CN112105739A - 包含缩醛磷脂的功能性素材的制造方法 - Google Patents

Abstract

包含缩醛磷脂的功能性素材的制造方法，其包括下述工序：酶处理工序，用蛋白酶对包含缩醛磷脂的动物组织进行处理；以及，提取工序，用含有乙醇的提取液对经蛋白酶处理的动物组织进行提取。

Description

包含缩醛磷脂的功能性素材的制造方法

技术领域

本发明涉及由动物组织制造包含缩醛磷脂的功能性素材的方法。

背景技术

磷脂作为生物膜的构成成分是重要的，其中作为醚磷脂的缩醛磷脂占哺乳动物生物膜的磷脂的约18％。已知该缩醛磷脂尤其大量存在于脑神经、心肌、骨骼肌、白细胞、精子。

就缩醛磷脂而言，由于与二十二碳六烯酸、花生四烯酸等多元不饱和脂肪酸大量结合，因此成为由这些多元不饱和脂肪酸产生的前列腺素、白三烯等细胞间信号的第二信使的储存所，不仅如此，还发挥着细胞融合、离子运输等重要作用。

进一步地，由于缩醛磷脂的乙烯基醚键(烯键(Alkenyl bond))对氧化应激尤其敏感，因此还发挥着细胞的抗氧化功能。

另外，已知缩醛磷脂具有促进神经新生的作用、抑制由脂多糖(LPS)引起的神经炎的作用、抑制脑内β淀粉样蛋白(Aβ)蓄积的作用等，据说其对阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症、精神分裂症等脑神经疾病是有效的。此外，据说缩醛磷脂对于糖尿病、代谢综合征、各种感染症、免疫异常的治疗及改善也是有效的。

以往，进行了由动物组织提取这样的缩醛磷脂的尝试(专利文献1及2)。例如，专利文献1提出了下述方法：使用乙醇作为提取溶剂对表层的胸脯肉进行提取处理，并回收提取液。

另外，在专利文献2中提出了以下方法：对动物组织进行乙醇提取处理，得到乙醇提取物，用磷脂酶A1(PLA1)对乙醇提取物进行处理，将二酰基型甘油磷脂水解，进一步用水溶性酮系溶剂进行处理，并回收不溶部分，用脂肪族烃溶剂与水溶性酮溶剂的混合有机溶剂、和水对不溶部分进行溶剂分配，将混合有机溶剂部分进行回收。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第5483846号公报

专利文献2：日本专利第5489439号公报

发明内容

发明所要解决的课题

如上所述，以往虽然尝试过由动物组织得到有用的缩醛磷脂，但不能说一定可以高效地得到缩醛磷脂。

本发明的课题在于提供能够高效地由动物组织得到缩醛磷脂的方法。

用于解决课题的手段

为了由动物组织高效地提取缩醛磷脂，本申请的发明人进行了深入研究，结果发现，通过用蛋白酶对动物组织进行处理，然后用乙醇进行提取，能够提取出大量的缩醛磷脂，从而完成了本发明。另外发现，利用这样的方法得到的功能性素材对抑制脑神经炎极为有效。

即，本发明如下所示。

[1]包含缩醛磷脂的功能性素材的制造方法，其特征在于，包括下述工序：

酶处理工序，用蛋白酶对包含缩醛磷脂的动物组织进行处理，以及

提取工序，用含有乙醇的提取液对经上述蛋白酶处理的动物组织进行提取。

[2]如[1]所述的包含缩醛磷脂的功能性素材的制造方法，其特征在于，动物组织为选自扇贝类、海鞘以及鸟类的动物组织。

[3]如[1]或[2]所述的包含缩醛磷脂的功能性素材的制造方法，其特征在于，蛋白酶为中性蛋白酶。

[4]脑神经炎抑制组合物的制造方法，其特征在于，配合利用[1]～[3]中任一项的制造方法得到的功能性素材。

[5]功能性素材，其是利用[1]～[3]中任一项的制造方法得到的。

[6]脑神经炎抑制组合物，其是利用[4]的制造方法得到的。

[7]如[6]所述的脑神经炎抑制组合物，其特征在于，用于预防或改善选自认知症、帕金森病、抑郁症以及精神分裂症的脑神经疾病。

发明效果

根据本发明，可以由动物组织高效地提取缩醛磷脂。

附图说明

[图1]是表示实施例中的磷脂的分析条件的图。

[图2]是表示实施例中制备的本发明组合物对来自小鼠的小胶质(microglia)细胞(MG6及BV2)中的LPS诱导性炎症信号的炎症抑制效果的图。

具体实施方式

本发明的包含缩醛磷脂的功能性素材的制造方法的特征在于，包括下述工序：酶处理工序，用蛋白酶对包含缩醛磷脂的动物组织进行处理；以及，提取工序，用含有乙醇的提取液对经蛋白酶处理的动物组织进行提取。在本发明的制造方法中，在酶处理工序及提取工序的前后还可以具备其它工序。但是，如果在提取工序前(尤其是在用蛋白酶进行处理的同时或在用蛋白酶处理之后)设有用脂解酶进行处理的工序，则对脑神经炎的抑制效果可能减弱，因此从这个观点考虑，优选不包括用脂解酶进行处理的工序。

[酶处理工序]

酶处理工序是用蛋白酶对包含缩醛磷脂的动物组织进行处理的工序。

作为动物组织，只要是包含缩醛磷脂的动物组织则没有特别限定，可举出扇贝类、海鞘、海参、鲍鱼、鲑鱼、秋刀鱼、鲣鱼等水产动物、鸟类等，其中，优选扇贝类、海鞘、鸟类，作为使用的部位，优选食用部位(可食部位)。

本发明中的扇贝类是指属于帘蛤科的可食用的双壳贝，例如可举出属于虾夷扇贝属(Mizuhopecten)、海扇蛤属(Pecten)的种类。具体而言可举出，在日本采集的虾夷扇贝(学名：Mizuhopecten yessoensis)、在欧洲采集的欧洲扇贝(学名：Pecten maximus(Linnaeus))等。作为食用部位，可举出贝柱、裙边等。

本发明中的海鞘是指属于真海鞘科的可食用的脊索动物，可举出属于真海鞘属、红海鞘属的种类。具体而言，可举出真海鞘(学名：Halocynthia roretzi)、红海鞘(学名：Halocynthia aurantium)等。作为食用部位，可举出躯体部分(筋膜体)。

就本发明中的鸟类而言，只要是可食用的鸟类则没有特别限制，例如可举出鸡、乌鸡、鸭等。作为食用部位，优选富含缩醛磷脂的胸脯肉。

这些动物组织可以是切断物，但为了更高效地提取缩醛磷脂，优选使用粉碎物。

作为用于酶处理的蛋白酶，可举出来自曲霉属(Aspergillus)、根霉属(Rhizopus)等丝状菌的蛋白酶，来自芽孢杆菌属(Bacillus)等细菌的蛋白酶，由木瓜、菠萝等植物提取的蛋白酶，也可以使用市售的蛋白酶制剂。其中，优选来自丝状菌的蛋白酶，特别优选来自曲霉菌的蛋白酶。另外，由于缩醛磷脂在酸性、碱性的条件下不稳定，因此优选在pH 4～10左右的环境下进行酶处理，优选使用至少含有中性蛋白酶的酶。

作为蛋白酶的使用量，例如，相对于动物组织100g，优选为0.1～10.0g左右，更优选为0.2～8.0g左右，进一步优选为0.3～5.0g左右。

[提取工序]

在提取工序中，使用包含乙醇的提取液对经蛋白酶处理的动物组织进行提取。

作为提取工序中使用的包含乙醇的提取液，可以是含水乙醇，也可以是乙醇与其它有机溶剂的混合物。作为乙醇浓度，优选为50质量％以上，更优选为80质量％以上，进一步优选为95质量％以上，特别优选实质上为100质量％。

作为乙醇的使用量，例如，相对于动物组织100g，优选为100～3000mL左右，更优选为200～2000mL左右，进一步优选为250～1000mL左右。需要说明的是，可以将利用乙醇进行的提取进行多次。

在进行提取处理后，除去固态成分并回收提取液，根据需要进行干燥固化，由此可以得到本发明的含有缩醛磷脂的功能性素材。

另外，可以针对该乙醇提取物实施浓缩处理以提高缩醛磷脂的浓度。例如，在乙醇提取工序后，可以设置使用包含亲油性溶剂的提取液进行提取的亲油性溶剂提取工序。作为亲油性溶剂，例如可举出脂肪族烃、芳香族烃，特别优选己烷、异丙醇或他们的混合物。

作为利用本发明的制造方法得到的功能性素材中所含有的缩醛磷脂的量，优选为0.001～100mg/g(湿重换算)，更优选为0.1～10mg/g。

就本发明的含有缩醛磷脂的功能性素材而言，可以通过使其包含于食品、医药品、化妆品等来使用。作为食品，除了一般的食品外，可举出特定保健用食品、营养辅助食品、功能性食品、膳食补充剂等。作为化妆品，可举出乳液、乳霜、化妆水、精油、面膜、洁面用品、清洁剂、身体清洗剂等。

由于本发明的功能性素材包含大量缩醛磷脂，对抑制脑神经炎特别有效，因此含有本发明的功能性材料的食品等也能用作脑神经炎抑制组合物，从而对阿尔茨海默病等的认知症、帕金森病、抑郁症、精神分裂症等脑神经疾病的预防或改善尤其有用。除此之外，含有本发明的功能性材料的食品等对以下情况是有效的：改善特应性皮炎、抑制高血糖化、降低血胆固醇、促进脂质代谢、抗疲劳、维持血中白蛋白的量、恢复肝功能、抑制运动时的肌肉损失、改善失眠等。另外，含有本发明的功能性素材的化妆品对以改善皱纹和美白为目的的抗皮肤老化是有效的。

食品、医药品、化妆品等的形态没有特别限制，例如可举出片状、胶囊状、粉末状、颗粒状、液体状、粒状、棒状、板状、块状、固体状、球状、糊状、霜状、囊状、凝胶状、咀嚼片状、条状等。

[实施例1]

按照以下步骤，由各素材(扇贝类的食用部位、鸟类的食用部位、海鞘的食用部位)提取包含缩醛磷脂的组合物，并进行了分析。具体而言，作为扇贝类，使用的是虾夷扇贝(学名：Mizuhopecten yessoensis)的裙边。作为鸟类，使用的是鸡胸肉。作为海鞘，使用的是真海鞘(学名：Halocynthia roretzi)的躯体(筋膜体)。

1.将素材(扇贝、鸡胸肉、海鞘)50g解冻，用剪刀剪碎。

2.准备了下述的试验溶液。

a)仅0.1M柠檬酸溶液(pH4.5)50mL

b)0.1M柠檬酸溶液(pH4.5)50mL+COCHLASE(注册商标)·P颗粒(来源于米曲霉(Aspergilus oryzae))[三菱化学食品株式会社制]0.25g

c)10mM的Tris-HCl Buffer(pH7.4)50mL+Protease P“Amano”3SD(来源于曲霉属(Aspergilus))[天野酶制品株式会社制]0.25g

d)10mM的Tris-HCl Buffer(pH7.4)50mL+PROTIN SD-NY10(来源于芽孢杆菌属(Bacillus))[天野酶制品株式会社制]1.25g

3.将素材与上述a)～d)的各试验溶液混合，用捣碎机(WARING公司制HGBSS)进行粉碎(10秒×3次)。

4.于50℃使其反应60分钟(每隔约15分钟用玻璃棒进行搅拌)。

5.加入250ml的乙醇，加入捣碎机进行粉碎(10秒×2次)。

6.放置30分钟(每隔约5分钟用玻璃棒旋转搅拌10次)。

7.进行抽滤，并回收滤液。

8.采集滤液至1mL的SPITZ管中，用于磷脂的分析。

9.用蒸发器使剩余的滤液干固，测定总脂质重量。

各分析结果如下所示。

(1)总脂质重量

使用了上述a)～d)的试验溶液的提取物的总脂质重量(g/每50g素材)如表1所示。

[表1]

g/每50g素材	扇贝	鸡胸肉	海鞘
				a)无蛋白酶	3.76	2.49	4.28
b)COCHLASE P	5.52	4.54	5.95
				c)Protease-Amano 3SD	5.95	4.69	6.23
d)PROTIN SD-NY10	6.35	5.61	6.74

(2)磷脂的分析条件(参见图1)中的缩醛磷脂(p1-PE+p1-PC)的比例(HPLC面积值)如表2所示。

[表2]

	扇贝	鸡胸肉	海鞘
				a)无蛋白酶	47.3	21.8	40.8
b)COCHLASE P	52.1	22.9	42.0
				c)Protease-Amano 3SD	48.6	21.0	39.4
d)PROTIN SD-NY10	48.3	19.8	42.9

(3)基于蛋白酶处理的缩醛磷脂(p1-PE+p1-PC)的增加率算出用上述(1)中求出的总脂质量乘以上述(2)中求出的缩醛磷脂(p1-PE+p1-PC)的比例而得的数值，以“a)无蛋白酶”作为基准(1.0)，对缩醛磷脂(p1-PE+p1-PC)的量进行比较。其结果如表3所示。

需要说明的是，就磷脂在总脂质整体中所占的比例而言，即使实施蛋白酶处理也几乎没有变化。

[表3]

	扇贝	鸡胸肉	海鞘
				a)无蛋白酶	1.0	1.0	1.0
b)COCHLASE P	1.6	1.9	1.4
				c)Protease-Amano 3SD	1.6	1.8	1.4
d)PROTIN SD-NY10	1.7	2.0	1.7

如表3所示，可知通过实施蛋白酶处理，缩醛磷脂的提取量飞跃性地提高。

[实施例2]

[扇贝提取物的制备1]

根据以下步骤，由虾夷扇贝(学名：Mizuhopecten yessoensis)得到本发明的功能性素材(本发明的组合物)。

1.将素材(生扇贝裙边)200g解冻，用剪刀剪碎。

2.添加COCHLASE P(注册商标)·P颗粒(来源于米曲霉(Aspergilus oryzae))[三菱化学食品株式会社制]1.0g。

3.用捣碎机进行粉碎(10秒×2次)。

4.用搅拌机使其于50℃反应30分钟。

5.添加800ml的乙醇。

6.用捣碎机进行粉碎(10秒×2次)。

7.于50℃搅拌20分钟。

8.进行抽滤。

9.用蒸发器使滤液干固。

10.添加500ml的己烷/异丙醇(3:2)并进行混合。

11.添加250ml的水并进行混合。

12.转移到分液漏斗中并充分混合。

13.静置10分钟。

14.取下层(水层)，并用N₂气体使其干固。

→将在该步骤中得到的组合物(氨基酸+其他水溶性成分)作为比较组合物(3)。

15.取上层(己烷层)，并用N₂气体使其干固。

→将在该步骤中得到的组合物(p1-PE+其他脂质)作为本发明的组合物(1)。

[扇贝提取物的制备2(使用蛋白酶及磷脂酶，且不进行乙醇提取的情况下(比较例)]

1.向50mL的0.1M柠檬酸溶液(pH4.5)中，加入0.5g的COCHLASE P和0.8g的磷脂酶A1(PLA1)并混合。

2.将素材(生扇贝裙边)200g解冻，用剪刀剪碎。

3.加入1.进行混合，并用捣碎机粉碎(10秒×3次)。

4.使其于50℃反应1小时(每隔15分钟用玻璃棒混合)。

5.加入1000mL的己烷/异丙醇(3∶2)。

6.于室温搅拌10分钟。

7.对上清液进行抽滤。

8.用200mL的己烷/异丙醇(3∶2)进行洗涤，并再次进行抽滤。

9.将滤液转移至分液漏斗。

10.加入800mL的硫酸钠水溶液并充分混合。

11.静置10分钟。

12.舍弃下层。

13.用蒸发器使上层干固。

14.加入4mL的己烷利用超声波使其充分悬浮，并转移到离心管。

15.加入40mL的丙酮(4℃)并混合。

16.于-30℃放置1小时至一夜。

17.在3000rpm、4℃的条件下离心10分钟。

18.舍弃上清液，回收沉淀物。

19.在干燥器中干燥一夜。

→将在该步骤中得到的组合物(p1-PE+p1-PC+CAEP+胆固醇)作为比较组合物(2)。需要说明的是，p1-PC是胆碱缩醛磷脂，CAEP是神经酰胺氨基乙基膦酸。

[本发明组合物的炎症抑制作用的确认]

发炎时，主要是小胶质细胞中，炎症因子NF-kB的亚基即p65蛋白转移至核内，诱导IL-1beta、TNF-alpha等炎症细胞因子。脂多糖(LPS)通过增加核内的p65的表达来诱导炎症信号。本实施例中，验证了本发明的组合物针对来自小鼠的小胶质细胞(MG6及BV2)中的LPS诱导性炎症信号的效果。

具体的操作规程如下。

1.使组合物(1)～(3)溶于水中。

2.用添加或未添加组合物的状态的2％血清DMEM培养基将来自小鼠的小胶质细胞(MG6及BV2)培养一夜。需要说明的是，对于添加了组合物的培养基而言，分别以包含相同量(5μg/mL)的活性缩醛磷脂的方式进行制备。

3.之后，加入LPS(1μg/ml)，处理6小时。

需要说明的是，评价对象为以下5种：未添加LPS的“对照LPS^-”、添加了LPS的“对照LPS⁺”、“本发明的组合物(1)LPS⁺”、“比较组合物(2)LPS⁺”、“比较组合物(3)LPS⁺”。

4.6小时后，通过细胞采集、细胞分级来分离提取出核。

5.使用核提取物进行蛋白质印迹检测，检测出作为炎症标志物的p65蛋白。

6.通过该蛋白质表达的确认，对在小胶质细胞中组合物(1)～(3)是否会减轻LPS诱导性炎症信号(核内的p65的表达)进行验证。其结果如图2所示。

如图2所示，就本发明的组合物(1)及比较组合物(2)而言，可以显著地抑制由脂多糖(LPS)诱发的炎症，就其抑制效果而言，与比较组合物(2)相比，本发明的组合物(1)更优异。

产业上的可利用性

由于利用本发明的制法制造的包含缩醛磷脂的功能性素材可以用于食品、化妆品，因此在产业上是有用的。

Claims (7)

1.包含缩醛磷脂的功能性素材的制造方法，其特征在于，包括下述工序：

酶处理工序，用蛋白酶对包含缩醛磷脂的动物组织进行处理，以及

提取工序，用含有乙醇的提取液对经所述蛋白酶处理的动物组织进行提取。

2.如权利要求1所述的包含缩醛磷脂的功能性素材的制造方法，其特征在于，动物组织为选自扇贝类、海鞘以及鸟类的动物组织。

3.如权利要求1或2所述的包含缩醛磷脂的功能性素材的制造方法，其特征在于，蛋白酶为中性蛋白酶。

4.脑神经炎抑制组合物的制造方法，其特征在于，配合利用权利要求1～3中任一项的制造方法得到的功能性素材。

5.功能性素材，其是利用权利要求1～3中任一项的制造方法得到的。

6.脑神经炎抑制组合物，其是利用权利要求4的制造方法得到的。

7.如权利要求6所述的脑神经炎抑制组合物，其特征在于，用于预防或改善选自认知症、帕金森病、抑郁症、以及精神分裂症的脑神经疾病。

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