KR102424333B1 - 펩타이드를 이용하는 줄기세포 유래 고순도 세포외 소포체의 대량 생산 방법 - Google Patents
펩타이드를 이용하는 줄기세포 유래 고순도 세포외 소포체의 대량 생산 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102424333B1 KR102424333B1 KR1020200174891A KR20200174891A KR102424333B1 KR 102424333 B1 KR102424333 B1 KR 102424333B1 KR 1020200174891 A KR1020200174891 A KR 1020200174891A KR 20200174891 A KR20200174891 A KR 20200174891A KR 102424333 B1 KR102424333 B1 KR 102424333B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- mesenchymal stem
- stem cells
- derived
- sucrose
- extracellular vesicles
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 title description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 8
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 74
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 45
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 43
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 43
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 43
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 33
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 claims abstract description 24
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 22
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 25
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 22
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 claims description 10
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000008274 jelly Substances 0.000 claims description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 5
- 208000000491 Tendinopathy Diseases 0.000 claims description 4
- 206010043255 Tendonitis Diseases 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 201000004415 tendinitis Diseases 0.000 claims description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 3
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001640 Fibromyalgia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007882 Gastritis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 claims description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 2
- 201000002481 Myositis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 claims description 2
- 206010068319 Oropharyngeal pain Diseases 0.000 claims description 2
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 claims description 2
- 201000007100 Pharyngitis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 claims description 2
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 claims description 2
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000003146 cystitis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014617 hemorrhoid Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 2
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000008383 nephritis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001245 periodontitis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010044008 tonsillitis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010034038 Parotitis Diseases 0.000 claims 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims 1
- 101150074164 PMAIP1 gene Proteins 0.000 abstract description 13
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 87
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 55
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 24
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 24
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 23
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 22
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 14
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 13
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 7
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 7
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 5
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 5
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 5
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 5
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 4
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 4
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 4
- 101710089543 Nitric oxide synthase, inducible Proteins 0.000 description 4
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 description 4
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- -1 specifically Proteins 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 3
- YJIYWYAMZFVECX-UHFFFAOYSA-N 2-[N-[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]-2-[2-[2-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]anilino]acetic acid acetyloxymethyl ester Chemical compound CC(=O)OCOC(=O)CN(CC(=O)OCOC(C)=O)C1=CC=CC=C1OCCOC1=CC=CC=C1N(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O YJIYWYAMZFVECX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 3
- RJWLAIMXRBDUMH-ULQDDVLXSA-N N-Acetylleucyl-leucyl-methioninal Chemical compound CSCC[C@@H](C=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(C)=O RJWLAIMXRBDUMH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- 102100029438 Nitric oxide synthase, inducible Human genes 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007590 Calpain Human genes 0.000 description 2
- 108010032088 Calpain Proteins 0.000 description 2
- 101100507655 Canis lupus familiaris HSPA1 gene Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 101000836492 Dictyostelium discoideum ALG-2 interacting protein X Proteins 0.000 description 2
- 102100032564 Golgin subfamily A member 2 Human genes 0.000 description 2
- 108010074556 Golgin subfamily A member 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101000725401 Homo sapiens Cytochrome c oxidase subunit 2 Proteins 0.000 description 2
- 101001134621 Homo sapiens Programmed cell death 6-interacting protein Proteins 0.000 description 2
- 101000605127 Homo sapiens Prostaglandin G/H synthase 2 Proteins 0.000 description 2
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 2
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101001034845 Mus musculus Interferon-induced transmembrane protein 3 Proteins 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100033344 Programmed cell death 6-interacting protein Human genes 0.000 description 2
- 108050003267 Prostaglandin G/H synthase 2 Proteins 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 235000001465 calcium Nutrition 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 2
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 2
- 102000010660 flotillin Human genes 0.000 description 2
- 108060000864 flotillin Proteins 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- BZWRLDPIWKOVKB-ZPFDUUQYSA-N Asn-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O BZWRLDPIWKOVKB-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 1
- 238000011728 BALB/c nude (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 229940121926 Calpain inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- NXQCSPVUPLUTJH-WHFBIAKZSA-N Cys-Ser-Gly Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O NXQCSPVUPLUTJH-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102100030497 Cytochrome c Human genes 0.000 description 1
- 108010075031 Cytochromes c Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 239000004278 EU approved seasoning Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 239000004386 Erythritol Substances 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100026539 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- NJNRBRKHOWSGMN-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NJNRBRKHOWSGMN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N Lys-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AIRZWUMAHCDDHR-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- MZNYWPRCVDMOJG-UHFFFAOYSA-N N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=CC=C2C([NH2+]CC[NH3+])=CC=CC2=C1 MZNYWPRCVDMOJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010034464 Periarthritis Diseases 0.000 description 1
- XWBJLKDCHJVKAK-KKUMJFAQSA-N Phe-Arg-Gln Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N XWBJLKDCHJVKAK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- XUDRHBPSPAPDJP-SRVKXCTJSA-N Ser-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CO XUDRHBPSPAPDJP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 244000228451 Stevia rebaudiana Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 1
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 1
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 108700039689 bcl-2 Homologous Antagonist-Killer Proteins 0.000 description 1
- 102000055574 bcl-2 Homologous Antagonist-Killer Human genes 0.000 description 1
- 108700000707 bcl-2-Associated X Proteins 0.000 description 1
- 102000055102 bcl-2-Associated X Human genes 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000002583 cell-derived microparticle Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 235000019414 erythritol Nutrition 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N erythritol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)CO UNXHWFMMPAWVPI-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 229940009714 erythritol Drugs 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 101150094281 mcl1 gene Proteins 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N rebaudioside A Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)O[C@]12C(=C)C[C@@]3(C1)CC[C@@H]1[C@@](C)(CCC[C@]1([C@@H]3CC2)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HELXLJCILKEWJH-NCGAPWICSA-N 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 108010048397 seryl-lysyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N silicic acid Chemical compound O[Si](O)(O)O RMAQACBXLXPBSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N sulfanilamide Chemical compound NC1=CC=C(S(N)(=O)=O)C=C1 FDDDEECHVMSUSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/34—Sugars
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
- C12N2501/734—Proteases (EC 3.4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Mycology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 녹사 (Noxa) 단백질에서 유래한 펩타이드 및 중간엽줄기세포를 이용한 세포외 소포의 대량 생산 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 녹사 단백질 유래 펩타이드, 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose) 및 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]를 포함하는 배지 조성물에서 중간엽줄기세포를 배양함으로써 상처 재생 및 면역 조절 효과를 갖는 세포외 소포를 고수율, 나아가 고순도로 얻을 수 있는 세포외 소포의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 녹사 (Noxa) 단백질에서 유래한 펩타이드 및 중간엽줄기세포를 이용한 세포외 소포의 대량 생산 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 녹사 단백질 유래 펩타이드, 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose) 및 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]를 포함하는 배지 조성물에서 중간엽줄기세포를 배양함으로써 상처 재생 및 면역 조절 효과를 갖는 세포외 소포를 고수율, 나아가 고순도로 얻을 수 있는 세포외 소포의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
세포외 소포체 (Extracellular vesicle)는 인간과 동물은 물론, 곤충, 식물, 미생물 등 다양한 진핵 세포에서 분비되는 다양한 크기의 지질 이중막 구조의 소포체로서, 이중 나노 수준의 입경을 가지는 미세 소포체를 엑소좀(exosome)이라 한다.
엑소좀은 세포가 함유하는 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물 등 특정 분자들을 포함하면서, 지질 이중층으로 특정 분자들을 안정적으로 보호하고 분비 후 다른 세포로 전달하는 정보 전달 역할을 한다.
엑소좀은 새로운 약물 전달 수단으로 주목받고 있다. 엑소좀은 리포좀 (Liposome)에 비해 세포내로 더 쉽게 들어갈 뿐만 아니라 면역 체계의 저항을 거의 받지 않는다. 뿐만 아니라, 엑소좀의 막 표면에 존재하는 풍부한 양의 리간드 (Ligand)는 수용체를 통한 세포 특이적 전달 가능성을 보여주고 있다.
한편, 줄기세포를 이용한 재생의학 또는 면역질환 치료에 있어서, 살아있는 줄기세포를 병변부에 직접 이식하는 세포 치료법을 대체하는, 줄기세포로부터 유래된 세포외 소포체를 이용한 치료법이 전임상 시험에서 효능을 보이고 있으며, 몇몇 질병치료에 있어 임상 단계에 진입한 사례도 보고되고 있다. 줄기세포에서 분비되는 엑소좀은 줄기세포가 가지고 있는 항염증 활성 및 재생 (self-renewal) 활성과 관련된 핵심 인자를 함유하고 있는 것으로 알려져 있다.
따라서, 세포를 이용하지 않아 치료적 유효량의 세포 확보 및 유지 등의 문제가 있는 기존 세포 치료제의 단점을 극복할 수 있는 새로운 접근으로서 각광받고 있다.
그러나, 일반적으로 유핵세포가 분비하는 엑소좀 개수는 세포 당 1000개 정도에 불과하다. 따라서 엑소좀을 이용한 치료제 기술에서 세포로부터 분리된 엑소좀의 수율을 향상시키는 것은 매우 중요한 문제이다.
일반적으로 엑소좀은 세포 배양액으로부터 분리되는 방식으로 수득한다. 일반적인 줄기세포 배양 시 2차원 배양을 하는데, 이 경우 다량의 엑소좀을 얻기 위해서는 많은 양의 세포를 배양해야 하기 때문에 결과적으로 비용의 증가를 가져온다.
또한, 다수의 세포를 배양한 대량의 세포배양액에서 엑소좀을 분리하는 것은 상당한 노동을 필요로 한다. 엑소좀의 분리 및 정제에는 원심분리 및 TFF (tangential flow filtration)를 주로 사용한다.
원심분리의 경우 적용할 수 있는 용량이 한정되어 있어 대량의 세포 배양액에서 엑소좀을 분리하기에는 적합하지 않으며, TFF는 원심분리에 비하여 대량 공정에 적합하다는 장점이 있지만, 여과 공정 도중 발생하는 전단 스트레스 (shear stress) 및 엑소좀의 손실 등 다양한 문제점이 존재한다.
이러한 문제점을 해결하기 위해서 적은 수의 세포 및 소량의 배양액으로 다량의 엑소좀을 수득할 수 있는 효율적인 추출 방법의 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 다양한 유익 성분을 함유하면서도 지질 이중막으로 구성되어 그 자체로서 안정적인 약물 전달 시스템의 기능을 하는 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포 (Extracellular vesicle), 구체적으로는 탯줄로부터 유래된 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포체의 효율적인 수득 방법을 개발하기 위하여 연구 노력하였다.
그 결과, 녹사 (Noxa) 단백질 유래 펩타이드를 포함하는 배지에서 탯줄로부터 유래된 중간엽줄기세포 (Wharton's jelly-derived MSCs, WJ-MSCs)를 배양하고 회전 진탕 배양 (orbital shaking culture)함으로써 단일세포 (single cell)를 부유 (floating)시켜 세포외 소포를 분리할 경우, 줄기세포 고유의 상처 재생 효과 및 면역 조절 효과를 나타내는 세포외 소포를 고수율 및 고순도로 얻을 수 있음을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스, 수크로스 및 MOPS를 포함하는 배지 조성물로 전처리된 중간엽줄기세포 또는 이의 배양물로부터 분리된 세포외 소포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 중간엽줄기세포 또는 이의 배양물로부터 분리된 세포외 소포를 포함하는 상처 완화, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 중간엽줄기세포 또는 이의 배양물로부터 분리된 세포외 소포를 포함하는 염증 완화, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 중간엽줄기세포 또는 이의 배양물로부터 분리된 세포외 소포를 포함하는 염증성 질환의 완화, 억제 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 녹사 (Noxa) 단백질에서 유래한 펩타이드 및 탯줄로부터 유래된 중간엽줄기세포를 이용한 세포외 소포의 대량 생산 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 녹사 (Noxa) 단백질에서 유래한 펩타이드, 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose) 및 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]를 포함하는 배지에서 탯줄로부터 유래된 중간엽줄기세포를 배양함으로써 줄기세포 고유의 상처 재생 및 면역 조절 효과를 갖는 세포외 소포를 고수율, 나아가 고순도로 얻을 수 있는 세포외 소포의 대량 생산 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 다음의 단계를 포함하는 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 생산 방법에 관한 것이다:
중간엽줄기세포를 전배양하는 제1배양 단계; 및
전배양한 중간엽줄기세포를 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose) 및 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]를 포함하는 배지 조성물에서 배양하는 제2배양 단계.
본 발명에 있어서 중간엽줄기세포의 유래는 골수, 배아, 탯줄, 근육, 지방 및 신경 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 탯줄인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 “줄기세포 (Stem cell)”는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 중간엽줄기세포는 탯줄로부터 유래된 중간엽줄기세포 (Wharton's jelly-derived MSCs, WJ-MSCs)일 수 있다.
줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있고, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래 줄기세포일 수 있으며, 성체 또는 배아 유래 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 세포외 소포는 그 크기 및 생성 과정에 따라 엑소좀 (Exosome), 자멸 사체 (Apoptotic body) 또는 미세 소포 (Microveslcles, Ectosome)와 같이 3가지로 분류되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 “엑소좀 (Exosome)”은 세포 유래성 소포체로, 거의 모든 진핵 생물의 체액에 존재하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 엑소좀의 직경은 30 내지 100nm 정도이며, 이는 LDL 단백질보다는 크지만, 적혈구보다는 훨씬 작은 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 녹사 (Noxa) 단백질 유래 펩타이드인 것일 수 있다.
Noxa 단백질은 BH3 (Bcl-2 homology 3) 도메인을 이용하여 Mcl1과 Bcl2A1에 결합하여 억제시킴으로써, BAX와 BAK 단백질이 활성화되고 시토크롬 C (Cytochrome-c)가 세포질로 유출되어 Caspase system이 작동하여 세포자멸사를 일으키는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 용어 “펩타이드 (peptide)”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에 일 구체예에 있어서 Noxa 단백질 유래 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 약 60% 이상, 약70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 상동성을 갖는 펩타이드인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 펩타이드는 고체상 합성법 (Solid phase peptide synthesis)을 이용하여 화학적 직접 합성하는 방법, 자동 합성기를 이용하여 합성하는 방법 또는 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 벡터에 삽입하고 발현시켜 제조하는 방법을 이용하여 제조되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 용어 “벡터 (Vector)”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 벡터는 예를 들어, 플라스미드 (Plasmid) 벡터, 코즈미드 (Cosmid) 벡터 및 박테리오파아지 (Bacteriophage) 벡터, 아데노바이러스 (Adenovirus) 벡터, 레트로바이러스 (Retrovirus) 벡터 및 아데노-연관 바이러스 (Adeno-associated virus, AAV) 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 전배양 (pre-culture)은 중간엽줄기세포의 Confluency가 일정 수준에 이를 때까지 중간엽줄기세포를 배양하는 것을 의미할 수 있으며, 예를 들어, Confluency가 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상이 될 때까지 중간엽줄기세포를 배양하는 것을 의미할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 제1배양 단계는 전배양한 중간엽줄기세포에 트립신 (trypsin)을 처리하여 중간엽줄기세포를 부유시키는 트립신 처리 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 제1배양 단계는 전배양한 중간엽줄기세포를 수득하기 위해 원심분리를 수행하는 수득 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 배지 조성물에 포함된 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 농도는 0.1 내지 5.0 uM, 0.1 내지 4.5 uM, 0.1 내지 4.0 uM, 0.1 내지 3.5 uM, 0.1 내지 3.0 uM, 0.1 내지 2.5 uM, 0.1 내지 2.0 uM, 0.1 내지 1.5 uM, 0.5 내지 5.0 uM, 0.5 내지 4.5 uM, 0.5 내지 4.0 uM, 0.5 내지 3.5 uM, 0.5 내지 3.0 uM, 0.5 내지 2.5 uM, 0.5 내지 2.0 uM 또는 0.5 내지 1.5 uM인 것일 수 있으며, 예를 들어, 0.5 내지 1.5 uM인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 배지 조성물에 포함된 글루코스의 농도는 1 내지 10 mM, 1 내지 8 mM, 1 내지 6 mM, 2 내지 10 mM, 2 내지 8 mM, 2 내지 6 mM, 3 내지 10 mM, 3 내지 8 mM, 3 내지 6 mM, 4 내지 10 mM, 4 내지 8 mM 또는 4 내지 6 mM인 것일 수 있으며, 예를 들어, 4 내지 6 mM인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 배지 조성물에 포함된 수크로스의 농도는 200 내지 300 mM, 200 내지 280 mM, 200 내지 260 mM, 220 내지 300 mM, 220 내지 280 mM, 220 내지 260 mM, 240 내지 300 mM, 240 내지 280 mM 또는 240 내지 260 mM인 것일 수 있으며, 예를 들어, 240 내지 260 mM인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 배지 조성물에 포함된 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]의 농도는 1 내지 20 mM, 1 내지 18 mM, 1 내지 16 mM, 1 내지 14 mM, 1 내지 12 mM, 3 내지 20 mM, 3 내지 18 mM, 3 내지 16 mM, 3 내지 14 mM, 3 내지 12 mM, 5 내지 20 mM, 5 내지 18 mM, 5 내지 16 mM, 5 내지 14 mM, 5 내지 12 mM, 8 내지 20 mM, 8 내지 18 mM, 8 내지 16 mM, 8 내지 14 mM 또는 8 내지 12 mM인 것일 수 있으며, 예를 들어, 8 내지 12 mM인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제2배양 단계는 전배양한 중간엽줄기세포를 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose) 및 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]를 포함하는 배지 조성물에서 배양하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 제2배양 단계는 5 내지 30 분, 5 내지 25 분, 5 내지 20 분, 5 내지 18분, 10 내지 30 분, 10 내지 25 분, 10 내지 20 분, 10 내지 18분, 13 내지 30 분, 13 내지 25 분, 13 내지 20 분 또는 13 내지 18분 동안 수행되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 13 내지 18 분 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 제2배양 단계는 부유 배양을 통해 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 용어 “부유 배양 (orbital shaking culture)”은 수평으로 일정한 반경의 원을 그리면서 선회하는 기판에 플라스크를 놓아 일정한 회전 속도로 세포를 배양하는 것을 의미할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, 부유 배양은 오비탈 쉐이커 (orbital shaker)를 이용하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 생산 방법은 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포를 분리하는 분리 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 분리 단계는 제2배양 단계를 수행한 배지 조성물로부터 세포외 소포를 수득하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스, 수크로스 및 MOPS를 포함하는 배지 조성물에서 중간엽줄기세포를 배양하여 생산되는 총 세포외 소포의 수 (Total particle number)를 측정한 결과, 대조군에 비하여 총 세포외 소포의 수가 상대적으로 증가하는 것을 확인하였다. (표 8)
본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스, 수크로스 및 MOPS를 포함하는 배지 조성물에서, 중간엽줄기세포를 부유 배양함으로써 생산되는 총 세포외 소포의 수 (Total particle number)를 측정한 결과, 대조군 또는 부유 배양하지 않은 것에 비하여 총 세포외 소포의 수가 상대적으로 더욱 증가하는 것을 확인하였다. (표 8)
본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스, 수크로스, MOPS를 포함하는 배지 조성물에서, 중간엽줄기세포를 부유 배양함으로써 생산되는 총 세포외 소포의 수 (Total particle number)를 측정한 결과, 대조군, 부유 배양하지 않은 것 또는 부유 배양한 것에 비하여 수득한 총 세포외 소포의 수가 더욱 증가하는 것을 확인하였다. (표 8)
본 발명에 따른 세포외 소포의 생산 방법은 세포외 소포를 고수율 및 고순도로 생산할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스, 수크로스, MOPS를 포함하는 배지에서 중간엽줄기세포를 부유 배양함으로써 생산되는 세포외 소포의 순도 (purity)를 측정한 결과, 대조군에 비하여 대폭 증가하는 것을 확인하였다. (도 6 및 표 10)
본 발명의 다른 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose) 및 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]로 전처리된 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 전처리 (pre-treatment)는 트립신을 줄기세포에 미리 처리하는 과정을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 중간엽줄기세포는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스, 수크로스 및 MOPS를 포함하는 배지 조성물로 더 전처리된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 배양물은 당 업계의 통상적인 방식을 이용하여 중간엽줄기세포를 배양한 배양액 및/또는 부유 배양한 부유 배양액을 의미하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 세포외 소포는 상처 완화, 억제 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 배지 조성물로 전처리된 중간엽줄기세포 또는 이의 배양물로부터 분리된 세포외 소포는 대조군에 비하여 세포 이동능이 상대적으로 향상되는 것을 확인하였다. (도 11 및 표 12)
본 발명의 중간엽줄기세포 또는 이의 배양물로부터 분리된 세포외 소포는 염증성 질환의 완화, 억제 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 배지 조성물로 전처리된 중간엽줄기세포 또는 이의 배양물로부터 분리된 세포외 소포는 LPS로 유도된 염증 모델에서 산화질소 (NO) 농도와 염증 유발 유전자 (iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, COX-2)의 mRNA 발현 정도를 감소시키는 것을 확인하였다. (도 12 및 표 13)
본 발명의 또 다른 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose) 및 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]로 전처리된 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포를 포함하는 상처 완화, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 상처는 피부, 장기 또는 뼈 등의 손상된 조직에 존재하는 손상 부위를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상처 완화, 억제 또는 치료는 손상된 조직의 세포 분화를 촉진하는 등의 방법으로 조직의 손상도를 완화, 억제하거나 조직을 치료하는 것을 의미하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상처 완화, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물은 세포 치료제일 수 있다.
본 발명에 있어서 용어 “세포 치료제”는 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종 (xenogenic) 세포를 체외에서 증식ㆍ선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 세포 치료제는 줄기세포 치료제일 수 있다.
본 발명에 있어서 용어 “줄기세포 치료제”는 자가골수 유래, 자가지방세포 유래, 동종제대혈 유래 줄기세포 등을 이용한 바이오 의약품을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 중간엽줄기세포 또는 이의 배양물로부터 분리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스, 수크로스 및 MOPS로 전처리된 중간엽줄기세포 또는 이의 배양물로부터 분리된 세포외 소포를 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 용어 “유효성분으로 포함하는”이란 줄기세포 또는 이의 배양물로부터 분리된 세포외 소포의 특정 질환에 대한 완화, 억제 또는 치료 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있고, 예를 들어, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 및 보존제 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 경구 및 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 비강내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 경막 내 투여, 안구 투여, 피부 투여 및 경피 투여 등으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 투여량이 정해질 수 있으며, 소망하는 완화, 억제 또는 치료에 효과적인 투여량으로 결정 또는 처방될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-1000 ㎎/㎏일 수 있다.
본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose) 및 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]로 전처리된 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포를 포함하는 염증성 질환의 완화, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 염증성 질환은 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군 (sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 예는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose) 및 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]로 전처리된 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포를 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 식품 조성물은 염증성 질환의 완화, 억제 또는 개선용 식품 조성물일 수 있다.
본 발명에 있어서 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 탄수화물은 포도당, 과당 등의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스, 올리고당 등의 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 향미제는 타우마틴, 스테비아 추출물 등의 천연 향미제, 및 사카린, 아스파탐 등의 합성 향미제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 생산 방법은 녹사 단백질 유래 펩타이드 (peptide), 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose) 및 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]를 포함하는 배지 조성물에서 중간엽줄기세포를 부유 배양함으로써 상처 재생 및 면역 조절 효과를 갖는 세포외 소포를 고수율, 나아가 고순도로 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 녹사 단백질 유래 펩타이드, 글루코스, 수크로스 및 MOPS를 포함하는 배지 조성물로 전처리된 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포는 우수한 상처의 완화, 억제 또는 치료 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 녹사 단백질 유래 펩타이드, 글루코스, 수크로스 및 MOPS를 포함하는 배지 조성물로 전처리된 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포는 우수한 염증성 질환의 완화, 억제 또는 치료 효과를 나타낸다.
도 1은 세포외 소포의 eMTD 펩타이드에 대한 생존력을 흡광도로 측정하여 분석한 그래프 및 줄기세포 외관을 촬영한 사진이다.
도 2는 세포외 소포의 eMTD 펩타이드에 대한 생존력을 세포수 계수로 측정하여 분석한 그래프 및 줄기세포 외관을 촬영한 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 제조예에 따라 세포외 소포를 생산하여 분리한 후 줄기세포당 생산되는 세포외 소포의 수를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 Control-EV의 평균 크기와 크기에 따른 파티클의 수를 측정하여 나타낸 DLS/NTA 그래프이다.
도 4b는 TS-eEV의 평균 크기와 크기에 따른 파티클의 수를 측정하여 나타낸 DLS/NTA 그래프이다.
도 5a 는Control-EV를 투과 전자 현미경 (transmission electron microscope, TEM)으로 관찰하여 촬영한 사진이다. (Scale bar: 200 nm)
도 5b는 TS-eEV를 투과 전자 현미경 (transmission electron microscope, TEM)으로 관찰하여 촬영한 사진이다. (Scale bar: 200 nm)
도 6은 본 발명의 일 실험예에 따라 제조된 Control-EV 및 TS-eEV의 순도 (purity)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7a는 Control-EV가 표면 마커 (surface marker)인 CD9-BV421, CD63-PE 또는 CD81-APC의 발현하는지 여부를 유세포 분석기로 분석한 그래프이다.
도 7b는 TS-eEV가 표면 마커 (surface marker)인 CD9-BV421, CD63-PE 또는 CD81-APC의 발현하는지 여부를 유세포 분석기로 분석한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 세포외 소포가 발현하는 항원 작용기인 CD9, CD63, Hsp70, Flotillin-1, Alix, GM130 및 β-actin의 발현 여부를 분석하여 나타낸 웨스턴 블랏 (Western-Blot) 결과이다.
도 9는 본 발명의 세포외 소포가 HaCaT 세포에 의한 흡수 (uptake) 여부를 확인하기 위하여, 세포외 소포를 염색하고 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 10은 본 발명에 따른 세포외 소포의 HaCaT 세포에 대한 생존력 (Cell viablity)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 11a 및 11b는 본 발명에 따른 세포외 소포의 세포 이동능 증식 효과를 측정하여 촬영한 사진 (11a)과 그래프 (11b)이다.
도 12a 내지 12f는 본 발명에 따른 세포외 소포의 항염증 효과를 확인하기 위하여, 항염증 효과를 측정하기 위한 척도 중 하나인 산화질소 배출량과 염증 유발 유전자(iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, COX-2)들을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명에 따른 세포외 소포의 상처 치유능을 확인하기 위하여 상처 부위를 촬영한 사진 (a)과 상처 부위의 감소율을 측정한 그래프 (b)이다.
도 14a 및 14b는 본 발명의 세포외 소포가 생산되는 과정에 있어, 칼슘 이온 또는 칼페인 효소의 작용이 본 발명의 일 구체예에 따른 TS-eEV의 생성에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 2는 세포외 소포의 eMTD 펩타이드에 대한 생존력을 세포수 계수로 측정하여 분석한 그래프 및 줄기세포 외관을 촬영한 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 제조예에 따라 세포외 소포를 생산하여 분리한 후 줄기세포당 생산되는 세포외 소포의 수를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 Control-EV의 평균 크기와 크기에 따른 파티클의 수를 측정하여 나타낸 DLS/NTA 그래프이다.
도 4b는 TS-eEV의 평균 크기와 크기에 따른 파티클의 수를 측정하여 나타낸 DLS/NTA 그래프이다.
도 5a 는Control-EV를 투과 전자 현미경 (transmission electron microscope, TEM)으로 관찰하여 촬영한 사진이다. (Scale bar: 200 nm)
도 5b는 TS-eEV를 투과 전자 현미경 (transmission electron microscope, TEM)으로 관찰하여 촬영한 사진이다. (Scale bar: 200 nm)
도 6은 본 발명의 일 실험예에 따라 제조된 Control-EV 및 TS-eEV의 순도 (purity)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 7a는 Control-EV가 표면 마커 (surface marker)인 CD9-BV421, CD63-PE 또는 CD81-APC의 발현하는지 여부를 유세포 분석기로 분석한 그래프이다.
도 7b는 TS-eEV가 표면 마커 (surface marker)인 CD9-BV421, CD63-PE 또는 CD81-APC의 발현하는지 여부를 유세포 분석기로 분석한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 세포외 소포가 발현하는 항원 작용기인 CD9, CD63, Hsp70, Flotillin-1, Alix, GM130 및 β-actin의 발현 여부를 분석하여 나타낸 웨스턴 블랏 (Western-Blot) 결과이다.
도 9는 본 발명의 세포외 소포가 HaCaT 세포에 의한 흡수 (uptake) 여부를 확인하기 위하여, 세포외 소포를 염색하고 공초점 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 10은 본 발명에 따른 세포외 소포의 HaCaT 세포에 대한 생존력 (Cell viablity)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 11a 및 11b는 본 발명에 따른 세포외 소포의 세포 이동능 증식 효과를 측정하여 촬영한 사진 (11a)과 그래프 (11b)이다.
도 12a 내지 12f는 본 발명에 따른 세포외 소포의 항염증 효과를 확인하기 위하여, 항염증 효과를 측정하기 위한 척도 중 하나인 산화질소 배출량과 염증 유발 유전자(iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, COX-2)들을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명에 따른 세포외 소포의 상처 치유능을 확인하기 위하여 상처 부위를 촬영한 사진 (a)과 상처 부위의 감소율을 측정한 그래프 (b)이다.
도 14a 및 14b는 본 발명의 세포외 소포가 생산되는 과정에 있어, 칼슘 이온 또는 칼페인 효소의 작용이 본 발명의 일 구체예에 따른 TS-eEV의 생성에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
제조예 1. 세포외 소포의 eMTD 펩타이드에 대한 생존력 분석 (viabillity test)
탯줄로부터 유래된 중간엽줄기세포 (Wharton's jelly-derived MSCs, WJ-MSCs)에 eMTD 펩타이드를 농도별 및 처리시간별로 처리하여 생존력 분석 (viabillity test)을 수행하였다.
1-1. 흡광도 분석
eMTD 펩타이드의 농도별 test를 위하여, 24 well plate (30024, SPL)에 2 x 104 cells의 탯줄로부터 유래된 중간엽줄기세포를 접종하고 (seeding) 24 시간 후에 eMTD 펩타이드를 최종농도가 0, 0.5, 1, 3, 5, 10 또는 20 uM이 되도록 수크로스 버퍼 (sucrose buffer)와 함께 처리하였다.
eMTD 펩타이드의 서열은 표 1에 나타내었다.
서열번호 | 명명 | 서열목록 | 비고 |
1 | eMTD | KLNFRQKLLNLISKLFCSGT | 20 aa |
수크로스 버퍼는 글루코스 (glucose), 수크로스 (Sucrose) 및 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]를 포함하고, 각각의 성분에 따른 최종 농도는 표 2에 나타내었다.
(mM) | Glucose | Sucrose | MOPS |
Sucrose buffer | 5 | 250 | 10 |
15 분 후, ez-cytox (EZ-3000, DOGEN)를 처리하고 30 내지 60 분 동안 반응을 진행시킨 다음, Bio-RAD x-MarkTM 분광광도계 (Bio-Rad Laboratories, 미국)를 이용하여 흡광도 (Absorbance, 450 nm)를 측정하였다.
그리고, eMTD 펩타이드의 처리시간별 test를 위해서 24 well plate (30024, SPL)에 2 x 104 cells의 탯줄로부터 유래된 중간엽줄기세포를 접종하고 24 시간 후에 1 uM의 eMTD 펩타이드를 시간별 (0, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30 분 동안)로 수크로스 버퍼와 함께 처리하였다.
처리 15 분 후에 ez-cytox (EZ-3000, DOGEN)를 처리하고 30 내지 60 분 동안 기다렸고, Bio-RAD x-MarkTM 분광광도계 (Bio-Rad Laboratories, 미국)를 이용하여 흡광도 (450nm)를 측정하여, 그 결과를 그 결과를 도 1 및 표 3, 4에 나타내었다.
실시예1 | 비교예1 | 비교예2 | 비교예3 | 비교예4 | 비교예5 | 비교예6 | |
MTT assay Concentration (uM) | 1.0 | 0 | 0.5 | 3.0 | 5.0 | 10.0 | 20.0 |
Cell viablility (%) |
57.4 ±2.48 |
100 ±0.72 |
53.9 ±0.72 |
13.6 ±1.43 |
5.8 ±1.43 |
2.9 ±2.48 |
4.1 ±1.24 |
실시예2 | 비교예7 | 비교예8 | 비교예9 | 비교예10 | 비교예11 | 비교예12 | |
MTT assay Time (min) | 15 | 0 | 5 | 10 | 20 | 25 | 30 |
Cell viablility (%) |
37.0 ±4.28 |
100 ±1.19 |
52.7 ±3.14 |
41.8 ±2.05 |
29.4 ±3.56 |
18.5 ±2.38 |
17.8 ±1.19 |
1-2. 세포수 계수
세포 수를 측정하기 위해, 12 well plate (30012, SPL)에 2.5 x 104 cells의 탯줄로부터 유래된 중간엽줄기세포를 접종하고 24 시간 후에 eMTD 펩타이드를 최종농도가 0, 0.5, 1.0, 3.0, 5.0, 10.0 또는 20.0 uM이 되도록 표 2의 수크로스 버퍼와 함께 처리하였다. 15 분 경과 후에 트리판 블루 (Trypan blue solution)를 이용하여 세포 수를 측정하였다.
또한, 12 well plate (30012, SPL)에 2.5 x 104 cells의 탯줄로부터 유래된 중간엽줄기세포를 접종하고 24 시간 후에 eMTD 펩타이드를 시간별 (0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 분 동안)로 표 2의 수크로스 버퍼와 함께 처리하였다. 15 분 경과 후에 트리판 블루를 이용하여 세포 수를 측정하여 그 결과를 도 2 및 표 5, 6에 나타내었다.
실시예3 | 비교예13 | 비교예14 | 비교예15 | 비교예16 | 비교예17 | 비교예18 | |
TB assay Concentration (uM) | 1.0 | 0 | 0.5 | 3.0 | 5.0 | 10.0 | 20.0 |
Cell viablility (%) |
66.3 ±10.22 |
100 | 66.7 ±5.77 |
21.9 ±4.21 |
11.2 ±5.30 |
0 | 2.1 ±3.03 |
실시예4 | 비교예19 | 비교예20 | 비교예21 | 비교예22 | 비교예23 | 비교예24 | |
TB assay Time (min) | 15 | 0 | 5 | 10 | 20 | 25 | 30 |
Cell viablility (%) |
38.5 ±4.71 |
100 | 40.0 ±0.78 |
29.7 ±0.78 |
35.9 ±4.88 |
14.6 ±1.80 |
15.6 ±2.34 |
도 1, 2 및 표 3 내지 6을 참조하여, 세포외 소포를 제조하기 위해 약 50% 정도의 cell viability를 나타내는 실험 조건인 eMTD 펩타이드 농도 1.0 uM, 처리시간 15분을 선정하였다.
제조예 2. EV 분리 (isolation) 및 생산량 비교
2-1. Control-EV의 제조
탯줄로부터 유래된 중간엽줄기세포를 150 mm dish (20151, SPL)에 접종하고 (5000 cells/cm2), 80 내지 90 %로 세포가 찼을 때 exosome-depleted FBS (PS-FB1, PEAK)를 10% 포함하는 a-MEM (a-Minimum Essential Media) 배지 (12561072, Gibco)로 교체해 주었다.
48시간 후, a-MEM 배지의 배양액을 수득하고, 300 g로 3 분 동안 원심분리하고 세포 찌꺼기를 제거한 후, 2,000 g로 10 분 동안 원심분리하여 상등액을 새로운 튜브로 옮기고, 다시 10,000 g로 30 분 동안 원심분리하여 수득한 상등액을 마지막으로 187,000 g로 2 시간 동안 원심분리한 후, 펠렛에서 Control-EV를 수득하였다.
2-2. eEV (eMTD-EV)의 제조
실험예 2-1. 과정에 따라 수득한 펠렛에 수크로스 버퍼와 eMTD 펩타이드 (1 uM)가 함께 포함된 조성물을 15 분 동안 처리한 후, eEV (eMTD-EV)를 분리하였다.
2-3. S-eEV (shaking-eMTD-EV)의 제조
실험예 2-1. 과정에 따라 수득한 펠렛에 수크로스 버퍼와 eMTD 펩타이드 (1 uM)가 포함된 조성물을 처리하고, 오비탈 쉐이커 (orbital shaker, 60 RPM) (69455, INFORS HT Celltron)를 이용하여 15 분 동안 배양한 후, S-eEV (shaking-eMTD-EV)를 분리하였다.
2-4. T-eEV (Trypsinization-eMTD-EV)의 제조
실험예 2-1. 과정에 따라 80 내지 90 %로 세포가 찼을 때, 트립신 (25200-056, gibco)을 이용하여 세포를 부유시켰다 (floating). 부유시킨 세포는 원심분리하여 펠렛을 수득하고, 50 ml conical tube (50050, SPL)에서 펠렛에 수크로스 버퍼와 eMTD 펩타이드 (1 uM)가 포함된 조성물을 15 분 동안 처리한 후, T-eEV (Trypsinization-eMTD-EV)를 분리하였다.
2-5. TS-eEV (Trypsinization shaking-eMTD-EV)의 제조
실험예 2-4. 과정에 따라 세포를 부유 (floating)시키고, 부유시킨 세포는 원심분리하여 펠렛을 수득하고, 50 ml conical tube (50050, SPL)에서 펠렛에 수크로스 버퍼와 eMTD 펩타이드 (1 uM)가 포함된 조성물을 처리하였다.
오비탈 쉐이커 (orbital shaker, 60 RPM)를 이용하여 15 분 동안 처리한 후, TS-eEV (Trypsinization shaking-eMTD-EV)를 분리하였다.
2-5. EV 분리 (isolation) 및 생산량 비교 결과
Control-EV, eEV, S-eEV, T-eEV 및 TS-eEV를 수득한 탯줄로부터 유래된 중간엽 줄기세포의 초기 세포수 (Starting cell number), 수득한 세포수 (Harvest cell number) 및 세포외 소포를 수득하기 위한 배양 시간 (Incubation time)을 표 7에 요약하여 나타내었다.
Starting cell number | Harvest cell number | Incubation time | |
Control-EV | 5000 cells/cm2 | 107 cells | 2,880 min (48 hr) |
eEV | 5000 cells/cm2 | 107 cells | 15 min |
S-eEV | 5000 cells/cm2 | 107 cells | 15 min |
T-eEV | 5000 cells/cm2 | 107 cells | 15 min |
TS-eEV | 5000 cells/cm2 | 107 cells | 15 min |
수득한 Control-EV, eEV, S-eEV, T-eEV 및 TS-eEV의 개수는 도 3 및 표 8에 나타내었다.
EV production (particle number/cell) |
EV production (particle number/min) |
Total particle number | |
Control-EV | 8.84 x 102±2.66 x 102 | 5.45 x 10-1±2.99 x 10-1 | 1.19 x 1010±9.25 x 109 |
eEV | 2.70 x 103±1.09 x 102 | 1.80 x 102±7.25 | 2.60 x 1010±1.40 x 109 |
S-eEV | 5.32 x 103±1.17 x 103 | 3.55 x 102±7.77 x 10 | 4.89 x 1010±2.14 x 109 |
T-eEV | 7.30 x 103±1.74 x 102 | 4.86 x 102±2.00 x 10 | 7.30 x 1010±1.74 x 109 |
TS-eEV | 2.39 x 104±3.42 x 102 | 1.59 x 103±2.28 x 10 | 2.64 x 1011±3.78 x 109 |
도 3 및 표 8에서 확인할 수 있듯이, Total particle number는 Control-EV가 1.19 x 1010±9.25 x 109인 것에 비하여 eEV는 2.60 x 1010±1.4 x 109으로, 약 +118.5% 향상되었다.
S-eEV는 4.89 x 1010±2.14 x 109으로, Control-EV에 비하여 약 +310.9% 향상되었고, T-eEV는 7.30 x 1010±1.74 x 109으로, Control-EV에 비하여 약 +513.4% 향상되었고, TS-eEV는 2.64 x 1011±3.78 x 109으로, Control-EV에 비하여 약 +2,118.5% 향상되었다.
특히, 1 x 1010의 EV를 수득하기 위한 비용은 표 9에 나타내었다. TS-eEV는 Control-EV에 비하여 약 70배 이상 저렴한 것으로 계산되었다.
Cost for 1 x 1010 particles of EV (\, won) | |
Control-EV | 49,445 ± 8,024 |
eEV | 15,515 ± 1,032 |
S-eEV | 4,114 ± 307 |
TS-eEV | 721 ± 20 |
실험예 1. EV characterization
1-1. EV의 크기 및 크기에 따른 파티클의 수 분석
Nano Zetasizer (Malvern Instruments, 멜버른, 영국)를 이용한 동적 광산란 (dynamic light scattering, DLS) 분석을 통해 EV의 크기를 측정하였고, 나노입자 추적 분석기 NS300 (Nanoparticle tracking analysis, NTA) (Nanosight, Amesbery, 영국)를 이용하여 EV의 크기 및 개수를 측정하였고, 그 결과를 도 4a, 4b에 나타내었다.
도 4a 및 4b에서 확인할 수 있듯이, Control-EV의 평균 크기는 159 nm, TS-eEV의 평균 크기는 90 nm인 것으로 측정되었다.
1-2. EV의 형태 분석
EV의 형태는 80 kV에서 투과 전자 현미경 (transmission electron microscope, TEM, JEM-1010, Nippon Denshi, 도쿄, 일본)을 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 5a 및 5b (Scale bar: 200 nm)에 나타내었다.
도 5a 및 5b에서 확인할 수 있듯이, Control-EV와 TS-eEV의 외관 형태는 비슷하였다.
1-3. EV의 순도 (purity) 분석
NTA를 이용하여 파티클 개수 (particle number)를 측정하였고, 추가적으로 BCA kit를 이용하여 단백질을 정량한 후, EV의 순도 (purity) (particles/ug protein)를 측정하여, 그 결과를 도 6 및 표 10에 나타내었다.
Particles/ug protein | |
Control-EV | 3.22 x 108 ± 1.22 x 108 |
TS-eEV | 1.61 x 1010 ± 5.86 x 109 |
도 6 및 표 10에서 확인할 수 있듯이, Control-EV의 순도가 3.22 x 108 ± 1.22 x 108으로 측정된 것에 비해, TS-eEV는 1.61 x 1010 ± 5.86 x 109으로 측정되어 약 +4,900 % 향상됨을 확인하였다.
한편, Control-EV는 세포를 배양하면서 얻기 때문에 세포가 분비하는 여러 가지 수용성 단백질 (soluble protein) 또는 사이토카인 (cytokine) 등의 물질이 섞여 있을 가능성이 매우 크다.
1-4. EV의 표면 마커 (surface marker) 확인
Exosome-Human CD9 Flow Detection Reagent (invitrogen, 10620D)을 이용하여 EV를 포획하고, CD9-BV421 (743047, BD), CD63-PE (556020, BD) 또는 CD81-APC (130-119-787, miltenyi biotec)로 염색한 다음, 유세포 분석기 (Beckman Coulter/CytoFLEX)로 측정하여, 그 결과를 도 7a 및 7b에 나타내었다.
도 7a에서 확인할 수 있듯이, Control-EV의 surface marker로 CD9, CD63 및 CD81이 발현하고 있었다. 도 7b에서 확인할 수 있듯이, TS-eEV의 surface marker로 CD9, CD63 및 CD81이 발현하고 있었다.
그리고, Protease inhibitor cocktail (87786, Invitrogen)이 포함된 RIPA 버퍼 (CBR002, LPS solution)를 이용하여 탯줄로부터 유래된 중간엽 줄기세포를 용해하여 WCL (Whole cell lysate)를 분리하였다. WCL과 EV는 4-12% Bis-Tris Flus Gels (NW04125BOX, Invitrogen/NW04122BOX, Invitrogen)로 전기영동 후, NC membrane (IB23001, Invitrogen)으로 전이시켰다. NC membrane에 일차 항체 (primary antibody, 1:1000)를 4 ℃에서 밤새 부착하였고 (overnight), 1x TBST (TLP-118.1, TrnasLab)를 이용하여 세 번 워싱을 진행하였다. 이차 항체 (secondary antibody)를 2 시간 동안 상온에서 반응을 진행한 후, 1x TBST를 이용하여 워싱하였다.
일차 항체 및 이차 항체는 다음과 같은 제품을 사용하였다: 항-CD9 항체 (ab263023, Abcam), 항-CD63 항체 (ab134045, Abcam), 항-HSP70 항체 (4876, CST), 항-Flotillin-1 항체 (18634, CST), 항-Alix 항체 (2171, CST), 항-GM130 항체 (12480, CST), β-actin 항체 (sc-47778, santa cruz), HRP linked 항-토끼 IgG (7074, CST), and HRP linked 항-마우스 IgG (7076, CST).
모든 항체는 1x blocking buffer (TLP-115.1G, Translab)에 희석시켜 사용하였으며, Invitrogen™-iBright™ Imagers (CL-1000)를 이용하여 촬영하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 확인할 수 있듯이, Exosome positive marker인 CD9, CD63, Hsp70, Flotillin-1 및 Alix와 Exosome negative marker 인 GM130 (골지체 마커)은 발현하지 않았다.
1-5. HaCaT 세포에 의한 EV 흡수 (uptake) 확인
EV를 DiR (D12731, Invitrogen) 2 ug/ml로 상온에서 1시간 염색 후, 울트라센트리퓨지 (ultracentrifuge)를 이용하여 178,000 g에서 2 시간 동안 미반응 염색 시약 (free dye)을 제거하였다. 3 x 109 개의 EV를 HaCaT cells에 6 시간 동안 처리 후, DAPI (4`, 6-diamidino-2-phenylindole) [VECTASHIELD® Antifade Mounting Medium with DAPI-(H-1200)]와 CellMask™(Green Plasma Membrane Stain, C37608, Invitrogen)를 이용하여 염색하였다. 공초점 레이저 현미경 (confocal laser microscopy, Carl Zeiss LSM 800)을 이용하여 염색한 HaCaT cell을 관찰하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 확인할 수 있듯이, TS-eEV는 HaCaT 세포에 흡수 (uptake)되었다.
실험예 2. 상처 치유 (wound healing) 및 항-염증 효과 (anti-inflammation effect) 확인
2-1. 생존력 분석 (viabillity test)
HaCaT 세포의 Control-EV와 TS-eEV에 대한 생존력 분석 (viabillity test)을 위해, 96 well plate (30096, SPL)에 HaCaT 세포를 1 x 104 cell을 접종하고 24 시간 후, exosome-depleted FBS가 10% 포함된 DMEM-high glucose (D6046, sigma) 배지로 교체하고, EV를 개수별 (1 x 106, 1 x 107, 1 x 108 또는 1 x 109 particles)로 처리하였다. 24 시간 후, ez-cytox (EZ-3000, DOGEN)를 처리하고 1 시간 경과 후 Bio-RAD x-MarkTM 분광광도계 (Bio-Rad Laboratories, 미국)를 이용하여 흡광도 (450 nm)를 측정하여 그 결과를 도 10 및 표 11에 나타내었다.
Cell viablity (%) | |||||
EV particles | Control | 1 x 106 | 1 x 107 | 1 x 108 | 1 x 109 |
Control-EV | 100 | 103.4±0.86 | 105.8±0.46 | 109.1±1.12 | 121.6±2.66 |
TS-eEV | 100 | 106.0±0.37 | 106.8±4.46 | 110.8±6.90 | 120.0±0.74 |
도 10 및 표 11에서 확인할 수 있듯이, TS-eEV를 처리하면 농도에 따라 Cell viablity가 증가하며, 1 x 109를 기준으로 TS-eEV의 cell viablity는 Control에 비하여 약 +20 % 증가하였다. Control-EV와 TS-eEV 그룹 사이의 cell viablity는 유의미한 차이가 없었다.
2-2. 세포 이동능 증식 효과
Control-EV와 TS-eEV의 세포 이동능 증식 효과를 확인하기 위해, 6 x 105 cells의 HaCaT 세포를 6 well plate (32006, SPL)에 접종하고 95 % 이상 배양한 뒤, 10 ug/ml 마이토마이신 C (mitomycin C, M4287, Sigma)를 2 시간 동안 처리하여 세포 증식을 억제시켰다.
1 ml 피펫 팁 (pipette tip)을 이용하여 세포에 상처를 낸 뒤, Control-EV 또는 TS-eEV (1 x 109 particles/ml)를 처리하고 24, 48 또는 72 시간이 된 때에 현미경을 통하여 Control-EV와 TS-eEV의 세포 이동능 증식을 관찰하여, 그 결과를 도 11a에 나타내고, 상대적인 상처 영역 (Relative Wound area)은 도 11b 및 표 12에 나타내었다. 대조군 Control (PBS) 배양액에는 EV를 처리하지 않고, PBS를 처리하였다.
표 12는 도 11b의 Contol 값을 100으로 두고, Con-EV, TS-eEV의 시간별 상대적인 상처 영역 변화를 수치값으로 나타낸 것이다.
Wound area (%) | Control | 24 h | 48 h | 72 h |
Control(PBS) | 100 | 86.3±2.05 | 65.5±2.05 | 30.0±1.28 |
Control-EV | 100 | 74.8±2.37 | 44.5±5.19 | 10.4±9.98 |
TS-eEV | 100 | 75.5±4.06 | 44.2±8.49 | 10.7±5.08 |
도 11a, 11b 및 표 12에서 확인할 수 있듯이, TS-eEV는 상처 영역 (Wound area)을 100에서 10.7±5.08로 감소시키고, Control(PBS)은 100에서 30.0±1.28로 감소시켰다. 즉, 세포 이동능은 TS-eEV를 처리한 것이 Control (PBS) 대비 약 +19.3 % 증가하였다.
Control-EV와 TS-eEV 그룹 사이에는 유의미한 차이가 없었고, 1 x 109 particle TS-eEV를 처리하면 Control (PBS) 대비 세포 이동능이 약 +27.0 % 이상 증가하였다.
2-3. 항-염증 효과
1.5 x 105 cells의 Raw264.7 세포를 24 well plate에 접종하고 12시간 후, LPS 10 ng/ml (L4391-1MG, Sigma)와 함께 Control-EV 1 x 108 또는 1 x 109 particles를 300 ul의 Raw264.7 세포 배양액에 처리하였다. 또한, Control-EV 대신 TS-eEV 1 x 108 또는 1 x 109를 300 ul의 Raw264.7 세포 배양액에 처리하였다.
18시간 후, 배양액을 수득하여 그리스 시약 [Griess reagent, 0.1% N-(1-naphthyl) ethylenediamide dihydrochloride and 1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid]과 반응시켜 540 nm 흡광도를 측정하여 산화 질소 (Nitric oxide, NO) 수준을 분석하였고, 그 결과를 도 12a 및 표 13에 나타내었다.
추가적으로, mRNA을 추출하여 real-time PCR을 통해 염증 유발 유전자인 iNOS, TNF-alpha, IL-1beta, IL-6 및 COX2의 상대적인 발현량을 비교하여 그 결과를 도 12b 내지 12f 및 표 13에 나타내었다. 염증 유발 유전자의 발현량 확인을 위한 프라이머 서열은 서열번호 2 내지 11에 나타내었다.
Contorl | LPS only | Con-EV (1x108) |
Con-EV (1x109) |
TS-eEV (1x108) |
TS-eEV (1x109) |
|
NO (uM) | 1.0±0.21 | 21.7±0.4 | 16.9±2.89 | 15.1±1.44 | 17.9±0.2 | 15.0±0.20 |
miNOS | 1.0±0.13 | 2.69±0.27 | 1.74±0.18 | 1.47±0.14 | 1.69±0.23 | 1.46±0.08 |
mTNF-α | 1.0±0.09 | 2.28±0.57 | 1.78±0.29 | 1.46±0.28 | 1.68±0.33 | 1.46±0.07 |
mIL-1β | 1.0±0.06 | 4.18±0.52 | 2.28±0.59 | 1.89±0.14 | 2.7±0.33 | 1.51±0.13 |
mIL-6 | 1.0±0.08 | 1.62±0.1 | 0.85±0.15 | 0.74±0.15 | 0.97±0.09 | 0.71±0.04 |
mCOX2 | 1.0±0.07 | 2.87±0.67 | 1.32±0.38 | 1.29±0.13 | 1.77±0.32 | 1.56±0.22 |
도 12a 내지 12f 및 표 13에서 확인할 수 있듯이, TS-eEV를 1 x 108 처리하면 산화질소 (NO)의 농도는 17.9±0.2 uM인 것으로 측정되어, LPS only가 21.7±0.4 uM로 측정된 것에 비하여 약 -17.5% 감소되었다.
TS-eEV를 1 x 109의 농도로 처리하면 NO의 농도는 15.0±0.20 uM인 것으로 측정되어, LPS only가 27.7±0.4로 측정된 것에 비하여 약 -45.8% 감소되었다.
염증 유발 유전자 중 하나인 iNOS 발현량은 1.46±0.08인 것으로 측정되어, LPS only가 2.69±0.27로 측정된 것에 비하여, 약 -45.7% 감소되었다.
TNF-α 발현량은 1.46±0.07 인 것으로 측정되어, LPS only가 2.28±0.57로 측정된 것에 비하여, 약 -36.0% 감소되었다.
IL-1β 발현량은 1.51±0.13인 것으로 측정되어, LPS only가 4.18±0.52로 측정된 것에 비하여, 약 -63.9% 감소되었다.
IL-6 발현량은 0.71±0.04인 것으로 측정되어, LPS only가 1.62±0.1로 측정된 것에 비하여, 약 -56.2% 감소되었다.
COX2 발현량은 1.56±0.22인 것으로 측정되어, LPS only가 2.87로 측정된 것에 비하여, 약 -45.6% 감소되었다.
이로부터, Raw 264.7 (mouse macrophage) 세포에 LPS(Lipopolysaccharide)로 유도된 염증 반응은 TS-eEV에 의하여 감소될 수 있으며, TS-eEV의 항-염증 (anti-inflammation) 효과를 확인할 수 있었다.
실험예 3. In vivo 상처 치유능 분석 (wound healing assay)
6주령 BALB/c Nude Female 마우스를 구입하여 1주 동안 적응시켰다. 5 mm 바이옵시 펀치 (Kai, BP-50F)를 이용하여 상처를 낸 후, Control-EV 또는 TS-eEV를 1 x 109 particles/20 ul 농도로 상처 부위에 떨어뜨렸으며, 매일 상처 부위를 촬영함으로써 상처 영역 (Wound area)을 확인하였고, 그 결과를 도 13 및 표 14에 나타내었다.
Relative Wound area(%) | Day 0 | Day 2 | Day 3 | Day 5 | Day 7 |
Control(PBS) | 100 | 71.2±11.40 | 59.6±11.06 | 50.5±7.89 | 29.5±4.62 |
Control-EV | 100 | 63.3±27.42 | 46.6±18.16 | 38.0±14.85 | 18.3±10.22 |
TS-eEV | 100 | 59.1±15.02 | 37.6±15.30 | 29±16.71 | 15.4±4.05 |
도 13 및 표 14에서 확인할 수 있듯이, Control-EV와 TS-eEV 그룹간의 유의미적인 차이는 없었으며, TS-eEV는 Relative Wound area가 15.4%인 것으로 측정되었다. TS-eEV는 Relative Wound area가 29.5%인 것으로 측정된 Control(PBS) 대비 약 -48.0% 더 감소시키는 것으로 보아, 상처 치유능이 향상되었다. 또한, Relative Wound area가 18.3%인 것으로 측정된 Control-EV 대비 약 -15.8% 더 감소시키는 것으로 보아, TS-eEV는 Control-EV 보다도 상처 치유능이 향상되었다.
실험예 4. 억제자 분석 (inhibitor assay)
세포에 BAPTA-AM (calcium-selective chelator) 50 uM을 1h, ALLM (calpain inhibitor) 10 uM을 18h pre-treatment 한 후, 각 방법에 따른 EV 생산량을 비교하여 그 결과를 도 14a, 14b 및 표 15에 나타내었다.
EV production (particle number/cell) |
EV production (particle number/min) |
|
Control-EV | 8.14 x 102±1.99 x 102 | 4.98 x 10-1±2.55 x 10-1 |
eEV | 3.02 x 103±2.45 x 10 | 2.01 x 102±1.63 |
S-eEV | 5.20 x 103±2.51 x 103 | 3.47 x 102±1.67 x 10 |
T-eEV | 6.92 x 103±3.181 x 102 | 4.62 x 102±2.12 x 10 |
TS-eEV | 1.97 x 104±1.31 x 103 | 1.31 x 103±8.77 x 10 |
TS-eEV with BAPTA-AM | 7.34 x 103±9.08 x 102 | 4.89 x 102±6.06 x 10 |
TS-eEV with ALLM | 8.25 x 103±9.96 x 102 | 5.50 x 102±6.64 x 10 |
도 14a, 14b 및 표 15에서 확인할 수 있듯이, TS-eEV를 isolation 한 결과 억제자 (inhibitor)인 BAPTA-AM 또는 ALLM을 처리한 그룹은, 그렇지 않은 그룹에 비하여 EV 수득량이 60% 이하로 감소하였고, EV 생산 속도가 감소된 것으로 보아, 칼슘 이온 (BAPTA-AM_calcium chelator)의 작용과 calpain 효소 (ALLM_calpain inhibitor)는 TS-eEV의 생성에 중요한 역할을 하는 것으로 판단된다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University
Konkuk University Industrial Cooperation Corp.
<120> METHOD FOR MASS PRODUCTION OF HIGH-PURITY EXTRACELLULAR VESICLES
DERIVED FROM STEM CELLS USING PEPTIDES
<130> PN200351
<160> 11
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> eMTD
<400> 1
Lys Leu Asn Phe Arg Gln Lys Leu Leu Asn Leu Ile Ser Lys Leu Phe
1 5 10 15
Cys Ser Gly Thr
20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miNOS Forward primer sequence
<400> 2
gagacaggga agtctgaagc ac 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miNOS Reverse primer sequence
<400> 3
ccagcagtag ttgctcctct tc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCOX2 Forward primer sequence
<400> 4
ttccagccca ttgaacctgg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mCOX2 Reverse primer sequence
<400> 5
gctacgaaaa cccaatcagc g 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mIL-6 Forward primer sequence
<400> 6
taccacttca caagtcggag gc 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mIL-6 Reverse primer sequence
<400> 7
ctgcaagtgc atcatcgttg ttc 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mIL-1 beta Forward primer sequence
<400> 8
aaattgggcc atgaggctcc 20
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mIL-1 beta Reverse primer sequence
<400> 9
gttgagaggg ctagtgagaa gg 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mTNF-alpha Forward primer sequence
<400> 10
ggtgcctatg tctcagcctc tt 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mTNF-alpha Reverse primer sequence
<400> 11
gccatagaac tgatgagagg gag 23
Claims (19)
- 다음의 단계를 포함하는 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 생산 방법:
중간엽줄기세포를 전배양하는 제1배양 단계; 및
전배양한 중간엽줄기세포를 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose) 및 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]를 포함하는 배지 조성물에서 배양하는 제2배양 단계. - 제1항에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 골수, 배아, 탯줄, 근육, 지방 및 신경 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유래를 갖는 것인, 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄로부터 유래된 중간엽줄기세포 (Wharton's jelly-derived MSCs, WJ-MSCs)인 것인, 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1배양 단계는 중간엽줄기세포에 트립신을 처리하는 트립신 처리 단계를 더 포함하는 것인, 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제2배양 단계는 부유 배양을 통해 수행하는 것인, 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 제2배양 단계는 5 내지 30분 동안 수행하는 것인, 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물에 포함되는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 농도는 0.1 내지 5.0 uM인 것인, 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물에 포함되는 글루코스의 농도는 1 내지 10 mM인 것인, 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물에 포함되는 수크로스의 농도는 200 내지 300 mM인 것인, 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 배지 조성물에 포함되는 MOPS 농도는 1 내지 20 mM인 것인, 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포를 분리하는 분리 단계를 추가로 포함하는 것인, 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포의 생산 방법.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose) 및 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]로 전처리된 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose) 및 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]로 전처리된 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포를 포함하는 상처 완화, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄로부터 유래된 중간엽줄기세포 (Wharton's jelly-derived MSCs, WJ-MSCs)인 것인, 상처 완화, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose) 및 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]로 전처리된 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포를 포함하는 염증성 질환의 완화, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제15항에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄로부터 유래된 중간엽줄기세포 (Wharton's jelly-derived MSCs, WJ-MSCs)인 것인, 염증성 질환의 완화, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 염증성 질환은 아토피 피부염, 부종, 피부염, 알레르기, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군 (sjogren's syndrome) 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 염증성 질환의 완화, 억제 또는 치료용 약제학적 조성물.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 글루코스 (glucose), 수크로스 (sucrose) 및 MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]로 전처리된 중간엽줄기세포 유래 세포외 소포를 포함하는 식품 조성물.
- 제18항에 있어서, 중간엽줄기세포는 탯줄로부터 유래된 중간엽줄기세포 (Wharton's jelly-derived MSCs, WJ-MSCs)인 것인, 식품 조성물.
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200174891A KR102424333B1 (ko) | 2020-12-14 | 2020-12-14 | 펩타이드를 이용하는 줄기세포 유래 고순도 세포외 소포체의 대량 생산 방법 |
US18/267,230 US20240043797A1 (en) | 2020-12-14 | 2021-12-10 | Method for mass production of highly pure, stem cell-derived extracellular vesicle by using peptide |
PCT/KR2021/018761 WO2022131700A1 (ko) | 2020-12-14 | 2021-12-10 | 펩타이드를 이용하는 줄기세포 유래 고순도 세포외 소포체의 대량 생산 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200174891A KR102424333B1 (ko) | 2020-12-14 | 2020-12-14 | 펩타이드를 이용하는 줄기세포 유래 고순도 세포외 소포체의 대량 생산 방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20220084929A KR20220084929A (ko) | 2022-06-21 |
KR102424333B1 true KR102424333B1 (ko) | 2022-07-22 |
Family
ID=82059256
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020200174891A KR102424333B1 (ko) | 2020-12-14 | 2020-12-14 | 펩타이드를 이용하는 줄기세포 유래 고순도 세포외 소포체의 대량 생산 방법 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20240043797A1 (ko) |
KR (1) | KR102424333B1 (ko) |
WO (1) | WO2022131700A1 (ko) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20190116858A (ko) * | 2018-04-05 | 2019-10-15 | 주식회사 엑소코바이오 | 줄기세포 유래의 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 염증후 과색소침착의 예방, 완화, 감소 내지는 제거 용도 |
KR102176845B1 (ko) * | 2018-10-02 | 2020-11-10 | 주식회사 스템온 | 유도된 엑소좀을 포함하는 피부 재생 및 상처 치유용 조성물 |
KR102189574B1 (ko) * | 2019-01-28 | 2020-12-11 | 조선대학교산학협력단 | 녹사 단백질 유래 세포사 유도 펩타이드 eMTD |
KR102260525B1 (ko) * | 2019-11-15 | 2021-06-03 | 주식회사 엑소코바이오 | 줄기세포 유래 엑소좀과 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 새로운 조성물 |
-
2020
- 2020-12-14 KR KR1020200174891A patent/KR102424333B1/ko active IP Right Grant
-
2021
- 2021-12-10 WO PCT/KR2021/018761 patent/WO2022131700A1/ko active Application Filing
- 2021-12-10 US US18/267,230 patent/US20240043797A1/en active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, VOL. 291, NO. 48, P. 25207_25216, NOVEMBER 25, 2016 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20240043797A1 (en) | 2024-02-08 |
KR20220084929A (ko) | 2022-06-21 |
WO2022131700A1 (ko) | 2022-06-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20190276803A1 (en) | Method of culturing immune cells, kit for thereof, immune cell cultured medium obtained by same method, cosmetic composition and pharmaceutical composition comprising thereof | |
KR102105532B1 (ko) | 만능 줄기세포의 유도 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포 | |
JP7449590B2 (ja) | 間葉系幹細胞由来のエキソソーム生産方法およびこれから製造された培養液 | |
US9962433B2 (en) | Method for preparing an immunogenic lysate, the lysate obtained, dendritic cells loaded with such lysate and a pharmaceutical composition comprising the lysate or the dendritic cells | |
US20180078581A1 (en) | Exosomes Sourced from Granulocytic Myeloid-derived Suppressor Cells and Application thereof | |
KR102253418B1 (ko) | 피부 유산균 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 제조방법 | |
EP3725296A1 (en) | Cosmetic composition and pharmaceutical composition for alleviating atopic dermatitis, hair loss, and wounds or reducing skin wrinkles | |
NZ727950A (en) | Mesenchymal stromal cells for treating sepsis | |
US20190307794A1 (en) | Method for inducing transdifferentiation of immune cells based on exosomes | |
JP2023075260A (ja) | 幹細胞由来エクソソーム生成促進及び幹細胞能増強用組成物 | |
WO2021200299A1 (ja) | 細胞老化抑制剤、生体組織修復促進剤、遺伝子発現調節剤及び製造方法 | |
CN113699103A (zh) | 一种禽类间质干细胞外泌体的诱发增援制备工艺及应用 | |
KR101564325B1 (ko) | 지방유래줄기세포에 t항원을 도입한 adsc-t 세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물 | |
WO2024012540A1 (zh) | 日本血吸虫虫卵及其分泌排泄蛋白抗肿瘤的作用及制备和用途 | |
KR102424333B1 (ko) | 펩타이드를 이용하는 줄기세포 유래 고순도 세포외 소포체의 대량 생산 방법 | |
KR20120069221A (ko) | 봉독조성물 | |
CN111748523A (zh) | 一种免疫调节小胞外囊泡的制备方法及其用途 | |
WO2019235789A1 (ko) | 편도 유래 중간엽 줄기세포의 조정 배지를 포함하는 이식편대숙주 질환 예방 혹은 치료용 조성물 | |
WO2007111535A1 (fr) | Composition immunomodulatrice | |
Zhang et al. | Human menstrual blood-derived stem cells alleviate autoimmune hepatitis via JNK/MAPK signaling pathway in vivo and in vitro | |
CN111481565A (zh) | 戈氏副拟杆菌的脂多醣用于抑制发炎反应的医药组合物的用途 | |
RU2799432C1 (ru) | Способ получения экзосом, происходящих из мезенхимальных стволовых клеток, и культурального раствора, продуцированного из них | |
KR20190015106A (ko) | 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 비알콜성 단순 지방간 또는 비알콜성 지방간염의 개선 용도 | |
WO2022055238A1 (ko) | 경막외 지방 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 골 질환 치료용 조성물 | |
CN114224915A (zh) | M2型巨噬细胞外泌体在治疗骨质疏松症药物制备中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant |