JP5925391B2

JP5925391B2 - ペプチド又はその酸付加塩、飲食品、及び糖尿病予防等の組成物

Info

Publication number: JP5925391B2
Application number: JP2015538203A
Authority: JP
Inventors: 貴文水重; 耕作大日向; 達宏綾部; 耕介速水; 韓　力; 力韓; 辻　智子; 智子辻
Original assignee: Kyoto University; Nippon Suisan KK
Current assignee: Kyoto University; Nippon Suisan KK
Priority date: 2013-10-16
Filing date: 2014-10-08
Publication date: 2016-05-25
Anticipated expiration: 2034-10-08
Also published as: WO2015056619A1; JPWO2015056619A1

Description

本発明は、ペプチド又はその酸付加塩、飲食品、及び糖尿病予防等の組成物に関する。

日本では６５歳以上の高齢者人口が３,１９０万人、総人口に占める割合は２５．１％（平成２５年１０月現在）に達し、さらに高齢者の割合は増加の一途をたどると予想されている。加齢は様々な身体機能に影響を及ぼし、特に運動機能の維持に必須である骨格筋量はピーク時より３０〜４０％減少するといわれている。加齢によるサルコペニア（筋肉減少症）により日常生活に支障をきたし、寝たきりとなってしまう高齢者も多く存在する。また、骨格筋は糖・エネルギー代謝を行う主たる組織であり、サルコペニアは糖尿病、肥満の発症の引き金となりうる。そのため、これら症状の改善のために、筋機能や耐糖能の維持、改善につながる生理活性物質を提供することが期待されている。

年齢を問わず筋機能維持のためには適切な運動が効果的である。一方で、乳清タンパク質や大豆タンパク質をはじめとした食品タンパク質を摂取すると、骨格筋のタンパク質合成を促進し、分解を抑制することが知られている。そこで、食品タンパク質の摂取と骨格筋量との関係が注目されている。

ところで、骨格筋には瞬発力にすぐれた速筋繊維と、持久力に優れた遅筋繊維の２種類の筋繊維タイプが存在する。これまで、ラットにスケトウダラタンパク質（ＡＰＰ）を含んだ餌を８週間摂取させることで骨格筋が肥大化、速筋化することが明らかとなっており（非特許文献１）、高齢者の筋委縮の改善につながると考えられている。また、骨格筋、特に速筋は糖取り込みが盛んな臓器であり、骨格筋の肥大化、速筋化により耐糖能が上昇し、糖尿病の改善につながると考えられている。

また、タラタンパク質がインスリン感受性を高めるという報告がある（非特許文献２）。

ＴａｋａｆｕｍｉＭｉｚｕｓｈｉｇｅ，ＦｕｍｉｎｏｒｉＫａｗａｂａｔａ，ＫｅｉｓｕｋｅＵｏｚｕｍｉ，ＴｏｍｏｋｏＴｓｕｊｉ，ＴａｒｏＫｉｓｈｉｄａ，ＫｉｙｏｓｈｉＥｂｉｈａｒａ．Ｆａｓｔ−ｔｗｉｔｃｈｍｕｓｃｌｅｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙｐａｒｔｌｙｉｎｄｕｃｅｓｌｉｐｉｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｗｉｔｈＡｌａｓｋａｐｏｌｌａｃｋｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔａｋｅｉｎｒａｔｓ．ＢｉｏｍｅｄＲｅｓ．２０１０Ｄｅｃ；３１（６）：３４７−５２．ＶｅｒｏｎｉｑｕｅＯｕｅｌｌｅｔｅｔａｌ．；ＤｉｅｔａｒｙＣｏｄＰｒｏｔｅｉｎＩｍｐｒｏｖｅｓＩｎｓｕｌｉｎＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｉｎＩｎｓｕｌｉｎ−ＲｅｓｉｓｔａｎｔＭｅｎａｎｄＷｏｍｅｎ；ＤｉａｂｅｔｓＣａｒｅ；２００７Ｎｏｖ；３０（１１）：２８１６−２８２１．

しかしながら、糖尿病予防等に用いられる組成物の研究は発展途上であり、より改善効果の高い組成物を提供することが求められている。

本発明は、以上の実情に鑑みてなされたものであり、その目的は、糖尿病予防、糖尿病治療、インスリン感受性増強又は糖代謝改善等に優れる組成物を提供することである。

本発明者らは、ＱＷを含む９アミノ酸以下のペプチド、又はＥＬＲを含む１０アミノ酸以下のペプチドからなる、単離されたペプチド又はその酸付加塩が、糖尿病予防、糖尿病治療、インスリン感受性増強、糖代謝改善等に優れることを見出し、本発明を完成するに至った。具体的に、本発明は以下のものを提供する。

（１）本発明は、ＱＷ（配列番号１，２）を含む９アミノ酸以下のペプチド、又はＥＬＲ（配列番号３，４）を含む１０アミノ酸以下のペプチドからなる、単離されたペプチド又はその酸付加塩である。

（２）また、本発明は、前記ＱＷを含む９アミノ酸以下のペプチドがＱＷＲ（配列番号５，６）を含む９アミノ酸以下のペプチドである、（１）に記載の単離されたペプチド又はその酸付加塩である。

（３）また、本発明は、前記ＱＷＲが、前記ＱＷを含む９アミノ酸以下のペプチドのＣ末端に存在するものである、（２）に記載の単離されたペプチド又はその酸付加塩である。

（４）また、本発明は、前記ＱＷを含む９アミノ酸以下のペプチドがＡＮＧＥＶＡＱＷＲ（配列番号７，８）、ＡＮＳＥＶＡＱＷＲ（配列番号９，１０）又はＱＷＲ（配列番号５，６）のいずれかである、（１）から（３）のいずれかに記載の単離されたペプチド又はその酸付加塩である。

（５）また、本発明は、前記ＥＬＲが、前記ＥＬＲを含む１０アミノ酸以下のペプチドのＣ末端に存在するものである、（１）から（４）のいずれかに記載の単離されたペプチド又はその酸付加塩である。

（６）また、本発明は、前記ＥＬＲを含む１０アミノ酸以下のペプチドがＥＬＲ（配列番号３，４）である、（１）から（５）のいずれかに記載の単離されたペプチド又はその酸付加塩である。

（７）また、本発明は、前記ＥＬＲを含む１０アミノ酸以下のペプチドがＹＮＥＬＲ（配列番号１１，１２）である、（１）から（６）のいずれかに記載の単離されたペプチド又はその酸付加塩である。

（８）また、本発明は、（１）から（７）のいずれかに記載の単離されたペプチド又はその酸付加塩を添加した飲食品である。

（９）また、本発明は、（１）から（７）のいずれかに記載の単離されたペプチド又はその酸付加塩を有効成分とする糖尿病予防又は糖尿病治療に用いられる組成物である。

（１０）また、本発明は、（１）から（７）のいずれかに記載の単離されたペプチド又はその酸付加塩を有効成分とするインスリン感受性増強又は糖代謝改善に用いられる組成物である。

（１１）また、本発明は、ＡＮＧＥＶＡＱＷＲ（配列番号７）、ＡＮＳＥＶＡＱＷＲ（配列番号９）又はＩＷＨＨＴＦＹＮＥＬＲ（配列番号１３）の配列を有するペプチドを含む動物性タンパク質をトリプシンにより分解し、さらに分解物中の前記ペプチドを２倍以上に濃縮する、糖尿病予防又は糖尿病治療に用いられる組成物の製造方法である。

本発明によれば、ＱＷを含む９アミノ酸以下のペプチド、又はＥＬＲを含む１０アミノ酸以下のペプチドからなる、単離されたペプチド又はその酸付加塩を用いることで、糖尿病予防、糖尿病治療、インスリン感受性増強、糖代謝改善等の効果が得られる。

ＡＰＰトリプシン消化物をマウスに投与したときの血糖値の減少率を示す図である。ＡＰＰキモトリプシン消化物又はパンクレアチン消化物をマウスに投与したときの血糖値の減少率を示す図である。ＡＰＰトリプシン消化物を４つのフラクションに分画したときのＨＰＬＣチャートである。上記４つのフラクションに係る消化物をマウスに投与したときの血糖値の減少率を示す図である。フラクションＣをさらに１０個のフラクションに再分画したときのＨＰＬＣチャートである。上記１０個のフラクションに係る消化物をマウスに投与したときの血糖値の減少率を示す図である。上記１０個のフラクションの中のフラクションＣ３及びＣ８をさらに再々分画したことを示す図である。図７に示す各々のフラクションに係る消化物をマウスに投与したときの血糖値を示す図である。フラクションＣ３−２及びＣ８−３のＨＰＬＣチャートを示す。合成ペプチドＡＮＧＥＶＡＱＷＲ（配列番号８），ＡＮＧ（配列番号１５），ＥＶＡ（配列番号１６）及びＱＷＲ（配列番号６）をマウスに投与したときの血糖値の減少率を示す図である。合成ペプチドＷＲ（配列番号１７）をマウスに投与したときの血糖値の減少率を示す図である。合成ペプチドＩＷＨ（配列番号１８），ＨＴＦ（配列番号１９）及びＹＮＥＬＲ（配列番号１２）をマウスに投与したときの血糖値の減少率を示す図である。合成ペプチドＹＮＥＬＲ（配列番号１２），ＹＮＥ（配列番号２０）及びＥＬＲ（配列番号４）をマウスに投与したときの血糖値の減少率を示す図である。合成ペプチドＡＮＳＥＶＡＱＷＲ（配列番号１０）をマウスに投与したときの血糖値の減少率を示す図である。各種合成ペプチドの細胞内糖取込み活性を示す図である。図１５に続く図である。合成ペプチドＱＷＲ（配列番号６）を病態マウスに投与し、グルコース負荷試験を行ったときの結果を示す図である。合成ペプチドＱＷＲ（配列番号６）を病態マウスに投与し、インスリン負荷試験を行ったときの結果を示す図である。合成ペプチドＱＷＲ（配列番号６）を正常マウスに投与し、インスリン負荷試験を行ったときの結果を示す図である。

以下、本発明の実施形態を説明するが、これに本発明が限定されるものではない。

＜ペプチド又はその酸付加塩＞
本発明は、ＱＷ（配列番号１，２）を含む９アミノ酸以下のペプチド、又はＥＬＲ（配列番号３，４）を含む１０アミノ酸以下のペプチドからなる、単離されたペプチド又はその酸付加塩である。本明細書において、ペプチドの酸付加塩とは、製薬上許容される酸（無機酸及び有機酸）との付加塩をいい、例えば塩酸塩、臭化水素、酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等が挙げられる。

［ＱＷを含む９アミノ酸以下のペプチド］
ペプチドの配列は、ＱＷを含み、９アミノ酸以下の単離されたものであれば、特に限定されるものではないが、ＱＷＲ（配列番号５，６）を含み、９アミノ酸以下の単離されたものであることが好ましい。また、ＱＷＲは、Ｃ末端に存在することが好ましい。

ＱＷＲを含み、９アミノ酸以下のペプチドは、その機能が完全に損なわれない限りにおいて、投与量あたりの機能性を向上する観点で、アミノ酸数が低いことが好ましく、具体的には、８アミノ酸以下、７アミノ酸以下、６アミノ酸以下、５アミノ酸以下、４アミノ酸以下、３アミノ酸以下が好ましい。中でも、ペプチドは、ＡＮＧＥＶＡＱＷＲ（配列番号７，８）、ＡＮＳＥＶＡＱＷＲ（配列番号９，１０）又はＱＷＲのいずれかであることが好ましい。

ペプチドは、ペプチド合成によって得られたものであっても、天然物由来のものであってもよい。ペプチド合成の手法は特に限定されるものでなく、固相法、液相法のいずれであってもよい。ペプチド合成によって得られた本発明のペプチドは逆相高速液体クロマトグラフィー、イオン交換樹脂やハイポーラスポリマー樹脂を用いたクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を用いた通常の精製法で精製できる。また、下記に説明するとおり、天然物由来のものは、ＡＮＧＥＶＡＱＷＲ又はＡＮＳＥＶＡＱＷＲの配列を有するペプチドを含む動物性タンパク質をトリプシンで分解し、分離、精製することによって得られる。

［ＥＬＲを含む１０アミノ酸以下のペプチド］
ペプチドの配列は、ＥＬＲを含み、１０アミノ酸以下の単離されたものであれば、特に限定されるものではないが、ＥＬＲは、Ｃ末端に存在することが好ましい。

ＥＬＲを含む１０アミノ酸以下のペプチドは、その機能が完全に損なわれない限りにおいて、投与量あたりの機能性を向上する観点で、アミノ酸数が低いことが好ましく、具体的には、９アミノ酸以下、８アミノ酸以下、７アミノ酸以下、６アミノ酸以下、５アミノ酸が好ましい。中でも、ペプチドは、ＥＬＲ又はＹＮＥＬＲ（配列番号１１，１２）であることが好ましい。

ＱＷを含む９アミノ酸以下のペプチドと同様、ＥＬＲを含む１０アミノ酸以下のペプチドについてもまた、ペプチド合成によって得られたものであっても、天然物由来のものであってもよい。下記に説明するとおり、天然物由来のものは、ＩＷＨＨＴＦＹＮＥＬＲ（配列番号１３）の配列を有するペプチドを含む動物性タンパク質をトリプシンにより分解することによって得られる。

＜飲食品＞
上記ペプチド又はその酸付加塩は、飲食品に含まれるものであってもよい。飲食品の種類は特に限定されず、例えば、チューインガム、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト若しくはまんじゅう等の菓子類、清涼飲料、お茶類、栄養飲料、スープ、又はパン若しくはうどん等の麺類等が挙げられる。飲食品は、食品の製造工程において、あるいは最終製品に、本実施形態の組成物、ペプチド等を混合、塗布、噴霧等により（典型的には食品添加剤として）添加して製造できる。

食品中のペプチドの含有量は適宜選択可能であるが、一般に食品に対して０．００００１〜１００重量％の範囲内である。そして、食品の味や外観を考慮すると、ペプチドの含有量は、食品１ｋｇあたり、１００μｇ〜１０００ｇ程度が好ましい。ペプチドそのままを健康食品等のサプリメントとして用いる場合、粉末、タブレット等の成形するための賦形剤等を添加するのみでよい。

＜組成物＞
上記ペプチド又はその酸付加塩は、糖取り込み増加作用を有することから、慢性的高血糖状態において随時血糖値及び／又は空腹時血糖値を低下させる血糖降下作用を示し、これにより慢性の高血糖状態を改善することができるため、糖尿病予防又は糖尿病治療の組成物として用いられる。また、上記ペプチド又はその酸付加塩は、インスリン感受性増強作用を示し、これにより、インスリン抵抗性を改善することができるため、インスリン感受性増強又は糖代謝改善の組成物としても用いられる。

本明細書において、「糖尿病」とは、インスリンの量的不足又は作用不足による慢性の高血糖状態を主徴とする代謝疾患群をいう。糖尿病は、インスリン依存型糖尿病（１型糖尿病）とインスリン非依存型糖尿病（２型糖尿病）に大別され、本発明の組成物は、インスリンとの併用にかかわらず有効成分の機能が奏されるため、いずれのタイプの糖尿病の予防又は治療にも好ましく用いることができる。

また、本明細書において、「インスリン感受性」とは、インスリンの作用の程度、即ち血糖低下作用及び糖新生抑制作用の程度をいう。従って、インスリン感受性増強に用いられる組成物は、インスリンとともに（同時であっても同時でなくてもよい。投与経路が同じであっても、異なっていてもよい。）投与される。上記ペプチド又はその酸付加塩の血糖降下作用及びインスリン感受性調節作用は、例えば、糖取り込み増加作用を測定することで評価できる。糖取り込み増加作用は、例えば、正常動物及び病態モデル動物を用いた高インスリン正常血糖クランプ法におけるＧｌｕｃｏｓｅｉｎｆｕｓｉｏｎｒａｔｅ（ＧＩＲ）を指標として評価できる。

また、本明細書において、「インスリン抵抗性」とは、組織におけるインスリンの感受性が低下し、インスリンの作用が抑制された状態をいう。インスリン抵抗性は、例えば、空腹時血糖とインスリン濃度、Ｂｒｇｍａｎのミニマムモデル、ｓｔｅａｄｙｓｔａｔｅｐｌａｓｍａｇｌｕｃｏｓｅ（ＳＳＰＧ）法、ＨＯＭＡ−ＩＲ（Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓｍｏｄｅｌａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、高インスリン正常血糖クランプ法を用いて評価できる。

また、本明細書において、「糖代謝改善」とは、糖質の代謝不良を改善し、より正常な糖の代謝状態とすることをいう。例えば、インスリンの作用不足により起こる高血糖状態等、糖質がエネルギーとなる過程において糖質の代謝経路が正常に働かず、糖質の利用が阻害されることがあるが、糖質の代謝不良を改善し、糖質の利用を促進することである。糖代謝改善がなされると、食後の血糖値の上昇を抑制し、またできる限り早く血糖値を正常値まで低下させることができる。一方、糖質の代謝不良は慢性的な高血糖状態を引き起こし、慢性的な高血糖状態は全身の血管障害を起こし、さらに神経障害、網膜症などの合併症もきたす。したがって、本発明の組成物は、これらの血管障害、その合併症の予防又は改善に有用である。

本発明に係る組成物は、上記有効成分のままの状態で又は医薬として許容される担体等の任意成分を更に配合して、経口又は非経口で投与される。

本発明の組成物を経口投与する場合の剤形としては、例えば、錠剤（糖衣錠及びフィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤及びマイクロカプセル剤を含む）、舌下錠、シロップ剤、乳剤又は懸濁剤が挙げられる。また、本発明の組成物を非経口投与する場合の剤形としては、例えば、注射剤、注入剤、点滴剤、バップ剤又は坐剤が挙げられる。

本発明のペプチド又はその酸付加塩は、適当な基剤（例えば、酪酸の重合体、グリコール酸の重合体、酪酸−グリコール酸の共重合体、酪酸の重合体とグリコール酸の重合体との混合物又はポリグリセロール脂肪酸エステル）と組み合わせて、徐放性製剤とすることも可能である。

上記組成物は、他の栄養成分（炭水化物等）、塩分（ＮａＣｌ等）、ｐＨ調整剤（食用酸等）を更に含んでもよい。また、本発明に係る予防又は治療剤は、薬学的又は生理学的に許容される基剤、担体、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤及び着色剤等の１種以上等を更に含んでよい。

担体及び賦形剤としては、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム及び結晶セルロース等が挙げられる。結合剤としては、デンプン、ゼラチン、シロップ、トラガントゴム、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース及びカルボキシメチルセルロース等が挙げられる。崩壊剤としては、デンプン、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム及びカルボキシメチルセルロースカルシウム等が挙げられる。滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、水素添加植物油、タルク及びマクロゴール等が挙げられる。着色剤は、医薬品に添加することが許容されている任意の着色剤であってよい。

本発明に係る組成物は、必要に応じて、白糖、ゼラチン、精製セラック、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート及びメタアクリル酸重合体等の一層以上の被膜を有してもよい。また、本発明に係る予防又は治療剤は、必要に応じて、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤及び可溶化剤等を含んでもよい。

本発明の組成物は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル又はヒト）、特にヒトに対して投与した場合に、血糖降下作用及びインスリン感受性増強作用を発揮できる。組成物の投与量は、症状の程度、患者の年齢、体重及び健康状態等の条件に応じて、限定されないが、成人であれば、上記ペプチド又はその酸付加塩が１μｇ〜１０ｇ／ｋｇ／日、好ましくは１００μｇ〜１ｇ／ｋｇ／日の量になるように、経口で１日１回又は２〜４回以上に分割し適宜の間隔をあけて、投与されてよい。

＜組成物の製造方法＞
上記組成物は、ＡＮＧＥＶＡＱＷＲ、ＡＮＳＥＶＡＱＷＲ又はＩＷＨＨＴＦＹＮＥＬＲの配列を有するペプチドを含む動物性タンパク質をトリプシンにより分解し、さらに分解物中の前記ペプチドを２倍以上に濃縮することによって得られる。

［動物性タンパク質］
動物性タンパク質は、ＡＮＧＥＶＡＱＷＲ（配列番号７）、ＡＮＳＥＶＡＱＷＲ（配列番号９）又はＩＷＨＨＴＦＹＮＥＬＲ（配列番号１３）の配列を有するペプチドを含み、かつ、この配列のペプチドがトリプシンにより産生されるものであれば、特に限定されず、乳タンパク質、牛、豚、羊、うさぎ、カンガルー等の畜肉及び獣肉、鶏、七面鳥、うずら等の鳥肉、魚、白身魚等の魚肉等の肉類タンパク質であってよい。魚肉タンパク質、特に白身魚の魚肉タンパク質、中でもタラ目に属する魚の魚肉タンパク質は、ペプチドがＡＮＧＥＶＡＱＷＲの配列とＩＷＨＨＴＦＹＮＥＬＲの配列との両方がトリプシン分解で産生される点で好ましい。

タラ目に属する魚としては、スケトウダラ、ミナミダラ、ノーザンブルーホワイティング、キングクリップ、メルルーサ、マダラ及びホキ等が挙げられ、中でもスケトウダラが好ましい。例えば、魚肉タンパク質として、以下の工程で処理したスケトウダラ魚肉及びホキ魚肉を使用することができる。

魚肉タンパク質は、例えば、次のような工程で製造してよい。魚肉を適当な大きさに切断し、切断した試料を凍結させた後、凍結乾燥機で凍結乾燥させる。凍結乾燥した試料を常法にて粉砕し、これにエタノール等を添加して脂溶性成分を溶出させる。次いで、エタノールを除去することにより魚肉タンパク質を得ることができる。

エタノール等の使用量は特に限定されないが、通常、抽出材料に対して、１〜５０倍量（容量）であり、好ましくは２〜２０倍量である。抽出温度は、室温〜抽出溶媒の沸点程度の間で任意に設定できるが、例えば室温〜抽出溶媒の沸点程度の温度で、振盪下または還流下に行うのが好ましい。あるいは、抽出材料と抽出溶媒からなる混合物を煮沸してもよい。抽出時間は、抽出を溶媒の沸点程度の温度で行う場合、５分〜数時間、好ましくは２０分〜２時間程度が適当である。このような抽出操作は、１回だけ行ってもよく、複数回繰り返し行ってもよい。

［動物性タンパク質の酵素分解］
上記動物性タンパク質をタンパク質分解酵素で分解する。このタンパク質分解酵素はトリプシンであることを要する。上記動物性タンパク質をトリプシンで分解することによって、分解物からＡＮＧＥＶＡＱＷＲ（配列番号７）、ＡＮＳＥＶＡＱＷＲ（配列番号９）又はＩＷＨＨＴＦＹＮＥＬＲ（配列番号１３）の配列からなる、単離されたペプチドを得ることができる。

酵素分解の手法は特に限定されるものではないが、例えば、脂溶性成分を除去した動物性タンパク質に対して適量の水を加えて充分ホモジナイズし、トリプシンを全重量の１／１００量を加えて３７℃で５時間、ｐＨ７．５の条件下でゆっくり撹拌して酵素分解に付すことが挙げられる。次いで、酵素分解後に１００℃で１０分間煮沸し、酵素を失活させて反応を終了させ、吸引ろ過によりペプチドに富むろ液を得ることができる。このようにして得られたろ液に、必要に応じて、例えば水酸化ナトリウムを加えると、ペプチドの酸付加塩にすることができる。

［ペプチドの濃縮］
そして、分解物中のペプチドを２倍以上に濃縮する。濃縮方法は特に限定されるものでなく、ろ過（例えば限外ろ過）、沈殿させて少量の溶媒へ再溶解、凍結乾燥して少量の溶媒へ再溶解、又は乾燥ゲルで溶媒吸収等が挙げられる。

＜試験１＞消化酵素のスクリーニング
［スケソウダラ魚肉タンパク質（以下「ＡＰＰ」ともいう。）の調製］
冷凍のアラスカ産スケトウダラフィレー（ユニシー社製）をバンドソー（秋山機械社製、６００ＳＴ）で１ｃｍ×１ｃｍ×１ｃｍ程度の大きさに切断した。切断した試料を凍結乾燥用トレーに一層に並べて、凍結乾燥機（東京理化器械社製、ＴＦ２０−８５ＡＴＮＮＮ）にて−３０℃で４時間の予備凍結後に、４昼夜凍結乾燥した。凍結乾燥試料を手で軽く砕き、ピンミル（槇野産業社製、ＥＭ−１Ａ）にて粉砕した。粉砕した凍結乾燥試料に９９．５％エタノール（和光純薬工業社製、試薬特級）を添加して脂溶性成分を溶出させた。１週間風乾させた後、残留エタノールをロータリーエバポレーター（東京理化器械社製、Ｎ−２１ＮＳ）にて除去し、スケトウダラ魚肉タンパク質を得た。冷凍のスケトウダラフィレー１０ｋｇから、約１．５ｋｇのスケトウダラ魚肉タンパク質が得られた。このタンパク質の組成を表１に示す。

［ＡＰＰ消化物の取得］
上記脂溶性成分を除去して得られたＡＰＰに水を加え、濃度を２０ｍｇ／ｍｌとし、充分ホモジナイズし、トリプシン、キモトリプシンについては全重量の１／１００量、パンクレアチンについては全重量の１／２０量を加えて３７℃で５時間、ｐＨ７．５の条件下でゆっくり撹拌して酵素分解に付した。その後、１００℃で１０分間煮沸し、消化酵素を失活させた。そして、吸引ろ過により、３種類のＡＰＰ消化物を得た。

［インスリン負荷試験］

４週齢の雄性ｄｄＹマウス（日本エスエルシー社）を２２±１℃、明暗サイクル１２時間（明期７：００−１９：００）の動物飼育室で７日間予備飼育した。予備飼育期間中、マウスには固形飼料ＭＦ（日本エスエルシー社製）と水とを自由に摂取させた。

その後、マウスを１８０分絶食させた後、表２に示すＡＰＰ消化物を表２に示す量だけ摂取させた。そして、さらに１８０分絶食させた後、インスリンを０．７５Ｕ／ｋｇＢ．Ｗ．となるように腹腔内投与した。投与直前と投与後１５分、３０分、６０分後に尾静脈より採血し、ニプロフリースタイルキッセイメーター（ニプロ社製）を用いて血糖値を測定した。トリプシン消化物についての結果を図１に示し、キモトリプシン消化物及びパンクレアチン消化物についての結果を図２に示す。

図１より、トリプシン消化物は、１００ｍｇ／ｋｇ程度の投与量で血糖値を６０％程度にまで下げることができるといえる。一方、図２より、他の消化物では、３００ｍｇ／ｋｇの量だけ投与しても、血糖値を７５％程度にまでしか低下できない。

したがって、トリプシン消化物は、他の消化物に比べインスリン感受性増強作用を有するといえる。

＜試験２＞ペプチド又はその酸付加塩のスクリーニング

［ＨＰＬＣによるＡＰＰトリプシン消化物の分画］
上記ＡＰＰトリプシン消化物を５０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、４℃、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を得た。上清１ｍｌをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ _５Ｃ_１８−ＡＲ−II，２０×２５０ｍｍ，ナカライテスク社製）を用いてＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ６００，日本ウォーターズ社製）で分画した。移動相は０．１％ＴＦＡを含むＨ_２Ｏと０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むＣＨ_３ＣＮとし、後者の割合を０−５０％（０−５０ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒｇｒａｄｉｅｎｔ）、流速を１０ｍＬ／ｍｉｎとした。これを４つのフラクション（フラクションＡ−Ｄ）に分画した。ＡＰＰトリプシン消化物を４つのフラクションに分画したときのＨＰＬＣチャートを図３に示す。

［インスリン負荷試験（１回目）］
続いて、各フラクションを凍結乾燥し、得られたサンプルを用いてインスリン負荷試験を行った。マウスを１８０分絶食させた後、サンプルを元の消化物相当で１００ｍｇ／ｋｇとなるように投与したこと以外は、試験１と同様の手法にて血糖値を測定した。結果を図４に示す。

図４より、４つのフラクションの中でも、フラクションＣがインスリン感受性増強作用を持つことが確認された。

［ＡＰＰトリプシン消化物の再分画］
インスリン負荷試験により活性の見られたフラクションＣをさらに分画した。トリプシン消化物を用いて上記と同様の条件でＨＰＬＣを行った。フラクションＣに相当する流出時間をさらに１０分割して１０個のフラクション（フラクションＣ１−Ｃ１０）に再分画した。ＡＰＰトリプシン消化物のフラクションＣをさらに１０個のフラクションに分画したときのＨＰＬＣチャートを図５に示す。

［インスリン負荷試験（２回目）］
続いて、各フラクションを凍結乾燥し、得られたサンプルを用いてインスリン負荷試験を行った。試験は、１回目と同様の手法にて行った。結果を図６に示す。

図６より、１０個のフラクションの中でも、フラクションＣ３がインスリン感受性増強作用を持つことが確認された。また、フラクションＣ８がインスリン感受性を増強する傾向が見られた。

［ＡＰＰトリプシン消化物の再々分画］
インスリン負荷試験により活性の見られたフラクションＣ３及びＣ８について、ピークを１本ずつ分取し、これら分取したフラクションの各々について、トリプシン消化物を用いて上記と同様の条件でＨＰＬＣを行った。図７に示すとおり、フラクションＣ３については、３個のフラクション（フラクションＣ３−１〜Ｃ３−３）が得られ、フラクションＣ８については、４個のフラクション（フラクションＣ８−１〜Ｃ８−４）が得られた。

［インスリン負荷試験（３回目）］
続いて、各フラクションを凍結乾燥し、得られたサンプルを用いてインスリン負荷試験を行った。試験は、１回目と同様の手法にて行った。結果を図８に示す。

図８より、特にフラクションＣ３−２及びＣ８−３がインスリン感受性増強作用を持つことが確認された。

＜試験３＞フラクションＣ３−２及びＣ８−３のアミノ酸配列
ＣＮカラムを用い、上記フラクションＣ３−２及びＣ８−３をＨＰＬＣにより分離した。カラムは５ＣＮ−Ｒ（４．６×２５０ｍｍ，ナカライテスク社製）を用い、移動相は０．１％ＴＦＡを含むＨ_２Ｏおよび０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含むＣＨ_３ＣＮを用いた。後者の割合を０−５０％（０−５０ｍｉｎ，ｌｉｎｅａｒｇｒａｄｉｅｎｔ）、流速１ｍＬ／ｍｉｎとした。吸光波長２１５ｎｍの各ピークを分取し、これらを質量分析（ＭＳ；Ｍａｒｉｎｅｒ；ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびプロテインシーケンサー（Ｐｒｏｃｉｓｅ４９２ＨＴ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。ＭＳで得られた質量とプロテインシーケンサーで得られた配列の情報をもとに、ピークに含まれているペプチドのアミノ酸配列を決定した。フラクションＣ３−２のＨＰＬＣチャートを図９の（ａ）に示し、フラクションＣ８−３のＨＰＬＣチャートを図９の（ｂ）に示す。

その結果、フラクションＣ３−２に関しては、ピークに含まれているペプチドのアミノ酸配列がＡＮＧＥＶＡＱＷＲ（配列番号７）からなる９残基ペプチドであり、フラクションＣ８−３に関しては、ピークに含まれているペプチドのアミノ酸配列がＩＷＨＨＴＦＹＮＥＬＲ（配列番号１３）からなる１１残基ペプチドであることが確認された。

＜試験４＞合成ペプチドのインスリン感受性増強作用
〔試験４−１〕９種類の合成ペプチドＡＮＧＥＶＡＱＷＲ、ＡＮＧ、ＥＶＡ、ＱＷＲ、ＷＲ、ＩＷＨＨＴＦＹＮＥＬＲ、ＩＷＨ、ＨＴＦ及びＹＮＥＬＲのインスリン感受性増強作用
［ペプチド合成］
以下の手法にて、９種類の合成ペプチドＡＮＧＥＶＡＱＷＲ（配列番号８）、ＡＮＧ（配列番号１５）、ＥＶＡ（配列番号１６）、ＱＷＲ（配列番号６）、ＷＲ（配列番号１７）、ＩＷＨＨＴＦＹＮＥＬＲ（配列番号１４）、ＩＷＨ（配列番号１８）、ＨＴＦ（配列番号１９）及びＹＮＥＬＲ（配列番号１２）を得た。
ペプチド合成機（ＰＳ３；Ａｌｏｋａ，ｐｅｔｉＳｙｚｅｒＭｏｄｅｌＰＳＳ−５１０；ハイペップ研究所製）を用いて、固相合成法により合成を行った。Ｒｅｓｉｎアミノ酸にＦｍｏｃアミノ酸（渡辺化学）をＮ−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ存在下で順次結合させ、ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｔｅｉｃａｃｉｄ（ＴＦＡ）で脱保護した。その後ｄｉｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒで沈殿させ粗ペプチドとした。これをＯＤＳカラム（２０×２５０ｍｍ）を用いてＨＰＬＣで分離し、そのメインピーク（吸光波長：２３０ｎｍ）を採取し、凍結乾燥した。なお、合成ペプチドの質量は質量分析器で確認し、アミノ酸配列はプロテインシーケンサーで確認した。

［インスリン負荷試験］
続いて、各合成ペプチドを凍結乾燥し、得られたサンプルを用いてインスリン負荷試験を行った。合成ペプチドのマウスへの投与量は、合成ペプチドＡＮＧＥＶＡＱＷＲ、ＷＲ及びＩＷＨＨＴＦＹＮＥＬＲについては１ｍｇ／ｋｇＢ．Ｗ．，３ｍｇ／ｋｇＢ．Ｗ．及び１０ｍｇ／ｋｇＢ．Ｗ．の３種類とし、他の合成ペプチドについては１ｍｇ／ｋｇＢ．Ｗ．とした。試験は、試験例３と同様の手法にて行った。ＡＮＧＥＶＡＱＷＲについての結果を図１０の（ａ）に示し、ＡＮＧ、ＥＶＡ及びＱＷＲについての結果を図１０の（ｂ）に示し、ＷＲについての結果を図１１に示す。また、ＩＷＨ、ＨＴＦ及びＹＮＥＬＲについての結果を図１２に示す。

図１０の（ａ）より、合成ペプチドＡＮＧＥＶＡＱＷＲはインスリン感受性増強作用を有することが確認された。中でも、ＱＷＲがインスリン感受性増強作用を示したことから（図１０の（ｂ））、ＡＮＧＥＶＡＱＷＲのＣ末端側が活性に重要であることが示唆された。一方、ＡＮＧ、ＥＶＡ、ＷＲは有意なインスリン感受性増強作用を示さなかった（図１０の（ｂ）、図１１）。これにより、インスリン感受性増強作用には、ペプチドがＱＷを含み９アミノ酸以下である必要があることが示唆された。

図１２より、合成ペプチドＹＮＥＬＲはインスリン感受性増強作用を有することが確認された。一方、ＩＷＨＨＴＦＹＮＥＬＲ（data not shown）、ＩＷＨ及びＨＴＦは有意なインスリン感受性増強作用を示さなかった（図１２）。

〔試験４−２〕３種類の合成ペプチドＹＮＥＬＲ、ＹＮＥ、ＥＬＲのインスリン感受性増強作用
［ペプチド合成］
試験４−１と同様の手法にて、３種類の合成ペプチドＹＮＥＬＲ（配列番号１２）、ＹＮＥ（配列番号２０）、ＥＬＲ（配列番号４）を得た。

［インスリン負荷試験］
続いて、合成ペプチドを凍結乾燥し、得られたサンプルを用いてインスリン負荷試験を行った。合成ペプチドのマウスへの投与量は、それぞれ１ｍｇ／ｋｇＢ．Ｗ．とした。試験は、試験例３と同様の手法にて行った。結果を図１３に示す。

図１３より、合成ペプチドＹＮＥＬＲ及びＥＬＲはインスリン感受性増強作用を有することが確認された。中でも、ＥＬＲがインスリン感受性増強作用を示したことから、ＹＮＥＬＲのＣ末端側が活性に重要であることが示唆された。一方、ＹＮＥは有意なインスリン感受性増強作用を示さなかった（図１３）。これにより、インスリン感受性増強作用には、ＥＬＲの構造が重要であることが分かる。

〔試験４−３〕合成ペプチドＡＮＳＥＶＡＱＷＲのインスリン感受性増強作用
［ペプチド合成］
試験４−１と同様の手法にて、合成ペプチドＡＮＳＥＶＡＱＷＲ（配列番号１０）を得た。

［インスリン負荷試験］
続いて、合成ペプチドを凍結乾燥し、得られたサンプルを用いてインスリン負荷試験を行った。合成ペプチドのマウスへの投与量は、１ｍｇ／ｋｇＢ．Ｗ．，３ｍｇ／ｋｇＢ．Ｗ．及び１０ｍｇ／ｋｇＢ．Ｗ．の３種類とした。試験は、試験例３と同様の手法にて行った。結果を図１４に示す。

図１４より、合成ペプチドＡＮＳＥＶＡＱＷＲはインスリン感受性増強作用を有することが確認された。その際、投与量との相関性は見られなかった。

＜試験５＞細胞内糖取込み活性測定
［合成ペプチド］
試験例４−１で合成した９種類の合成ペプチドＡＮＧＥＶＡＱＷＲ、ＡＮＧ、ＥＶＡ、ＱＷＲ、ＷＲ、ＩＷＨＨＴＦＹＮＥＬＲ、ＩＷＨ、ＨＴＦ及びＹＮＥＬＲを用いた。

［細胞内糖取込み活性測定］
実験にはマウス由来骨格筋細胞Ｃ２Ｃ１２を使用した。１０％ウシ胎児血清（ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含んだＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ社製）で構成される増殖培地で培養した（３７℃、５％ＣＯ_２）。Ｃ２Ｃ１２を１２穴プレートに播種し、１００％コンフルエンスになるまでインキュベートした。培地を２％ウマ血清（Ｇｉｂｃｏ社製）、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸで構成される分化培地に交換し、５日間インキュベートし、筋管細胞へ分化させた。分化後、培地を無血清培地に交換し、６時間インキュベートした。培地を２％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）を含んだＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ＨＥＰＥＳ緩衝液に交換し、各種の合成ペプチドまたはインスリンを添加した。その２０分後に１ｍＭの２−Ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ（２−ＤＧ，Ｓｉｇｍａ）を添加した。さらに２０分後に糖取り込み阻害剤であるＰｈｌｏｒｅｔｉｎ（Ｓｉｇｍａ）を含んだＰＢＳで洗浄し、反応を停止させた。細胞を回収し、得られた抽出液中の２−ＤＧ量を２−ＤＧ代謝速度測定キット（コスモバイオ社製）を用いて定量した。結果を図１５及び図１６に示す。

Ｉｎｖｉｖｏでインスリン感受性増強作用を示したＡＮＧＥＶＡＱＷＲ、ＱＷＲ、ＹＮＥＬＲは、骨格筋細胞において糖取り込み促進作用を示した。このことは、ＡＮＧＥＶＡＱＷＲ、ＱＷＲ、ＹＮＥＬＲを用いると、インスリンの併用の有無にかかわらず血糖値が下がることを示唆している。一方、インスリン増強作用を示さなかったペプチドは、骨格筋細胞への糖取り込み能に有意な変化が見られなかった。従って、糖尿病予防、糖尿病治療、糖代謝改善のためにも、ペプチドが、ＱＷを含み９アミノ酸以下であること、又はＥＬＲを含み１０アミノ酸以下であることが必要であると示唆された。

＜試験６＞病態モデルマウスでの検討
試験１〜試験５は、いずれも、正常モデルマウスを用いたときの結果を示す。試験６では、病態モデルマウスを用いたときの結果を示す。病態モデルマウスを用いたときであっても、正常モデルマウスを用いたときと同様の効果を奏する。

［合成ペプチド］
試験例４−１で合成した９種類の合成ペプチドのうち、ＱＷＲを用いた。

［グルコース負荷試験］
５週齢の雄性ＮＳＹマウス（株式会社星野試験動物飼育所）を２３±１℃、明暗サイクル１２時間（明期７：００−１９：００）の動物飼育室で７日間予備飼育した。予備飼育期間中、マウスには固形飼料ＭＦ（日本エスエルシー社製）と水とを自由に摂取させた。

そして、マウスを１８時間絶食させた後、グルコースを２ｇ／ｋｇＢ．Ｗとなるように経口投与を行った。合成ペプチドＱＷＲのマウスへの投与量は、１ｍｇ／ｋｇＢ．Ｗとした。そして、さらに１８０分絶食させた後、インスリンを０．７５Ｕ／ｋｇＢ．Ｗ．となるように腹腔内投与した。投与直前と投与後１５分、３０分、６０分、１２０分後に尾静脈より採血し、ニプロフリースタイルキッセイメーター（ニプロ社製）を用いて血糖値を測定した。結果を図１７に示す。

図１７から、病態モデルマウスに対してグルコースを経口投与した場合であっても、血糖値の減少が見られることが確認された。

［インスリン負荷試験］合成ペプチドＱＷＲの腹腔内投与
５週齢の雄性ＮＳＹマウス（株式会社星野試験動物飼育所）を２３±１℃、明暗サイクル１２時間（明期７：００−１９：００）の動物飼育室で７日間予備飼育した。予備飼育期間中、マウスには固形飼料ＭＦ（日本エスエルシー社製）と水とを自由に摂取させた。

その後、マウスを１８０分絶食させた後、合成ペプチドＱＷＲを１ｍｇ／ｋｇＢ．Ｗだけ摂取させた。そして、さらに１８０分絶食させた後、インスリンを０．７５Ｕ／ｋｇＢ．Ｗ．となるように腹腔内投与した。投与直前と投与後１５分、３０分、６０分後に尾静脈より採血し、ニプロフリースタイルキッセイメーター（ニプロ社製）を用いて血糖値を測定した。結果を図１８に示す。

図１８から、病態モデルマウスに対して合成ペプチドＱＷＲを腹腔内投与した場合であっても、血糖値の減少が見られることが確認された。

＜試験７＞経口投与での検討
［インスリン負荷試験］合成ペプチドＱＷＲの経口投与
５週齢の雄性ｄｄＹマウス（株式会社星野試験動物飼育所）を２２±１℃、明暗サイクル１２時間（明期７：００−１９：００）の動物飼育室で７日間予備飼育した。予備飼育期間中、マウスには固形飼料ＭＦ（日本エスエルシー社製）と水とを自由に摂取させた。

そして、マウスを１８０分絶食させた後、ＱＷＲの強制経口投与を行った。ＱＷＲのマウスへの投与量は、１０ｍｇ／ｋｇＢ．Ｗ．，３０ｍｇ／ｋｇＢ．Ｗ．及び１００ｍｇ／ｋｇＢ．Ｗ．の３種類とした。そして、さらに１８０分絶食させた後、インスリンを０．５Ｕ／ｋｇＢ．Ｗ．となるように腹腔内投与した。投与直前と投与後１５分、３０分、６０分後に尾静脈より採血し、ニプロフリースタイルキッセイメーター（ニプロ社製）を用いて血糖値を測定した。結果を図１９に示す。

図１９から、正常モデルマウスに対して合成ペプチドＱＷＲを経口投与した場合であっても、血糖値の減少が見られることが確認された。

Claims

タラ目に属する魚の魚肉タンパク質がトリプシンによって分解された分解物であって、ＱＷＲ（配列番号５，６）をＣ末端に含む９アミノ酸以下のペプチド、ＥＬＲ（配列番号３，４）をＣ末端に含む１０アミノ酸以下のペプチド又はそれらの酸付加塩を有効成分として含む、糖尿病予防又は糖尿病治療に用いるための組成物。
タラ目に属する魚の魚肉タンパク質がトリプシンによって分解された分解物であって、ＱＷＲ（配列番号５，６）をＣ末端に含む９アミノ酸以下のペプチド、ＥＬＲ（配列番号３，４）をＣ末端に含む１０アミノ酸以下のペプチド又はそれらの酸付加塩を有効成分として含む、インスリン感受性増強又は糖代謝改善に用いるための組成物。
前記有効成分として、前記ＱＷＲをＣ末端に含む９アミノ酸以下のペプチド又はその酸付加塩を含む場合、前記ＱＷＲを含む９アミノ酸以下のペプチドは、ＡＮＧＥＶＡＱＷＲ（配列番号７，８）又はＡＮＳＥＶＡＱＷＲ（配列番号９，１０）の配列をＣ末端に含み、
前記有効成分として、前記ＥＬＲをＣ末端に含む１０アミノ酸以下のペプチド又はその酸付加塩を含む場合、前記ＥＬＲを含む１０アミノ酸以下のペプチドは、ＥＬＲ（配列番号３，４）、ＹＮＥＬＲ（配列番号１１，１２）又はＩＷＨＨＴＦＹＮＥＬＲ（配列番号１３）の配列をＣ末端に含む、請求項１又は２に記載の組成物。
ＡＮＧＥＶＡＱＷＲ（配列番号７，８）、ＡＮＳＥＶＡＱＷＲ（配列番号９，１０）、ＱＷＲ（配列番号５，６）、ＥＬＲ（配列番号３，４）、ＹＮＥＬＲ（配列番号１１，１２）又はＩＷＨＨＴＦＹＮＥＬＲ（配列番号１３）の配列からなる単離されたペプチド又はその酸付加塩の少なくとも１種以上を有効成分とする糖尿病予防剤又は糖尿病治療剤。
インスリン感受性増強剤又は糖代謝改善剤である、請求項４に記載の糖尿病予防剤又は糖尿病治療剤。
ＡＮＧＥＶＡＱＷＲ（配列番号７，８）、ＡＮＳＥＶＡＱＷＲ（配列番号９，１０）、ＥＬＲ（配列番号３，４）、又はＹＮＥＬＲ（配列番号１１，１２）から選択される、単離されたペプチド又はその酸付加塩。
タラ目に属する魚の魚肉タンパク質をトリプシンにより分解し、ＱＷＲ（配列番号５，６）をＣ末端に含む９アミノ酸以下のペプチド又はＥＬＲ（配列番号３，４）をＣ末端に含む１０アミノ酸以下のペプチドを含む分解物を取得する、糖尿病予防又は糖尿病治療に用いられる組成物の製造方法。
前記ＱＷＲ又は前記ＥＬＲの配列をＣ末端に含むペプチドは、ＡＮＧＥＶＡＱＷＲ（配列番号７，８）、ＡＮＳＥＶＡＱＷＲ（配列番号９，１０）、ＥＬＲ（配列番号３，４）、ＹＮＥＬＲ（配列番号１１，１２）又はＩＷＨＨＴＦＹＮＥＬＲ（配列番号１３）の配列をＣ末端に含むペプチドを含む、請求項７に記載の組成物の製造方法。