KR101787618B1

KR101787618B1 - 항중추신경계 염증제

Info

Publication number: KR101787618B1
Application number: KR1020137010484A
Authority: KR
Inventors: 시로우 마와타리; 다케히코 후지노; 마사타카 이후쿠; 마사아키 스기야마; 히데타카 후추
Original assignee: 후지노 브레인 리서치 가부시키가이샤; 마루다이 푸드 가부시키가이샤; 우메다 지무쇼 리미티드
Priority date: 2010-09-24
Filing date: 2011-09-22
Publication date: 2017-10-18
Also published as: KR20130141493A; JPWO2012039472A1; JP5847086B2; EP2620154A1; WO2012039472A1; CN103118685A; CN103118685B; EP2620154A4; US20130172293A1

Abstract

본 발명은 신규의 중추신경계 염증을 개선하는 효과를 갖는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명에 의해 플라스말로겐을 포함하는 항중추신경계 염증제가 제공된다. 그 중에서도 주로 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐을 포함하는 생체 조직(바람직하게는 새의 조직) 추출 플라스말로겐을 포함하는 항중추신경계 염증제가 바람직하게 제공된다.

Description

항중추신경계 염증제{DRUG AGAINST CENTRAL NERVOUS SYSTEM INFLAMMATION}

본 발명은 플라스말로겐을 포함하는 항중추신경계 염증제에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 생체 조직으로부터 추출된 플라스말로겐을 유효 성분으로서 포함하는 항중추신경계 염증제에 관한 것이다. 또한, 항중추신경계 염증제는 중추신경계 염증 예방 또는 치료제로 바꾸어 말할 수 있다.

중추신경계는 다수의 신경 세포가 모여서 큰 덩어리로 되어 있는 영역이고, 척추 동물에서는 뇌, 척수 등이 이에 해당된다. 이들은 뇌수나 수막에 의하여 덮여서 보호되어 있다. 중추신경에 있어서 일어나는 염증(중추신경계 염증: 뇌염, 척수염, 수막염 등)은 여러 가지 원인으로 초래된다. 예를 들면, 진균, 세균, 또는 바이러스의 감염에 의해 급성 또는 만성의 뇌염, 척수염, 수막염 등이 초래될 수 있다. 또, 백혈병이나 악성의 뇌종양 등에 의해서도 염증이 초래될 수 있다.

중추신경계 염증은 신경 세포를 손상하기 때문에 여러 가지 병이나 장애를 일으키는 것이 알려져 있다. 예를 들면, 세균성 또는 바이러스성 뇌염에서는 감염된 세균이나 바이러스의 종류에도 따르지만, 염증에 의해 뇌가 중증의 장애를 받은 경우, 착란, 경련 발작의 빈발, 혼수 등이 보이게 되고, 최악의 경우, 사망하는 일도 있다. 또, 회복했다고 해도 신경 세포의 손상 때문에 자주 어떠한 영구적인 신경 장애가 남는다.

또, 최근에는 알츠하이머병(AD), 파킨슨병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 다발성 경화증 등의 만성 신경 변성 질환의 대부분, 또는 뇌졸중이나 두부 외상 등의 급성 뇌손상에 있어서도 중추 신경(뇌, 척수 등)의 만성 염증을 동반하는 것이 명백해져 오고 있다. 그리고 이들의 병은 중추 염증에 의하여 초래되고, 진행되는 것은 아닌가하는 가능성도 생각되고 있다. 예를 들면, 중추신경계 염증이 알츠하이머병 등의 신경 변성 질환을 발증시키는 것이나 병을 진행시킬 가능성이 있는 것이 보고되어 있다(예를 들면, 비특허문헌 1). 또, 염증을 일으키는 물질인 LPS(리포폴리사카라이드)의 복강내 투여에 의해 제작한 기억 장애 모델 쥐를 해석한 결과, 뇌에 Aβ(아밀로이드 베타) 펩티드의 축적이 보인 것, 항염증제인 설린닥 설파이드(sulindac sulfide)에 의해 증상이 회복된 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2).

또한, 중추신경계 염증은 우울증이나 자폐증 등의 정신 질환이나 발달 장애, 나아가서는 정상적인 노화 과정에 있어서도 고율(高率)로 인정되는 것도 명백하게 되어 오고 있다.

이상의 것에서, 중추 신경계 염증을 예방 또는 치료함으로써 감염에 의한 염증에 의해 신경 세포가 손상되어 신경 장애가 발생하는 것을 방지할 수 있고, 또는, 알츠하이머병, 파킨슨병 등의 신경 변성 질환의 치료 또는 통합 실조증, 우울증, 자폐증 등의 정신 질환이나 발달 장애의 치료를 실시할 수 있다고 기대되고 있다.

이와 같은 현상 하, 중추신경계 염증을 효과적이고, 또한, 부작용 없이 치료할 수 있는 방법이 이전보다 더 요망되고 있다.

비특허문헌 1: Yan Q et. al., J Neurosci. 2003 Aug20;23(20):7504-9 비특허문헌 2: Lee JW et. al., Neuroinflammation. 2008 Aug 29;5:37.

본 발명은 신규의 중추 신경계 염증 예방 또는 치료 효과를 갖는 제(劑)를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자들은 놀랍게도 플라스말로겐이 중추신경계 염증을 일으키는 원인의 하나로 생각되고 있는 글리어 세포의 증가를 억제하고, 중추신경계 염증을 개선하는 효과를 갖는 것을 발견하고, 더욱 개량을 거듭하여 본 발명을 완성시키는 데 이르렀다.

즉, 본 발명은 예를 들면, 이하의 항에 기재된 주제를 포함한다.

항 1. 플라스말로겐을 포함하는 항중추신경계 염증제.

항 2. 생체 조직으로부터 추출된 플라스말로겐을 포함하는 항 1에 기재된 항중추신경계 염증제.

항 3. 새의 조직으로부터 추출된 플라스말로겐을 포함하는 항 2에 기재된 항중추신경계 염증제.

항 4. 상기 플라스말로겐에 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐이 함유되는 항 1∼3 중 어느 한 항에 기재된 항중추신경계 염증제.

항 5. 상기 플라스말로겐의 90질량％ 이상이 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐인 항 4에 기재된 항중추신경계 염증제.

항 6. 상기 플라스말로겐에 함유되는 (에탄올아민 플라스말로겐: 콜린 플라스말로겐)의 질량비가 (1:5)∼(5:1)인 항 4 또는 5에 기재된 항중추신경계 염증제.

항 7. 인지증(특히, 알츠하이머병), 파킨슨병, 우울증 및 통합 실조증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 질환의 예방 또는 치료용인 항 1∼6 중 어느 한 항에 기재된 항중추신경계 염증제.

항 8. 플라스말로겐이 이하의 공정(1)∼(3)을 포함하는 제조 방법으로 제조된 플라스말로겐인 항 3∼7 중 어느 한 항에 기재된 항중추신경계 염증제.

(1) 새의 껍질을 에탄올 또는 함수 에탄올로 추출 처리하는 공정

(2) 공정(1)에서 얻어진 추출물을 아세톤으로 원심 처리 후, 침전을 회수하고, 또한, 헥산／아세톤 혼합 용매로 원심 처리 후, 액층을 회수하는 공정

(3) 공정(2)에서 회수한 액을 포스포리파아제 A1(PLA1)에 의해 처리하는 공정

항 9. 플라스말로겐을 경구 투여 또는 경혈관 투여하는 공정을 포함하는 중추신경계 염증의 치료 방법.

항 10.생체 조직(바람직하게는 새의 조직)으로부터 추출된 플라스말로겐을 경구 투여 또는 경혈관 투여하는 공정을 포함하는 항 9에 기재된 치료 방법.

항 11. 상기 플라스말로겐에 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐이 함유되는(바람직하게는 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐이 상기 플라스말로겐의 90질량％ 이상 함유되는) 항 9 또는 10에 기재된 치료 방법.

항 12. 상기 플라스말로겐에 함유되는 (에탄올아민 플라스말로겐:콜린 플라스말로겐)의 질량비가 (1:5)∼(5:1)인 항 11에 기재된 치료 방법.

항 13. 인지증(특히, 알츠하이머병), 파킨슨병, 우울증 및 통합 실조증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 치료하기 위한 항 9∼12 중 어느 한 항에 기재된 치료 방법.

항 14.플라스말로겐이 이하의 공정(1)∼(3)을 포함하는 제조 방법으로 제조된 플라스말로겐인 항 10∼13 중 어느 한 항에 기재된 치료 방법.

항 15. 중추신경계 염증의 치료에 있어서의 사용을 위한 플라스말로겐.

항 16. 생체 조직(바람직하게는 새의 조직)으로부터 추출된 항 15에 기재된 플라스말로겐.

항 17. 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐이 함유되는(바람직하게는 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐이 90질량％ 이상 함유되는) 항 15 또는 16에 기재된 플라스말로겐.

항 18. 이하의 공정(1)∼(3)을 포함하는 제조 방법으로 제조된 항 16 또는 17에 기재된 플라스말로겐.

항 19. 중추신경계 염증의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의 플라스말로겐의 사용.

항 20.플라스말로겐이 생체 조직(바람직하게는 새의 조직)으로부터 추출된 플라스말로겐인 항 19에 기재된 사용.

항 21. 플라스말로겐이 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐이 함유되는(바람직하게는 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐이 상기 플라스말로겐의 90질량％ 이상 함유되는) 플라스말로겐인 항 19 또는 20에 기재된 사용.

항 22. 플라스말로겐이 이하의 공정(1)∼(3)을 포함하는 제조 방법으로 제조된 플라스말로겐인 항 19∼21 중 어느 한 항에 기재된 사용.

또한, 본 발명은 예를 들면, 이하의 항 A―1∼항 M에 기재된 글리어 세포 증가 억제제 및 방법을 포함한다.

항 A―1. 플라스말로겐을 포함하는 글리어 세포 증가 억제제.

항 A―2. 플라스말로겐을 포함하는, 중추신경계 염증에 동반하는 글리어 세포 증가 억제제.

항 B. 생체 조직으로부터 추출된 플라스말로겐을 포함하는 항 A―1 또는 A―2에 기재된 글리어 세포 증가 억제제.

항 C. 새의 조직으로부터 추출된 플라스말로겐을 포함하는 항 B에 기재된 글리어 세포 증가 억제제.

항 D. 상기 플라스말로겐에 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐이 함유되는 항 A―1∼항 C 중 어느 한 항에 기재된 글리어 세포 증가 억제제.

항 E. 상기 플라스말로겐의 90질량％ 이상이 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐인 항 D에 기재된 글리어 세포 증가 억제제.

항 F. 상기 플라스말로겐에 함유되는(에탄올아민 플라스말로겐:콜린 플라스말로겐)의 질량비가 (1:5)∼(5:1)인 항 D 또는 E에 기재된 글리어 세포 증가 억제제.

항 G. 인지증(특히, 알츠하이머병), 파킨슨병, 우울증 및 통합 실조증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 질환의 예방 또는 치료용인 항 A―1∼항 F 중 어느 한 항에 기재된 글리어 세포 증가 억제제.

항 H. 플라스말로겐이 이하의 공정(1)∼(3)을 포함하는 제조 방법으로 제조된 플라스말로겐인 항 C∼항 G 중 어느 한 항에 기재된 글리어 세포 증가 억제제.

항 I. 플라스말로겐의 유효량을 피험 대상에 경구 투여 또는 경혈관 투여하는 공정을 포함하는 글리어 세포 증가 억제 방법.

항 J. 생체 조직(바람직하게는 새의 조직)으로부터 추출된 플라스말로겐을 경구 투여 또는 경혈관 투여하는 공정을 포함하는 항 I에 기재된 방법.

항 K. 상기 플라스말로겐에 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐이 함유되는(바람직하게는 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐이 상기 플라스말로겐의 90질량％ 이상 함유되는) 항 I 또는 J에 기재된 방법.

항 L. 상기 플라스말로겐에 함유되는 (에탄올아민 플라스말로겐:콜린 플라스말로겐)의 질량비가 (1:5)∼(5:1)인 항 K에 기재된 방법.

항 M. 플라스말로겐이 이하의 공정(1)∼(3)을 포함하는 제조 방법으로 제조된 플라스말로겐인 항 I∼K 중 어느 한 항에 기재된 치료 방법.

본 발명의 플라스말로겐을 포함하는 항중추신경계 염증제에 의해 중추신경의 염증을 개선하고, 치료할 수 있다. 중추신경계 염증(예를 들면, 뇌염, 수막염)을 일으키는 원인의 하나로서, 중추신경계(뇌, 척수 등)에 존재하는 활성화 글리어 세포가 염증성 사이토카인을 방출하는 것이 생각되고 있다. 본 발명의 항중추신경계 염증제는 중추신경의 염증 발생에 동반하여 증가 및 활성화되는 글리어 세포에 대해서 증가 억제 작용을 갖고 있으며, 해당 작용에 의해 중추신경계 염증을 개선하고, 치료할 수 있다. 즉, 본 발명의 항중추신경계 염증제를 투여하는 것으로 염증 부위의 글리어 세포의 증가를 억제하고, 염증을 개선 및 치료할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항중추신경계 염증제는 글리어 세포 증가 억제제로 바꾸어 말할 수 있다.

나아가서는 상기와 같이, 중추신경의 염증이 원인의 하나라고 생각되고 있는 질환, 예를 들면, 인지증(특히, 알츠하이머병(AD)), 파킨슨병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 다발성 경화증 등의 만성 신경 변성 질환 및 통합 실조증, 우울증, 자폐증 등의 정신 질환의 치료를 위해서도, 본 발명의 항중추신경계 염증제를 바람직하게 이용할 수 있다.

또한, 플라스말로겐은 생체 조직에 많이 포함되는 성분이고, 또, 종래부터 플라스말로겐을 포함하는 생체 조직이 식용되고 있다. 따라서, 플라스말로겐(특히, 생체 조직으로부터 추출된 플라스말로겐)을 포함하는 본 발명의 항중추신경계 염증제는 부작용 등의 염려는 거의 없어서, 안전성이 매우 높다고 생각된다.

도 1은 닭 껍질로부터 추출한 고순도 플라스말로겐 함유물을 HPLC―ELSD에 의해 분석하여 얻어진 크로마토그램을 나타낸다. plPE는 에탄올아민 플라스말로겐을, plPC는 콜린 플라스말로겐을 각각 나타낸다.
도 2는 복강 내에 생리 식염수(Saline), LPS, 또는 플라스말로겐 및 LPS(LPS＋PIs)를 투여한 쥐의 뇌(대뇌 피질) 절편을 항Iba―1 항체 또는 항GFAP 항체를 이용하여 면역 염색한 결과를 나타낸다. a에 공초점 현미경에 의해 취득한 화상 및 그들을 병합한 화상을 나타낸다. 해당 화상에 있어서 글리어 세포수를 카운트하고, 해석한 결과를 b 및 c에 나타낸다. b에 미크로글리어 수의 해석 결과를, c에 성상 세포수의 해석 결과를 나타낸다.
도 3은 복강 내에 생리 식염수(Saline), LPS, 또는 플라스말로겐 및 LPS(LPS＋PIs)를 투여한 쥐의 뇌(치상회) 절편을, 항Iba―1 항체 또는 항GFAP 항체를 이용하여 면역 염색한 결과를 나타낸다. a에 공초점 현미경에 의해 취득한 화상 및 그들을 병합한 화상을 나타낸다. 해당 화상에 있어서 글리어 세포수를 카운트하고, 해석한 결과를 b 및 c에 나타낸다. b에 미크로글리어 수의 해석 결과를, c에 성상 세포수의 해석 결과를 나타낸다.
도 4는 복강 내에 생리 식염수(Saline), LPS, 또는 플라스말로겐 및 LPS(LPS＋PIs)를 투여한 쥐의 뇌(해마 CA1) 절편을, 항Iba―1 항체 또는 항GFAP 항체를 이용하여 면역 염색한 결과를 나타낸다. a에 공초점 현미경에 의해 취득한 화상 및 그들을 병합한 화상을 나타낸다. 해당 화상에 있어서 글리어 세포수를 카운트하고, 해석한 결과를 b 및 c에 나타낸다. b에 미크로글리어 수의 해석 결과를, c에 성상 세포수의 해석 결과를 나타낸다.
도 5는 복강 내에 생리 식염수(Saline), LPS, 또는 플라스말로겐 및 LPS(LPS＋PIs)를 투여한 쥐의 뇌(대뇌 피질) 절편을, 항NeuN 항체 또는 항Aβ(아밀로이드 베타) 항체를 이용하여 면역 염색하고, 공초점 현미경에 의해 취득한 화상을 나타낸다. 또, 이들을 병합한 화상도 나타낸다.
도 6은 복강 내에 생리 식염수(Saline), LPS, 또는 플라스말로겐 및 LPS(LPS＋PIs)를 투여한 쥐의 뇌(해마 CA1) 절편을, 항NeuN 항체 또는 항Aβ(아밀로이드 베타) 항체를 이용하여 면역 염색하고, 공초점 현미경에 의해 취득한 화상을 나타낸다. 또, 이들을 병합한 화상도 나타낸다.

이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명은 플라스말로겐을 포함하는 항중추신경계 염증제에 관련된 것이다.

플라스말로겐이란, 통상, 글리세롤 골격의 1위에 비닐에테르 결합을 통한 장쇄 알케닐기를 갖는 글리세로 인지질을 말한다. 이하에, 플라스말로겐의 일반식을 나타낸다.

[식 중, R¹ 및 R²는 지방족 탄화수소기를 나타낸다. R¹은 통상, 탄소수 1∼20의 지방족 탄화수소기이고, 예를 들면, 도데실기, 테트라데실기, 헥사데실기, 옥타데실기, 이코사닐기 등을 들 수 있다. R²는 통상, 지방산 잔기 유래의 지방족 탄화수소기이고, 예를 들면, 옥타데카디에노일기, 옥타데카트리에노일기, 이코사테트라에노일기, 이코사펜타에노일기, 도코사테트라에노일기, 도코사펜타에노일기, 도코사헥사에노일기 등을 들 수 있다. 또, 식 중, X는 극성기를 나타낸다. X는 바람직하게는 에탄올아민, 콜린, 세린, 이노시톨, 또는 글리세롤이다.]

특히, 상기 식 중 X가 에탄올아민인 에탄올아민 플라스말로겐과, X가 콜린인 콜린 플라스말로겐이 자연계에 널리 존재하는 플라스말로겐이다.

본 발명에 이용하는 플라스말로겐은 생체 조직으로부터 추출되는 것이 바람직하다. 여기에서의 생체 조직이란, 생물에 있어서의 플라스말로겐을 함유하는 조직이다. 플라스말로겐을 추출하기 위해 이용하는 생물로서는 예를 들면, 동물 및 미생물을 들 수 있다. 미생물로서는, 혐기성 세균이 적합하고, 예를 들면, 장내 세균의 Acidaminococcaceae과의 세균 등은 특히 바람직하다. 세균의 경우, “생체 조직”은 세균 그 자체이다. 동물로서는, 조류, 포유류, 어류, 패류 등이 적합하다. 포유류로서는, 공급 안정성과 안전성의 양면에서 가축이 바람직하고, 예를 들면, 소, 돼지, 말, 양, 산양 등을 들 수 있다. 포유류의 경우, 플라스말로겐을 함유하고 있는 주요한 조직으로서는, 피부, 뇌, 장, 심장, 생식기 등을 들 수 있고, 이들의 조직으로부터 플라스말로겐을 추출할 수 있다. 또, 조류로서는, 닭, 집오리, 메추라기, 오리, 꿩, 타조, 칠면조 등을 들 수 있다. 입수의 용이함, 비용의 면 및 먹는 것에 대한 저항감 등도 고려하면, 닭이 특히 바람직하다. 또, 새의 조직으로서는, 특별히 제한은 되지 않지만, 예를 들면, 새의 고기(특히, 새가슴살), 새의 껍질, 새의 내장 등을 이용하는 것이 적합하다. 또한, 1 또는 복수종의 생물의 다른 조직을 2종 이상 조합하여 이용해도 좋다.

본 발명에서는 생체 조직으로부터 추출된 플라스말로겐으로서, 새의 조직으로부터 추출된 플라스말로겐을 이용하는 것이 특히 바람직하다. 그 중에서도 종래부터 식용되어 온 새(식용 새)는 안전성이 확인되어 있고, 안정 공급도 하기 쉽기 때문에 적합하다. 최적인 것은 닭이다.

생체 조직으로부터 플라스말로겐을 추출하는 방법으로서는, 플라스말로겐이 추출(및 필요에 따라서 정제)할 수 있는 한, 특별히 제한되지 않지만, 간편함 및 비용 등의 점에서, 다음에 서술하는 바와 같이 하여 추출 및 정제를 실시하는 것이 바람직하다. 또, 해당 추출 및 정제 방법에 따르면, 디아실형 글리세로 인지질을 분해ㆍ제거할 수 있기 때문에 플라스말로겐의 순도를 더한층 높일 수 있어서 바람직하다.

구체적으로는, 플라스말로겐의 추출 및 정제는 (1) 생체 조직으로부터 플라스말로겐을 추출하는 공정, (2) 추출물 중의 플라스말로겐을 정제하는 공정(구체적으로는, 중성 지질 및／또는 스핑고 지질을 제거하는 공정), (3) 추출물을 가수 분해 처리 후 정제하는 공정(구체적으로는, 디아실형 글리세로 인지질을 가수 분해한 후, 유리 지방산 및 리졸린 지질을 제거하는 공정)을 포함하는 방법으로 실시할 수 있다. 여기에서, 공정(1)이 플라스말로겐의 추출 공정이고, 공정(2) 및 (3)은 정제 공정이다. 따라서, 공정(2) 및 (3)은 임의 공정이고, 각각 포함되지 않아도 좋지만, 정제에 의해 농축된 플라스말로겐을 이용하는 편이 바람직하다. 특히, (1)∼(3)공정을 모두 포함하는 방법에 의해 추출 및 정제된 플라스말로겐을 포함하는 항중추신경계 염증제는 효과가 보다 우수하기 때문에 바람직하다.

또한, 이하, “생체 조직으로부터 추출된 플라스말로겐”을 “생체 조직 추출 플라스말로겐”으로 기재하는 일이 있다. 또, 예를 들면, “새의 조직으로부터 추출된 플라스말로겐”을 “새의 조직 추출 플라스말로겐”으로 기재하는 일이 있다.

추출은 물 또는 유기 용매(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소프로판올, 아세톤, 헥산 등 또는 이들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2종 이상의 혼합 용매), 또는 함수 유기 용매에 의한 추출을 실시하는 것이 바람직하다. 함수 유기 용매의 함수율은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 1할∼9할이다. 그 중에서도 에탄올 또는 함수 에탄올로 추출하는 것이 바람직하다. 또, 추출에 제공되는 새의 조직은 날것으로도, 미리 어떠한 처리가 실시된 것이어도 좋다. 예를 들면, 미리 건조 처리 및／또는 탈유 처리된 것이어도 좋다.

추출 처리 조건에 대해서는 특별히 제한되지 않지만, 냉침, 온침 등의 침지법, 퍼컬레이션법 등에 의해 실시할 수 있다. 적합한 일례로서, 닭 껍질에 에탄올을 첨가하고, 30℃ 이상에서 60분 이상, 바람직하게는 40℃ 이상에서 180분 이상 정치 또는 교반을 실시하는 방법이 예시된다. 예를 들면, 탈유 건조 처리된 닭 껍질 1㎏에 대하여 에탄올을 예를 들면 1∼10L, 바람직하게는 1∼6L, 더욱 바람직하게는 2∼4L이라는 비율로 이용하여 실시할 수 있다.

얻어진 유기 용매 추출액은 농축되는 것이 바람직하고, 농축 건고되는 것이 보다 바람직하다. 농축(또는 농축 건고)은 공지의 방법에 따라서 실시할 수 있으며, 예를 들면, 증발기를 이용하여 실시할 수 있다. 유기 용매 추출액을 농축 건고함으로써 유기 용매 추출 건고물이 얻어진다. 해당 유기 용매 추출 건고물에는 플라스말로겐 등의 지질이 농축되어 있다.

또한, 해당 유기 용매 추출 건고물을 예를 들면, 아세톤으로 원심 처리 후, 침전을 회수하는 것이 바람직하고, 또한, 헥산／아세톤 혼합 용매로 원심 처리 후, 액층을 회수하는 것이 보다 바람직하다. 한정적인 해석을 바라는 것은 아니지만, 아세톤으로 원심 처리 후, 침전을 회수하는 것으로 중성 지질이 제거될 수 있고, 헥산／아세톤 혼합 용매로 원심 처리 후, 액층을 회수하는 것으로 스핑고 지질이 제거될 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 액층을 농축 건고하는 것으로 인지질 농축 건고물이 얻어진다. 해당 인지질 농축 건고물을 가수 분해 처리 공정에 제공하여 디아실형 인지질을 가수 분해하는 것으로 플라스말로겐을 바람직하게 농축할 수 있다.

이와 같은 가수 분해 처리로서는 예를 들면, 포스포리파아제 A1(PLA1)에 의한 처리를 들 수 있다. PLA1은 디아실형 인지질에 있어서, sn-1 지방산과 글리세린 골격의 결합부를 특이적으로 가수 분해한다. 한편, 플라스말로겐은 sn-1이 에테르 결합이기 때문에 PLA1의 작용을 받지 않는다. 따라서, PLA1에서 처리함으로써 디아실형 글리세로 인지질은 분해되지만, 플라스말로겐은 분해되지 않는다. PLA1에 의해 처리하면, 디아실형 글리세로 인지질은 유리 지방산 및 라이소 인지질로 분해된다. 플라스말로겐과 공존하고 있는 디아실형 글리세로 인지질을 PLA1으로 라이소체로 변환하고, 유리 지방산 및 라이소 인지질을 제거하는 것으로 플라스말로겐을 정제할 수 있다. 유리 지방산 및 라이소 인지질의 제거는 예를 들면, 아세톤 및 헥산을 이용한 분배에 의해 실시할 수 있다.

PLA1은 상기의 효과가 얻어지는 것이면, 그 유래 등은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 아스페르질루스ㆍ오리제 유래의 PLA1을 들 수 있다. 또, 이와 같은 PLA1은 예를 들면, 미츠비시 화학 푸드 주식회사 등으로부터 구입 가능하다. 또, 그 사용량도 이용하는 유기 용매 추출 건고물량에 따라서 적절히 설정할 수 있다. 바람직하게는 0.2∼200unit／(유기 용매 추출 건고물 1㎎)을 사용할 수 있고 더욱 바람직하게는 2∼200unit／(유기 용매 추출 건고물 1㎎)을 사용할 수 있다. 또한, 1unit은 1분간당 1μ㏖의 기질(디아실형 글리세로 인지질)을 변화시키는 양(1μ㏖/min)을 의미한다.

또, 사용 버퍼도 사용하는 PLA1에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면, 0.1M 시트르산-HCl 버퍼(pH 4.5)를 이용할 수 있다. 이 경우, 유기 용매 추출 건고물에 해당 버퍼를 추가하여 용해시키고나서 이것에 PLA1을 첨가하면 좋다. 또, 사용 버퍼량으로서는, 효소 반응이 진행될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 유기 용매 추출 건고물 1g당 1∼30mL, 더욱 바람직하게는 5∼15mL 정도이다.

반응 조건도 적절히 설정할 수 있지만, 바람직하게는 50℃에서 교반하면서 1∼2시간 반응시킨다.

또한, 효소의 불활성화 처리를 실시해도 좋다. 바람직하게는 가수 분해 반응 후, 온도를 70℃ 정도까지 상승시키는 것으로 해당 처리를 실시한다.

이와 같이 하여, 디아실형 글리세로 인지질이 분해된 처리액(가수 분해 처리액)을 얻을 수 있다. 해당 가수 분해 처리액에 예를 들면, 2∼3배량의 헥산을 첨가하여 원심 처리 후, 액층을 회수하는 것으로 효소 버퍼 및 효소 단백질을 제거할 수 있다.

또한, 플라스말로겐은 헥산에 용해하지만, 아세톤에는 난용성인 것에서, 이들의 용매 및 물을 적절히 조합하여 분배를 실시하고, 또한, 물 또는 수용액에 의해 용액 분배하는 것으로 라이소 인지질을 제거하여 플라스말로겐을 정제할 수 있다. 즉, 아세톤에 의해 인지질 이외의 중성 지질을 제거할 수 있고, 수계 용액 분배에 의해 플라스말로겐과 라이소 인지질을 분리할 수 있다.

또한, 상기 기재로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 (1)∼(3)의 공정을 보다 구체적으로 기재하면, 예를 들면, 다음과 같이 된다.

(3) 공정(2)에서 회수한 액을 포스포리파아제 A1(PLA1)에 의해 처리하는 공정(또한, 필요에 따라서 아세톤 및 헥산을 이용한 분배에 의해 유리 지방산 및 라이소 인지질을 제거하는 공정)

예를 들면, 이와 같이 하여 추출 및 정제된 생체 조직 추출 플라스말로겐은 바람직하게 본 발명의 항중추신경계 염증제의 유효 성분으로서 이용할 수 있다.

생체 조직 추출 플라스말로겐은 주로 에탄올아민 플라스말로겐 및／또는 콜린 플라스말로겐(즉, 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종)을 포함한다. 생체 조직 추출 플라스말로겐에 있어서의 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐의 질량비(에탄올아민 플라스말로겐:콜린 플라스말로겐)는 (1:5)∼(1:0) 정도인 것이 바람직하고, (1:5)∼(5:1) 정도인 것이 보다 바람직하고, (1:3)∼(3:1) 정도인 것이 더욱 바람직하고, (1:1)∼(3:1) 정도인 것이 한층 바람직하고, (1:1)∼(2:1) 정도인 것이 더한층 바람직하다.

또, 특별히 제한되지 않지만, 본 발명에 이용하는 생체 조직 추출 플라스말로겐은 건조 질량 환산으로 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐의 함유량이 50질량％ 이상인 것이 바람직하고, 60질량％ 이상인 것이 보다 바람직하고, 70질량％ 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80질량％ 이상인 것이 한층 바람직하고, 90질량％ 이상인 것이 또한 바람직하고, 92질량％ 이상인 것이 특히 바람직하다.

에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐의 질량비 및 함유량은 생체 조직 추출 플라스말로겐을 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에서 해석하는 것으로 구할 수 있다. 구체적으로는, HPLC에 있어서, 증발 광산란 검출(ELSD: Evaporative Light Scattering Detector)에 의해(즉, HPLC―ELSD에 의해) 크로마토그램을 얻고, 해당 크로마토그램에 있어서의 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐을 나타내는 각각의 피크의 면적비를 구하는 것으로 질량비를 구할 수 있다. 또, 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐을 나타내는 피크 면적이 크로마토그램 전체의 피크 면적의 몇％에 해당되는지를 산출하는 것으로 함유량을 구할 수 있다. ELSD에서는 유사한 구조를 갖는 물질이면, 동일한 에어리어 리스펀스를 나타내기 때문이다. 또한, 콜린형은 전기적으로 중성이고, 한편, 에탄올아민은 인산의 마이너스 전하를 갖기 때문에 약산성인 것에서, 용매로서 초산 및 트리에틸아민을 이용하여 산성 지질을 챠지시켜서 분석한다. 챠지시키는 것으로 보다 동일한 에어리어 리스펀스를 나타낼 수 있기 때문이다.

본 발명의 항중추신경계 염증제는 의약 분야 및 식품 분야에서 바람직하게 이용된다. 해당 제(劑)는 플라스말로겐(바람직하게는 생체 조직 추출 플라스말로겐)을 함유한다.

본 발명의 항중추신경계 염증제는 중추신경계 염증의 예방, 치료, 또는 개선을 위해, 바람직하게 이용할 수 있다. 중추신경계 염증으로서는, 뇌염, 수막염을 예시할 수 있다. 본 발명의 항중추신경계 염증제는 특히, 글리어 세포의 증가를 동반하는 중추신경계 염증에 대하여 유효하다.

본 발명의 항중추신경계 염증제를 의약 분야에서 이용하는 경우, 해당 제(이하 “본 발명에 관련되는 의약제”로 기재하는 일이 있다)는 플라스말로겐 만으로 이루어지는 것이어도 좋고, 다른 성분을 배합한 것(즉, 플라스말로겐을 포함하는 의약 조성물)이어도 좋다. 예를 들면, 본 발명에 관련되는 의약제에 있어서는, 유효 성분인 플라스말로겐에 필요에 따라서 약학적으로 허용되는 기제, 담체, 첨가제(예를 들면, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 용제, 감미제, 착색제, 교미제, 교취제, 계면 활성제, 보습제, 보존제, pH 조정제, 점조화제 등) 등을 배합할 수 있다. 이와 같은 기재, 담체, 첨가제 등은 예를 들면, 의약품 첨가물 사전 2000(주식회사 야쿠지 일보사)에 구체적으로 기재되어 있으며, 예를 들면, 이것에 기재되는 것을 이용할 수 있다. 또, 상법에 의해 예를 들면, 정제, 피복 정제, 산제, 과립제, 세립제, 캡슐제, 환제, 액제, 현탁제, 유제, 젤리제, 츄어블제, 소프트 정제 등의 제제로 조제할 수 있다. 특히, 액제, 현탁제, 유제 등으로 조제하고, 주사제 또는 점적제로서 이용하는 것이 바람직하다. 또, 경구제로서 이용해도 좋다.

본 발명에 관련되는 의약제에 있어서의 플라스말로겐의 배합량은 항중추신경계 염증 작용이 발휘되는 한, 특별히 제한되지 않고, 1일당의 바람직한 플라스말로겐의 섭취량에 따라서 적절히 설정할 수 있다. 바람직하게는 0.0005∼100질량％, 보다 바람직하게는 0.005∼90질량％, 더욱 바람직하게는 0.05∼80질량％이다.

본 발명에 관련되는 의약제를 투여하는 대상으로서는, 중추신경계 염증을 앓은 대상이 바람직하다. 예를 들면, 진균, 세균, 또는 바이러스 감염에 의해 중추신경계 염증을 발증한 대상을 들 수 있다.

또, 중추신경계 염증이 원인의 하나로 된다고 생각되는 질환을 앓은 대상이 바람직하다. 이와 같은 질환으로서는, 신경 변성 질환 및 정신 질환 등을 예시할 수 있다. 신경 변성 질환으로서는, 구체적으로는 알츠하이머병(AD), 파킨슨병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 다발성 경화증 등을 예시할 수 있다. 또, 정신 질환으로서는, 구체적으로는 우울증, 조울증, 조울병, 통합 실조증, 자폐증, 섭식 장애 등을 예시할 수 있다. 나아가서는, 이와 같은 질환을 장래 앓을 가능성이 높은 대상에 대해, 본 발명에 관련되는 의약제를 예방적으로 투여해도 좋다. 예를 들면, 유전학적으로 상기 예시한 질환을 앓을 가능성이 높은 것이 나타내어지는 대상이나 고령자(특히, 60세 이상) 등에 예방을 위해 투여할 수 있다.

또, 본 발명에 관련되는 의약제를 투여하는 대상은 인간뿐만 아니라, 그 밖의 포유류이어도 좋다. 이와 같은 포유류로서는 예를 들면, 가축이나 애완 동물로서 사육되는 것을 상정할 수 있고, 예를 들면, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 원숭이, 토끼, 쥐(mice), 래트(rats), 햄스터 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 항중추신경계 염증제의 투여 시기는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 제제 형태, 환자의 연령, 환자의 증상의 정도 등을 고려하여 적절히 투여 시기를 선택하는 것이 가능하다. 또, 투여 형태도 특별히 한정되지 않지만, 공지의 투여 형태를 이용할 수 있는데, 특히, 경혈관 투여(경정맥 투여 등) 또는 경구 투여가 적합하다.

본 발명의 항중추신경계 염증제의 투여량은 환자의 연령, 환자의 증상의 정도, 그 밖의 조건 등에 따라서 적절히 선택될 수 있다. 통상, 해당 제(劑) 중의 플라스말로겐의 양이 바람직하게는 성인 1일당 1∼1000㎎, 보다 바람직하게는 10∼100㎎의 범위로 되는 양을 기준으로 하는 것이 바람직하다. 또한, 1일 1회 또는 복수회(바람직하게는 2∼3회)로 나누어서 투여할 수 있다.

본 발명의 항중추신경계 염증제를 식품 첨가제로서 이용하는 경우, 해당 제(이하, “본 발명에 관련되는 식품 첨가제”로 기재하는 일이 있다)는 플라스말로겐 그 자체이어도 좋고, 이들과 식품 위생학상 허용되는 기제, 담체, 첨가제나 기타 식품 첨가제로서 이용될 수 있는 성분ㆍ재료가 적절히 배합된 것(즉, 플라스말로겐을 포함하는 식품 첨가용 조성물)이어도 좋다. 또, 이와 같은 식품 첨가제의 형태로서는 예를 들면, 액상, 분말상, 플레이크상, 과립상, 페이스트상의 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 구체적으로는, 조미료(간장, 소스, 케첩, 드레싱 등), 플레이크(가루), 불고기 소스, 후추, 루(roux) 페이스트(커리 루 페이스트 등) 등을 예시할 수 있다. 이와 같은 식품 첨가제는 상법에 따라서 적절히 조제할 수 있다. 본 발명에 관련되는 식품 첨가제에 있어서의 플라스말로겐의 배합량은 항중추신경계 염증 작용이 발휘되는 한, 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 0.0005∼100질량％, 보다 바람직하게는 0.005∼90질량％, 더욱 바람직하게는 0.05∼80질량％이다.

이와 같은 본 발명에 관련되는 식품 첨가제는 해당 식품 첨가제가 첨가된 식품을 먹음으로써 섭취된다. 또한, 해당 첨가는 식품 조리 중 또는 제조 중에 실시해도 좋고, 조리된 식품을 먹기 직전 또는 먹으면서 실시해도 좋다. 해당 식품 첨가제는 이와 같이 하여 경구 섭취함으로써 중추신경계 염증을 개선하는 효과 및 예를 들면, 상기 예시한 질환의 증상을 예방 또는 개선하는 효과를 발휘한다. 또한, 본 발명에 관련되는 식품 첨가제의 섭취량, 섭취 대상, 함유 플라스말로겐량의 측정 등은 예를 들면, 상기한 본 발명에 관련되는 의약제와 동일한 것이 바람직하다.

본 발명의 항중추신경계 염증제를 음식품으로서 이용하는 경우, 해당 제(이하, “본 발명에 관련되는 음식품”으로 기재하는 일이 있다)는 플라스말로겐 및 식품 위생학상 허용되는 기제, 담체, 첨가제, 기타 식품으로서 이용될 수 있는 성분ㆍ재료 등이 적절히 배합된 것(즉, 플라스말로겐을 포함하는 식품 조성물)이다. 예를 들면, 플라스말로겐을 포함하는, 중추신경계 염증 개선용의, 또는 예를 들면, 상기 예시한 질환의 증상을 예방 또는 개선하기 위한 가공 식품, 음료, 건강 식품(영양 기능 식품, 특정 보건용 식품 등), 서플리먼트, 환자용 식품(병원식, 환자식, 또는 간호식 등) 등을 예시할 수 있다. 특별히 제한은 되지 않지만, 해당 제에 배합되는 플라스말로겐이 가축 또는 가금(예를 들면, 소, 돼지, 닭 등)의 조직으로부터 추출된 생체 조직 추출 플라스말로겐인 경우에는, 예를 들면, 해당 플라스말로겐이 배합된 햄버거, 미트볼, 비엔나 소시지, 새 소보로, 새의 껍질 칩스 등의 가공 육식품 및 가공된 육식품을 포함하여 이루어지는 건강 식품(영양 기능 식품, 특정 보건용 식품 등), 서플리먼트, 환자용 식품 등인 것이 바람직하다. 또, 플라스말로겐을 예를 들면, 분말상으로 하는 등, 음료류(쥬스 등), 과자류(예를 들면, 검, 초콜릿, 캔디, 비스킷, 쿠키, 센베이, 전병, 푸딩, 아몬드 젤리 등), 빵류, 스프류(분말 스프 등을 포함한다), 가공 식품 등의 각종 음식품에 함유시킨 것이어도 좋다.

또한, 건강 식품(영양 기능 식품, 특정 보건용 식품 등), 서플리먼트로서, 본 발명에 관련되는 음식품을 조제하는 경우에는, 계속적인 섭취를 실시하기 쉽도록 예를 들면, 과립, 캡슐, 정제(츄어블제 등을 포함한다), 음료(드링크제) 등의 형태로 조제하는 것이 바람직하고, 그 중에서도 캡슐, 태블릿, 정제의 형태가 섭취의 간편함의 점에서는 바람직하지만, 특별히 이들에 한정되는 것은 아니다. 과립, 캡슐, 정제 등의 형태의 본 발명에 관련되는 음식품으로 이루어지는 항중추신경계 염증제는 약학적 및／또는 식품 위생학적으로 허용되는 담체 등을 이용하여 상법에 따라서 적절히 조제할 수 있다. 또, 다른 형태로 조제하는 경우이어도 종래의 방법에 따르면 좋다.

본 발명에 관련되는 음식품에 있어서의 플라스말로겐의 배합량은 중추신경계 염증을 개선하는 효과, 또는 예를 들면, 상기 예시한 질환의 증상을 예방 또는 개선하는 효과가 발휘될 수 있는 한, 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 0.0005∼100질량％, 보다 바람직하게는 0.005∼90질량％, 더욱 바람직하게는 0.05∼80질량％이다.

본 발명에 관련되는 음식품은 중추신경계 염증의 개선을 위해, 또는 예를 들면, 상기 예시의 질환의 증상을 예방 또는 개선하기 위해 바람직하게 이용할 수 있다. 또, 섭취량, 섭취 대상, 함유 플라스말로겐량의 측정 등은 예를 들면, 상기한 본 발명에 관련되는 의약제와 동일한 것이 바람직하다.

또한, 병원식이란, 병원에 입원했을 때에 제공되는 식사이고, 환자식은 환자용의 식사이며, 간호식이란, 피간호자용의 식사이다. 본 발명에 관련되는 음식품은 특히, 상기 예시의 질환으로 입원, 자택 요양 등으로 되어 있는 환자, 또는 간호를 받고 있는 환자용의 병원식, 환자식, 또는 간호식으로서 바람직하게 이용할 수 있다. 또, 고령자 등, 상기 예시의 질환을 앓을 가능성이 높은 사람이 예방적으로 섭취할 수도 있다.

본 발명은 중추신경계 염증을 앓은 대상에 대하여 유효량의 본 발명의 항중추신경계 염증제를 투여(특히, 경혈관 투여 또는 경구 투여)하는 공정을 포함하는 중취신경계 염증의 치료 방법도 제공한다. 또한, 본 발명은 신경 변성 질환 또는 정신 질환을 앓은 대상 또는 앓을 가능성이 높은 대상에 대하여 유효량의 본 발명의 항중추신경계 염증제를 투여(특히, 경혈관 투여 또는 경구 투여)하는 공정을 포함하고, 이들 질환의 예방 또는 치료 방법도 제공한다. 해당 방법은 구체적으로는, 상기의 본 발명의 항중추신경계 염증제를 투여하는 것으로 실시된다. 또한, 해당 방법에 있어서의 대상, 섭취량 등의 각 조건은 상기와 같다.

(실시예)

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 하기의 예에 한정되는 것은 아니다.

조제예 1: 생체 조직 추출 플라스말로겐 함유 획분의 제조

새의 조직인 닭 껍질을 상법에 따라서 채취하고, 약 8㎜의 민스(minced)로 초핑(chopped)했다. 그리고 얻어진 민스 닭 껍질에 대하여 가열 처리 및 압착기에 의한 압착 처리를 실시하는 것으로 중성 지질을 제거하고, 탈유 닭 껍질을 조제했다. 그 후, 상법에 의해 동결 건조 및 분쇄를 실시하고, 탈유 닭 껍질 건조 분말을 얻었다. 탈유 닭 껍질 건조 분말은 추출에 사용하기까지 탈산소제와 함께 밀봉 보존했다.

＜유기 용매 추출 공정＞

공정(1)

상기와 같이 하여 얻은 탈유 닭 껍질 건조 분말 1㎏에 에탄올 2L를 첨가하여 12시간, 40℃에서 교반하여 정치하고, 그 후, 추출액을 고형물과 분리했다. 고형물에는 다시 에탄올 2L를 첨가하여 상기와 같이 추출하고, 얻어진 추출액을 합쳐서 여과지로 여과 후, 감압 건조하여 농축 건조 고과 추출물을 얻었다.

공정(2)

상기의 농축 건고물에 물 8mL를 첨가하여 교반, 원심하고, 상층을 제거했다. 이 침전에 아세톤 200mL를 첨가하여 교반, 4℃에서 원심하고, 아세톤층을 제거했다. 또한, 이 침전에 아세톤 100mL를 첨가하여 교반, 원심하고, 침전을 회수했다. 또한, 이 침전에 헥산／아세톤(7:3) 혼합 용매 100mL를 첨가하여 교반, 원심하고, 액층(플라스말로겐 함유 획분) 20g을 회수했다. 액층은 신속히 회전 증발기에서 농축 건고했다. 또한, 원심은 3000rpm×10min으로 실시하고, 아세톤 단일 및 헥산／아세톤 혼합 용매를 이용한 것은 4℃, 그 밖에는 15℃로 실시했다.

공정(3)

상기와 같이 하여 얻은 플라스말로겐 함유 획분 20g을 포스포리파아제Al(미츠비시 화학 푸드) 용액 400mL(10㎎/mL 0.1M 구연산-HCl 버퍼) 중에 분산시키고, 질소가스 충전 하에서 50℃로 2시간 교반했다. 그 후, 냉각하고, 2배 용량의 헥산을 첨가하여 2회 교반, 분배하고, 상층을 회수하여 농축 건고했다. 또한, 건고물은 아세톤을 60mL 첨가하여 교반, 원심하고, 침전을 회수하는 조작을 2회 반복했다. 또한, 해당 침전에 헥산／아세톤(7:3) 60mL 첨가하여 교반, 원심하고, 액층(고순도 플라스말로겐 함유 획분)을 회수했다. 이 액층을 농축 건고한 후, 헥산／아세톤(1:1) 240mL를 첨가하여 분액 깔때기로 옮기고, 물을 36mL 첨가하여 교반ㆍ분배했다. 하층을 제거하고, 상층에 아세톤／물(5:3) 96mL를 첨가하여 교반ㆍ분배했다. 상층을 회수하고, 신속히 감압 건조하여 닭 껍질 유래 고순도 플라스말로겐 함유물을 얻었다.

＜닭 껍질 유래 고순도 플라스말로겐 함유물의 순도의 검토＞

상기와 같이 하여 얻은 닭 껍질 유래 고순도 플라스말로겐 함유물을 하기 조건의 HPLC에서 해석하고, 크로마토그램을 얻었다.

[HPLC해석 조건]

기기; Shimadzu LC-10AD

컬럼; LiChrospher Diol 100(250-4, Merck사)(전치 컬럼(pre-columns) 없음)

용매; A액: 헥산/2-프로판올/초산(82:17:1. v/v), B액: 2-프로판올/물/초산(85:14:1, v/v)+0.2％트리에틸아민

경사도 조건:

시간(분)	A액	B액
0→1	95％	5％
1→24	95→60％	5→40％
24→25. 5	60％	40％
25. 5→28	60→100％	0％

검출; ELSD증발 광산란 검출기(시마즈 제작소, 교토, 일본)

결과를 도 1에 나타낸다. 닭 껍질로부터 얻어지는 플라스말로겐은 에탄올아민 플라스말로겐(plPE)과 콜린 플라스말로겐(plPC)의 혼합물인 것을 알 수 있었다. 검출된 전체 피크의 면적을 100％로 했을 때, 플라스말로겐의 면적 비율은 94.6％이고, plPE가 63.1％, plPC가 31.5％이었다. 따라서, 얻어진 닭 껍질 유래 고순도 플라스말로겐 함유물은 플라스말로겐을 94.6질량％ 함유하는 것을 알 수 있었다. 또, plPE와 plPC의 질량비는 2:1 정도인 것을 알 수 있었다. 이하의 실험에서는 해당 닭 껍질 유래 고순도 플라스말로겐 함유물을 새의 조직 추출 플라스말로겐으로서 사용했다.

또한, 새의 조직으로서, 닭 껍질에 대신해서 닭가슴살을 이용하여, 상기와 동일하게 하여 닭가슴살 유래 고순도 플라스말로겐 함유물을 제조하고, 마찬가지로 HPLC에서 해석한 바, 검출된 전체 피크의 면적을 100％로 했을 때, 플라스말로겐의 면적 비율은 94.6％이고, plPE가 47.9％, plPC가 46.7％이었다. 따라서, 얻어진 닭가슴살 유래 고순도 플라스말로겐 함유물은 플라스말로겐을 94.6질량％ 함유하는 것을 알 수 있었다. 또, plPE와 plPC의 질량비는 1:1 정도인 것을 알 수 있었다.

실시예 1: 생체 조직 추출 플라스말로겐의 항중추 염증 작용의 검토

새의 조직 추출 플라스말로겐이 중추신경의 염증에 미치는 영향을 검토하기 위해, 이하의 실험을 실시했다.

＜모델 쥐의 제작 및 검토 물질의 투여＞

상기 비특허문헌 2(Lee JW et. al., Neuroinflammation. 2008 Aug 29;5:37.)에 기재된 수법과 동일하게 하여 뇌염증 모델 쥐를 제작했다. 즉, TLR4(Toll-like receptor 4)의 자극 물질인 LPS(리포 폴리 사카라이드; lipopolysaccharide)를 매일 복강 내 투여함으로써 만성적인 뇌내 염증 모델 쥐를 작성했다.

구체적으로는, 8∼12주령 C57BL 웅성(雄性) 쥐(규도 주식회사제) 4마리에 LPS(250㎍/㎏, Sigma사제)를 1일 1회 연속 7일간 복강 내 투여하여 뇌내 염증 모델 쥐를 얻었다. 또, 동 쥐(4마리)에 LPS 대신에 생리 식염수(Saline)(10㎖/㎏)를 7일간 연속 복강 내 투여하여 대조군으로 했다. 또한, 동 쥐(4마리)에 있어서, 뇌내 염증 모델 쥐를 제작하는 순서에 추가하여 새의 조직 추출 플라스말로겐(20㎎/㎏)을 LPS투여 30분 전에 LPS와 동일하게 7일간 연속 복강 내 투여하여 피험군으로 했다.

＜면역 염색＞

[뇌절편의 제작]

LPS 최종 투여(대조군은 생리 식염수 최종 투여) 24시간 후에 각 쥐에 펜토바르비탈을 투여하여 마취를 실시하고, 개복 후, 좌심실에서 0.9％생리 식염수를 흘려서 탈혈(脫血)했다. 그 후, 4％ 파라포름알데히드로 뇌를 관류 고정했다. 적출한 뇌는 하룻밤 4％ 파라포름알데히드로 정치하고, 또한, 30％ 스크롤액으로 하룻밤 정치한 후, 크라이오스태트로 30∼40㎛ 동결 절편을 제작했다.

[글리어 세포의 면역 염색]

해당 동결 뇌절편을 블로킹 용액으로 30분간 실온에서 처치한 후, 적절히 희석한 1차 항체를 반응시키고, 4℃에서 하룻밤 정치했다. 그 후, 해당 뇌절편을 수회 PBS(인산 완충 생리 식염수)로 세정 후, 적절히 희석(1:500)한 2차 항체를 실온에서 6시간 반응시킨 후, PBS로 수회 세정하여 뇌절편 표본을 작성했다. 해당 표본을 공초점 현미경으로 관찰하여 화상을 취득했다. 대뇌 피질(Cortex)의 화상을 도 2a에, 치상회(DG)의 화상을 도 3a에, 해마(CA1)의 화상을 도 4a에 각각 나타낸다.

또한, 1차 항체로서는, 미크로글리어의 마커인 Iba-1(ionized calcium-binding adapter molecule-1; 이온화 칼슘 결합 어댑터 분자 1)에 대한 항Iba-1 항체(Wako사제)를 2차 항체로서 형광 표지 래빗 IgG 항체(LabeledAnti-Rabbit IgG antibody, Alexa Flour 488, Molecular Probes사제)를 이용했다. 또, 성상 세포의 염색에는 성상 세포의 마커인 GFAP(glial fibrillary acidic protein; 글리어 섬유 산성 단백질)에 대한 형광 표지 완료 항GFAP 항체(Sigma사제)를 이용했다. 따라서, 해당 항GFAP 항체를 이용한 경우에는, 2차 항체를 반응시키는 공정은 불필요했다.

또한, 미크로글리어 및 성상 세포는 모두 글리어 세포의 1종이다. 미크로글리어는 뇌내에서 상해나 염증이 일어나고 있을 때, 세포 증식이나 형태 변화 등의 반응을 나타내는 세포이고, 중추신경계에서 면역을 담당하여 여러 가지 신경 변성 질환이나 염증에 깊이 관여하고 있다고 생각되고 있다. 또, 성상 세포는 신경 섬유의 유지 등을 담당하는 세포라고 생각되고 있다.

[Aβ단백질 및 신경 세포 핵의 면역 염색]

상기와 같이 하여 얻은 뇌절편을 시트르산 완충액으로 열처리한 후, 적절히 희석한 1차 항체를 반응시키고, 실온에서 19시간 정치했다. 그 후, 해당 뇌절편을 수회 PBS(인산 완충 생리 식염수)로 세정하고, 적절히 희석(1:250)한 2차 항체를 실온에서 6시간 반응시킨 후, PBS로 수회 세정하여 뇌절편 표본을 작성했다. 해당 표본을 공초점 현미경으로 관찰하여 화상을 취득했다. 대뇌 피질(Cortex)의 화상을 도 5에, 해마(CA1)의 화상을 도 6에 각각 나타낸다.

또한, Aβ단백질의 면역 염색에는 1차 항체로서 Aβ1-16을 인식하는 항체(ab14220, Abcam사제)를, 2차 항체로서 형광 표지 래빗 IgG항체(LabeledAnti-Rabbit IgG antibody, Alexa Flour 488, Molecular Probes사제)를 이용했다. 신경 세포 핵의 면역 염색에는 1차 항체로서 신경 세포 핵을 인식하는 항신경 세포 핵 항체(Anti-Neuronal Nuclei(NeuN) monoclomal antibody, 쥐 유래, Millipore제)를, 2차 항체로서 형광 인식 항쥐 IgG 항체(Labeled Anti-Mouse IgG antibody, Alexa Flour 568, 염소 유래, Molecular Probes사제)를 이용했다.

또, 상기의 면역 염색 검토에 있어서, 1차 항체 및 2차 항체의 희석에는 10분의 1로 희석한 블록 에이스(DS파마 바이오메디컬)를 사용했다.

[미크로글리어 및 성상 세포의 세포수의 해석]

최근, 글리어 세포의 활성화에 의해 염증이 초래되어 주위의 신경 세포가 상해된다고 생각되고 있다. 특히, 알츠하이머병이나 파킨슨병 등의 변성 신경 질환에서는 변성 신경 세포 주위의 글리어 세포는 염증성 사이토카인을 산출하고, 염증을 일으켜서 신경 변성을 발생시키고 있다고 생각되고 있다.

그래서 상기와 같이 하여 취득한 화상(도 2a, 도 3a 및 도 4a) 중의 글리어 세포수의 해석을 실시했다. 구체적으로는 각 화상에 있어서, 200㎛×200㎛의 합계 4000㎛² 중에 존재하는 Iba-1 양성 세포 및 GFAP 양성 세포(즉, 형광을 발하는 세포)의 수를 각각 카운트했다. 통계학적 유의차 검정에는 one-way ANOBA에 의한 Fisher에 의한 PLSD를 이용했다.

결과를 도 2b(대뇌 피질 미크로글리어) 및 도 2c(대뇌 피질 성상 세포), 도 3b(치상회 미크로글리어) 및 도 3c(치상회 성상 세포) 및 도 4b(해마 미크로글리어) 및 도 4c(해마 성상 세포)에 나타냈다. 각 도면 중, “＊”는 p＜5％를 나타내고, “＊＊”는 p＜1％를 나타낸다. 또, 각 도면 중의 “40³㎛²”는 “4000㎛²”를 나타낸다.

도 2∼도 4의 결과로부터, LPS를 7일간 연속 투여함으로써 대뇌 피질(Cortex), 치상회(DG) 및 해마(CA1) 영역에 있어서, 글리어 세포(미크로글리어 및 성상 세포)의 수가 현저히 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한, 플라스말로겐의 투여에 의하여 이 글리어 세포의 증가가 현저히 억제되는 것을 알 수 있었다.

이로부터, LPS 투여에 의해 글리어 세포수가 증가하여 글리어 세포가 활성화된 결과, 뇌내 염증이 초래되었다고 생각되었다. 그리고 플라스말로겐을 투여함으로써 글리어 세포의 증가는 억제되고, 염증이 개선되었다고 생각되었다.

또, 도 5 및 도 6의 결과로부터, LPS를 7일간 연속 투여함으로써 대뇌 피질(Cortex) 및 해마(CA1) 영역에 있어서, 아밀로이드 베타(Aβ) 단백질이 축적되는 것을 알 수 있었다. 또한, 플라스말로겐의 투여에 의하여 이 Aβ단백질의 축적은 억제되는 것을 알 수 있었다.

Aβ 단백질의 축적은 알츠하이머병의 주요 원인으로 생각되고 있으며, 또, Aβ 단백질은 직접 신경 세포를 상해하는 작용을 갖는 것도 알려져 있다. 그러면, 플라스말로겐을 투여하는 것으로 염증을 개선 및 치료할 수 있으며, 또한, Aβ단백질의 축적도 억제할 수 있는 것에서, 플라스말로겐은 특히 알츠하이머병 등의 신경 변성 질환의 예방 및 치료에 유효하다고 생각되었다.

Claims

플라스말로겐을 포함하는 뇌염 또는 수막염의 치료 또는 예방제.
제1항에 있어서,
생체 조직으로부터 추출된 플라스말로겐을 포함하는
뇌염 또는 수막염의 치료 또는 예방제.
제2항에 있어서,
새의 조직으로부터 추출된 플라스말로겐을 포함하는
뇌염 또는 수막염의 치료 또는 예방제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 플라스말로겐에 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐이 함유되는
뇌염 또는 수막염의 치료 또는 예방제.
제4항에 있어서,
상기 플라스말로겐의 90질량％ 이상이 에탄올아민 플라스말로겐 및 콜린 플라스말로겐인
뇌염 또는 수막염의 치료 또는 예방제.
제4항에 있어서,
상기 플라스말로겐에 함유되는 (에탄올아민 플라스말로겐: 콜린 플라스말로겐)의 질량비가 (1:5)~(5:1)인
뇌염 또는 수막염의 치료 또는 예방제.
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