JP5589176B2 - 新規ペプチド分解物 - Google Patents
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Description
本発明は、酵素処理したエイ肉のペプチド分解物並びにそれを含む食品及び脂質代謝改善剤・肝機能改善剤に関する。
近年、先進国では高脂血症、肥満、糖尿病および高血圧などの生活習慣病の罹患率増加に対して、食品の生体調節機能を利用したストレスが少ない予防法の確立が模索されている。生体調節機能を持つ食品成分には脂質や食物繊維なども知られているが、タンパク質やタンパク質の加水分解物も生理作用を持つことが報告されている（例えば、特許文献１など）。また、動物性タンパク質のうち魚タンパク質からは、陸上動物とは異なった栄養生理機能を持つことが知られている。そこで、これらの栄養生理機能を有するタンパク質の加水分解物を健康の改善に利用しようという試みが多くなされ始めている。
一方、日本の干潟の４０％の面積をもつ有明海は、高い漁業生産力を有し、日本の他の海域では見られない特産生物の宝庫として知られている。しかしながら、近年タイラギやアサリなどの二枚貝の減少が続いており、漁獲量も激減している。現在タイラギの水揚げ量は例年の２５％に落ち込み、漁業者にとって大きな打撃となっている。その原因の一つとして、ナルトビエイにより食害が挙げられる。このような被害は、山口県や大分県、長崎県などからも報告されている。
ナルトビエイ（Aetobatus flagellum）は温帯から熱帯の沿岸域に生息し、摂食量は多く、小魚は食べず二枚貝のみを餌とする。また、大きなものでは２０キロを超え、解剖では体内に一匹当たり２００から３００個のアサリが確認されている。現在、佐賀県を中心としてナルトビエイの駆除を行っているが、捕獲量は年間５５トンにも及んでいる。ナルトビエイの肉質は、尿素が多く臭みがあるためそのままでは食用には利用されにくく、捕獲後はすべて焼却処分されているのが現状である。このため、捕獲したナルトビエイの有効利用法について、県や漁業組合で検討が進められている。
これまでに、エイ肉の摂取による脂質代謝および肝機能改善作用が実験動物の系において報告されているが（非特許文献１）、エイ肉タンパク質をペプチド化することにより、栄養生理機能が増強することは未だ知られていなかった。
特表２００６−５１０３６７
佐賀大学有明海総合研究プロジェクト成果報告集、第１巻、別紙４、２００５年７月
したがって本発明は、エイ肉のペプチド分解物並びにそれを含む食品及び脂質代謝改善剤・肝機能改善剤を提供することを課題とする。
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ねた結果、エイ肉を酵素処理してペプチド化することにより、栄養生理機能が増強することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下の通りである。
項１．酵素処理したエイ肉のペプチド分解物。
項２．酵素処理が、消化酵素由来プロテアーゼ、カビ・酵母由来プロテアーゼ、細菌由来プロテアーゼ、植物由来プロテアーゼからなる群より選ばれる、少なくとも１つの酵素によって行われる、項１に記載のペプチド分解物。
項３．酵素が、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パンクレアチン、パパイン及びブロメラインからなる群より選択される、項２に記載のペプチド分解物。
項４．項１〜３のいずれか１つに記載のペプチド分解物を含有する飲食品。
項５．項１〜３のいずれか１つに記載のペプチド分解物を含有する、脂質代謝改善剤。
項６．項１〜３のいずれか１つに記載のペプチド分解物を含有する、肝機能改善剤。
項７．項１〜３のいずれか１つに記載のペプチド分解物を含有し、以下の(i)〜(iii)のいずれかの表示を付した飲食品。
(i) 血中脂肪やコレステロールを低減する旨の表示
(ii)肝機能を改善する旨の表示
(iii) 生活習慣病を予防し、体調を維持する旨の表示
項８．項１〜３のいずれか１つに記載のペプチド分解物を含有する、ペットフード及び又は飼料用組成物。
項１．酵素処理したエイ肉のペプチド分解物。
項２．酵素処理が、消化酵素由来プロテアーゼ、カビ・酵母由来プロテアーゼ、細菌由来プロテアーゼ、植物由来プロテアーゼからなる群より選ばれる、少なくとも１つの酵素によって行われる、項１に記載のペプチド分解物。
項３．酵素が、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パンクレアチン、パパイン及びブロメラインからなる群より選択される、項２に記載のペプチド分解物。
項４．項１〜３のいずれか１つに記載のペプチド分解物を含有する飲食品。
項５．項１〜３のいずれか１つに記載のペプチド分解物を含有する、脂質代謝改善剤。
項６．項１〜３のいずれか１つに記載のペプチド分解物を含有する、肝機能改善剤。
項７．項１〜３のいずれか１つに記載のペプチド分解物を含有し、以下の(i)〜(iii)のいずれかの表示を付した飲食品。
(i) 血中脂肪やコレステロールを低減する旨の表示
(ii)肝機能を改善する旨の表示
(iii) 生活習慣病を予防し、体調を維持する旨の表示
項８．項１〜３のいずれか１つに記載のペプチド分解物を含有する、ペットフード及び又は飼料用組成物。
本発明により、エイ肉のペプチド分解物を用いると、エイ肉をそのままで用いた場合よりも血清および肝臓における脂質改善並びに脂肪組織重量改善が高められることが見出された。本発明のペプチド分解物を食品に添加することにより、日常の食生活のなかで、高コレステロール血症を代表とする高脂血症や高トリグリセリド血症などの生活習慣病を予防あるいは改善することが期待できる。
本発明において、エイ肉とはエイの肉であればよく、好ましくは、トビエイ（Myliobatiformes）の肉を用いる。エイ肉はそのまま使用してもよいし、あるいは、冷凍したもの、または熱風乾燥、凍結乾燥したものなど必要に応じて任意に使用することができる。
本発明に用いる酵素処理したエイ肉のペプチド分解物とは、エイ肉を酵素処理してペプチドに分解したものであれば良い。酵素の種類はエイ肉を分解できる酵素であれば特に限定されない。例えば、そのような酵素として、タンパク質分解酵素、ペプチド分解酵素などが挙げられるが、エイ肉を十分に分解するにはタンパク質分解酵素が好ましく、例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パンクレアチンのような消化酵素由来プロテアーゼ、カビ・酵母由来プロテアーゼ、細菌由来プロテアーゼ、あるいはパパインやブロメライン等の植物由来プロテアーゼなどを用いることができる。
上記の酵素は１種又は任意の２種以上を組み合わせて使用することもできる。酵素処理は、使用する酵素それぞれに応じて一般的な方法で行うことができる。たとえば、２０℃から８０℃でエイ肉に反応させて処理することで実施することができる。この際、反応液のｐＨや反応溶媒は、使用する酵素の種類に応じて適宜選択することができる。
本発明のエイ肉のペプチド分解物の具体的な調製方法の一態様としては、例えば、以下の方法が挙げられる。まず、エイの凍結肉を粉砕し、プロテアーゼを用い至適ｐＨならびに温度にて反応させ、固液分離により可溶化物を分画後、限外濾過により分子量５ｋＤａ以下の透過液（プロテアーゼ消化物）および保持液（可溶性・未消化物）を得る。本発明の目的とするエイ肉ペプチド分解物は、酵素処理後の限外濾過による透過液に溶けた水溶性物質として含まれている。固液分離法としては、濾過処理、遠心分離等が挙げられる。限外濾過法としては、通常の限外濾過膜を用いた方法の他、セラミックフィルタを用いた方法等を用いることができる。必要に応じ、酵素処理前に粉砕した肉をアルコール等の有機溶媒で洗浄し、脂質や低分子エキス成分を除去することもできる。
このようにして得られたエイ肉ペプチド分解物水溶液を、そのまま製品とすることもでき、また、必要に応じて、各種の精製処理を行って、より高純度の製品を得ることもできる。精製処理としては、脱脂処理や脱塩処理、クロマトグラフィー等が挙げられる。固液分離処理としては、濾過処理、遠心分離処理などが挙げられる。
本発明のペプチド分解物は、飲食品（健康食品、栄養補助食品等を含む）又は医薬品（生命予後改善用薬、栄養剤等を含む）のいずれにも用いることができる。飲食品には、動物（ヒトを含む）が摂取できるあらゆる飲食品が含まれる。例えば、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、粉末剤、飲料、ガム、チョコレート、飴、麺、パン、ケーキ、ビスケット、缶詰、レトルト食品、畜肉食品、水産練食品、乳加工品、大豆加工品、米加工品、調味料などの通常の医薬品、食品の形態を採用することができる。中でも、摂取量を調節しやすいカプセル剤、錠剤、顆粒剤、飲料などが好ましい。
また前記飲食品を保健機能食品として提供することも可能であり、この保健機能食品には、脂質代謝改善および肝機能改善のために用いるものであるという表示を付した飲食品、特に特定健康用食品なども含まれる。
本発明に係るエイ肉の酵素処理ペプチド分解物を含む飲食品には、必要に応じて、ミネラル類、ビタミン類、フラボノイド類、キノン類、ポリフェノール類、アミノ酸、核酸、必須脂肪酸、清涼剤、結合剤、甘味料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤等を配合することができる。かかる添加物については、本書においてそれらの全体が援用される「指定品目 食品添加物便覧 １９９９年版」岸 眞之輔 編集、平成１１年１２月１０日発行、又は、「新訂版＝よくわかる 暮しのなかの食品添加物」日本食品添加物協会編集、１９９６年１２月２０日発行」に記載される添加物を用いることができる。
発明に係るエイ肉の酵素処理ペプチド分解物を含有した飲食品および医薬品は、そのペプチド分解物が脂質代謝及び肝機能の改善に有効であり、日常食する主食、飲料等に利用すれば、高脂血症、高血圧などの生活習慣病を予防し、改善にきわめて大きな効果を有する。
また、発明に係るエイ肉の酵素処理ペプチド分解物を含有したペットフードおよび飼料は、そのペプチド分解物が脂質代謝及び肝機能の改善に有効であり、日常給与するペットフード、試料等に利用すれば、ペットや家畜の高脂血症、高血圧などの生活習慣病を予防し、改善にきわめて大きな効果を有する。
本発明の脂質代謝改善剤および肝機能改善剤は、上記エイ肉の酵素処理ペプチド分解物を有効成分とし、常法により製剤化することができる。製剤上の必要に応じて、例えば、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、でんぷん、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、ゼラチン等の担体や、溶剤、溶解補助剤、等張化剤等の通常の添加剤を適宜配合することができる。
製剤における配合量は、投与形態、使用目的、年齢、体重などによって異なるが、通常、製剤全量中、固形分換算して、０．１〜９５重量％、好ましくは１〜９０重量％である。また、製剤化における有効成分の添加法については、予め加えておいても、製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すれば良い。
本発明の脂質代謝改善剤および肝機能改善剤は、有効成分がエイ肉のペプチド分解物であるため、安全性に優れており、飲食品、ペットフード、試料の形態でも簡便に使用することができる。
本発明のエイ肉の酵素処理ペプチド分解物を脂質代謝改善および肝機能改善の用途で摂取する場合、一日の投与量は、一般成人で、ペプチド分解物に換算して０．００１〜３ｇ／ｋｇ体重／日以上、好ましくは０．０１〜３ｇ／ｋｇ体重／日、より好ましくは０．０３〜２ｇ／ｋｇ体重／日である。これらは、１日に１回投与してもよく、あるいは数回に分けて投与してもよい。投与方法や投与量は種々の条件で変動するので、上記投与範囲より少ない量で十分な場合もあるし、また、範囲を超えて投与する必要がある場合もある。
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、本発明者らは、本発明が理論により拘束されることを望まない。
[実施例]ナルトビエイ肉ペプシン分解物の調製
１．原料
ナルトビエイ凍結肉（有明海産、約10 kg）を約4〜5 cm四方程度のブロックに切り、凍結状態のまま回転刃式ミキサー（ロボクープ製 R-2）で粗粉砕した。これを再凍結させ、凍結乾燥（FTS-Systems製 Dura-top/Dura-dry）に供した。乾燥品をミキシングして均質化させた。
２．ペプシン消化物の調製（図1）
ナルトビエイ肉乾燥粉末（Eagle Ray Powder；ERP）を含水エタノール（80%, v/v）で洗浄し、エキス分を除去した処理物（W-ERP）を得た。W-ERPを純水に分散させ、撹拌しながら塩酸を添加し、pH = 2.0に調整した。これを50℃に調温し、ブタ胃粘膜由来ペプシン（日本バイオコン製）をサンプルに対して1wt％添加し、そのまま18〜20 h反応させた。沸騰水中で酵素を失活（Boil, 20 min）させた反応液を遠心分離し（18,000 x G, 20min）、上清を得た。これを分画分子量5 kDaの限外ろ過膜（ミリポア製Biomax）で限外ろ過し、透過液（ペプシン消化物）および保持液（可溶性・ペプシン未消化物）を得た。これらにNaOHを添加してpH =6.5に調整し、凍結乾燥して各々の乾燥粉末を得た。ペプチド調製工程の概略図を図１に示す。
３．結果
表1に示すように、40%の収率で、ナルトビエイ肉よりペプシン分解物（Pepsic-lysate）が得られた。また、副産物であるペプシン未消化-不溶性画分、ペプシン未消化-可溶性画分および80%エタノール可溶性画分の収率は、それぞれ 25.9、16.3 ならびに18.7%であった。それぞれの産物の総アミノ酸含有量を表2に示した。
[実施例]ナルトビエイ肉ペプシン分解物の調製
１．原料
ナルトビエイ凍結肉（有明海産、約10 kg）を約4〜5 cm四方程度のブロックに切り、凍結状態のまま回転刃式ミキサー（ロボクープ製 R-2）で粗粉砕した。これを再凍結させ、凍結乾燥（FTS-Systems製 Dura-top/Dura-dry）に供した。乾燥品をミキシングして均質化させた。
２．ペプシン消化物の調製（図1）
ナルトビエイ肉乾燥粉末（Eagle Ray Powder；ERP）を含水エタノール（80%, v/v）で洗浄し、エキス分を除去した処理物（W-ERP）を得た。W-ERPを純水に分散させ、撹拌しながら塩酸を添加し、pH = 2.0に調整した。これを50℃に調温し、ブタ胃粘膜由来ペプシン（日本バイオコン製）をサンプルに対して1wt％添加し、そのまま18〜20 h反応させた。沸騰水中で酵素を失活（Boil, 20 min）させた反応液を遠心分離し（18,000 x G, 20min）、上清を得た。これを分画分子量5 kDaの限外ろ過膜（ミリポア製Biomax）で限外ろ過し、透過液（ペプシン消化物）および保持液（可溶性・ペプシン未消化物）を得た。これらにNaOHを添加してpH =6.5に調整し、凍結乾燥して各々の乾燥粉末を得た。ペプチド調製工程の概略図を図１に示す。
３．結果
表1に示すように、40%の収率で、ナルトビエイ肉よりペプシン分解物（Pepsic-lysate）が得られた。また、副産物であるペプシン未消化-不溶性画分、ペプシン未消化-可溶性画分および80%エタノール可溶性画分の収率は、それぞれ 25.9、16.3 ならびに18.7%であった。それぞれの産物の総アミノ酸含有量を表2に示した。
[試験例]エイペプチドのOLETFラットにおける影響
実験動物には、肥満モデルであるOtsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF)ラットを用いた。食餌組成はAIN-76に準じ、コントロール食のタンパク質はカゼイン20％とした。エイパウダー群（ERP 10%、R群）およびエイペプチド群（Ray pepsic-lysate 10%、RL群）には、それぞれエイタンパク質粉末及びエイペプチド粉末を20％添加し、カゼインと置き換えた（表２）。
実験動物には、肥満モデルであるOtsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF)ラットを用いた。食餌組成はAIN-76に準じ、コントロール食のタンパク質はカゼイン20％とした。エイパウダー群（ERP 10%、R群）およびエイペプチド群（Ray pepsic-lysate 10%、RL群）には、それぞれエイタンパク質粉末及びエイペプチド粉末を20％添加し、カゼインと置き換えた（表２）。
以上の食餌を、５週齢雄のOLETFラットに3週間摂食させ、腹部大動脈採血により屠殺を行い、血清、肝臓、脂肪組織（白色脂肪組織：腎臓周辺・精巣周辺・腸間膜周辺・腹部皮下脂肪）を摘出し、分析に供した。
評価項目は、体重、摂食量、肝重量、体脂肪重量（白色）、血液生化学データ（トリアシルグリセロール、総コレステロール、リン脂質、血糖、インスリン、アディポサイトカイン等）及び肝臓脂質濃度とした。
血清トリアシルグリセロール（TG）濃度および総コレステロール（T-Chol）濃度は、ゲル濾過浸透HPLCを用いたオンライン2重酵素法（スカイライトバイオテック）によって測定を行った。血清リン脂質（PL）濃度はリン脂質C-テストワコー（和光純薬）を用いてコリンオキシダーゼ・DAOS法により測定した。血清グルコース濃度はグルコースCII-テストワコー（和光純薬）を用いてムロターゼ・GOD法により測定した。血中のインスリン、アディポネクチン、レプチン、plasminogen activator inhibitor-１（PAI-１）、およびC-reactive protein（CRP）濃度は、それぞれレビスインスリンキット（シバヤギ）、マウス/アディポネクチンELISAキット（大塚製薬）、ラットレプチンELISAキット（矢内原研究所）、IMUCLONE Rat PAI-1ELISA（American diagnostica Inc）、Rat CRP ELISA KIT（alpha diagnostic international）を用いてELISA法により測定した。
肝臓脂質はFolchらの方法により抽出、濃縮した(Folch J et al, J. Biol. Chem., vol.226, pp.497-506, 1957)。即ち、摘出した肝臓0.25 gを7.5 mlのメタノール、15 mlのクロロホルムでホモジナイズした後、37℃にて10分間加温抽出し、クロロホルム：メタノール混液（C:M＝2:1，v/v）で25 mlに定容し濾過した。濾液量測定後、蒸留水を20％容加え転倒混和し、一晩放置した。翌日、クロロホルム層をエバポレーターを用いて減圧濃縮し、石油エーテルに再溶解した後25 mlに定容した。
肝臓TG濃度はFletcherらの方法により定量した（Fletcher M.J., Clin. Chem. Acta., vol.22, pp.393-397, 1968)。脂質抽出液を窒素ガス下で乾燥後、クロロホルム5 ml及びシリカゲル1.0 gを添加し、よく振とうした後、遠心分離した（3000 rpm、10分）。そのうち1 mlを再び窒素ガス下で乾燥し、イソプロパノール：蒸留水（isopro:H2O＝9:1，v/v）2 ml、5％水酸化カリウム液（in isopropanol: H2O＝2:3, v/v）0.6 mlを加え、栓をして60〜70℃水浴中で30分間加温した（ケン化）。3 mMメタ化ヨウ素酸ナトリウム1 ml、アセチルアセトン液0.5 mlを加え十分混和し、50℃水浴中で30分間加温発色させた。冷却後、405 nmで吸光度を測定した。
肝臓T-Chol濃度は、コレステロールE-テストワコー（和光純薬）を用いてコレステロールオキシダーゼ・DAOS法により測定した。脂質抽出液を乾燥後、発色液を入れて攪拌し、30℃で5分間加温した。次に、クロロホルム1.5 mlを加え、シェーカーで5分間混和し、20分間遠心分離（3000 rpm、10℃）後、波長600 nmで吸光度を測定した。
肝臓PL濃度は、Bartlettらの方法で測定した(Bartlett G.R., J. Biol. Chem., vol.234, pp.466-469, 1958)。脂質抽出液を乾燥後、70％過塩素酸溶液1 ml、2.5％モリブデン酸アンモニウム1 mlを加えて攪拌した。次に、10％アスコルビン酸1 mlを加え、栓をした後5分間加温して発色させ、波長820 nmで吸光度を測定した。
上記実験によって得られたデータは、Student t-testおよびDuncan’s multiple range test (Duncan, D.B., Biometrics, Vol.11, pp.1-42, 1955)を用いて統計処理を行った。
結果：
表３に示すように、体重増加量、摂食量及び食餌効率においては、エイタンパク質摂取群、エイペプチド摂取群、カゼイン摂取群の間に差は認められなかった。このことは、エイペプチドがカゼインおよびエイタンパク質と同等の栄養価を有し、ラットの成長に悪影響を及ぼさないことを示していた。一方、肝臓重量並びに脂肪組織重量においては、エイペプチド摂取群で、カゼイン摂取群及びエイタンパク質摂取群に比して低減する傾向が認められた。この結果は、過剰摂取による肥満防止に対してエイペプチド摂取が有効であることを示唆していた。
表３に示すように、体重増加量、摂食量及び食餌効率においては、エイタンパク質摂取群、エイペプチド摂取群、カゼイン摂取群の間に差は認められなかった。このことは、エイペプチドがカゼインおよびエイタンパク質と同等の栄養価を有し、ラットの成長に悪影響を及ぼさないことを示していた。一方、肝臓重量並びに脂肪組織重量においては、エイペプチド摂取群で、カゼイン摂取群及びエイタンパク質摂取群に比して低減する傾向が認められた。この結果は、過剰摂取による肥満防止に対してエイペプチド摂取が有効であることを示唆していた。
また、肝臓TG濃度においては、エイタンパク質摂取群で、カゼイン摂取群に比して有意な低値を示した（表４）。さらに、T-Chol濃度及びPL濃度は、エイタンパク質摂取群およびエイペプチド摂群で、カゼイン摂取群に比して低値を示した（表４）。
血中グルコース濃度については、エイタンパク質摂取群およびエイペプチド摂取群とカゼイン摂取群との間の差は認められなかったが、血中インスリン濃度ならびに血中レプチン濃度は、エイペプチド摂取群においてカゼイン摂取群に比して低値を示す傾向が認められ、特に血中レプチン濃度については、有意な低値を示した（表５）。このことは、エイタンパク質並びにエイペプチドの摂取が、OLETFラットにおけるインスリン抵抗性ならびにレプチン抵抗性の発症抑制に有効であることを示唆していた。
また、血管系炎症反応の指標とされるPAI-1濃度ならびにCRP濃度は、エイペプチド摂取群においてカゼイン摂取群に比して低値を示す傾向が認められた（表５）。このことは、エイペプチドの摂取が、OLETFラットにおける血管炎症反応の抑制と、炎症より惹起される動脈硬化性疾患の予防に有用であることを示唆するものであった。
さらに、血清脂質濃度に及ぼす各種食餌の影響について検討したところ、TG、T-CholならびにPL濃度は、エイタンパク質摂取群及びエイペプチド摂取群においてカゼイン摂取群に比して低値を示す傾向が認められ、特に、TG濃度はエイタンパク質摂取により１４％の低下傾向を示し、エイペプチド摂取により４７％の低下傾向を示した（図２）。
以上の結果から、エイペプチドはエイタンパク質における脂質代謝改善効果の主たる関与成分であり、脂質代謝及び肝機能の改善に有効であること、さらには日常食する主食、飲料等にエイペプチドを含有する飲食品を利用することにより、肥満、高脂血症、動脈硬化症、高血糖などの生活習慣病を予防し、利用者のQuality of Lifeの改善に対してきわめて大きな効果を発揮することが示された。
Claims (6)
- 酵素処理したトビエイ肉のペプチド分解物であって、酵素が、ペプシンである、ペプチド分解物。
- 請求項１に記載のペプチド分解物を含有する飲食品。
- 請求項１に記載のペプチド分解物を含有する、脂質代謝改善剤。
- 請求項１に記載のペプチド分解物を含有する、肝機能改善剤。
- 請求項１に記載のペプチド分解物を含有し、以下の(i)〜(iii)のいずれかの表示を付した飲食品。
(i)血中脂肪やコレステロールを低減する旨の表示
(ii)肝機能を改善する旨の表示
(iii)生活習慣病を予防し、体調を維持する旨の表示 - 請求項１に記載のペプチド分解物を含有する、ペットフード又は飼料用組成物。
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