KR20120069221A - 봉독조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체 활성화에 효과적인 봉독조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간, 가축류, 어류, 가금류 등의 생체에 대하여 질병 예방과 치료 및 면역기능 향상의 효과를 제공하며, 항생제에 내성이 없고, 안전하게 사용할 수 있으며, 기존의 항생제 대체제에 비해 증체율 및 면역기능을 향상시킬 수 있는 봉독조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 봉독조성물는 봉독을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

봉독조성물{BEE VENOM COMPOSITION}

본 발명은 생체 활성화에 효과적인 봉독조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인간, 가축류, 어류, 가금류 등의 생체에 대하여 질병 예방과 치료 및 면역기능 향상의 효과를 제공하며, 항생제에 내성이 없고, 안전하게 사용할 수 있으며, 기존의 항생제 대체제에 비해 증체율 및 면역기능을 향상시킬 수 있는 봉독조성물에 관한 것이다.

봉독은 벌 복부 끝 독낭(毒囊)에 저장되어 봉침과 연결되어 자극 시에 분비되는 동물성 천연생리 활성물질로서 이 봉독을 이용한 치료는 이집트, 바빌로니아에서 치료목적으로 사용되었다는 기록이 남아 있으며, 히포크라테스도 봉독을 “신비한약”으로 표현하고 있다.

우리나라에서도 마왕퇴백서(최초의 침구학문헌), 동의보감, 민간요법에서 생봉침을 통증 및 류마티스 관절염 치료에 이용하였다는 기록이 남아 있다.

이런 봉독은 염증유발 동물의 부종을 감소시키고, 관절염 환자의 활막세포에 작용하여 그 주성분 멜리틴(melittin)이 NF-kB를 비활성화시킴으로써 NO의 양을 감소시키며 COX-2를 억제하여 항염증효과를 유발하는 것으로 알려져 있다.

봉독의 성분을 분리 정제하여 치매나 암치료에 이용하는 등의 봉독처리 후 효과를 확인하는 생리적 연구나 건조봉독의 성분분석에 대한 연구결과는 이미 보고되어 있다.

한의학에서는 염증 질환의 치료제로 오랫동안 사용되어 왔으며 봉독의 항염증 효과와 항암 효과에 대해서 연구하고 있다.

봉독을 이용한 동물의 관절염 또는 항염증 치료제 개발 연구는 이미 농진청을 비롯한 많은 정부기관에서 수행된 바 있다.

이와 같이 봉독은 많은 치료 경험 과정에서 면역증강 효능이 비교적 자주 관찰되나 이 효능에 맞는 봉독시료의 규격화 및 조성물의 표준화가 온전히 이루어지지 않아 그동안 면역기능 강화 기능성 약물로서 구체적, 실용적 연구결과물이 도출되지 못했다는 문제가 있다.

특히 봉독 자체의 다양한 질환의 치료 내지는 면역기능 향상 및 증체율을 증대시키는 것에 대한 연구는 아직 추진되지 않고 있는 실정이어서, 봉독의 건조과정에서 초래되는 일부 활성 물질의 소실, 변성에 대한 연구와 멜리틴을 포함한 봉독의 유효성분들을 표준화하여 안정적이고 효과적인 신개념 치료제를 개발할 필요가 있다.

한편, 항생제는 살아있는 유기물에서 추출한 것으로 다른 미생물의 생장을 억제하거나 죽이는 물질을 말한다. 지금까지 4천여 가지 이상의 항생제가 발견됐고 현재 50 여종이 실제 임상에서 사용되고 있다.

1929년 페니실린의 발견과 함께 시작된 항생제 시대는 항생제 과용 등에 의해 급속도로 증가하고 있는 기존 항생제에 대한 내성균주의 출현과 함께 끝나가고 있는 것처럼 보이며, 이들 슈퍼 버그에 대해서는 더 이상 치료제가 없는 지경에 이르러, 항생제 내성에 대한 우려가 높아가고 있다.

특히 식용으로 사육되는 가축류 및 가금류의 경우, 내성균에 감염된 동물을 재료로 한 식육 가공품에 대한 문제성이 날로 심각해지고 있다.

전 세계적으로 광범위한 항생제 남용, 부정확한 진단 및 불필요한 항생제 처방 등의 항생제 과다 사용으로 인한 항생제 내성 미생물 발생으로 인해 유럽에서는 2006년에 우리나라는 2012년에 항생제 사료혼합을 전면금지 하기로 하였다.

이러한 항생제의 대체제로서 효소제, 허브추출 에센셜 오일, 유기산, 젖산(lactic acid) 및 프로폴리스(propolis) 등에 관해 다양하게 연구가 이루어지고 있으나, 대체로 항생제에 비해 증체 효과 및 면역기능 증강의 면에서 효능이 떨어지고 경제성이 적어 사용이 어렵다는 문제가 있다.

이에 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 생체에 투여할 경우 체중 증가율이 월등히 증가하고, 각종 질병의 예방 및 치료를 할 수 있으며 면역기능을 향상시키는 봉독조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 기존의 항생제 대체제에 비해 경제성 및 효능이 우수한 봉독조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따른 봉독조성물은 봉독을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 봉독조성물에 있어서 봉독은 상기 봉독조성물 100 중량부에 대하여 0.01~4 중량부인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 봉독조성물은 사포닌 및/또는 알파-파이넨을 더욱 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 봉독조성물에 있어서 상기 사포닌은 0.01~5 중량부이고, 상기 알파-파이넨은 0.01~1 중량부인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 봉독조성물은 프로필렌글리콜, 에탄올, 소르빈산 중에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상이 더욱 포함되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 봉독조성물은 상기 프로필렌글리콜은 0.01~2 중량부이고, 상기 에탄올은 0.01~2 중량부이며, 상기 소르빈산은 0.001~0.1 중량부인 것을 특징으로 한다.

이상과 같은 구성의 본 발명에 따른 봉독조성물에 의하면 생체에 대한 증체율을 현저히 높이고, 각종 질병에 대한 예방 및 치료 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 봉독조성물에 의하면 항생제에서 발생하는 내성이 없고, 장기간 사용하더라도 안정성을 확보할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 봉독조성물에 의하면 기존 항생제 대체제에 비해 질병 예방 및 치료효과가 우수하고 경제적인 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 봉독조성물에 있어서, 생봉독과 건조봉독의 분석과정을 도시하는 순서도이다.
도 2는 본 발명에 따른 봉독조성물을 SDS-PAGE하여 분리된 단백질들의 이미지이다.
도 3은 본 발명에 따른 봉독조성물의 이차원 전기 영동하여 분리된 단백질들의 이미지이다.
도 4는 본 발명에 따른 봉독조성물에 있어서, 2D gels에서 분리된 봉독의 단백질 성분을 요약한 데이터이다.
도 5는 본 발명에 따른 봉독조성물에 있어서, SDS-PAGE gels에서 분리된 봉독의 단백질 성분을 요약한 데이터이다.
도 6은 본 발명에 따른 봉독조성물에 있어서, 봉독과 그 용매 분획의 추출공정을 나타내는 개략도이다.
도 7은 본 발명에 따른 봉독조성물이 육계의 체중 증가에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 봉독조성물이 육계의 비장 무게 변화에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 봉독조성물의 육계의 림프구 증식능에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 10(a) 및 (b)는 육계의 비장에서 분리한 림프구에서 B cell과 T cell의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 11(a), (b) 및 (c)는 육계의 비장에서 분리한 림프구(help T cell)에서의 CD4⁺:CD8⁺비율을 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따른 봉독조성물이 육계의 혈중 lysozyme의 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 13(a), (b) 및 (c)는 본 발명에 따른 봉독조성물을 투여한 육계의 비장에서 m-RNA를 추출하여 사이토카인 (IL-4, IL-18 그리고 IFN-gamma)의 발현능에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 14는 본 발명에 따른 봉독조성물이 정제봉독의 시험관 내에서의 항균 효과를 나타내는 사진이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명의 봉독조성물은 봉독을 유효성분으로 포함하는 것이다.

봉독은 꿀벌의 산란관에서 나오는 독액으로서, 생(生)봉독, 건조봉독, 봉독 추출물 및 정제봉독을 포함하는 것이다.

봉독에는 멜리틴(Melittin), 아파민(Apamin), 비반 세포 과립 감소 펩티드 (MCD-Peptide, Mast Cell Degranulation Peptide, Op), 단백효소 억제제(Protease Inhibitor), 세카르핀(Secarpin), 터치아핀(Tertiapin), 프로카민(Procamine) 등 다양한 펩티드(Peptides)를 함유하고 있다.

생봉독은 건조 또는 정제과정을 거치지 않은 것으로서, 비중이 1.1 내지 1.3, 산도(pH)가 5.2 내지 5.5 범위이고, 75%는 단백질 또는 펩타이드로 이루어진다.

봉독 추출물은 생봉독에서 펩티드 등을 포함하는 유효성분을 분리, 추출하여 얻을 수 있다.

봉독 추출물은 당업계에 공지된 다양한 추출 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 물, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 아세톤, 에틸 아세테이트, 부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 얻을 수 있다.

보다 바람직하게는 봉독을 물로 현탁하고, 에틸 아세테이트를 용매로 수회 추출하고, 분리된 수층을 다시 부탄올(butanol)로 추출하며, 각층을 감압 농축하여 분획을 얻는 것이다.

봉독 1g에 대하여 용매는 50~150ml인 것이 바람직하다.

정제봉독은 상술한 추출 용매에 의한 추출물 이외에 통상적인 정제 과정을 거쳐 얻거나, 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피에 의한 분리, 정제방법에 의해 정제된 봉독을 포함하는 것이다.

봉독은 봉독조성물 100 중량부에 대하여 0.01~4 중량부인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.1~1.0인 것이다.

그리고 봉독이 0.01 중량부 미만인 경우에는 생체의 증체율 및 면역기능을 향상시키는 효과가 미미하고, 4중량부를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미약하다.

본 발명의 조성물은 생체의 증체율 및 면역기능을 향상을 위하여 사포닌 0.01~5 중량부를 더욱 포함하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.07~0.4 중량부를 포함하는 것이다.

사포닌(saponin)은 식물계에 존재하는 배당체에서 당이 아닌 부분이 여러 고리 화합물로 이루어진 것으로서, 강심제나 이뇨제로서 강한 작용이 있으며, 어느 것이나 세포에 대해서는 표면 활성제로서 작용하여, 세포막에서의 물질의 투과성을 높이기도 한다.

특히 본 발명에서는 점안제의 형태로 본 발명의 봉독조성물을 투여하는 것이 투약의 효과를 향상시킬 수 있고, 이러한 현상은 사포닌을 첨가함으로써 더욱 증대시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 알파-파이넨(α-pinene) 0.01~1 중량부를 더욱 포함하는 것이 바람직하다.

알파-파이넨은 소나무, 약쑥, 쑥갓, 후추 등에서 추출할 수 있으며, 테르펜(terpene) 계열의 화합물로 (IR, 5R)-(-)-alpha-pinene과 (ISR, 5S)-(-)-alpha-pinene) 두 가지 이성질체 구조를 가지고 있다.

알파-파이넨은 항균 효과, 항진균 효과, 진정 효과, 항스트레스 효과가 있고, 면역관련 질병에 특히 효과가 있으며, 특히 호염증성 사이토카인의 생산에 중요한 역할을 한다.

사포닌 및 알파-파이넨은 공지된 추출방법을 다양하게 이용할 수 있고, 수증기증류법, 압착법 또는 용제추출법을 이용해 추출할 수 있다.

본 발명의 조성물은 프로필렌글리콜 0.01~2 중량부, 에탄올 0.01~2 중량부 및 소르빈산 0.001~0.1 중량부를 더욱 포함할 수 있다.

상기 프로필렌글리콜, 에탄올, 소르빈산은 봉독의 유효성분을 장기간 보관할 수 있도록 첨가될 수 있다.

프로필렌글리콜은 화학식 C₃H₈O₂이고, 비중은 1.036~1.04이며, 끓는점은 185~189℃이다. 프로필렌글리콜은 용해력이 우수하고, 곰팡이의 번식을 방지하며, 발효되지 않는 특성으로 인해 본 발명의 조성물을 장시간 보관할 수 있도록 해준다.

소르빈산은 화학식 C₆H₈O₂이고, 녹는점은 134.5℃정도로서, 사상균, 효모, 호기성 세균 등의 미생물 발육을 저해한다.

에탄올은 분자식이 C₂H₅OH이고, 마취성이 있어 동물의 중추신경에 대한 영향력과 봉독을 장기간 보관하기 위해 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 점안제 또는 접안제 및 피하 주사제로 제조하여, 이를 생체에 접종할 수 있고, 점안제나 주사제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제 및 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 생체 즉, 인간, 가축류, 가금류, 어류 등에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 또한 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제와 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 상기 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름이 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다.

먼저, 생봉독과 건조봉독의 성분을 비교 분석하기 위해 프로테오믹스(proteomics)기법에 의해 특정 단백질을 분석하였다.

동일 양의 생봉독과 건조봉독을 2차원 전기 영동법을 통해 분리하여 생봉독 또는 건조봉독에 특이적으로 존재하는 단백질을 확인하였다.

도 1은 본 발명에 따른 봉독조성물에 있어서, 생봉독과 건조봉독의 분석과정을 도시하는 순서도이고, 도 2는 생봉독과 건조봉독의 SDS-PAGE하여 분리된 단백질들의 이미지로서, 도시된 바와 같이 겔 영동 장치인 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Poluacrylamide Gel Electrophoresis)에 의해 단백질을 분리하였다.

그리고, 도 3은 건조봉독과 생봉독의 이차원 전기 영동에 의해 분리된 단백질의 특이 스팟을 표시한 이미지로써, 생봉독 특이 스팟 15개(분홍색 표시)와 생봉독과 건조봉독 공통스팟 7개(푸른색 표시)를 찾아냈다.

그리고 이를 오려내어 트립신으로 단백질을 가수분해하여 폴리펩티드 조각들을 제조하였다.

도 4는 2D gels에서 분리된 봉독의 단백질 성분 요약한 데이터로서, 파란색으로 표시된 것은 생봉독과 건조봉독에 공통 스팟에 대한 데이터이다. 스팟 번호(Spot No.) 1, 2, 4, 8, 10, 14, 17, 19 에 기재된 단백질 성분은 생봉독에서만 발견된 것으로서, 생봉독과 건조봉독에 포함된 단백질에 차이가 있음을 알 수 있다.

도 5는 SDS-PAGE gels에서 분리된 봉독의 단백질 성분을 요약한 데이터로서, 생봉독 및 건조봉독 각각 melittin 성분이 함유되어 있으나, 스팟 번호 A, B, C, D, E 는 생봉독에만 포함된 단백질임을 확인할 수 있다.

실시예1 . 봉독으로부터 분획물 및 봉독조성물의 제조

도 6은 봉독과 용매 분획의 추출하는 공정을 나타내는 개략도로서, 도시된 바와 같이 봉독 5g을 물 500ml로 현탁하여 separating funnel에 넣었다.

EtOAc (ethyl acetate)500mL로 3회 추출하였다. 수층을 다시 n-BuOH(butanol) 500ml로 2회 분배 추출하였고, 각층을 감압 농축하여, EtOAc 분획(BVE, 420mg), n-BuOH 분획(BVB, 820mg), H₂O 분획(1.2g) 및 잔사 (2.5g)를 얻었다.

상기 EtOAc 분획 420mg과 n-BuOH 분획 820mg을 혼합하여 정제봉독을 제조하고, 정제봉독을 물과 혼합하여 고농도 (8,400 ug/ml), 중농도 (2,100 ug/ml), 저농도 (420 ug/ml)의 농도별로 본 발명의 봉독조성물을 제조하였으며, 이를 하기 실험예 1 내지 3의 시료로 사용하였다.

한편, 얻어진 각 분획에 대하여 TLC(Therapeutic Lifestyle Change)로 성분 profile을 조사하였다.

EtOAc 분획은 약 5종의 주요성분이 존재하는 것으로 나타났으며, UV 흡수가 없고 황산분무 후 가열하였을 때에 황색으로 발색되어 aliphatic 화합물로 추정된다.

n-BuOH 분획은 fructose 외에 UV 흡수를 보이는 3종의 화합물이 존재하는 것으로 나타났다.

물층은 대부분 fructose 이나 n-BuOH 분획과 마찬가지로 UV 흡수를 보이는 3종의 화합물이 존재하는 것으로 나타났다.

실험예1 . 실험방법 및 정제봉독의 투여

1일령 육계 병아리 (Ross) 101마리를 입사하여, 사료와 물을 자유 급식하며 4주간 사육하였다.

정제봉독의 투여 적정 농도를 확인하기 위해 실시예 1에서 제조한 고농도 (8,400 ug/ml), 중농도 (2,100 ug/ml), 저농도 (420 ug/ml) 각각을 육계에 접안(10ul)과 피하(100ul)로 나누어 투여하였다.

정제봉독의 투여의 적정 횟수를 확인하기 위해 2회 또는 4회 1주일 간격으로 투여를 실시하였다.

즉, 2회 투여 군은 입사 후 1일과 8일 후 각각의 농도와 투여 경로에 따라 정제봉독의 접종을 실시하였고, 4회 투여 군은 입사 후 1, 8, 15 그리고 22일에 각각의 농도와 투여 경로에 따라 정제봉독의 접종을 실시하였다.

도 7 내지 도13의 그래프에 표시된 각 부호의 의미는 다음과 같다.

** Control : 정제봉독 무투여군.

** OL2 : 접안을 통한 저농도(Low Conc.)의 정제봉독 2회 투여군.

** OM4 : 접안을 통한 중농도(Middle Conc.)의 정제봉독 4회 투여군.

** SH4 : 피하조직을 통한 고농도(High Conc.)의 정제봉독 4회 투여군.

(Control군을 제외하고 모두 12종류의 정제봉독 투여군을 실험함)

** (n=18) : 대조군 육계의 개체 수 18마리

** ↗ : 유의성 있게 증가

실험예2 . 육계의 증체 효과 비교

정제봉독 투여에 따른 육계의 체중 증가를 비교 분석하기 위해, 4주간 사료와 식수를 자유급여 하였고, 그 결과를 도 7의 그래프에 도시하였다.

도 7에 도시된 바와 같이, 전 개체의 체중을 전자저울로 측정한 결과 Control군 (무투여군: 841 ± 71g)에 비해 정제봉독 투여군 모두에서 유의성 있게 체중이 증가하였다.

특히 OM4 (접안을 통한 중농도 4회 투여군: 1114 ± 80g)와 OH4 (접안을 통한 고농도의 4회 투여군: 1117 ± 113g)군에서 평균 체중이 가장 많이 증가하였다.

실험예3 . 육계의 면역 증가 효과 비교

3-1. 닭의 비장 무게 변화

정제봉독의 투여가 육계의 면역력 향상에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 육계의 비장의 무게를 측정하였고, 그 결과를 도 8의 그래프에 도시하였다.

도 8에 도시된 바와 같이, 정제봉독 투여에 따른 육계의 면역장기 (비장) 무게를 측정한 결과, Control (무투여군: 0.968 ± 0.115g)에 비해 접안을 통한 4회 투여군들에서 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보여주었으며, OH4군 (접안을 통한 고농도의 4회 투여군: 1.268 ± 0.228g)에서 유의적으로 증가하였다.

3-2. 림프구 증식능 평가

정제봉독 투여에 따른 육계의 림프구 증식능을 비교 분석하기 위해, 각 군의 육계로부터 비장을 채취하였다.

채취된 비장은 다시 무균 상태에서 림프구 분리에 사용되었으며, 분리된 림프구를 이용하여 본 실험을 수행하였다.

살아있는 림프구의 수는 trypan blue로 염색 후, 현미경하에서 측정 및 그 수를 계산하였고, 최종적으로 1X10⁶ cells/ml의 농도로 RPMI-1640 배지에 희석하였다.

96-well cell culture plate의 각 well에 100ul씩 희석된 세포를 분주 후, ConA (5ug/ml) 또는 LPS (50ug/ml)가 첨가된 RPMI-1640 배지를 100ul씩 추가로 넣어주거나 또는 mitogen이 무(無)첨가된 배지를 100ul씩 첨가하여 41^oC, 5% CO₂의 조건으로 48시간 동안 배양하였다.

48시간 동안 배양된 세포의 각 well에 MTT (5mg/ml)용액 20ul씩을 첨가한 후, 다시 41^oC, 5% CO₂의 조건으로 4시간을 더 배양하였다.

배양 종료 후, 상층액을 모두 제거하고 각 well당 200ul씩의 DMSO를 넣어 모든 세포가 녹은 후, 540nm에서 흡광도를 측정하여 림프구의 증식능을 비교하였고, 그 결과를 도 9의 그래프에 도시하였다.

도 9에 도시된 바와 같이, 이 림프구의 증식능은 mitogen 무첨가시, 각 군에서 차이를 보이지 않았으나, LPS (B cell mitogen)와 ConA (T cell mitogen)로 자극시, Control군 (LPS: 0.614 ± 0.02, ConA: 0.601 ± 0.05)에 비해 OM4군 (LPS: 1.030 ± 0.09, ConA: 1.032 ± 0.09)의 증식능이 유의적으로 가장 크게 증가하였다.

3-3. 비장 내 세포의 비율 비교

비장에서 분리한 림프구의 비율을 유세포 분석기를 이용하여 비교 분석하였다.

비장 적출 후 cell strainer를 이용하여 세포를 유리시킨 후, RBC lysis buffer에 10분간 현탁하여 적혈구를 파괴하였다.

다음으로, 2,500rpm에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거하고 PBS로 원심 세척하여 림프구의 수를 5.0×10⁶cell/㎖의 농도로 희석하였다.

FITC anti-chicken CD3 (total T cell)와 PE anti-chicken BU-1 (B cell)또는 FITC anti-chicken CD4 (help T cell)와 PE anti-chicken CD8 (cytotoxic T cell)의 항체로 암실에서 30분간 반응시켜 염색하였다.

반응 후에 2회 원심 세척하고 PBS 1ml를 분주하여 유세포분석기 (FACSCalibur FACS, BD Biosciences, USA)를 이용하여 비장내 림프구의 비율을 측정하였고, 그 결과를 도 10 내지 도 11의 그래프에 도시하였다.

도 10(a),(b) 내지 도 11(a),(b),(c)에 도시된 바와 같이, B cell과 T cell의 비율에는 군별 큰 변화가 없었다.

help T cell의 비율에 있어 control군 (6.80±2.98 %)에 비해 접안을 통한 4회 투여군들 모두에서 증가하는 경향을 보였으며, 특히 OM4 (19.08 ± 4.00%)의 help T cell 비율이 가장 큰 증가를 보였다.

뿐만 아니라, cytotoxic T cell의 비율 또한 control군 (54.83 ± 11.10 %)에 비해 OM4 (41.41 ± 4.19%)의 비율이 현저히 줄어든 것을 확인할 수 있었다.

따라서 CD4⁺:CD8⁺ ratio를 분석하여 보면, 도 11에 도시된 바와 같이 control군 (0.13 ± 0.08)에 비해 OM4군 (0.47 ± 0.14)에서 가장 큰 증가를 보였다.

3-4. 혈중 리소자임 ( lysozyme ) 활성 비교

Crystral lysozyme의 세균에 대한 분해 정도를 Strandard curve로 사용하여, 대조군과 정제봉독 투여군들의 혈청 lysozyme 농도를 비교 측정함으로써 대식 세포의 활성을 평가하였다.

혈청 중 lysozyme 활성을 측정하기 위해 crystalline lysozyme을 0.5, 1, 2, 3, 4, 5ug/ml의 농도로 녹여서 standard로 준비하였다.

96-well plate의 각 well에 200ul씩의 M. lysodeikticus용액을 넣었고, 미리 준비한 standard lysozyme또는 혈청 20ul씩 첨가하였다.

41℃에서 1시간 동안 배양하며 15분 간격으로 흡광도를 측정하였다 (540nm).

시료의 lysozyme 활성 측정은 standard curve에 시료의 시간에 따른 흡광도의 변화를 대입하여 구하였고, 그 결과를 도 12의 그래프에 도시하였다.

도 12에 도시된 바와 같이, 비록 통계적 유의성은 없었으나, Control군에 비해 12군의 정제봉독 투여군 모두에서 평균 lysozyme 활성이 증가하는 경향을 보인다는 것을 확인할 수 있었다.

3-5. 사이토카인 mRNA 발현 정도의 비교

Control군(대조군)과 정제봉독 투여군들의 비장으로부터 m-RNA를 추출하여 Real-time PCR을 이용하여 사이토카인 (IL-4, IL-18 그리고 IFN-gamma)의 발현능을 측정하였고, 그 결과는 도 13 내지 표 1에 정리하였다.

도 13(a),(b),(c) 내지 표 1에 나타난 바와 같이, 사이토카인 발현 정도에 있어서 Control군(대조군)과 정제봉독 투여군들 간의 유의적인 차이는 없었다.

Target	Accession no.	Nucleeotide sequence(5'→3')
GAPDH Forward	NM_204305	CCTAGGATACACAGAGGACCAGGTT
GAPDH Reverse		GGTGGAGGAATGGCTGTCA
IL-4 Forward	NM_001007079	GCTCTCAGTGCCGCTGATG
IL-4 Reverse		GAAACCTCTCCCTGGATGTCAT
IL-18 Forward	NM_204608	AGGTGAAATCTGGCAGTGGAAT
IL-18 Reverse		TGAAGGCGCGGTGGTTT
IFN-gamma Forward	NM_205149	GCTCCCGATGAACGACTTGA
IFN-gamma Reverse		TGTAAGATGCTGAAGAGTTCATTCG

3-6. 정제봉독의 시험관 내( in vitro )에서의 항균효과 비교

정제봉독의 시험관 내에서(in vitro)의 항균 효과를 알아보기 위해 Salmonella Gallinarum (SG3001)을 대상으로 실시하였다.

양성 대조군으로 Sigma사의 Bee venom (V3375)을 농도 별로 (1,000 ug/ml, 500ug/ml, 250ug/ml)로 사용하였고, 실험군으로는 닭의 면역실험에서 사용한 정제봉독을 농도별로 [고농도 (8,400 ug/ml), 중농도 (2,100 ug/ml), 저농도 (420 ug/ml)] 사용하였으며, 음성 대조군으로는 정제봉독의 용제인 3차 증류수를 사용하였다. 그 결과는 도 14의 사진에 나타난 바와 같이 고농도 정제봉독에서 세균 성장 억제대를 확인할 수 있었다.

4. 결론

봉독의 분무 방식과 접안투여 방식의 결과를 비교 분석하여 적정투여 농도 결정, 안정성 평가, 증체율에 미치는 영향 평가, 면역력 증강 효과(대식세포활성, 면역 세포 증식능, 비장에서의 T 림프구 분포 측정, T 림프구 중 CD4⁺:CD8⁺ 비율, 사이토카인 발현측정 등) 등을 확인한 결과, 봉독이 육계(닭)의 증체율과 면역력 향상에 구체적으로 관여하는 것을 확인할 수 있었다.

표 2는 실험예 2 내지 실험예3(3-1 ~ 3-6)에서 가장 육계의 증체효과 및 면역기능 향상효과가 우수한 실험군을 나타내었다.

그 결과 증체율 및 면역기능면에서 봉독의 유용성분에 대하여 농도의존적으로 유의성있게 증가한다는 것을 확인할 수 있다.

	실험예2	실험예3
		3-1	3-2	3-3	3-4	3-5	3-6
실험예에서 우수한 효과를 나타내는 실험군	OH4군 OM4군	OH4군	OM4군	OM4군	12개 모든 군	유의성 없음	고농도군

도 15는 육계의 증체율에 따른 항생제 대체제로서의 효과를 나타내는 그래프로서, 도시된 바와 같이 항생제, 생균제, 유기산 및 효소 등을 사용한 경우에 비하여 본 발명의 조성물은 육계의 증체율이 현저히 높다는 것을 확인할 수 있다.

또한, 임상실험결과 정제봉독 조성물을 안구를 통해 접종(접안투여)한 닭에서 체중증가(대조군 대비 20%이상) 및 비특이적인 면역증강효과(CD4⁺/CD8⁺ ratio 증가, 대조군 0.13±0.08, 중농도 투여군 0.47±0.14)가 확인되었다.

따라서 양계농장에서 접안 분무백신을 투여할 때 봉독조성물을 함께 사용하면 편리하고 효과적으로 닭의 면역반응을 증가시킬 수 있어 항생제 대체제 뿐만 아니라 양질의 축산물을 개발할 수 있다.

이하 본 발명에 따른 봉독조성물에 있어서, 생봉독 성분의 안정성을 개선시키기 위한 단백질분해효소와 유용물질을 분리시키는 방법을 상세하게 설명한다.

도 4 내지 도 5에 도시된 바와 같이, 봉독은 단백질 분해효소를 포함하고 있으므로 봉독의 건조 및 정제과정에서 단백질의 가수분해가 나타나 유용 단백질의 절편화 또는 불활성화가 일어날 수 있다.

도 16(a), (b)는 나노구조체를 이용한 단백질 분해효소와 유용물질의 분리방법에 대한 개념도로서, 도 16(a)에 도시된 바와 같이 수용액 상태에서는 단백질 분해효소가 펩티드 내지는 단백질 등의 유용물질을 분해시키게 되나, 도 16(b)와 같이 나노구조체를 이용함으로써 단백질 분해효소 및 단백질이 나노구조체에 포집되면 유용물질이 분해되지 않게 된다.

구체적으로는, 상기한 문제점을 해결하기 위하여 단백질 분해효소로 잘 알려진 트립신을 이용하고 이의 기질로서 알부민을 사용하여 나노구조체와 섞은 후 배양하여 단백질의 가수분해가 억제되는지를 확인하는 모델시스템을 이용할 수 있다.

또한, 생봉독의 유용성분인 펩티드 내지 단백질은 PLGA 등의 나노입자로 캡슐화(encapsulation)하여 안정성을 높일 뿐만 아니라, 지속적인 방출(sustained release)이 이루어지도록 가축용 제제(점안제, 또는 분무제)로 제형화함으로써 그 효능을 증강시킬 수 있다.

그리고 날로 심각해지는 축산업계의 항생제 과다 사용의 문제점을 천연물질인 봉독의 유용성분을 규격화하여 재구성함으로써 이 봉독조성물은 항생제 대체물질로서의 역할을 할 수 있다.

이상에서 설명된 본 발명은 예시적인 것에 불과하며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 잘 알 수 있을 것이다. 그러므로 본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 형태로만 한정되는 것은 아님을 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다. 또한, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 그 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (6)

1. 봉독을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 봉독조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 봉독은 상기 봉독조성물 100 중량부에 대하여 0.01~4 중량부인 것을 특징으로 하는 봉독조성물.
3. 제2항에 있어서,
   사포닌 및/또는 알파-파이넨을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 봉독조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 사포닌은 0.01~5 중량부이고, 상기 알파-파이넨은 0.01~1 중량부인 것을 특징으로 하는 봉독조성물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서,
   프로필렌글리콜, 에탄올, 소르빈산 중에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상이 더욱 포함되는 것을 특징으로 하는 봉독조성물.
6. 제5항에 있어서
   상기 프로필렌글리콜은 0.01~2 중량부이고, 상기 에탄올은 0.01~2 중량부이며, 상기 소르빈산은 0.001~0.1 중량부인 것을 특징으로 하는 봉독조성물.

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