 5.
I risultati ottenuti a parità di tempi di incubazione hanno dimostrato la diretta proporzionalità tra intensità di fluorescenza e quantità di curcumina presente nelle nanoparticelle, con valori crescenti passando da Np1 a Np4 mentre la fluorescenza era minima nelle CSM non trattate o trattate con NpO.
I risultati ottenuti a parità di nanoparticelle hanno dimostrato che il massimo di captazione sì otteneva dopo 60 minuti. Infatti, a 30 minuti l'intensità di fluorescenza era inferiore a quella ottenibile a 60 minuti, mentre a 120 minuti non si otteneva un ulteriore incremento significativo dell’intensità di fluorescenza.
Le CSM caricate con le nanoparticelle Np3 ed incubate per 60 minuti sono state coltivate con terreno minimo per una notte, e quindi il surnatante è stato separato per valutare la presenza di microvescicole e/o esosomi caricati con nanoparticelle, anche in questo caso sfruttando la proprietà fluorescente della curcumina.
I risultati hanno confermato la presenza di nanoparticelle Np3 nelle microvescicole e/o esosomi rilasciati nel surnatante dalle CSM.
Claims (30)
- RIVENDICAZIONI 1. Un processo di produzione di microvescicole e/o esosomi caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti fasi: (i) prelevare un fluido biologico comprendente microvescicole e/o esosomi, (ii) dializzare o ultrafiltrare detto fluido biologico utilizzando una membrana avente un valore di soglia (cut-off) uguale o inferiore a 500.000 Dalton ed un fluido di dialisi od ultrafiltrazione, (iii) aggiungere un crio-protettore alla soluzione dializzata o ultrafiltrata ottenuta dalla fase (ii), e (iv) liofilizzare la soluzione risultante dalla fase (iii).
- 2. Il processo di produzione di microvescicole e/o esosomi secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto fluido biologico è un surnatante di cellule in coltura.
- 3. Il processo di produzione di microvescicole e/o esosomi secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che detto surnatante è prelevato da cellule coltivate in un mezzo di coltura per almeno 4 ore.
- 4. Il processo di produzione di microvescicole e/o esosomi secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che detto mezzo di coltura è un terreno di coltura minimo.
- 5. Il processo di produzione di microvescicole e/o esosomi secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni da 2 a 4, caratterizzato dal fatto che dette cellule sono cellule staminali.
- 6. Il processo di produzione di microvescicole e/o esosomi secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che dette cellule staminali sono cellule staminali mesenchimali.
- 7. Il processo di produzione di microvescicole e/o esosomi secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che dette cellule staminali mesenchimali sono isolate da tessuto adiposo mediante lavaggio con soluzione tampone e digestione con enzimi.
- 8. Il processo dì produzione di microvescicole e/o esosomi secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni da 2 a 7, caratterizzato dal fatto che dette cellule sono coltivate in un mezzo di coltura contenente nanoparticelle caricate con una sostanza biologicamente attiva.
- 9. Il processo di produzione di microvescicole e/o esosomi secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto fluido biologico è un fluido corporeo.
- 10. Il processo di produzione di microvescicole e/o esosomi secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detta membrana ha un valore di soglia (cut-off) uguale o inferiore a 300.000 Dalton, preferibilmente uguale o inferiore a 100.000 Dalton, e più preferibilmente uguale o inferiore a 10.000 Dalton.
- 11. Il processo di produzione di microvescicole e/o esosomi secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto fluido di dialisi o ultrafiltrazione è acqua o una soluzione tampone con una concentrazione di sali inferiore alla concentrazione di sali del fluido biologico.
- 12. Il processo di produzione di microvescicole e/o esosomi secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto fluido di dialisi comprende un poliossialchilene avente peso molecolare medio uguale o maggiore di 100 g/mol.
- 13. Il processo di produzione di microvescicole e/o esosomi secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che detto poliossialchilene è un polietilenglicole (PEG) con un peso molecolare medio uguale o maggiore di 100 g/mol, preferibilmente uguale o maggiore di 300 g/mol, più preferibilmente uguale o maggiore di 500 g/mol.
- 14. Il processo di produzione di microvescicole e/o esosomi secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che detto poliossialchilene è un polietilenglicole (PEG) con un peso molecolare medio uguale o minore di 4000 g/mol, preferibilmente uguale o minore di 3000 g/mol, più preferibilmente uguale o minore di 2500 g/mol.
- 15. Il processo di produzione di microvescicole e/o esosomi secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che detto crio-protettore è scelto nel gruppo che consiste di zuccheri, amminoacidi, o loro miscele.
- 16. il processo di produzione di microvescicoie e/o esosomi secondo la rivendicazione 15, caratterizzato dal fatto che detto crio-protettore è scelto nel gruppo che consiste di mannitolo, lattosio, saccarosio, trealosio, sorbitolo, glucosio, maltosio, fruttosio, raffinosio, arginina, alanina, glieina, istidina e loro miscele.
- 17. Il processo di produzione di microvescicole e/o esosomi secondo la rivendicazione 16, caratterizzato dal fatto che detto crio-protettore è scelto nel gruppo che consiste di mannitolo, glieina o loro miscele.
- 18. Il processo di produzione di microvescicole e/o esosomi secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la fase di liofilizzazione (iv) comprende le seguenti fasi: a) congelare la soluzione dializzata o ultrafiltrata ottenuta dalla fase (iii) operando ad una temperatura inferiore a -50°C, preferibilmente inferiore a -70°C, b) sublimare sotto vuoto la soluzione congelata in un liofilizzatore.
- 19. Prodotto sotto forma di polvere liofilizzata comprendente microvescicole e/o esosomi aventi diametro compreso tra 20 e 5.000 nm e diametro medio compreso tra 50 e 200 nm.
- 20. Prodotto secondo la rivendicazione 19, caratterizzato dal fatto che dette microvescicole e/o esosomi comprendono nanoparticelle caricate con una sostanza biologicamente attiva.
- 21. Prodotto secondo la rivendicazione 20, caratterizzato dal fatto che detta sostanza biologicamente attiva è scelta nel gruppo che consiste di farmaci cardiovascolari, farmaci del sistema nervoso centrale e periferico, farmaci antidolorifici, farmaci antimicrobici, chemioterapici, vaccini, ormoni, vitamine, estratti vegetali, e fitocomplessi.
- 22. Composizione farmaceutica comprendente una sostanza biologicamente attiva ed almeno un eccipiente farmaceuticamente accettabile, caratterizzata dal fatto che detta sostanza biologicamente attiva è caricata in nanoparticelle comprese in microvescicole e/o esosomi liofilizzati aventi diametro compreso tra 20 e 5.000 nm e diametro medio compreso tra 50 e 200 nm.
- 23. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 22 caratterizzata dal fatto che detta sostanza biologicamente attiva è scelta nel gruppo che consiste di farmaci cardiovascolari, farmaci del sistema nervoso centrale e periferico, farmaci antidolorifici, farmaci antimicrobici, chemioterapici, vaccini, ormoni, vitamine, estratti vegetali, e fitocom plessi.
- 24. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 23 caratterizzata dal fatto che detti farmaci cardiovascolari sono scelti nel gruppo che consiste di antiipertensivi, antiarìtmici e diuretici.
- 25. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 23 caratterizzata dal fatto che detti farmaci del sistema nervoso centrale e periferico sono scelti nel gruppo che consiste di anestetici, ipnotici, sedativi, ansiolitici e anti-Parkinson.
- 26. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 23 caratterizzata dal fatto che detti farmaci antidolorifici sono scelti nel gruppo che consiste di antiinfiammatori e analgesici.
- 27. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 23 caratterizzata dal fatto che detti farmaci antimicrobici sono scelti nel gruppo che consiste di sulfamidici, antibiotici, antivirali e antifungini.
- 28. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle precedenti rivendicazioni da 22 a 27 per uso nel trattamento di artrosi, malattie cardiovascolari, malattie neurologiche, dolore, insufficienza midollare, diabete e cancro.
- 29. Composizione cosmetica o cosmeceutica comprendente una sostanza biologicamente attiva ed almeno un eccipiente cosmeticamente accettabile, caratterizzata dal fatto che detta sostanza biologicamente attiva è caricata in nanoparticelle comprese in microvescicole e/o esosomi liofilizzati aventi diametro compreso tra 20 e 5.000 nm e diametro medio compreso tra 50 e 200 nm.
- 30. Composizione cosmetica o cosmeceutica secondo la rivendicazione 29 per uso nel trattamento anti-invecchiamento della pelle.
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