KR102215237B1 - 세포 배양액으로부터 고수율의 엑소좀을 분리하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 배양액으로부터 고수율의 엑소좀을 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명으로부터 제공되는 세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법은 세포간 의사소통에 중요한 물질인 엑소좀을 고수율로 분리하고, 고순도로 정제할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 배양액에서 나타나는 세포 재생효과 및 항염 효과를 보다 우수하게 나타낼 수 있어 다양한 용도로 사용될 수 있다.

Description

세포 배양액으로부터 고수율의 엑소좀을 분리하는 방법{Method of isolating high yield exosomes from cell culture supernatants}

본 발명은 세포 배양액으로부터 고수율의 엑소좀을 분리하는 방법에 관한 것이다.

모든 세포들은 다른 세포들 또는 외부 환경과 정보 교환을 한다. 이러한 정보 교환을 위해 세포들은 다양한 물질들을 외부 환경으로 분비하는데, 사이토카인(Cytokines), 케모카인(Chemokines), 호르몬, 신경전달물질 등의 가용 인자(Soluble factor)가 대표적이다. 최근에는, 이러한 가용 인자 외에도 세포밖 소포체(extracellular vesicles, EVs)를 통한 정보 교환이 점차 주목받고 있다. 세포밖 소포체는 모든 세포가 외부 환경으로 분비하는 지질 이중 층으로 둘러쌓인 나노 크기의 소포체이다. 세포밖 소포체의 분비는 세균(그람 음성 세균, 그람 양성 세균), 고세균(Archaea), 진핵생물(Eukarya)에 이르기까지 모든 생물계에서 진화적으로 보존된 현상이다.

엑소좀이란 미생물에서부터 인간에 이르는 모든 세포에서 세포 밖으로 분비되는 세포간 의사소통 물질로서 세포밖 소포체(extracellular vesicles)에서 50~200nm 나노 크기의 물질이다. 이러한 나노 크기의 엑소좀은 물에 녹지 않는 막 단백질을 수송할 수 있다. 막 단백질이란 인지질 이중막에 있는 단백질로 소수성이기 때문에 기본적으로는 혈액에 의한 세포간 전달이 어렵다. 이에 반해 엑소좀은 인지질 이중막으로 이루어져 있어 막 단백질을 수송할 수 있다.

또한, 엑소좀은 내용물을 인지질 이중막으로 둘러싸는 것을 통하여 외부의 분해 물질로부터 그 내용물을 보호할 수 있다는 것이다. 대표적인 예로 RNA 수송 기전을 들 수 있다. 세포 밖에 존재하는 RNA는 분해되는 반면에 엑소좀 안에 존재하는 RNA는 이들 물질로부터 보호되어 표적 세포로 원활하게 전달될 수 있다. 또한, 엑소좀은 국소적으로 높은 농도를 유지할 수 있다. 세포는 단순히 적은 단백질을 신호로 인지하지 않고, 일정 수준 이상의 양을 가진 단백질이 한번에 전달되어야 신호로 인지한다. 해당 신호 전달을 용이하게 하기 위하여 세포는 엑소좀을 이용하여 해당 단백질을 한정된 공간에 모아 한번에 수송함으로써, 표적 세포에 신호전달을 효율적으로 할 수 있게 된다. 호르몬류와 같이 혈류 전체를 다 순환해야만 특정 세포에 전달되는 방식이 아니라, 엑소좀 내용물은 포장되어 특정 목표에만 제한적으로 수송이 될 수 있기 때문에 적은 양의 내용물 만으로도 효율적인 전달이 가능하다. 또한, 엑소좀은 관련된 물질을 한번에 수송함으로써 복합적으로 신호를 전달할 수 있다. 세포 성장을 위해서 한 종류의 단백질을 전달하는 것보다는 서로 시너지 효과를 낼 수 있는 단백질 집단이나 다른 물질(핵산, 지질)을 한꺼번에 수송함으로써 신호를 효율적으로 전달할 수 있다.

이러한 특장점에도 불구하고 엑소좀에 대한 연구와 응용된 제품들이 아직까지는 미비한 상태이다. 그 이유 중 한가지로 엑소좀을 수득할 수 있는 방법이 아직까지 제한적이고 그 방법도 전체 엑소좀 중에 극히 소량만으로 추출할 수 있는 효율성이 떨어지는 것으로 연구와 제품 상용화에 있어 그 방법을 개선하는 것이 필수적인 상황이다.

엑소좀을 분리하기 위한 방법과 관련된 기술로는, 국내의 경우 대한민국 등록특허공보 제10-1980482호「엑소좀을 분리하기 위한 다중 컬럼 및 엑소좀 분리 방법」, 대한민국 등록특허공보 제10-2059535호「생체시료로부터 엑소좀과 지질단백질의 분리 방법」, 대한민국 등록특허공보 제10-2002527호「폴리페놀을 이용한 엑소좀의 분리」, 대한민국 등록특허공보 제10-1762833호「지방 조직으로부터 지방유래 줄기세포와 엑소좀을 분리하는 방법」 등이 개시되어 있다.

이에, 본 발명에서는 세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 새로운 방법을 적용할 경우 엑소좀을 고수율로 분리하고, 고순도로 정제할 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허공보 제10-1980482호 대한민국 등록특허공보 제10-2059535호 대한민국 등록특허공보 제10-2002527호 대한민국 등록특허공보 제10-1762833호

본 발명의 목적은 세포 배양액으로부터 고수율의 엑소좀을 분리하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법으로부터 수득된 엑소좀을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 엑소좀을 포함하는 의약품 또는 화장품을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 배양액을 농축하는 단계; 농축된 세포 배양액을 염석 방법으로 분리하여 엑소좀 분획물을 수득하는 단계; 염석분리된 엑소좀 분획물을 초고속 원심분리 방법으로 분리하여 엑소좀을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양액으로부터 고수율의 엑소좀을 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 세포 배양액은 인체 유래 줄기세포, 미생물 유래 세포, 식물 캘러스 유래 세포 및 식물 조직 유래 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 배양한 배양액인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 농축은 세포 배양액을 동결건조한 다음, 3차 증류수 또는 정제수를 이용하여 희석하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 농축은 세포 배양액의 단백질 농도가 200~300ug/ml이 되도록 수행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 염석은 무기염을 사용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 무기염은 초산나트륨, 황산암모늄, 시트르산나트륨 및 트라이클로로 아세트산으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 엑소좀을 분리하는 방법으로부터 수득된 엑소좀을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 엑소좀을 포함하는 의약품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 엑소좀을 포함하는 화장품을 제공한다.

본 발명으로부터 제공되는 세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법은 세포간 의사소통에 중요한 물질인 엑소좀을 고수율로 분리하고, 고순도로 정제할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 배양액에서 나타나는 세포 재생효과 및 항염 효과를 보다 우수하게 나타낼 수 있어 다양한 용도로 사용될 수 있다.

도 1은 1차 엑소좀 분획의 단백질 정량을 Bradford 방법을 이용하여 흡광도를 측정한 그래프이다.
도 2는 1차 엑소좀 분획의 단백질 발현량을 확인하여 위하여 줄기세포 엑소좀 특이적 마커인 Alix와 TSG101 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅을 실시한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 3은 1차 엑소좀(대조군)의 입자수와 크기를 측정하기 위하여 입도추적분석기(NTA)를 통한 입자 크기 분포도와 입자수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 1차 엑소좀(실험군)의 입자수와 크기를 측정하기 위하여 입도추적분석기(NTA)를 통한 입자 크기 분포도와 입자수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 2차 엑소좀 분획의 단백질 정량을 Bradford 방법을 이용하여 흡광도를 측정한 그래프이다.
도 6은 2차 엑소좀 분획의 단백질 발현량을 확인하여 위하여 줄기세포 엑소좀 특이적 마커인 Alix와 TSG101 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅을 실시한 결과를 나타낸 이미지이다
도 7은 2차 엑소좀(대조군)의 입자수와 크기를 측정하기 위하여 입도추적분석기(NTA)를 통한 입자 크기 분포도와 입자수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 2차 엑소좀(실험군)의 입자수와 크기를 측정하기 위하여 입도추적분석기(NTA)를 통한 입자 크기 분포도와 입자수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에 기재된 다양한 실시예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세 사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하거나 모호하게 하지 않기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 실시예에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 실시예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 실시예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현한 실시예의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 실시예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 실시예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

본 발명의 발명자들은 세포 배양액을 특정한 조건 하에서 엑소좀을 분리하는 경우, 엑소좀을 고수율로 분리하고, 고순도로 정제할 수 있는 것을 발견하여 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 세포 배양액을 농축하는 단계; 농축된 세포 배양액을 염석 방법으로 분리하여 엑소좀 분획물을 수득하는 단계; 염석분리된 엑소좀 분획물을 초고속 원심분리 방법으로 분리하여 엑소좀을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양액으로부터 고수율의 엑소좀을 분리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 세포 배양액은 인체 유래 줄기세포, 미생물 유래 세포, 식물 캘러스 유래 세포 및 식물 조직 유래 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포를 배양한 배양액인 것일 수 있다.

또한, 세포 배양액 뿐만 아니라 세포나 조직으로부터 추출한 추출물의 부유액도 이에 해당된다.

인체 유래 줄기세포는 중간엽 유래 성체 줄기세포로서 다분화능을 가졌으며 미분화 상태로 자가 복제하는 특징을 가진 세포이다. 인체 유래 줄기세포는 지방조직, 골수, 탯줄 및 태반 조직에서 분리하여 수득할 수 있으며, 일반적으로 부착세포로서 체외 배양이 가능하여 용이하게 줄기세포 배양액을 수득할 수 있다.

미생물 유래 세포는 일반적으로 원핵세포, 진핵세포, 진균, 원생동물, 세균, 조류 등을 포함하고 있으며, 인간에게 유용한 미생물로는 유산균이 대표적이다. 유산균은 특정 배지에 의해 손쉽게 배양이 가능하며, 배양 조건에 따라 혐기성, 호기성 균으로 나뉘어 진다. 유산균을 특정 배지에 배양하여 대량 배양이 가능하며 이로써 배양액을 수득할 수 있다.

식물 세포는 식물 조직에 따라 배양되는 세포 기원이 여러가지로 분류될 수 있으나 일반적으로는 분화되지 않은 부정형 세포의 캘러스를 의미한다. 캘러스는 식물체에 상처가 났을 때 상처 주변에 생기는 분열조직이 형성한 세포 부위로 처음 분열 조직의 세포를 영양 배지에 넣고 배양하면 캘러스가 형성되며, 이러한 캘러스 배양을 통하여 배양액을 수득할 수 있다.

상기와 같이 세포 배양액이 준비되면, 세포 배양액을 농축할 수 있다.

상기 농축은 세포 배양액을 동결건조한 다음, 3차 증류수 또는 정제수를 이용하여 희석하는 것을 특징으로 한다.

이때, 세포 배양액을 동결건조한 다음, 수분함량을 4% 이하로 낮추는 것이 건조된 분말이 재용해되지 않는 측면에서 바람직하다.

상기와 같이 세포 배양액을 동결건조한 다음, 3차 증류수 또는 정제수를 이용하여 희석하는데, 염이 포함되지 않도록 순수한 물을 사용하는 것이 바람직하다. 이는 염석 과정 중에 특정 무기염의 농도에 방해되지 않는 불순물이 없는 희석액을 사용해야 하기 때문이다.

상기와 같이 세포 배양액을 농축하는 단계는, 최종 세포 배양액의 단백질 농도가 200~300ug/ml이 되도록 농축하는 것이 바람직하다. 통상적으로 배양액의 단백질 농도는 5~30ug/ml로 유지되어 그 이상의 단백질을 생합성하지 않으며, 원하는 단백질 농도에 도달하기 위해서는 동결건조를 통한 농축 과정을 통해 이루어지도록 한다.

상기 동결건조하여 농축하는 과정을 통하여 엑소좀 분획물 내 단백질 농도를 고농도로 농축할 수 있으며, 고농도의 범위는 최소 200ug/ml 이상으로 일정 단백질 농도 이상에서 200~500%의 높은 수득율을 나타낼 수 있으므로 고수율의 엑소좀 분획물을 수득할 수 있게 된다.

상기 농축된 세포 배양액은 염석 방법으로 분리하여 엑소좀 분획물을 수득할 수 있다. 이때, 상기 염석은 무기염을 사용하는 것이 엑소좀과의 전위차로 인해 수소결합이 용이하게 이루어지는 측면에서 바람직하다.

상기 무기염은 초산나트륨(Sodium acetate)사용하는 것이 바람직하다. 이때, 상기 초산나트륨은 1M 초산나트륨(Sodium acetate) 10%를 첨가하여 사용하는 것이 엑소좀 수득 수율을 높이는 측면에서 더욱 바람직하다.

상기 무기염은 초산나트륨에 국한되지 않고 수용액의 단백질들을 특히 엑소좀의 겉표면의 물분자와 수소결합을 할 수 있는 무기염이 1M 포함된 수용액도 사용할 수 있다. 예컨대 황산암모늄, 시트르산나트륨 및 트라이클로로 아세트산 등을 사용할 수 있으며, 그 외 무기염이 포함된 염수용액이 이에 해당된다.

상기와 같이 농축된 세포 배양액을 염석 방법으로 분리하여 엑소좀 분획물을 수득하는 단계의 일예로, 먼저 농축된 세포 배양액에 10% 1M 초산나트륨을 첨가하여 잘 섞어준 다음, 4℃에서 1시간 동안 정치시켜 염석 반응을 일으킨 뒤, 37℃에서 5분 동안 정치시켜 반응을 멈추게 한 후, 5000g에서 5~10분간 원심분리하여 염석 침전물을 수득할 수 있다.

이후 남은 초산나트륨을 세척하기 위하여 0.1M 초산나트륨으로 염석 침전물을 농축된 세포 배양액의 동일한 양으로 첨가하여 파이펫을 이용해 완전히 풀어준다. 이때, 염석 침전물이 육안으로 보이지 않더라도 염석 침전물이 모이는 바닥부분을 충분히 세척하여 침전물들에 잔존하는 1M 초산나트륨을 희석할 수 있도록 한다. 이후 5000g에서 5~10분간 원심분리하여 세척된 염석 침전물을 재차 수득하게 되고 3차 증류수나 정제수 또는 완충 용액 등을 이용하여 희석한 뒤 엑소좀의 입자수와 단백질 농도를 측정한다.

이를 측정해 보면 세포 배양액의 단백질 농도가 200ug/ml 이하일 때와 비교하여 현저히 높은 수준으로 엑소좀이 추출된 것을 확인할 수 있다.

이는 일정농도 이상의 엑소좀을 포함한 단백질 농도에 도달해야만 무기염과 수소결합 반응 시 침전 가능한 무게를 형성하여 펠렛층을 형성할 수 있게 되므로 200ug/ml 이상 농도일 경우 보다 높은 수율로 엑소좀 분획을 수득할 수 있게 된다.

상기와 같이 염석 방법으로 추출된 엑소좀 분획물은 엑소좀과 적절한 결합 반응을 통하여 엑소좀을 높은 효율로 수득하지만, 다른 단백질도 염농도와 적절한 결합 반응을 하여 동시에 엑소좀과 함께 추출될 수 있다.

따라서, 세포 배양액을 염석 방법으로 분리하여 추출된 엑소좀 분획물은 엑소좀 뿐만 아니라 다른 단백질과 혼합되어 있어 순도를 높일 수 있는 다음 추출 방법이 필요하고 이러한 방법으로 초고속 원심분리기를 이용한 추출 방법을 적용할 수 있다.

상기 염석분리된 엑소좀 분획물의 순도를 높이기 위하여 초고속 원심분리 방법으로 엑소좀을 추출하는 단계의 일예로, 먼저 염석분리된 엑소좀 분획물은 3차 증류수, 정제수 또는 인산화 완충 용액으로 희석하고 희석된 엑소좀 분획 수용액을 초고속 원심 분리기에 튜브당 5~30ml씩 옮겨담은 뒤 분획 수용액을 300g, 4℃, 10분 후 상층액을 모은다. 그 다음 모은 상층액을 2000g, 4℃, 10분 후 상층액을 모으고, 모은 상층액을 10,000g, 4℃, 30분 후 상층액을 모아서 침전 시 불필요하게 추출된 세포 파편들을 제거하여 준다. 엑소좀 추출 과정으로 모은 상층액을 100,000~120,000g, 4℃, 2시간 후 상층액을 버리고 펠렛층을 수득한다. 그 다음 펠렛층을 인산화 완충용액이나 3차 증류수 등으로 세척하고, 세척된 부유액을 100,000~120,000g, 4℃, 2시간 후 다시 펠렛층을 모아 최종적으로 고순도의 엑소좀을 수득할 수 있게 된다.

상기 초고속 원심분리 방법으로 추출된 엑소좀은 염석 과정 중의 세포 파편이나 불순물을 제거하게 되고, 일정 고회전의 원심력을 통하여 엑소좀 만을 특수하게 획득할 수 있으므로 고순도의 엑소좀을 추출, 정제할 수 있게 된다.

상기 방법으로 수득된 엑소좀은 세포 배양액을 농축, 염석 방법의 공정을 통하여 고수율의 엑소좀을 획득하게 되고, 초고속 원심분리 방법을 통한 고순도의 엑소좀을 획득하는 두 가지 잇점을 나타내는 공정으로 수행할 수 있다. 또한, 세포 배양액에서 나타내는 유효성을 충분히 나타낼 수 있으며, 다른 세포 독소 물질들이 제거되어 보다 높은 유효성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 방법으로 분리된 엑소좀을 포함하는 의약품 또는 화장품에 관한 것이다.

상기 방법으로 분리된 엑소좀은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본 발명에서 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔,시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 세포 배양액의 준비

인체 유래 지방 줄기세포는 리영클리닉의 지방흡입 시술환자의 동의를 받고 지방 조직을 공여받아 줄기세포를 분리하였다. 분리된 지방줄기세포를 계대 5 passage 이하로 세포를 분열시켜 충분한 세포를 확보한 후, 동물 유래 혈청이나 엑소좀이 포함되지 않도록 무혈청 배양 배지를 통하여 72시간 배양한 뒤 줄기세포 배양액 1000ml을 수득하고 0.22um 필터로 여과하여 냉장 보관하였다.

<실시예 2> 줄기세포 배양액의 농축액 제조

상기 실시예 1에서 수득된 줄기세포 배양액을 일정 농도 이상으로 농축하기 위하여 동결건조를 실시하였다. 동결건조는 수거된 줄기세포 배양액 500ml씩 두 개로 나누어 분주하고 -70℃ 초저온 냉동고에서 24시간 동결한 다음, 동결건조기에 이동하여 실시하였다. 동결건조 후 수분함량을 4% 이하로 낮춘 뒤 건조된 배양액에 3차 증류수를 한 개는 실험군으로 50ml 첨가하고, 다른 한 개는 대조군으로 다시 500ml 첨가한 후 희석하였으며, 실험군은 10배 농축된 배양액, 대조군은 원액 농도 그대로 회복시켰다.

<실시예 3> 초산 나트륨을 이용한 염석 분리

상기 실시예 1에서 수득된 줄기세포 배양액의 농축액에 1M 초산나트륨 10%인 5.5ml을 첨가하고 대조군은 10%인 55.5ml을 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 뒤 37℃에서 5분간 정치시켜 반응을 정지시키고, 5000g에서 10분간 원심분리를 실시하였다. 원심분리 후, 남은 초산나트륨을 세척하기 위하여 상등액은 제거하고 침전된 펠렛층에 0.1M 초산나트륨을 첨가하여 펠렛층을 세척해주고, 다시 5000g에서 10분간 원심분리를 실시하여 염석된 펠렛층을 인산화 완충용액 50ml을 첨가하여 염석분리를 실시하여 1차 엑소좀을 제조하였다.

<실시예 4> 1차 분리된 엑소좀의 평가

상기 실시예 3에서 분리된 1차 엑소좀의 정량적, 물리적, 분자생물학적 평가를 위하여 단백질 정량, 엑소좀 마커 확인 및 입도추적 분석기(NTA: Nano Tracking Analyzer)를 이용한 분석을 실시하였다.

단백질 정량 분석은 1차 엑소좀 분획물의 단백질 정량을 Bradford 방법을 이용하여 흡광도를 측정하였다. 측정하고자 하는 1차 엑소좀에 Bradford 시약을 1/5 비율로 첨가하여 특정 아미노산과의 발색을 유도하고 96well 플레이트에 옮긴 후 단백질 특정 파장인 595nm에서 흡광도를 측정하여 소혈청 알부민으로 표준폼을 만든 계산식에 대입해 흡광도에 대비한 단백질 정량값을 계산하였다.

엑소좀 마커 확인은 1차 엑소좀 분획이 엑소좀을 함유하고 있는지 확인하기 위하여, 줄기세포 엑소좀 특이적 마커인 Alix와 TSG101 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅을 실시하여 단백질 발현량을 확인하였다. 해당 엑소좀 용액을 10 % SDS-폴리아크릴아미드 겔에 전기영동 시킨 후 니트로셀룰로오스 세포막(nitrocellulose membrane)으로 겔의 단백질을 전이시켰다. 멤브레인이 더 이상 다른 미지의 단백질에 의해 오염이 되지 않도록 5% 탈지분유(5% skim milk)을 이용하여 1시간 동안 상온에서 차단하고, 엑소좀 확인 마커인 Alix와 TSG101 1차 항체를 blocking solution에 1:500의 비율로 희석하여 24시간 동안 4℃ incubator에서 반응시켰다. 1차 항체 반응 후 10분씩 3회에 걸쳐 TBST(Tris-buffer Saline Tween 20)로 흔들어주며 세척하고, 2차 항체를 5% 탈지분유에 1:1000이 되도록 희석하여 1시간 30분 동안 상온에서 반응시키고, 1차 항체 때와 마찬가지로 10분씩 3회에 걸쳐 TBST (tris-buffer saline Tween 20)로 흔들어주며 세척한 다음 화학발광법으로 현상하여 확인하였다.

입도추적 분석은 1차 엑소좀의 입자수와 크기를 측정하기 위하여 입도추적분석기(NTA)를 통한 입자 크기 분포도와 입자수를 측정하였다. 입도 추적은 파티클 메트릭스사의 Zetaview Zeta potential 모델을 사용하였으며, 엑소좀 용액 1ml을 1/100로 인산화 완충 용액에 희석하고, 레이저 파장은 488nm로, 전기 전도도는 20.66 uS/cm로 설정하여 측정하였다.

그 결과, 단백질 정량 분석은 도 1에서 확인할 수 있듯이 대조군 대비 실험군의 단백질 농도가 5배 이상 높아진 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 보았을 때, 줄기세포 배양액을 농축시킨 후 염석 분리하여 엑소좀을 제조하는 것이 단백질의 농도가 현저하게 높아지는 것을 확인하였다.

엑소좀 마커 확인은 도 2에서 확인할 수 있듯이 특이적 마커와의 항원-항체 반응을 통하여 대조군 대비 실험군이 단백질 발현량의 세기를 보았을 때 농도가 더욱 높은 것을 확인할 수 있었다.

NTA 분석 결과는 도 3~4에서 확인할 수 있듯이 대조군 대비 실험군이 엑소좀의 사이즈와 일치한 것과 입자의 수가 현저히 많아진 것을 평가할 수 있었으나, 입자 크기의 분포도가 50~300nm로 광범위하여 순도에서 다른 단백질들과 불순물이 많이 혼합되어 있음을 확인하였다.

<실시예 5> 초고속 원심분리를 이용한 엑소좀의 분리

상기 실시예 3에서 분리된 1차 엑소좀의 순도를 높이기 위하여 초고속 원심 분리를 실시하였다. 1차 엑소좀 분획은 인산화 완충 용액으로 희석하고 희석된 엑소좀 분획 수용액을 초고속 원심 분리기에 튜브당 25ml 씩 옮겨 담은 후, 분획 수용액을 300g, 4℃, 10분 후 상층액을 모은 다음 모은 상층액을 2000g, 4℃, 10분 후 상층액을 모으고, 모은 상층액을 10,000g, 4℃, 30분 후 상층액을 모아서 침전 시 불필요하게 추출된 세포 파편들을 제거하여 주었고, 엑소좀 추출 과정으로 모은 상층액을 100,000~120,000g, 4℃, 2시간 후 상층액을 버리고 펠렛층을 수득하였다. 그 다음 펠렛층을 인산화 완충용액으로 세척하고, 세척된 부유액을 100,000~120,000 g, 4℃, 2시간 후 다시 펠렛층을 모아 최종적으로 고순도의 엑소좀(2차 엑소좀)을 수득하였다. 수득한 펠렛층은 5ml 인산화 완충 용액을 첨가하여 최초 세포 배양액 500ml의 100배 농축된 엑소좀을 확보하였다.

<실시예 6> 2차 분리된 엑소좀의 평가

상기 실시예 5에서 분리된 2차 엑소좀의 정량적, 물리적, 분자생물학적 평가를 위하여 실시예 4와 같은 방법으로 단백질 정량, 엑소좀 마커 확인 및 입도추적 분석기(NTA: Nano Tracking Analyzer)를 이용한 분석을 실시하였다. 이때, 대조군은 실시예 3에서 농축 후 염석하여 분리된 1차 엑소좀이다.

그 결과, 도 5와 같이 단백질 농도는 실험군(2차 엑소좀)이 대조군(1차 엑소좀)의 63% 수준으로 순도가 상승하였고, 엑소좀 마커에 대하여 도 6과 같이 양성 반응을 확인할 수 있었으며, NTA 분석 결과는 도 7~8에서 확인할 수 있듯이 입자수는 다소 줄어들었으나 엑소좀 사이즈인 50~200nm 사이의 크기로 균질하게 분리된 것을 확인하였다.

따라서, 세포 배양액을 농축, 염석 및 원심분리의 과정으로 분리된 엑소좀은 고수율 및 고순도로 분리되었음을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

1. 인체 유래 지방 줄기세포 배양액을 동결건조한 다음, 수분 함량을 4% 이하로 낮춘 후 3차 증류수로 희석하여 단백질 농도가 200~300ug/ml이 되도록 농축하는 단계;
   농축된 인체 유래 지방 줄기세포 배양액에 1M 초산나트륨(Sodium acetate) 10%를 첨가하여 염석 방법으로 분리한 후 엑소좀 분획물을 수득하는 단계;
   염석분리된 엑소좀 분획물을 초고속 원심분리 방법으로 분리하여 엑소좀을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양액으로부터 고수율의 엑소좀을 분리하는 방법.
   
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