KR101418881B1 - 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독과 이를 이용한 비경구 투여용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물과 이를 이용한 비경구 투여용 조성물 및 그 제조방법에 대한 것으로서, 더욱 상세하게는 지용성성분을 적절히 조절한 새로운 조성물을 제공함으로써 동물 또는 사람의 면역을 증강시키고 나아가 건강 개선 및 질병에 대한 예방 치료제로 활용할 수 있는 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물과 이를 이용한 비경구 투여용 조성물 및 그 제조방법에 대한 것이다.
본 발명의 면역 증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물은 봉독을 물로 현탁하고, 에틸 아세테이트를 용매로 수회 추출하고 분리된 수층을 다시 부탄올로 추출하며, 각층을 감압 농축하여 분획하여 얻은 봉독을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 면역증강, 항염증 및 통증치료용 수지봉독 조성물에 의하면 항생제에서 발생하는 내성이 없고, 장기간 사용하더라도 안정성을 확보할 수 있는 효과가 있다.
또한 본 발명에 따른 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 봉독 조성물에 의하면 기존 항생제 대체재에 비해 질병 예방 및 치료 효과가 우수하고 경제적인 효과가 있다.

Description

면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독과 이를 이용한 비경구 투여용 조성물 및 그 제조방법{LIPID WATER SOLUBLE BEE VENOM EXTRACTS FOR IMPROVING IMMUNITY AND FOR CURING INFLAMMATION AND FOR CURING PAIN AND COMPOSITION FOR PARENTERAL MEDICINES AND MANUFACTURING METHOD OF THE SAME}

본 발명은 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독과 이를 이용한 비경구 투여용 조성물 및 그 제조방법에 대한 것으로서, 더욱 상세하게는 지용성성분을 적절히 조절한 새로운 조성물을 제공함으로써 동물 또는 사람의 면역을 증강시키고 나아가 건강 개선 및 질병에 대한 예방 치료제로 활용할 수 있는 면역증강 및 염증, 통증 치료제용 수지봉독과 이를 이용한 비경구 투여용 조성물 및 그 제조방법에 대한 것이다.

본 발명은 동물 및 인체에 적용될 수 있는 면역 증강용 수지봉독 조성물의 제조방법에 대한 것이다. 꿀벌의 산란관에서 나오는 독액을 봉독(Bee Venom)이라 한다.

봉독은 벌 복부 끝 독낭에 저장되어 봉침과 연결되어 자극시에 분비되는 동물성 천연 생리 활성물질로서 이 봉독을 이용한 치료는 이집트, 바빌로니아에서 치료 목적으로 사용되었다는 기록이 남아 있으며, 히포크라테스도 봉독을 "신비한 약"으로 표현하고 있다.

동의보감과 마왕퇴백서(최초의 침구학문헌)에 생봉침을 이용하여 통증 및 류마티스 관절염 통증 치료에 이용하는 내용이 기재되어 있다.

봉독은 관절염 환자의 활막세포에 작용하여 봉독의 주성분 멜리틴(melittin)이 NF-KB((Nuclear factor kappa B)를 비활성화시킴으로써 일산화질소(Nitric Oxide; NO)의 양을 감소시키고 그 결과 싸이클로옥시게나아제-2(Cyclooxygenase-2; COX-2)가 억제되어 항염증 효과가 생긴다.

한의학에서는 봉독을 염증 질환의 치료제로 오랫동안 사용하여 왔으며, 또한 봉독의 성분을 분리 정제하여 치매나 암치료에 이용하기 위한 생리적 연구를 하고 있다.

봉독을 이용한 동물의 관절염 또는 항염증 치료제 개발 연구는 이미 농진청을 비롯한 많은 정부기관에서 수행된 바 있다.

이와 같이 봉독은 많은 치료 경험 과정에서 면역 증강 효능, 항염증 및 통증 치료 효과가 비교적 자주 관찰되나 이 효능에 맞는 봉독 시료의 규격화 및 조성물의 표준화가 온전히 이루어지지 않아 그동안 면역기능 강화 및 통증치료 효과 강화에 대한 기능성 약물로서 구체적, 실용적 연구 결과물이 도출되지 못했다는 문제가 있다.

봉독의 건조과정에서 초래되는 일부 활성물질의 소실, 변성에 대한 연구와 멜리틴을 포함하는 봉독의 지표성분 또는 그 밖에 봉독을 조성하고 있는 유효성분들을 규격화하여 보다 안정적이고 효과적인 신개념 치료에 적용할 수 있는 약제를 개발할 필요가 있다.

한편, 항생제는 살아 있는 유기물에서 추출한 것으로 다른 미생물의 생장을 억제하거나 죽이는 물질을 말한다. 지금까지 4천여 가지 이상의 항생제가 발견되었고 현재 50 여종이 실제 임상에서 사용되고 있다.

1929년 페니실린의 발견과 함께 시작된 항생제 시대는 항생제 과용 등에 의해 증가하고 있는 기존 항생제에 대한 내성 균주(슈퍼 버그)의 출현과 함께 끝나가고 있는 것처럼 보이며, 이들 슈퍼 버그에 대해서는 더 이상 치료제가 없는 지경에 이르러 항생제 내성에 대처할 수 있는 항생제 대체제에 대한 관심이 높아지고 있다.

특히 식용으로 사육되는 가축류 및 가금류의 경우, 내성균에 감염된 동물을 재료로 한 식육 및 그 가공품에 대한 문제가 날로 심각해지고 있다.

전 세계적으로 광범위한 항생제 남용, 부정확한 진단 및 불필요한 항생제 처방 등의 항생제 과다 사용으로 인한 항생제 내성 미생물 발생으로 인해 유럽에서는 2006년에, 우리나라는 2012년에 산업동물의 사료에 항생제 혼합이 전면 금지되었다.

이러한 항생제 대체제로서 효소제, 허브추출 에센셜 오일, 유기산, 젖산(lactic acid) 및 프로폴리스(propolis) 등에 관해 다양하게 연구가 이루어지고 있으나, 대체로 항생제에 비해 증체, 치료 효과 및 면역력 증강 등의 면에서 효능이 떨어지고 경제성이 적어 사용이 어렵다는 문제가 있었다.

또한 이러한 항생제의 일종으로서 봉독을 사용한다고 할 때 이하와 같은 문제가 발생할 수 있다.

즉, 살아있는 꿀벌로부터 액체상태의 봉독을 직접 쏘도록 유도하거나 또는 꿀벌의 독이 포함된 벌의 침을 별도로 분리하여 환부에 직접 작용시키는 종래의 생봉침에 대한 시술의 형태는 그 봉독 성분의 투여량을 조절하기 어렵다. 또한 벌의 연령과 채취시기에 따른 봉독 성분들의 변화 때문에 유효 성분의 정량적 규격화와 지속적으로 동일한 봉독의 적용이 어려워 봉독의 작용에 따른 정확한 효과를 기대하기 어렵다.

따라서 전기적인 자극을 통해 봉독을 생산하는 벌들의 독을 모으는 봉독 채취기를 사용해서 채집된 건조 분말 형태의 봉독을 정제하고, 정제된 용제를 주사하는 방식을 사용한다. 이와 같이 주사하는 방식을 비경구 투여방식이라 한다.

봉독의 주요성분인 멜리틴, 아파민, MCD(마스트 셀 과립; mast cell degranulating)-펩타이드 등은 진통, 소염, 항균작용과 함께 뇌하수체 호르몬 분비촉진, 혈액순환 촉진 등의 작용이 알려져 있다.

한국 등록특허공보 10-0483496호 '봉독 수용성분을 함유하는 소염 및 진통용 조성물'에는 봉독을 헥산 추출하여 헥산 가용물을 제거한 후 상기 헥산이 제거된 봉독을 다시 에테르로 추출하여 에틸아세테이트 가용물을 제거한 수용성 분획으로부터 얻어진 분자량 10KDa 이하의 물질로 구성된 소염, 진통 효과를 갖는 봉독 분획에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나 이는 봉독의 성분 중 지용성성분을 버리고 수용성 봉독성분만을 이용하는 단점이 있다. 한국 공개특허공보 10-2010-0118629호 '봉독 또는 봉독 추출물을 함유하는 화장료 조성물'에는 봉독 또는 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물로서, 상기 봉독 추출물은 물, 유기 용매 또는 물과 에탄올의 혼합용매로 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이 공개되어 있다.

그러나, 이 또한 봉독의 수용성 성분만을 이용하고 있는 것으로서 봉독의 구성요소 중에서 봉독의 지용성성분을 이용하여 인체 또는 동물 등에 적용할 수 있는 면역증강 및 통증치료용 약제의 제조방법에 대하여는 아직까지 활용되고 있지 않은 문제점이 있었다.

한국 등록특허공보 10-0483496호 '봉독 수용성분을 함유하는 소염 및 진통용 조성물' 한국 공개특허공보 10-2010-0118629호 '봉독 또는 봉독추출물을 함유하는 화장료 조성물'

본 발명은 상술한 바와 같은 문제를 해결하기 위하여 안출한 것으로서, 본 발명의 목적은 봉독의 구성성분 중 봉독의 지용성 성분도 함께 이용하여 생체에 투여할 경우 체중 증가율이 월등히 증가하고, 각종 질병의 예방, 치료 및 면역기능을 향상시킬 수 있으며, 항염증기능을 향상시키는 봉독 조성물을 제공하는 데 있다.

또한 본 발명의 다른 목적은 소, 돼지, 닭, 오리 등을 포함하는 동물 및 인체에 적용할 수 있는 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위해서 본 발명의 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물은 봉독을 물로 현탁하고, 에틸 아세테이트를 용매로 수회 추출하고 분리된 수용성층을 다시 부탄올로 추출하며, 각층을 감압 농축하고 분획하여 얻은 봉독을 포함한다. 상기 봉독 1g에 대하여 상기 용매(에틸 아세테이트와 부탄올)의 사용량은 50~300㎖이다.

또한 본 발명의 면역증강 및 통증치료용 수지봉독은 상기 봉독 조성물 100중량부에 대하여 0.01~4중량부이다.

또한 본 발명의 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물은 사포닌 또는 알파-파이넨을 더욱 포함한다.

또한 본 발명의 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물에서 상기 사포닌은 0.01~5중량부이고, 알파-파이넨은 0.01~1중량부이다.

또한 본 발명의 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물에서 프로필렌글리콜, 에탄올, 소르빈산 중에서 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상이 더욱 포함된다.

또한 본 발명의 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물에서 상기 프로필렌글리콜은 0.01~2중량부이고, 상기 에탄올은 0.01~2중량부이며, 상기 소르빈산은 0.0001~0.1중량부이다.

본 발명의 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법은 봉독을 수용성용매와 지용성용매를 이용하여 1차 분별하는 단계(S10)와, 분별된 1차 수용성층에 지용성용매를 가하여 2차 분별하는 단계(S20)와, 분별된 2차 수용성층에 지용성용매를 가하여 3차 분별하는 단계(S30)와, 분별된 3차 수용성층을 필터링하여 불용성 성분을 제거하여 수용성층을 준비하는 단계(S40)와, 1차 분별된 1차 지용성층에 2차 분별된 지용성층과 3차 분별된 지용성층을 합한 다음 필터링하여 불용성 성분을 제거하여 지용성층을 준비하는 단계(S50)와, 3차 수용성층을 필터링한 수용성층과 필터링한 지용성층을 혼합하는 단계(S60) 및 수용성층과 지용성층의 혼합물을 농축 및 건조하여 수지봉독 조성물을 수득하는 단계(S70)를 포함한다.

또한 본 발명의 면역증강용 수지봉독 조성물의 제조방법은 봉독을 수용성용매를 이용하여 추출하는 단계(S11)와, 수용성용매를 이용하여 추출한 봉독을 원심분리하고, 수용성층을 취하고 필터링하여 불용성 성분을 제거하는 단계(S21)와, 원심분리한 잔사를 건조하여 수용성용매를 제거하는 단계(S31)와, 건조된 상기 잔사에 지용성용매를 가하여 추출하는 단계(S41)와, 지용성용매를 이용하여 추출한 봉독을 필터링하여 불용성 성분을 제거하는 단계(S51)와, 준비된 수용성층과 지용성층을 서로 혼합하는 단계(S61) 및 수용성층과 지용성층의 혼합물을 농축 및 건조하여 수지봉독 조성물을 수득하는 단계(S71)를 포함한다.

또한 본 발명의 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법에서 수용성용매는 물, 에틸 알콜, 메틸 알콜 중에서 선택된 어느 하나이다.

또한 본 발명의 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법에서 지용성용매는 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 에테르, 부탄올 중에서 선택된 어느 하나이다.

또한 본 발명의 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법에서 농축 및 건조하여 수득된 수지봉독 조성물에 대하여 20,000~30,000V 사이의 전압으로 1~50㎲의 시간 동안 고전압 처리하는 단계(S80)를 더 포함한다.

또한 본 발명의 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법에서 수용성층과 지용성층의 부피비가 1:0.1~1인 수지봉독 조성물을 수득한다.

또한 본 발명의 염증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법에서 수용성층과 지용성층의 부피비가 0~0.5:1인 수지봉독 조성물을 수득한다.

또한 본 발명의 면역증강, 염증 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법에서 수지봉독 조성물은 육계에 투여시 육계의 비장에서 CD4+/CD8+ 의 비율이 0.4~1.5이다.

또한 본 발명의 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법에서 수지봉독 조성물은 육계에 투여시 라이소자임 활성이 7~14㎍/㎖이다.

또한 본 발명의 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법에서 수지봉독 조성물은 비단백질 성분으로 시티딘(cytidine), 아데노신(adenosine), 크리신(chrysin), 11-에이코세놀(11-eicosenol), 디노닐프탈레이트(dinonyl phthalate), 피노셈브린(pinocembrin) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 포함한다.

또한 본 발명의 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법에서 수지봉독 조성물은 단백질 성분으로 멜리틴, 포스포리파제A-2, 엠씨디펩타이드, 아파민 중에서 선택된 어느 하나 이상을 포함한다.

이상과 같이 본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물에 의하면 생체에 대한 증체율 및 면역기능을 현저히 높이고, 각종 질병에 대한 예방 및 치료 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 면역증강 및 염증, 통증 치료용 봉독 조성물에 의하면 항생제에서 발생하는 내성이 없고, 장기간 사용하더라도 안정성을 확보할 수 있는 효과가 있다.

또한 본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 봉독 조성물에 의하면 기존 항생제 대체제에 비해 질병 예방 및 치료 효과가 우수하고 경제적인 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 봉독조성물에 있어서, 생봉독과 건조봉독의 분석과정을 도시하는 순서도이다.
도 2는 본 발명에 따른 봉독조성물을 SDS-PAGE하여 분리된 단백질들의 이미지이다.
도 3은 본 발명에 따른 봉독조성물을 이차원 전기영동하여 분리된 단백질들의 이미지이다.
도 4는 본 발명에 따른 봉독조성물에 있어서, SDS-PAGE gels에서 분리된 봉독의 단백질 성분을 요약한 데이터이다.
도 5는 본 발명에 따른 봉독조성물에 있어서, 2D gels에서 분리된 봉독의 단백질 성분을 요약한 데이터이다.
도 6은 본 발명에 따른 봉독조성물에 있어서, 봉독과 그 용매 분획의 추출공정을 나타내는 개략도이다.
도 7은 본 발명에 따른 봉독조성물이 육계의 체중 증가에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 봉독조성물이 육계의 비장무게 변화에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 봉독조성물이 육계의 림프구 증식능에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 10a 내지 10b는 육계의 비장에서 분리한 림프구에서 B cell과 T cell의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 11a 내지 도 11c는 육계의 비장에서 분리한 림프구(helper T cell)에서 CD4⁺:CD8⁺ 비율을 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 봉독 조성물이 육계의 혈중 lysozyme의 활성에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 13a 내지 13c는 본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 봉독 조성물을 투여한 육계의 비장에서 m-RNA를 추출하여 사이토카인 (IL-4, IL-18 그리고 IFN-gamma)의 발현능에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.
도 14는 본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 봉독 조성물이 정제봉독의 시험관 내에서의 항균 효과를 나타내는 사진이다.
도 15는 육계의 증체율에 따른 항생제 대체제로서의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 16a 내지 16b는 나노구조체를 이용한 단백질 분해효소와 유용물질의 분리방법에 대한 개념도이다.
도 17은 본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법을 보여주는 도면이다.
도 18은 본 발명에 사용되는 수지봉독 조성물의 단백질 성분을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 19a 내지 19g는 본 발명에 사용되는 수지봉독 조성물의 비단백질 성분을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 20a와 도 20b는 봉독에 대한 고전압 처리(Pulsed Electric Field; PEF) 전후 CBV(crude bee venom), WBV(water-soluble bee venom) 및 LWBV(Lipid and Water soluble bee venom)의 양적인 변화를 보여주는 그래프이다.
도 21은 본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 또 다른 제조방법을 보여주는 도면이다.
도 22a는 본 발명에 따른 수지봉독 조성물의 효과 실험 중 육계의 증체량을 나타내는 그래프이고, 도 22b는 본 발명에 따른 수지봉독 조성물의 효과 실험 중 육계의 누적 증체량 비교를 나타낸 그래프이다.
도 23a는 수지봉독의 투여 횟수에 따른 증체량의 변화를 보여준다.
도 23b는 B세포의 활성이 수지봉독의 투여 횟수에 따라 변하는 정도를 보여주는 그래프이다.
도 23c는 T세포의 활성이 수지봉독의 투여 횟수에 따라 변하는 정도를 보여주는 그래프이다.
도 23d는 CD4⁺/CD8⁺의 비율이 수지봉독의 투여 횟수에 따라 변하는 정도를 보여주는 그래프이다.
도 24는 본 발명에 따른 면역 증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물을 투여한 육계의 비장에서 분리한 림프구(helper T 세포)에서의 CD4⁺와 CD8⁺의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 25는 본 발명에 따른 수지봉독의 라이소자임 활성에 대한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 26은 본 발명에 따른 봉독조성에 따른 세포독성을 보여주는 막대 그래프이다. CBV는 미정제 봉독, LBV는 도 17의 S50단계, LWBV는 S70단계의 시료를 의미한다.
도 27은 본 발명에 따른 봉독조성에 따른 항염증 효과를 보여주는 막대 그래프이다. CBV는 미정제 봉독, LBV는 도 17의 S50단계, LWBV는 S70단계의 시료를 의미한다.
도 28은 본 발명에 따른 수지봉독에 대하여 조성에 따른 항통증 효과를 보여주는 막대 그래프이다.
도 29는 본 발명에 따른 수지봉독에 대하여 조성에 따른 항통증 효과를 보여주는 꺾은선 그래프이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 그러나 이하의 실시예는 이 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 본 발명이 충분히 이해되도록 제공되는 것으로서 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 다음에 기술되는 실시예에 한정되는 것은 아니다. 도면상에서 동일 부호는 동일한 요소를 지칭한다.

봉독은 꿀벌의 산란관에서 나오는 독액으로서, 생봉독, 건조봉독, 봉독추출물 및 정제봉독을 포함하는 것이다.

봉독에는 멜리틴(Melittin), 아파민(Apamin), 비만세포 과립감소 펩티드(MCD-Peptide, Mast Cell Degranulation Peptide, Op), 단백효소 억제제(Protease Inhibitor), 세카르핀(Secarpin), 터치아핀(Tertiapin), 프로카민(Procamine) 등 다양한 펩타이드를 함유하고 있다.

생봉독은 건조 또는 정제과정을 거치지 않은 것으로서 비중이 1.1 내지 1.3이고, 산도(pH)가 5.2 내지 5.5 범위이며, 70~80중량%는 단백질 또는 펩타이드로 이루어진다.

봉독 추출물은 당 업계에 공지된 다양한 추출방법을 이용하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 물, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 이러한 저급알코올과 물과의 혼합용매, 아세톤, 에틸 아세테이트, 부틸렌글리콜을 추출용매로 하여 얻을 수 있다.

보다 바람직하게는 봉독을 물로 현탁하고, 에틸 아세테이트를 용매로 수회 추출하여 분리된 수층을 다시 부탄올(butanol)로 추출하며, 각 층을 감압 농축하여 얻는 것이다.

본 발명에 따른 봉독 조성물은 봉독 1g에 대하여 용매는 50~300㎖인 것이 바람직하다.

정제봉독은 상술한 추출용매에 의한 추출물 이외에 통상적인 정제 과정을 거쳐 얻거나, 여과 막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피에 의한 분리, 정제방법에 의하여 정제된 봉독을 포함하는 것이다.

이것을 중량비로 표현하면 봉독은 봉독 조성물 100중량부에 대하여 0.01~4중량부인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 0.1~4중량부인 것이다.

이에 대하여 상술하면, 봉독이 0.01 중량부 미만인 경우에는 생체의 증체율과 면역기능 및 통증치료 효과가 미약하고, 4중량부를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미약하다.

본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 봉독조성물은 생체의 증체율, 면역기능 및 통증치료 기능 향상을 위하여 사포닌 0.01~5중량부를 포함하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.07~4중량부를 포함하는 것이다.

사포닌(saponin)은 식물계에 존재하는 배당체에서 당이 아닌 부분이 여러 고리 화합물로 이루어진 것으로서 강심제나 이뇨제로서의 작용이 있으며, 어느 것이나 세포에 대해서는 표면 활성제로 작용하여 세포막에서의 물질의 투과성을 높이기도 한다.

특히 본 발명에서는 점안제의 형태로 본 발명의 봉독 조성물을 투여하는 것이 투약의 효과를 향상시킬 수 있고, 이러한 현상은 사포닌을 첨가함으로서 더욱 증대시킬 수 있다.

본 발명의 조성물은 알파-파이넨(α-pinene) 0.01~1중량부를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

알파-파이넨은 소나무, 약쑥, 쑥갓, 후추 등에서 추출할 수 있으며, 테르펜(terpene) 계열의 화합물로 (1R,5R)-(-)-alpha-pinene과 (1SR, 5S)-(-)-alpha-pinene의 두 가지 이성질체가 존재한다.

알파-파이넨은 항균 효과, 항진균 효과, 진정 효과, 항스트레스 효과가 있고, 면역관련 질병에 특히 효과가 있으며, 특히 호염증성 사이토카인 생산에 중요한 역할을 한다.

사포닌 및 알파-파이넨은 공지된 추출방법을 다양하게 이용할 수 있고, 수증기증류법, 압착법 또는 용제추출법을 이용해 추출할 수 있다.

본 발명의 면역증강 및 통증치료용 조성물은 봉독 조성물 100중량부에 대하여 프로필렌글리콜 0.01~2중량부, 에탄올 0.01~2중량부 및 소르빈산 0.001~0.1중량부를 더욱 포함할 수 있다.

이러한 프로필렌글리콜, 에탄올, 소르빈산은 봉독의 유효성분을 장기간 보관할 수 있도록 첨가할 수 있다.

프로필렌글리콜 화학식은 C₃H₈O₂이고, 비중은 1.036~1.04이며, 끓는점은 185~189℃이다. 프로필렌글리콜은 용해력이 우수하고, 곰팡이의 번식을 방지하며, 발효되지 않는 특성으로 인해 본 발명의 조성물을 장시간 보관할 수 있도록 해준다.

소르빈산 화학식은 C₆H₈O₂이고, 녹는점은 134.5℃ 정도로서, 사상균, 효모, 호기성세균 등의 미생물 발육을 저해한다.

에탄올 분자식은 C₂H₅OH이고, 마취성이 있어 동물의 중추신경에 대한 영향력과 봉독을 장기간 보존하기 위해 첨가할 수 있다.

본 발명의 조성물은 점안제 또는 접안제 및 피하주사제로 제조하여 이를 생체에 접종할 수 있고, 점안제나 주사제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제 및 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 생체 즉 인간, 가축류, 가금류, 어류 등에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제한다. 또한 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외 여러 가지 부형제와 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 및(또는) 올리브 오일과 같은 식물성 기름이 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다.

먼저, 생봉독과 건조봉독의 성분을 비교분석하기 위해 프로테오믹스(proteomics) 기법에 의해 특정단백질들(펩타이드들)을 분석하였다.

동일 양의 생봉독과 건조봉독을 2차원 전기 영동법을 통해 분리하여 생봉독 또는 건조봉독에 특이적으로 존재하는 단백질(또는 펩타이드들)을 확인하였다.

도 1은 본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 봉독조성물에 있어서 생봉독과 건조봉독의 분석과정을 도시하는 순서도이고, 도 2는 생봉독과 건조봉독의 SDS-PAGE에 의하여 분리된 단백질들의 이미지로서, 도시된 바와 같이 겔 영동장치인 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)에 의해 단백질을 분리하였다.

그리고 도 3은 건조봉독과 생봉독의 2차원 전기 영동에 의해 분리된 단백질의 특이 스팟을 표시한 이미지로서, 생봉독 특이스팟 13개(분홍색 표시)와 생봉독과 건조봉독 공통스팟 7개(푸른색표시)를 찾아냈다.

그리고 이를 오려내어 트립신으로 단백질을 가수분해하여 폴리펩티드 조각들을 제조하였다.

도 4는 2D 겔(gel)에서 분리된 봉독의 단백질 성분을 요약한 데이터로서 파란색으로 표시된 것은 생봉독과 건조봉독에 공통스팟에 대한 데이터이다. 스팟 번호(Spot No.) 1, 2, 4, 8, 10, 14, 17, 19에 기재된 단백질 성분은 생봉독에서만 발견된 것으로서, 생봉독과 건조봉독에 포함된 단백질에 현저한 차이가 있음을 알 수 있다.

도 5는 SDS-PAGE gels에서 분리된 봉독의 단백질 성분을 요약한 데이터로서 생봉독 및 건조봉독 각각 멜리틴 성분이 함유되어 있으나, 스팟 번호 A, B, C, D, E는 생봉독에만 포함된 단백질임을 확인할 수 있다.

실시예1. 봉독으로부터 분획물 및 봉독 조성물의 제조

도 6은 봉독과 용매분획의 추출하는 공정을 나타내는 개략도로서, 도시된 바와 같이 봉독 5g을 물 500㎖로 현탁하여 분리용 깔때기(separating funnel)에 넣었다.

그리고 나서, 에틸아세테이트(Ethyl Acetate; EtOAc) 500㎖로 3회 추출하였다. 수층을 다시 n-BuOH(butanol) 500㎖로 2회 분배 추출하였고, 각층을 감압농축하여 EtOAc 분획(BVE, 420㎎), n-BuOH 분획(BVB, 820㎎), H₂O 분획(1.2g) 및 잔사(2.5g)를 얻었다.

상기 EtOAc 분획420㎎과 n-BuOH 분획 820mg을 혼합하여 정제봉독을 제조하고 정제봉독을 물과 혼합하여 고농도(8,400㎍/㎖), 중농도(2,100㎍/㎖), 저농도(420㎍/㎖)의 농도별로 본 발명의 봉독조성물을 제조하였으며, 이를 하기 실험예1 내지 3의 시료로 사용하였다.

한편, 얻어진 각 분획에 대하여 TLC(Thin Layer Chromatography)로 비단백성분 프로파일(profile)을 조사하였다.

EtOAc 분획은 약 5종의 주요성분이 존재하는 것으로 나타났으며, UV 흡수가 없고 황산 분무 후 가열하였을 때에 황색으로 발색되어 알리파틱(aliphatic) 화합물로 추정된다.

n-BuOH 분획은 프록토오스(fructose) 외에 UV 흡수를 보이는 3종의 화합물이 존재하는 것으로 나타났다.

물층은 대부분 프록토오스이나 n-BuOH 분획과 마찬가지로 UV흡수를 보이는 3종의 비단백 화합물이 존재하는 것으로 나타났다.

실험예1. 실험방법 및 정제봉독의 투여

1일령 육계병아리(Ross) 101마리를 입사하여 사료와 물을 자유급식하며 4주간 사육하였다.

정제봉독의 투여 적정농도를 확인하기 위하여 실시예1에서 제조한 고농도(8,400㎍/㎖), 중농도(2,100㎍/㎖), 저농도(420㎍/㎖) 각각을 육계에 접안(10㎕)과 피하(100㎕)로 나누어 투여하였다.

정제봉독 투여의 적정 횟수를 확인하기 위해 2회 또는 4회 1주일 간격으로 투여를 실시하였다.

즉, 2회 투여군은 입사 후 1일과 8일 후 각각의 농도와 투여경로에 따라 정제봉독의 접종을 실시하였고, 4회 투여군은 입사 후 1, 8, 15 그리고 22일에 각각의 농도와 투여경로에 따라 정제봉독의 접종을 실시하였다.

도 7 내지 도 13의 그래프에 표시된 각 부호의 의미는 다음과 같다.

** control : 정제봉독 무투여군

** OL2 : 접안을 통한 저농도(Low Conc.)의 정제봉독 2회 투여군.

** OM4 : 접안을 통한 중농도(Middle Conc.)의 정제봉독 4회 투여군.

** SH4 : 피하조직을 통한 고농도(High Conc.)의 정제봉독 4회 투여군.

(대조군을 제외하고 모두 12종류의 정제봉독 투여군을 실험함.)

** (n =18) : 대조군 육계의 개체수 18마리

** ↗ : 유의성 있게 증가

실험예2. 육계의 증체효과 비교

정제봉독 투여에 따른 육계의 체중 증가율을 비교분석하기 위해 4주간 사료와 식수를 자유 지급하였고, 그 결과를 도 7의 그래프에 도시하였다.

도 7에 도시된 바와 같이 전 개체의 체중을 전자저울로 측정한 결과 대조군(무투여군 :841±71g)에 비해 정제봉독 투여군 모두에서 유의성(P<0.05)있게 체중이 증가하였다.

특히 OM4군(접안을 통한 중농도 4회 투여군: 1,114± 80g)와 OH4(접안을 통한 고농도의 4회 투여군: 1,117±113g)에서 평균체중이 가장 많이 증가하였다.

실험예3. 육계의 면역증가 효과 비교

3-1. 닭의 비장 무게 변화

정제봉독 투여가 육계의 면역력 향상에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위해 육계의 비장 무게를 측정하였고, 그 결과를 도 8의 그래프에 도시하였다.

도 8에 도시한 바와 같이 정제봉독 투여에 따른 육계의 면역 장기(비장) 무게를 측정한 결과 대조군(무투여군:0.968±0.115g)에 비해 접안을 통한 4회 투여군들에서 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보여주었으며, OH4군(접안을 통한 고농도의 4회 투여군: 1.268±0.228g)에서 유의적으로 증가하였다.

3-2. 림프구 증식능 평가

정제봉독 투여에 따른 육계의 림프구 증식능을 비교분석하기 위해 각 군의 육계로부터 비장을 채취하였다.

채취된 비장은 다시 무균상태에서 림프구 분리에 사용되었으며, 분리된 림프구를 이용하여 본 실험을 수행하였다.

살아있는 림프구의 수는 트리판 블루(trypan blue)로 염색한 후 현미경에서 측정 및 그 수를 계산하였고, 최종적으로 1×10⁶cells/㎖의 농도로 RPMI-1640 배지에 희석하였다.

96-well cell culture plate의 각 well에 100㎕씩 희석된 세포를 분주 후, 콘-에이(ConA, 5㎍/㎖) 또는 지질다당류 LPS(Lipopolysaccharide, 50㎍/㎖)가 첨가된 RPMI-1640배지를 100㎕씩 추가로 넣어주거나 또는 유사분열물질인 미토겐(mitogen)이 무(無)첨가된 배지를 100㎕씩 첨가하여 41℃, 5% 이산화탄소 조건으로 48시간 동안 배양하였다. 여기서 콘-에이는 암세포의 성장을 저해하는 식물성 단백질을 말하는데 암세포를 죽이지 않고 정상세포로 환원시키는 작용을 한다.

48시간 배양된 각 well에 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a yellow tetrazole) 5㎎/㎖ 용액 20㎕씩을 첨가한 후 다시 41℃, 5% 이산화탄소 조건으로 4시간을 더 배양하였다.

배양 종료 후 상층액을 모두 제거하고 각 well당 200㎕씩의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 넣었다.

모든 세포가 녹은 후 540nm에서 흡광도를 측정하여 림프구의 증식능을 비교하였고, 그 결과를 도 9의 그래프에 도시하였다.

도 9에 도시된 바와 같이 이 림프구의 증식능은 유사분열물질(mitogen) 무첨가시 각 군에서 차이를 보이지 않았으나, LPS(B cell mitogen)와 콘에이(T cell mitogen)로 자극시 대조군(LPS: 0.614±0.02, 콘에이: 0.601±0.05)에 비해 OM4 군(LPS: 1.030±0.09, 콘에이: 1.032±0.05)의 증식능이 유의적으로 가장 크게 증가하였다.

3-3. 비장 내 세포의 비율 비교

비장에서 분리한 림프구 비율을 유세포 분석기를 이용하여 비교분석하였다.

비장 적출 후 cell strainer를 이용하여 세포를 유리시킨 후, 적혈구 용해 완충액(RBC(Red blood cell) lysis buffer)에 10분간 현탁하여 적혈구를 파괴하였다.

적혈구 용해 완충법은 세포를 파쇄하는 방법의 하나로서 효소 처리하는 방법에 해당한다. 세제(detergent)가 세포막으로부터 단백질이나 지방단백질(lipoprotein)을 분리시켜 세포내 물질이 유출되게 한다. 주로 지방산(bile salt)이나 소듐라우릴설페이트(sodium laurylsulphate) 등이 쓰이며 pH와 온도에 민감하게 작용한다. 그러나 거품, 단백질 변성, 침전 등이 일어나 일반적으로 사용되지 못하는 방법이다.

다음으로 2,500rpm에서 5분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 원심세척하여 림프구의 수를 5.0×10⁶cell/㎖의 농도로 희석하였다.

FITC anti-chicken CD3(총 T 세포)와 PE 안티치킨(anti-chicken) BU -1 (B 세포) 또는 FITC(Fluorescein IsoThio-Cyanate) 안티치킨(anti-chicken) CD4(help T cell)와 PE 안티치킨(anti-chicken) CD8(cytotoxic T세포)의 항체로 암실에서 30분간 반응시켜 염색하였다.

반응 후에 2회 원심세척하고 PBS 1㎖를 분주하여 유세포 분석기(FACSCalibur FACS, BD Biosciences, USA)를 이용하여 비장내 림프구 비율을 측정하였으며 그 결과를 도 10a 내지 도 11c의 그래프에 도시하였다.

도 10a, 10b, 도 11a, 11b, 11c에 도시된 바와 같이 B cell 과 T cell의 비율에는 군별 큰 변화가 없었다.

헬퍼 T 세포(helper T cell)의 비율에 있어 대조군(6.80±2.98%)에 비해 접안을 통한 4회 투여군들 모두에서 증가하는 경향을 보였으며, 특히 OM4군(19.08±4.00%)의 헬퍼 T 세포 비율이 가장 큰 증가를 보였다.

뿐만 아니라, 사이토톡식 T 세포(cytotoxic T cell)의 비율 또한 대조 군(54.83±11.10%)에 비해 OM4군(41.41±4.19%)의 비율이 현저히 줄어든 것을 확인할 수 있었다.

따라서 CD 4⁺:CD 8⁺ 비를 분석하여 보면 도 11a 내지 도 11c에 도시된 바와 같이 대조군(0.13±0.08)에 비해 OM4군(0.47±0.14)에서 가장 큰 증가를 보였다.

3-4. 혈중 라이소자임(lysozyme) 활성 비교

결정 라이소자임의 세균에 대한 분해 정도를 표준 커브로 사용하여 대조군과 봉독 투여군들의 혈청 라이소자임 농도를 비교 측정함으로써 대식세포의 활성을 평가하였다.

혈청 중 라이소자임 활성을 측정하기 위해 결정 라이소자임을 0.5, 1, 2, 3, 4, 5㎍/㎖의 농도로 녹여 표준으로 준비하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 200㎕ 씩의 라이소데익티쿠스(lysodeikticus) 용액을 넣고, 미리 준비한 표준 라이소자임 또는 혈청 20㎕씩 첨가하였다.

이렇게 준비된 시료를 41℃에서 1시간 동안 배양하여 15분 간격으로 흡광도를 측정하였다(540㎚). 시료의 라이소자임 활성 측정은 표준 커브에 시료의 시간에 따른 흡광도의 변화를 대입하여 구하였고 그 결과를 도 12의 그래프에 도시하였다.

도 12에 도시된 바와 같이 비록 통계적 유의성은 없었으나 대조군에 비해 12군의 정제봉독 투여군 모두에서 평균 lysozyme 활성이 증가하는 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

3-5. 사이토카인 m-RNA 발현 정도 비교

대조군과 정제봉독 투여군들의 비장으로부터 m-RNA를 추출하여 실시간 PCR(real-time PCR)을 이용하여 사이토카인(IL-4, IL-18 그리고 IFN-gamma)의 발현능을 측정하였고, 그 결과를 도 13a, 13b, 13c 내지 표 1에 정리하였다.

도 13a 내지 도 13c 및 표1에 나타난 바와 같이 사이토카인 발현 정도에 있어서 대조군과 정제봉독 투여군들간의 유의적인 차이는 없었다.

Target	Accession No.	Nucleeotide sequence(5'-3')
GAPDH Forward	NM_204305	CCTAGGATACACAGAGGACCAGGTT
GAPDH Reverse		GGTGGAGGAATGGCTGTCA
IL-4 Forward	NM_001007079	GCTCTCAGTGCCGCTGATG
IL-4 Reverse		GAAACCTCTCCCTGGATGTCAT
IL-18 Forward	NM_204608	AGGTGAAATCTGGCAGTGGAAT
IL-18 Reverse		TGAAGGCGCGGTGGTTT
IFN gamma forward	NM_205149	GCTCCCGATGAACGACTTGA
IFN gamma Reverse		TGTAAGATGCTGAAGAGTTCATTCG

3-6. 정제봉독의 시험관내(in-vitro)에서의 항균효과 비교

정제봉독의 시험관내(in-vitro)에서의 항균효과를 알아보기 위해 Salmonella Gallinarum(SG 3001)을 대상으로 실시하였다.

양성대조군으로 Sigma사의 봉독(Bee Venom)(V3375)을 농도별로 (1,000㎍/㎖, 500㎍/㎖, 250㎍/㎖) 사용하였고, 실험군으로는 닭의 면역실험에서 사용한 정제봉독을 농도별[고농도(8,400㎍/㎖), 중농도(2,100㎍/㎖), 저농도(420㎍/㎖)]로 사용하였으며, 음성대조군으로는 정제봉독의 용제인 3차 증류수를 사용하였다. 그 결과는 도 14의 사진에 나타난 바와 같이 고농도 정제봉독에서 세균성장 억제대를 확인할 수 있었다.

4. 면역증강 및 통증치료용 봉독 조성물에 대한 실험 결과

봉독의 분무방식과 접안 투여방식의 결과를 비교분석하여 적정 투여농도 결정, 안정성 평가, 증체율에 미치는 영향평가, 면역력 증가효과(대식세포 활성, 면역세포 증식능, 비장에서의 T림프구 분포측정, T림프구 중 CD4+:CD8+ 비율, 사이토카인 발현 측정 등) 등을 확인한 결과, 봉독이 육계(닭)의 증체율과 면역력 향상에 구체적으로 관여하는 것을 알 수 있었다.

표2는 실험예2 내지 실험예3(3-1 ~ 3-6)에서 육계의 증체효과 및 면역기능 향상효과가 가장 우수한 실험군을 나타내었다.

그 결과 증체율 및 면역기능이 봉독의 유용성분에 대하여 농도 의존적으로 유의성있게 증가한다는 것을 확인할 수 있다.

	실험예2	실험예3
		3-1	3-2	3-3	3-4	3-5	3-6
실험예에서 우수한 효과를 나타내는 실험군	OH4군	OH4군	OM4군	OM4군	12개 모든군	유의성없음	고농도군

도 15는 육계의 증체율에 따른 항생제 대체제로서의 효과를 나타내는 그래프로서, 도시된 바와 같이 항생제, 생균제, 유기산 및 효소 등을 사용한 경우에 비하여 본 발명의 면역증강 및 통증치료용 봉독조성물은 육계의 증체율이 현저히 높다는 것을 확인할 수 있다.

또한, 임상실험 결과 정제봉독 조성물을 안구를 통해 접종(접안투여)한 닭에서 체중 증가(대조군 대비 20%이상) 및 비특이적인 면역 증강효과(CD4⁺/CD8⁺ ratio 증가, 대조군 0.13±0.08, 중농도 투여군 0.47±0.14)가 확인되었다.

따라서 양계농장에서 접안 분무백신을 투여할 때 봉독조성물을 함께 사용하면 편리하고 효과적으로 닭의 면역반응을 증가시킬 수 있어 항생제 대체제 뿐만 아니라 양질의 축산물을 개발할 수 있다.

이하 본 발명에 따른 봉독 조성물에 있어서 생봉독 성분의 안정성을 개선시키기 위한 단백질 분해효소와 유용물질을 분리시키는 방법을 상세하게 설명한다.

도 4 내지 도 5에 도시된 바와 같이 봉독은 단백질 분해효소를 포함하고 있으므로 봉독의 건조 및 정제 과정에서 단백질의 가수분해가 나타나 유용 단백질의 절편화 또는 불활성화가 일어날 수 있다.

도 16a, 16b는 나노구조체를 이용한 단백질 분해효소와 유용물질의 분리방법에 대한 개념도로서, 도 16a에 도시된 바와 같이 수용액 상태에서는 단백질 분해효소가 펩티드 내지는 단백질 등의 유용물질을 분해시키게 되나, 도 16b에 도시된 바와 같이 나노구조체를 이용함으로써 단백질 분해효소 및 단백질이 나노구조체에 포집되면 유용물질이 분해되지 않게 된다.

구체적으로는 상기한 문제점을 해결하기 위하여 단백질 분해효소로 잘 알려진 트립신을 이용하고 이의 기질로서 알부민을 사용하여 나노구조체와 섞은 후 배양하여 단백질의 가수분해가 억제되는 지를 확인하는 모델시스템을 이용할 수 있다.

또한 생봉독의 유용성분인 펩티드 내지 단백질은 PLGA(Poly D,L-Lactic-co-Glycolic Acid) 등의 나노입자로 캡슐화(encapsulation)하여 안정성을 높일 뿐만 아니라, 지속적인 방출(sustained release)이 이루어지도록 가축용 제제(점안제 또는 분무제)로 제형화함으로써 그 효능을 증강시킬 수 있다.

이러한 PLGA는 다공성 스캐폴드(scaffold)의 생체물질(biomaterial)로 사용된다. PLGA는 생분해성 및 생안정성 스캐폴드 물질로서 넓게 사용되어 왔다. 그러나 PLGA 단독으로는 생체 중간엽 줄기세포(MSCs, Mesenchymal stem cells)의 골조직 형성시 골유도환경을 제공하지 못한다고 보고되고 있다.

그리고 날로 심각해지는 축산업계의 항생제 과다사용의 문제점을 천연물질인 봉독의 유효성분을 규격화하여 재구성함으로써 이 봉독 조성물은 항생제 대체물질로서의 역할을 할 수 있다.

또한 본 발명은 봉독의 성분들(예를 들면, 포스포리파제(PLA2), 멜리틴(melittin), 엠씨디 펩타이드)을 천연 생봉독(벌의 침을 통해서 나오는 액체 상태의 봉독)에 가까우면서도 봉독의 지용성성분을 포함할 수 있도록 정제, 가공 및 규격화하여 효능에 있어서 우수하고 부작용이 최소화되는 수지봉독 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

표 3은 본 발명에 따른 봉독 조성물의 구성성분과 효과를 보여주는 표이다.

종류	성분	중량(%)	효능
효소(enzyme)	포스포리파제(phospolipase A2)	10-12	세포조직의 파괴성, 용혈작용, 촉매작용
	하이알루로니다제(hyaluronidase)	1-3	조직분해 작용, 항원성성분
	포스포에스테라아제산(Acid phosphoesterase)		항체역할 증진
	리소포스포리파제 (lysophospholipase)		PLA2작용억제
	알파-글루코시다아제(α-glucosidase)		항체역할 증진
다른 단백질과 펩타이드	멜리틴(melittin)	50	세포용해작용(백혈구, 비만세포, 리소좀, 미토콘드리아), 항염증작용, 면역작용
	아파민(apamin)	1-3	신경통완화, 진통, 항염증, 면역, 신경독 작용
	비만세포 과립감소 펩티드	1-2	항염증작용
	세카르핀	0.5-2.0	저온증, 진정작용
	프로카민	1-2	방사선 보호성과 관련
	아도라핀		항염증 작용 진통작용
	단백효소 억제제		단백질과 에스테르 용해 억제작용, 항염증작용
	터치아핀	0.1	비만세포. 탈과립작용
	작은 펩티드	13-15
정신활성 아민(physiological active amines)	히스타민	0.5-2.0	혈압강화작용, 장관수축 작용, 위산분비 촉진작용
	도파민(dopamine)	0.2-1.0	신경전달물질
	노르아드레날린(noradrenaline)	0.1-0.5
아미노산	티-아미노산(t-amino acids)	0.5
	에이-아미노산(a-amino acids)	1.0
설탕	글루코스(glucose) 및 프록토스(fructose)	2
휘발성 성분		4-8

표 3에서와 같이 다양한 봉독의 구성성분에는 수용성성분, 지용성성분 및 불용성 성분이 있다. 그러나, 기존에는 봉독의 수용성성분들 중 대표적인 펩타이드 단백질인 멜리틴(Melittin) 만을 지표(기능)성분으로 품질관리하고 있다. 또한, 약효 면에서도 봉독은 그동안 관절염에 대한 염증치료제로서 효과를 검증받아 인체 의약품 중 주사제 용도로 식약청의 허가를 받은 제품으로 이미 개발되어 있다.

또한, 동물에 있어서도 관절염과 같은 염증치료제로 등록되어 있으나, 적용범위가 개의 관절염에 한정되어 등록되어 있으며 소, 돼지, 닭, 오리 등 가축에는 아직 적용할 수 있도록 등록 또는 허가되어 있지 않다.

최근 들어 소, 돼지, 닭, 오리 등 가축의 사료에 첨가되고 있는 항생제의 사용이 규제되고 있어서, 항생제의 효과를 내면서도 가축에 독성이 없고 체내에 축적되지 않으며 안전하고 저렴한 대체물질이 필요한 실정이다.

가축의 사료에 항생제의 사용이 전면 금지되면 항생제를 대체할 수 있는 물질의 개발이 시급하다고 할 수 있다. EU(Europian Union)에서는 2006년 1월부터 가축의 성장 촉진용 항생제(Growth-promoting antibiotics; GPAs) 사용에서 수의사 처방 없는 사료 첨가 항생제의 사용이 전면 금지되어 있다.

보통 사료에 항생제를 첨가하는 이유는 질병예방과 가축의 증체량을 향상시키기 위해서이다. 사료에 첨가되는 항생제는 하나만 이용되는 것이 아니라 두 종류 이상이 혼합 첨가되므로 항생제를 남용하게 되어 가축에 잔류하는 문제와 항생제에 내성을 갖는 병원균들의 출현이 문제된다.

이러한 문제점들 때문에 사료에 항생제 첨가를 최소화하는 것이 법제화되어 있고, 수의사의 처방없이는 농장에서 자가진단 항생제의 사용이 엄격히 규제되고 있다. 예를 들면, 일본에서는 주의가 필요한 항생제의 경우 수의사 처방에 의해서만 사용할 수 있도록 규정하고 있다. 미국 역시 수의사 처방약, 수의사 전용약, 일반약 등으로 동물의약품을 엄격히 구분해 사용을 제한하고 있다.

그러나 이와 같은 항생제 남용때문에 항생제 사용에 대한 규제만을 강화한다면 가축 증체율 감소, 사료 효율 저하 및 폐사율 증가 등으로 인해 생산성이 급격히 떨어져 축산 농가들이 어려움에 봉착하게 되므로 항생제를 대체하면서도 안전한 제품을 개발하고자 하는 노력이 이루어지고 있다.

이와 같은 노력의 일환으로 유·무기산, 식물 유래의 추출물 및 생균제 등을 이용한 제품도 개발되어 상용화되고 있으나, 항생제 대체 효과는 기대 이하로 아직까지 항생제를 대체할 우수한 제품이 개발되지 않았고, 시장에서는 좋다고 여겨지는 것(예를 들면, 유기산, 유산균, 면역증강제 등)을 무작위로 혼합하여 사용하고 있는 실정이다. 항생제 대체물이 되기 위해서는 먼저 항생제와 유사한 정도의 항균력을 가져야 할 것이다. 가축에 독성이 없으며, 체내에 축적되지 않는 안전한 물질이어야 할 것이다. 또한 가격 측면에서도 항생제에 비해 크게 비싸지 않아야 효용성 및 사업성이 있으므로 천연 항균제의 원료가 되는 물질은 구하기 쉬우면서도 가격적 부담이 없어야 할 것이다.

봉독은 자연 상태의 벌이 가지고 있는 독으로 면역기능을 활성화시켜 질병을 치료하는 효과가 있다고 알려져 있다. 특히 몇몇 농가에서는 시범적으로 생봉독(whole bee venom)을 사용하여 질병에 대한 예방제로 사용하여 매우 긍정적인 결과를 얻은 바 있다.

봉독의 주요 성분으로는 표 3에 표시된 바와 같이 멜리틴, 아파민, MCD-펩티드(mast cell degranulating peptide) 등이고 전체적으로 진통, 소염, 항균작용과 함께 뇌하수체 호르몬 분비촉진, 혈액순환 촉진 등의 효능이 알려져 있다.

봉독은 생물학적 제재(biological drug)로서 안정적인 수급이 가능하고 원료의 균일성, 성분 비율, 저장 및 안전성 등의 측면에 대한 관리가 필요한 동물성 생약이다.

도 17은 본 발명에 사용되는 수지봉독 조성물의 단백질 성분을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 18은 수지봉독이 수용성 봉독에 비하여 효과 및 안전성면에서 보다 뛰어남을 보여주는 그래프이다. 도 18에서 EnBV는 캡슐화(encapsulation)된 봉독을 나타내고, WBV는 수용성 봉독을 나타내며, LWBV는 수지봉독을 나타낸다. 또한 PEF는 고전압 처리된 봉독을 나타낸다.

도 19a 내지 19g는 본 발명에서 사용되는 수지봉독 조성물의 비단백질 성분을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 19a 내지 19e에서, 도 19a는 표본(standard) 봉독의 비단백질 성분을 분석한 구성성분을 보여준다. 도 19a에서 EBV7은 디노닐프탈레이트(dinonyl phthalate)를 나타내고, EBV11-7은 크리신(chrysin)을 나타낸다. 가로축은 UV(UltraViolet) 흡광도를 나타내고 단위로는 mAu를 사용한다.

도 19f는 봉독 중 시티딘(cytidine)과 아데노신(adenosine)을 TLC를 이용하여 분석한 도면이다.

도 19g는 봉독 중 피노셈브린(pinocembrin)을 TLC를 이용하여 분석한 도면이다.

여기서 CBV(Crude bee venom)는 천연성분으로 되어있는 미정제봉독을 의미한다. WBV(water soluble bee venom)는 CBV로부터 얻어진 수용성성분으로 이루어진 봉독을 의미하고, LBV(Lipid soluble bee venom)는 지용성성분으로 이루어진 봉독(지봉독)을 의미하며, LWBV(Lipid-water soluble bee venom)는 수용성 및 지용성성분으로 이루어진 봉독(수지봉독)을 의미한다.

표 4는 봉독의 비단백질 성분을 분석한 것을 보여주는 표이다.

분율	분자량(M.W)	억제제 무첨가	세포독성검사	비고
BVE	-	5-10㎍	++(at10㎍/㎖)	분율
BVB	-	80㎍	-(at100㎍/㎖)	분율
BV-3	296.31	>200uM	+(at 80uM)	화합물
BV-7	418.31	>60uM	-(at 60uM)	화합물
BV11-7	286.05	60uM	+(at40uM)	화합물

표 4에서 BVE는 봉독의 에틸아세테이트 추출분획한 성분을 나타낸다. BVB는 봉독의 부탄올 추출분획한 성분을 나타낸다. BV-3은 11-에이코세놀을 의미하고, BV-7은 디노닐 프탈레이트(dinonyl phthalate)를 의미하며, BV11-7은 크리신(chrysin)을 의미한다.

도 18 또는 도 19a 내지 19g와 같은 봉독에 대한 단백질 분석 자료들은 비단백 지표성분 6종 이외 단백질(펩타이드 등) 지표 성분들(효소 및 펩타이드) 기준으로 규격화될 수 있다. 특히 봉독의 지표성분과 안정성에 관한 연구결과 봉독을 고전압 처리(Pulsed electric field; PEF) 또는 캡슐화(encapsulation)하면 봉독을 구성하는 단백질성분들을 선택적으로 변화시킬 수 있다.

도 20a와 도 20b는 봉독에 대한 고전압 처리(PEF) 전후 CBV(crude bee venom), WBV(water-soluble bee venom) 및 LWBV(Lipid and Water soluble bee venom)의 양적인 변화를 보여주는 그래프이다.

표5는 봉독 조성물에 대한 고전압 처리 후 고성능 액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)의 결과를 보여주는 표이다.

	CBV		WBV		LWBV
	처리전	처리후	처리전	처리후	처리전	처리후
포스포리파제	4393±27	4720±24(7%↑)	2378±3	2941±2(23%↑)	2710±17	2778±29
멜리틴	31269±159	38353±1243(22%↑)	19689±178	20826±519(5.6%↑)	20153±173	21045±111(4%↑)

표 5에 표시된 데이터는 평균±표준편차(standard deviation)로, 고전압 처리 전후의 HPLC 면적을 나타낸다. 표 5를 참조하면 PEF 처리 결과 미정제봉독(CBV)의 멜리틴이 22%증가하였고, 수용성봉독(WBV)의 포스포리파제 또한 23%증가한 것을 알 수 있다. 하지만 수지봉독(LBVW)의 경우 포스포리파제와 멜리틴의 큰 변화는 관찰되지 않았다.

다만 수용성봉독(WBV)이나 수지봉독(LWBV)의 경우 모두 미정제 봉독(CBV)으로부터 정제되는 과정에서 포스포리파제와 멜리틴의 양적인 감소가 있었으나 수지봉독이 수용성 봉독에 비해 고전압 처리에 더 안정적이라는 사실을 확인할 수 있었다.

본 발명의 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법은 봉독을 수용성용매와 지용성용매를 이용하여 1차 분별하는 단계(S10)와, 상기 분별된 1차 수용성층에 지용성용매를 가하여 2차 분별하는 단계(S20)와, 상기 분별된 2차 수용성층에 지용성용매를 가하여 3차 분별하는 단계(S30)와, 상기 분별된 3차 수용성층을 필터링하여 불용성성분을 제거하여 수용성층을 준비하는 단계(S40)와, 상기 1차 분별된 지용성층에 2차 분별된 지용성층과 3차 분별된 지용성층을 합한 다음 필터링하여 불용성성분을 제거하여 지용성층을 준비하는 단계(S50)와, 상기 3차 수용성층을 필터링한 수용성층과 상기 필터링한 지용성층을 혼합하는 단계(S60) 및 상기 수용성층과 지용성층의 혼합물을 농축 및 건조하여 수지봉독 조성물을 수득하는 단계(S70)를 포함한다.

도 21은 본 발명에 따른 면역증강용 수지봉독 조성물의 또 다른 제조방법을 보여주는 도면이다.

도 21에 제시된 본 발명의 면역증강용 수지봉독 조성물의 또 다른 제조방법은 봉독을 수용성용매를 이용하여 추출하는 단계(S11)와, 상기 수용성용매를 이용하여 추출한 봉독을 원심분리하여 수용성층을 취하고 필터링하여 불용성성분을 제거하는 단계(S21)와, 원심분리한 잔사를 건조하여 수용성용매를 제거하는 단계(S31)와, 건조된 상기 잔사에 지용성용매를 가하여 추출하는 단계(S41)와, 상기 지용성용매를 이용하여 추출한 봉독을 여과하여 불용성성분을 제거하는 단계(S51)와, 상기 준비된 수용성층과 지용성층을 서로 혼합하는 단계(S61) 및 상기 수용성층과 지용성층의 혼합물을 농축 및 건조하여 수지봉독 조성물을 수득하는 단계(S71)를 포함한다.

또한 이렇게 수득된 수지봉독 조성물을 20,000~30,000V 사이의 전압으로 1~50㎲의 시간 동안 고전압 처리시, 미정제봉독과 수용성봉독의 경우에는 멜리틴과 포스포리파제가 상대적으로 증가하는 것을 확인할 수 있다.

수지봉독 조성물의 수용성층과 지용성층 부피비가 1:0.1~1일 때 면역증강과 통증치료에 가장 효율적인 특징을 나타내고, 수지봉독 조성물의 수용성층과 지용성층 부피비가 0~0.5:1일 때 우수한 항염증 효능을 갖는다.

여기서 수용성용매는 물, 에틸알콜, 메틸알콜 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.

여기서 지용성용매는 에틸아세테이트, 클로로포름, 에테르, 부탄올 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.

또한 본 발명에 따른 수지봉독 조성물의 경우에는 면역력 조절과 증체 효과를 얻기 위해 나노캡슐화(Nano encapsulation)하는 것도 가능하다.

이하에서, 본 발명에 따른 면역증강용 수지봉독 조성물의 제조방법의 실시예들을 더욱 구체적으로 제시하며 다음에 제시하는 실시예들에 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예2>

실시예2는 본 발명에 따른 면역증강용 수지봉독 조성물의 제조방법을 나타내는 실시예이다.

도 17은 본 발명에 따른 면역증강용 수지봉독 조성물의 제조방법을 보여주는 도면이다.

도 17을 참조하면, 미정제봉독(CBV) 2.5g을 비이커에 넣고 증류수(DW) 100㎖에 용해시켰다. 용해된 봉독을 분별깔때기에 넣고 증류수 150㎖로 비이커의 내벽을 씻어주면서 첨가하였다. 에틸아세테이트(Ethyl acetate; EA) 250㎖를 넣고 잘 흔들어 혼합시켰다. 이렇게 준비된 상기 혼합액을 분별깔때기를 통해 정치시키고 뚜껑을 열어 압력을 빼고 정치해 두면 EA층과 증류수층이 성질상 차이로 분리된다.

이렇게 분리된 위층(EA층1)과 아래층(DW층1) 중 아래층에 있는 증류수를 비이커를 통해 받아 놓았다.

이때 위층은 따로 분리하여 받아 놓았다. 분리된 증류수층(DW층1)을 분별깔때기에 넣고 EA 250㎖를 넣고 잘 혼합시켜 두면, 위층과 아래층이 분리된다.

이렇게 분리된 위층(EA층2)과 아래층(DW층2) 중 아래층에 있는 증류수를 비이커를 통해 받아 놓았다.

이때 위층은 따로 분리하여 받아 놓았다. 분리된 증류수층(DW층2)을 분별깔때기에 넣고 EA 250㎖를 넣고 잘 혼합시켜 두면, 위층과 아래층이 분리된다.

이렇게 분리된 위층(EA층3)과 아래층(DW층3) 중 아래층에 있는 증류수를 비이커를 통해 받아 놓았다.

이때 위층은 따로 분리하여 받아 놓았다.

분리된 증류수층(DW층3)과 EA층(EA층1, EA층2, EA층3 혼합액)부피비가 1:1에서 1:0.1의 범위 내에서 4종류의 시료를 만들었다. 상기 제조된 4종류의 시료를 농축하고 건조하였다.

시료를 농축하고 건조하기 전에 지용성층인 EA층과 수용성층인 증류수층에서 불용성성분을 제거하는 공정을 수행하였다.

이렇게 제조된 면역증강용 수지봉독 조성물을 닭(육계)에 투여하여 면역성 테스트를 시행하였다.

<실시예3>

미정제봉독 1.0 g을 비이커에 넣고 증류수 100 ㎖를 가하여 추출하였다.

3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 수용성층(DW층)을 분리하여 취한 다음 필터링하여 불용성성분을 제거하고 수용성층을 보관하였다.

원심분리한 잔사를 건조하여 미량의 남은 증류수를 제거하였다.

건조한 잔사에 클로로포름 200 ㎖를 가하여 추출한 다음 필터링하여 불용성성분을 제거한 후 클로로포름층을 준비하였다.

증류수층과 클로로포름층을 혼합한 다음 실시예1과 같이 농축 및 건조하여 본 발명의 수지봉독 조성물을 제조하였다.

또한 후술하는 바와 같이 수용성층과 지용성층 혼합물에서 그 부피비는 수용성층과 지용성층의 부피비가 1:0.1~1인 것이 면역활성에 있어 우수한 특성을 나타내는 데 유리하다.

도 24 내지 도 25의 그래프에서 표시된 각 부호의 의미는 다음과 같다.

** control: 수지봉독 무투여군(대조군)

** Ocular: 점안

** Spray: 스프레이

<실험예4> 실험방법 및 수지봉독의 투여

먼저 육계 병아리(Ross)를 11개군으로 분류하고 봉독을 조성에 따라 준비하였다. 준비된 봉독은 LBV(지용성봉독), WBV(수용성봉독), LWBV(수지봉독) 및 나노캡슐화된 봉독(EnBV)이었다. 이러한 정제봉독에 대한 투여회수는 1회 또는 2회로 한정하였다. 또한 시기는 부화 후 24 시간 내에 안점투여하는 방식을 사용하였다.

<실험예5> 육계의 증체효과 비교

육계 병아리에 대하여 5주 동안 증체율에 대한 비교실험을 실시하였다. 여기서 수지봉독은 지용성분획과 수용성분획의 조성 비율에 따라 6종류로 구별하고 지용성봉독(LBV)은 2종류로 구별하여 실험을 실시하였다.

도 22a는 본 발명에 따른 수지봉독 조성물의 효과 실험 중 육계의 증체량을 나타내는 그래프이고, 도 22b는 본 발명의 수지봉독 조성물의 효과실험 중 육계의 누적 증체량 비교를 나타낸 그래프이다. 실험에 대한 상세는 표 6을 참조로 하여 설명한다.

	구분	내용	n
1	조절	용제 투여	20
2	LWBV-1	봉독의 지용성성분과 수용성성분을 일정비율로 혼합한 시료를 투여	19
3	LWBV-2		19
4	LWBV-3		19
5	LWBV-4		19
6	LWBV-5		19
7	LWBV-6		19
8	LBV-1	봉독의 지용성성분을 투여	19
9	LBV-2		19
10	WBV	봉독의 수용성성분을 투여	19
11	EnBV	캡슐화한 봉독을 투여	15

실험예5에 따른 실험결과 5주간 관찰한 육계의 증체량은 수지봉독을 투여한 경우와 캡슐화된 봉독을 투여한 경우에만 유의적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 누적 증체량의 실험결과는 대조군에 비해 약 120%의 증가가 나타났다.

도 23a는 수지봉독의 투여횟수에 따른 증체량의 변화를 보여준다. 도 23b는 B세포의 활성이 수지봉독의 투여횟수에 따라 변하는 정도(흡광도)를 보여주는 그래프이다. 도 23c는 T세포의 활성이 수지봉독의 투여횟수에 따라 변하는 정도(흡광도)를 보여주는 그래프이다. 도 23d는 수지봉독의 투여 횟수에 따라 CD4⁺/CD8⁺의 비율이 변하는 정도를 보여주는 그래프이다.

CD4⁺세포는 미성숙된 헬퍼(helper) T세포로서 MHC(Major histocompatibility complex, MHC)를 인식해 이것과 결합하는 세포이다.

CD8⁺세포는 미성숙된 킬러(killer) T세포로서 세포성 면역을 담당한다. 생체는 자기 항상성을 지키기 위해 생체 내에 침입하는 이물질을 식별해서 이를 파괴하는 작용을 하는데 이것을 면역이라 한다. 생체가 배제하여야 하는 것은 세균이나 바이러스 등 외계에서 들어온 이물질뿐만 아니라 침입자에 감염된 세포, 노폐 조직이나 암화된 세포 등 변형된 자기성분도 포함한다. 생체는 표피조직이나 표피에서 분비되는 물질들 그리고 관구조로 몸과 격리되어 있는 체내 기관 등으로 1차 방어선을 형성하고 있다. 1차 방어선을 뚫고 체내로 침입자가 침투하게 되면 2차 방어선이 작동한다. 1차 방어선을 뚫고 들어온 침입자에 대항하기 위해 즉각 작동하는 체내 방어선으로 침입자를 구별하지 않으며 화학방어와 세포방어로 나뉜다.

침입을 받은 세포가 침입자를 죽이거나 침입을 저지하는 화학물질을 분비한다. 라이소자임은 땀, 침, 눈물 등에 존재하는 단백질로서 세균의 세포벽을 녹인다. 이때 보체는 약 20종류의 혈장단백질로서 침입자 표면을 둘러싸 식세포의 포식(옵소닌 작용)을 촉진하거나 직접 침입자의 지질막에 구멍을 뚫는다.

이에 대하여 비특이적 세포방어라고 하는 것은 매크로파지(대식세포)와 백혈구, 단핵구들이 침입자를 공격하는 것을 말한다.

상술한 비특이적 방어에 대하여 특이적 방어기구는 면역을 말한다. 면역반응에는 체액성면역과 세포성면역이 있다. B림프구는 적색골수와 태아의 간에서 생성된다. 헬퍼 T세포의 도움을 받아 형질세포(plasma cell)로 분화하여 항체를 분비하는 체액성반응을 하며 일부는 기억세포로 된다.

헬퍼 T림프구는 흉선에서 분화한다. 사이토카인을 분비하여 다른 면역세포 들을 분화시키며 일부는 기억세포가 된다.

킬러 T림프구 또한 흉선에서 분화한다. 바이러스나 병원균을 직접 파괴하거나 이들에 감염된 자신의 세포 또는 암세포를 파괴하는 세포성 반응을 한다.

수지봉독 또는 캡슐화된 봉독은 눈(접안) 또는 코의 점막(비강) 투여방식으로 사용될 수 있으며 면역 기능이 떨어졌을 때 발생하는 설사 및 만성 소모성 질병을 예방하는 것이 가능하다. 설사 및 만성 소모성 질병을 예방하기 위해 사용하는 경우에는 동물 또는 사람에 아주 소량(멜리틴 기준으로 1회 투여량이 10㎍미만) 투여하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 0.1~10㎍ 중량 범위에서 지속적으로 면역세포를 자극하는 방식으로 투여하는 것이 바람직하다.

이는 봉독의 면역 증강효과를 활용한 예방 치료제 개념으로 물리적으로 안정화된 서방출 제형으로 작용하여 기존의 수용성봉독의 활용과 차별화되며 매우 안정된 형태로 표준화하여 사용할 수 있다.

<실험예6> 수지봉독의 항균활성 비교

도 17에 도시된 수지봉독의 정제방법에 의하여 지용성 비율 1:1에서 1:0.1의 범위 내에서 조제된 시료와 미정제봉독, 지용성봉독, 수용성봉독 및 고전압 처리된 봉독 시료의 최소농도억제(Minimum inhibitory concentration; MIC) 시험을 통해 7종 균주에 대한 항균활성을 측정하였다.

표 7은 본 발명에 따른 수지봉독의 최소농도억제 실험결과를 보여주는 표이다.

	P.C	용매	No.1	No.2	No.3	No.4	No.5	No.6	No.7	No.8	No.9	No.10	No.11	No.12
아우레스(S.aureus)	125	D.W	500	500	100	250	500	500	500	500	500	500	250	500
		DMSO	31.25	31.25	62.5	31.25	31.25	31.25	31.25	31.25	31.25	31.25	31.25	31.25
하이래(E.hirae)	62.5	DW	1.95	7.81	1.95	0.98	1.95	1.95	1.95	1.95	1.95	1.95	0.98	0.98
		DMSO	7.81	7.81	15.63	15.63	3.91	15.63	7.81	7.81	7.81	7.81	7.81	7.81
루토스(M.Luteus)	62.5	DW	0.98	1.95	3.91	1.95	0.98	1.95	1.95	0.98	1.95	1.95	0.98	0.95
		DMSO	7.81	15.63	15.63	15.63	7.81	15.63	15.63	15.63	15.63	7.81	7.81	7.81
뮤탄스(S.mutans)	62.5	DW	62.5	125	>1000	62.5	62.5	62.5	250	62.5	62.5	62.5	31.25	31.25
		DMSO	62.5	62.5	62.5	31.25	31.25	62.5	62.5	62.5	31.25	31.25	31.25	31.25
에피미디스(S.epidermidis)	125	DW	31.25	31.25	62.5	31.25	31.25	62.5	31.25	62.5	31.25	31.25	31.25	31.25
		DMSO	62.5	62.5	62.5	62.5	31.25	62.5	125	62.5	62.5	31.25	31.25	62.5
서브틸러스(B.subtilis)	62.5	DW	250	500	500	500	500	500	500	500	500	250	500	500
		DMSO	500	1000	1000	1000	500	1000	1000	1000	500	500	500	500
아크네스(P.acnes)	125	DW	500	1000	1000	500	500	500	1000	500	500	500	250	250
		DMSO	250	250	250	250	125	250	500	250	250	125	125	125

표 7에서 P.C는 양성대조군(positive control)을 의미하고, 단위는 ㎍/㎖이다. No.1에서 No.12까지는 시료의 특성에 따라 붙인 인덱싱 넘버이다.

시험에 사용된 7개의 균주 중 하이래(hirae) 균주에서 가장 높은 활성을 보였고, 미정제봉독(No.1)과 지용성봉독(No.3)은 고전압처리 후 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 용매로 하였을 때 항균활성이 각각 2배(No.5), 4배(No.7)로 증가하였다. 지용성비율에 따른 4종류의 수지봉독 중 D.W(distilled water)를 용제로 하였을 때, 2가지 시료(No.11, No.12)에서 항균활성이 미정제봉독(No.1)보다 모두 2배 증가하였다.

봉독 시료에서 최소농도억제 실험은 디스크 방법에 사용한 시료 배지로 단계별로 희석하여 최대 농도가 2000㎍/㎖(최종 농도 1000㎍/㎖)가 되게 한 후 단계적으로 희석(serial dilution)하였다. 또한 하루 동안 배양한 균을 600nm에서 흡광도 0.2(최종 흡광도 0.1)가 되도록 배지로 희석하였다.

시료 처리는 37℃에서 120rpm(round per minute)으로 24시간 동안 수행하였다.

<실험예7> 정제봉독의 지용성 함량이 육계의 면역력에 미치는 영향

육계의 면역력 실험에 사용된 봉독의 시료는 총 4종류였고, 수용성과 지용성을 모두 포함하고 있는 수지봉독이 대상이었다.

다만, 상기 조성물 제조방법은 미정제봉독(CBV) 2.5g에 수용성용매 250㎖, 지용성용매 750㎖를 사용하였으며 수지봉독 비율은 사용된 용매 부피 기준으로 수용성은 250㎖를 1로 하고, 지용성은 750㎖를 1로 하여 수용성:지용성의 비율로 표기하였다.

각 시료는 지용성성분 함량에 따라 차이가 있으며 최대 지용성 함량을 1로 볼 때, 1:1에서 1:0.1의 범위 내에서 만들어진 4종류의 시료가 그 대상이었다. 각각의 봉독 시료는 용제를 사용하여 2.1㎎/㎖(중농도)의 농도로 제조하여 점안과 스프레이방식의 두 가지로 실시하였다. 각 접종법에 따른 봉독의 투여량은 스프레이접종의 경우 5㎖/10chicks로 실시하였고, 점안접종의 경우 10㎕/chick로 실시하였다.

7-1. 비장 내 T cell의 CD4⁺/CD8⁺ 비율

비장에서 분리한 림프구의 비율을 유세포 분석기를 이용하여 비교 분석하였다. 비장 적출 후 셀 스트레이너(cell strainer)를 이용하여 세포를 유리시킨 후 RBC(Red blood cell), 라이시스 버퍼(lysis buffer)에 10분간 현탁시켜 적혈구를 파괴하였다. 다음으로 2,500rpm에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고 PBS(Phosphate Buffer Saline)로 원심 세척하여 림프구의 수를 5.0×10⁶cell/㎖ 농도로 희석하였다. FITC anti-chicken CD3(총 T 세포)와 PE 안티치킨(anti-chicken) BU -1 (B 세포) 또는 FITC(Fluorescein IsoThio-Cyanate) 안티치킨(anti-chicken) CD4(help T cell)와 PE 안티치킨(anti-chicken) CD8(cytotoxic T세포)의 항체로 암실에서 30분간 반응시켜 염색하였다. 반응 후에 2회 원심세척하고 PBS 1㎖를 분주하여 유세포 분석기(FACS Calibur FACS, BD Biosciences, USA)를 이용하여 비장내 림프구 비율을 측정하였다.

도 24는 본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 수지 조성물에 대하여 육계의 비장에서 분리한 림프구(helper T 세포)에서의 CD4⁺와 CD8⁺의 비율을 나타내는 그래프이다.

도 24를 참조하면 점안(ocular)에 대한 결과 1 내지 4는 대조군과 큰 차이가 없었으나 스프레이 3(1:0.1~0.5)의 조성에서는 유의적인 변화가 나타난다는 것을 확인할 수 있다.

일반적인 면역상태의 주요 요소 중 하나인 CD4⁺와 CD8⁺의 비율을 분석한 결과 대조군(0.827±0.210)에 비해 스프레이 3의 조성에서만 1.358±0.225라는 유의적인 증가를 보였다.

7-2. 혈중 라이소자임(lysozyme) 활성 정도 실험

결정 라이소자임의 세균에 대한 분해 정도를 표준 커브로 사용하여 대조군과 봉독 투여군들의 혈장 라이소자임 농도를 비교 측정함으로써 대식세포의 활성을 평가하였다. 혈청 중 라이소자임 활성을 측정하기 위해 결정 라이소자임을 0.5, 1, 2, 3, 4, 5㎍/㎖의 농도로 녹여 표준으로 준비하였다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 200㎕ 씩의 라이소데익티쿠스(lysodeikticus) 용액을 넣고, 미리 준비한 표준 라이소자임 또는 혈청 20㎕씩 첨가하였다. 이렇게 준비된 시료를 41℃에서 1시간 동안 배양하여 15분 간격으로 흡광도를 측정하였다(540㎚). 시료의 라이소자임 활성 측정은 표준 커브에 시료의 시간에 따른 흡광도의 변화를 대입하여 구하였다.

대식세포에서 주로 분비되는 세균벽 파괴효소인 라이소자임 농도를 측정한 결과 대조군(9.113±1.118)에 비해 스프레이 3의 조성이 11.870±0.446으로 측정되어 유의적인 변화를 보여주었다.

도 25는 본 발명에 따른 수지봉독의 라이소자임 활성에 대한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 25를 참조하면 스프레이3 수지봉독(**로 표시)이 대조군과 비교하여 유의적인 결과를 보여준다는 것을 알 수 있다.

7-3. 봉독분획의 항염증 활성 연구

염증은 상처를 줄 수 있는 자극에 대한 생체의 방어 반응으로, 다양한 세포와 cytokine들이 관여하는 일련의 과정이다. 이 과정은 lipopolysaccharide(LPS) 와 같은 외부 자극원 또는 arachidonic acid 대사체 같은 내부 자극원들을 주요 매개로 하여 macrophage, granulocyte와 같은 염증성 세포를 염증부위로 침윤 시키는 것을 주요 특징으로 한다. 특히 염증 부위의 활성화 된 macrophage는 cytokine 뿐 아니라 arachidonic acid 대사체 그리고 nitric oxide(NO)등을 대량 생성함으로써 염증 매개에 큰 역할을 한다.

현재 염증성 손상을 예방하기 위해 개발된 많은 후보물질들이 iNOS 또는 COX-2의 활성을 직접 억제하거나, 전사 단계를 조절하는 NF-B signaling 등을 억제함으로써 iNOS와 COX-2의 발현 유도를 선택적으로 조절할 수 있는 기능을 가지는 물질들이다.

RAW 264.7세포주에 봉독조성별로 각각의 농도에 따른 세포독성을 조사하였다. RAW 264.7 대식세포를 5X10⁵씩 96-well plate의 각 well에 넣고 8시간 안정화시킨 후, LBV 시료를 각 농도별로 첨가하여 16시간 전처리하였다. 그 후 대식세포에서 염증을 유발하는 세포내독소인 LPS(lopopolysaccharide)를 2 ug/ml의 농도가 되도록 세포에 처리하고 24시간 배양하였다. RAW 264.7세포의 생존율은 세포배양 후 MTT법에 의해 측정하였으며, 세포 염증의 지표로서 세포 배양액 중에 함유된 NO(nitric oxide)와 TNF-α(tumor-necrosis factor-α)를 정량키트를 통해 측정함으로서 LPS 유도 대식세포 염증에 대한 BV의 항염증 효과를 계측하였다.

그 결과, 봉독분획의 조성비에 따라 세포독성의 차이를 나타내는 것을 확인하였고 LBV은 세포독성이 나타나지 않는 범위에서 항염증 반응을 나타내었다(도 26). 이 결과에서와 같이 봉독은 그 조성에 따라 독성 및 항염증 효과에 있어서 현저한 차이를 나타낸다.

도 26은 본 발명에 따른 봉독분획 중 지용성 분획(LBV)에 대한 세포독성 보여주는 그래프이다.

도 27은 본 발명에 따른 봉독분획 중 지용성 분획(LBV)에 대한 항염증 효과를 보여주는 그래프이다.

이하에서는 수지봉독을 사용한 항통증 실험 결과에 대하여 논의한다.

신경병증적 통증은 주로 말초신경 손상 후 발생하는 자발통, 이질통 및 통각과민 등을 특징으로 하는 만성통증증후군이며 온도변화나 가벼운 접촉에 의해서도 심한 통증을 유발하고 일반적인 진통제나 마약제재에 의해 통증이 잘 완화되지 않는다.

신경병증적 통증을 나타내는 기전에 대한 지식 및 그것을 조절하는 새로운 약물들을 찾는 능력은 외상 후 통증이 오는 말초신경병증 랫드 모델의 도입으로 크게 진전되었다.

현재까지 랫드의 신경병증적 통증모델은 CCI(만성 압축 손상:Chronic Constriction Injury), PSL(부분적 좌골신경 결찰:Partial Sciatic Ligation), SNL(척수신경 결찰: Spinal Nerve Ligation) 등 3가지 모델이 널리 사용되고 있다.

이들 모델을 만드는 기본 과정에 따르는 4종류의 행동적 기준(assay)들이 신경병증적 통증증상들을 정량화하는데 사용되고 있다. 즉, 열에 대한 통각과민(Protocol 1: Heat Hyperalgesia), 기계적인 통각과민(Protocol 2: Mechano Hyperalgesia), 기계적인 이질통(Protocol 3: Mechano Allodynia), 그리고 냉에 대한 이질통(Protocol 4: Cold allodynia) 등이 기본 통증모델의 결과를 평가하기 위해서 공통적으로 측정된다.

참고로 통각과민(Hyperalgesia)은 아픔을 과대하게 느끼는 상태를 말한다. 때때로 촉자극(刺戟)이나 온도자극 등, 보통은 아픔으로 느끼지 않는 것과 같은 자극에 대해서도 아픔을 느낀다. 통각로가 자극상태에 있다고 생각되며, 신경통, 신경염, 뇌나 척수의 염증, 수막염 등의 초기에 볼 수 있다. 통각수용자극에 의해 통증이 정상보다 증강되고 오래 지속되는 상태를 말한다.

이질통은 통각 수용기를 활성화시키지 못하는 자극에도 통증이 나타나는 것을 의미한다.

여기서 이들의 정의는 다음과 같다. 통각과민은 유해성 자극에 의해 야기되는 과도한 통증 감각이고 이질통은 비유해 자극에 의해 유발되는 통증이다. 개념적으로는 이 둘의 차이점이 구별되지만, 쥐와 환자를 이용한 실험에서는 그 차이가 모호한 경우가 있다.

(1) 만성 수축성 상해 모델: 외상 후 말초 신경병증성 통증의 첫번째 모델인 CCI 모델은 좌골 신경의 부분적인 신경절을 형성하는데 좌골신경은 무수초의 축색돌기(unmyelinated axons)보다 유수초의 구심성축색(myelinated afferent axons)에 훨씬 더 많은 영향을 끼친다. 말초신경을 전부 절개했던 이전 모델들과는 다르게 CCI 모델은 부분적인 단절을 통하여 신경의 타겟인 뒷다리를 자극해 유도되는 통증행동 분석을 가능하게 해준다.

(2) 신경병증성 통증의 국소 좌골신경 결찰(PSL) 모델

PSL 모델은 좌골신경의 국소 탈신경을 포함하지만 영향은 모든 굵기의 축색돌기(axon)에서 동일하게 나타난다.

(3) 신경병증성 통증의 척수신경결찰(SNL) 모델

좌골신경 안에 있는 구심성 축색은 4번째와 5번째 요추후근(lumbar dorsal roots)안에 그들의 중심가지(central branches)를 가지고 있다. CCI와 PSL 모델과 동일하게 SNL 모델은 좌골신경의 국소 탈신경을 제공한다. 그리고 PSL 모델과 동일하게 모든 사이즈의 구심성 축색(afferent axon)에서 효과가 같다. SNL 모델은 신경손상이 요척수 5번과 6번 신경수준에서 나타나는 것이 특색이다. 이곳은 척수신경의 후근(dorsal roots)과 복근(ventral root)이 후근신경절(DRG, Dorsal Root ganglion)의 원위부에서 만나는 지점이며, 척수신경이 다양한 말초신경으로 분류되는 요신경총(lumbar plexus)의 근위부위에 해당한다.

요신경총은 요추(腰椎) 양측에서 후복벽 속에 있는 요신경의 망상구조로 사람은 제1, 2, 3 요신경의 전지(前枝)와 제12흉신경 및 제4요신경의 전지의 일부로 되어 있다. 그 아래 천골신경총과 합쳐 요천골신경총이라고도 한다. 분포 영역은 대략 하복부 ·골반 ·대퇴의 근육과 피부이며 이곳의 주요 신경에는 장골하복신경·장골서혜신경·음부대퇴신경·외측대퇴피신경·대퇴신경·폐쇄신경 등이 있다.

SNL 모델의 가장 유리한 점은 4번째 요추후근(lumber dorsal root)을 경유해 좌골 신경의 구심성축색(afferent axon)을 상하지 않게 하는 것이다.

이하에서는 열 통각과민, 기계적 통각과민, 기계적 이질통, 냉이질통에 대한 행동연구에 대해서 서술한다.

(1) 열통각과민은 하그리브스(Hargreaves) 장치를 사용해 측정한다. 하그리브스 장치는 투명한 플라스틱으로 만들어진 칸막이 안에 쥐들이 갇혀 있고, 밝고 열이 나는 광원을 뒷발바닥에 쏘이는 발톱튀기기(paw-flick) 테스트로 진행한다.

이러한 발톱튀기기(paw-flick) 테스트의 주요한 측정결과는 각 뒷발의 평균 도피 잠복기가 된다.

(2) 기계적 통각과민은 바늘로 찌르는 테스트이다. 기계적 통각 과민 테스트는 두가지 방법으로 측정된다. 쥐들은 철망바닥이 깔린 투명한 플라스틱 케이지 안에 갇혀 있고, 그물은 약 1cm의 직경이다. 만약 구멍이 더 크면 신경 손상된 발은 구멍으로 빠질 것이고, 만약 더 작으면 보기가 힘들 것이다. 바늘로 찌르는 것에 대한 일반적인 반응은 매우 작은 진폭과 짧고 지속적인 도피반사이다. 신경 손상 이후에는 진폭과 지속이 많이 증가하고, 동물은 자극 부위를 자주 핥을 것이다. 자극을 받는 발은 종종 무감각한 지점을 갖고, 그 기점은 둘이나 세지점을 자극해야 한다. 이 테스트가 끝나면 동일 자극이 반대편 발바닥에 가해져야 한다. 자극을 받은 쥐들이 휴식을 취하거나 거의 휴식을 취할 때마다 자극해야 한다. 왜냐하면, 강하게 굽힌 다리는 추가적인 굴근 반응의 탐지가 어렵기 때문이다.

(3) 기계적 이질통은 본프레이 헤어스(von Frey Hairs)를 이용하여 측정한다. 헤어스(hairs)는 서로 다른 직경의 나일론 모노필라멘트(단사)인데 헤어가 구부러지게 하는 정도의 힘으로 피부에 압력이 가해질 때 정해진 정도의 힘을 발휘한다. 일반적으로 사용하는 모노필라멘트의 세팅은 세므-와인스타인 시리즈(Semmes-Weinstein series)에 나온다. 모노필라멘트는 20개의 필라멘트로 이루어져 있고 그 특징은 표 8에 표시되어 있는 바와 같다.

순서	라벨(Log force(0.1mg))	힘(force)(g)	직경(mm)
1	1.65	0.0045	0.0635
2	2.36	0.0230	0.0762
3	2.44	0.0275	0.1016
4	2.83	0.0677	0.1270
5	3.22	0.1160	0.1524
6	3.61	0.4082	0.1778
7	3.84	0.6968	0.2032
8	4.08	1.194	0.2286
9	4.17	1.494	0.2540
10	4.31	2.062	0.3048
11	4.56	3.632	0.3556
12	4.74	5.500	0.3810
13	4.94	8.650	0.4064
14	5.07	11.70	0.4318
15	5.18	15.00	0.4826
16	5.46	29.00	0.5588
17	5.88	75.00	0.7112
18	6.10	127.0	0.8128
19	6.45	281.5	1.0160
20	6.65	447.0	1.1430

본프레이 헤어스(von Frey Hairs)에 대해 유의해야 할 몇 가지 포인트는 첫째, 자극은 때때로 압력(뉴턴= 힘×면적)의 단위로 보고된다는 것이다. 자극 영역에서 머리카락의 전체 단면적은 피부와 동등한 접촉에 있는지, 어떤 모서리 효과가 없는지 그리고 피부의 탄력이 무시될 수 있는지 등을 가정하여 추정하는 방법을 사용한다. 둘째, 나일론 모노필라멘트는 친수성으로 흔히 발생 습도에서 단단함과 나타내는 힘이 놀라울 정도로 큰 영향을 받아 변화가 나타난다. 이것은 좌우의 비교를 수행할 때 또는 모든 실험그룹이 같은 날 실험을 하는 경우에는 문제가 되지 않는다. 그러나 비교할 데이터가 몇 일 또는 몇 주의 과정을 통해 얻은 것을 이용한다면 심각한 오류가 발생할 수 있다. 후자의 경우, 테스트실의 습도는 주의깊게 확인되어야 한다. 습도의 특정수준은 각 헤어(hair)를 판 밸런스(pan balance)와 비교하여 눌러 보정할 수 있다.

셋째, 모노필라멘트의 끝이 무딘 경우 날카로운 지점이 상대적으로 무딘 끝대신 적용된다.

<실험예8>

SNL 모델을 활용하여 봉독 조성물의 이질통에 대한 항통증 효과를 확인하였다. 250~300g의 수컷 스프라그-돌리(sprague-Dawley rat) 종을 실험에 사용하였다. 사료는 깔집 위에 충분히 공급하여 통증 유발에 따른 통증으로 인한 사료 섭취의 어려움을 최소화시켰으며, 실험에 따른 모든 측정방법은 NIH(NIH publication no. 86-23, revised 1985)에 따라 수행하였고, 통증 관련 실험은 국제 통증학회(International Association For the Study of Pain, IASP) 규정을 준수하였다.(Zimmermann M., Pain, 16: 109-110(1983)).

쥐(rat)를 2% halothane과 N₂O/O₂(2:1 ratio) 혼합가스로 흡입 마취시킨 후 등쪽의 털을 깍고 수술대 위에 복와위(prone position)로 올려 놓고 사지를 고정시켰다. 모든 수술은 무균적으로 조작하였고, 쥐의 왼쪽 허리 엉치부위(lumbar& sacral regions)의 등쪽 부분을 위, 아래로 3cm 정도 절개한 후, 등근육을 싸는 근막을 미세가위(blunt-tipped scissor)를 사용하여 등근육과 결합조직을 제거하여 6번째 허리 척추(L6)의 가로 돌기를 제거하고, 그 아래로 지나가는 L5 척수신경의 앞 가지(ventral ramus)를 실크(black silk, 6.0)를 이용하여 단단히 붙들어매고, 매듭의 아래 척수신경을 미세가위로 자르고, 근육과 피부를 봉합하여 일련의 결찰수술을 완료하였다. 대조군(sham)은 위의 방법 중 결찰과 신경절단 전단계까지는 동일하게 시행한 후 실험을 실시하였다.

(실험 결과)

척수신경 결찰수술이 성공적으로 끝난 랫드의 경우 수술된 쪽의 발바닥이 아래로 떨어지고(planar flexion), 안쪽을 향하며(inversion), 뒷다리를 약간 절름거리며, 지면에 완전히 착지하지 못하는 특징을 보인다.

이러한 쥐(rat)는 수술 후 특징적인 신경병증성 통증반응(neuropathic behaviors), 즉 부드러운 낙타털의 자극에도 발바닥을 들어올리는 행동을 나타내는데 이러한 통증반응은 수술 후 5일 정도에 최고점에 이른다. 즉 수술 후, 7일이 지난 시점에서 본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물(LWBV) 0.1~0.5mg/kg(body weight, B.W.)과 수용성봉독(WBV) 0.1mg/kg(b.w)의 농도를 투여한다. 즉, 실험동물의 체중 250g을 기준으로 0.0001~1mg/kg 투여의 경우 0.025~0.25mg의 수지봉독 조성물을 멸균식염수 또는 용제(프로필렌글리콜 0.05~1wt%, 에탄올 0.1~5.0wt% 및 멸균수 등의 혼합 용제) 0.5ml에 녹여 각각 복강주사한 후, 시간대별로 앞서 설명한 행동기준(behavioral assays(mechano-allodynia)법으로 "von Frey Hairs"를 사용하여 평가하였다.

도 28은 본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 통증실험결과를 보여주는 막대그래프이다.

도 29는 본 발명에 따른 수지봉독 조성에 따른 항통증 효과를 보여주는 꺾은선 그래프이다.

도 28 내지 도 29를 참조하면, 본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 투여군이 0.5시간 이후의 항통증적 지속성이 더 크고 현저하게 나타남을 확인할 수 있었다.

이것은 서로 다른 봉독 분획에 따라 통증에 대한 지속성(효과)이 차별화됨을 보여준다. 또한 본 실험예를 통해 만성통증에 대한 항통증 효과 분획으로써 본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 활용의 선택성을 제시한 것이라고 볼 수 있다.

한편 수지봉독의 이와 같은 차별화된 작용기전을 구체적으로 구명하기 위하여 사전 외과적인 방법으로 수지봉독을 주사한 그룹과 사후 수지봉독을 처리한 그룹을 상호 비교하였다. 그 결과 신경 결찰 2주 후에 중대하게 기계적인 통증의 한계치가 증가되었다. 게다가 신경 연결 7일 후에 위수술군(sham group)과 비교했을 때, 기계적인 통증에서 매우 현저한 차이가 관찰되었다.

사후 본 발명에 따른 면역증강 및 통증치료용 수지봉독 조성물 처리를 한 그룹에서 기계적인 한계치(SNL)는 7일 후에 크게 증대하였다. 그리고 이 효과는 SNL 후 14일 동안 지속되었다.

이상, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다.

Claims (16)

1. 봉독을 수용성용매와 지용성용매를 이용하여 1차 분별하는 단계(S10);
   분별된 1차 수용성층에 지용성용매를 가하여 2차 분별하는 단계(S20);
   분별된 2차 수용성층에 지용성용매를 가하여 3차 분별하는 단계(S30);
   분별된 3차 수용성층을 필터링하여 불용성성분을 제거하여 수용성층을 준비하는 단계(S40);
   1차 분별된 1차 지용성층에 2차 분별된 지용성층과 3차 분별된 지용성층을 합한 다음 필터링하여 불용성성분을 제거하여 지용성층을 준비하는 단계(S50);
   3차 수용성층을 필터링한 수용성층과 필터링된 지용성층을 혼합하는 단계(S60); 및
   상기 수용성층과 지용성층의 혼합물을 농축 및 건조하여 수용성 봉독성분 및 지용성 봉독성분을 포함하는 수지봉독 조성물을 수득하는 단계(S70)를 포함하는 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법.
2. 봉독을 수용성용매를 이용하여 추출하는 단계(S11);
   상기 수용성용매를 이용하여 추출한 봉독을 원심분리하여 수용성층을 취하고 필터링하여 불용성성분을 제거하는 단계(S21);
   원심분리한 잔사를 건조하여 수용성용매를 제거하여 수용성층을 준비하는 단계(S31);
   봉독에 대하여 지용성용매를 가하여 추출하는 단계(S41);
   상기 지용성용매를 이용하여 추출한 봉독을 여과하여 불용성성분을 제거하여 지용성층을 준비하는 단계(S51);
   상기 준비된 수용성층과 상기 지용성층을 서로 혼합하는 단계(S61); 및
   상기 수용성층과 지용성층의 혼합물을 농축 및 건조하여 수용성 봉독성분 및 지용성 봉독성분을 포함하는 수지봉독 조성물을 수득하는 단계(S71);를 포함하는 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 수용성용매는 물, 에틸알콜, 메틸알콜 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 지용성용매는 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 에테르, 부탄올 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   농축 및 건조하여 수득된 상기 수지봉독 조성물에 대하여 20,000~30,000V 사이의 전압으로 1~50㎲ 시간 동안 고전압 처리하는 단계(S80)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 수용성층과 지용성층의 부피비가 1:0.1~1일 때 면역증강과 통증치료에 효율적인 특징을 나타내는 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 수용성층과 지용성층의 부피비가 0~0.5:1로 이루어진 우수한 항염증 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 수지봉독 조성물은 육계에 투여시 육계의 비장에서 CD⁴⁺/CD⁸⁺의 비율이 0.4~1.5인 것을 특징으로 하는 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 수지봉독 조성물은 육계에 투여시 라이소자임 활성이 7~14㎍/㎖인 것을 특징으로 하는 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 수지봉독 조성물은 접안 또는 비강투여 방식으로 투여될 수 있는 것을 특징으로 하는 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 수지봉독 조성물은 비단백질 성분으로 디노닐프탈레이트(dinonyl phthalate), 크리신(chrysin), 11-에이코세놀(11-eicosenol), 시티딘(cytidine), 아데노신(adenosine), 피노셈브린(pinocembrin) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 수지봉독 조성물은 단백질 성분으로 멜리틴, 아파민, 포스포리파제A-2, 엠씨디펩타이드 중에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법.
13. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 수지봉독 조성물은 세포 독성 및 항염증에 대한 효과를 특징으로 하는 면역증강, 염증치료 및 통증치료용 수지봉독 조성물의 제조방법.
14. 제1항의 방법 또는 제2항의 방법으로 얻어진 수지봉독 조성물의 동물 체중당 투여량이 0.0001~1mg/kg인 것을 특징으로 하는 비경구 투여용 조성물.
15. 제14항에 있어서,
    상기 비경구 투여용 조성물은 피하 또는 복강주사 방식으로 투입될 수 있는 것을 특징으로 하는 비경구 투여용 조성물.
16. 제14항에 있어서,
    상기 수지봉독 조성물은 멸균식염수 또는 용제(프로필렌글리콜 0.05~1%, 에탄올 0.1~5.0% 및 멸균수 등의 혼합용제) 0.1~10㎖에 녹여 동물의 신체에 도포 또는 투입되는 것을 특징으로 하는 비경구 투여용 조성물.

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