CN109503699B

CN109503699B - 一种带鱼鱼肉降血压肽

Info

Publication number: CN109503699B
Application number: CN201811513476.XA
Authority: CN
Inventors: 傅维擎; 张怡; 郑宝东; 胡嘉淼; 曾红亮
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2019-01-08
Filing date: 2019-01-08
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2039-01-08
Also published as: CN109503699A

Abstract

本发明提供一种带鱼鱼肉降血压肽，氨基酸序列为Ala–Asn–Ser–Glu–Val–Ala–Gln–Trp–Arg，采用胰蛋白酶酶解和超滤的方式得到降血压肽粗品，再通过反向高效液相色谱柱层析纯化筛选得到一条降血压肽纯品。降血压肽段在体外显示出很强的血管紧张素转换酶抑制活性，在长期服用时能显著降低自发性高血压大鼠的血压。这种降血压肽段能够通过降低血液中Ⅱ型血管紧张素含量、抑制氧化应激反应及抗炎的多条降血压通路起到降血压目的。同时，该降血压肽在长期服用时对正常大鼠无毒性作用，不影响大鼠正常生长，对自发性高血压大鼠（SHR）体重无明显影响，对SHR心率无明显影响，是极具开发应用潜力的降血压活性物。

Description

一种带鱼鱼肉降血压肽

技术领域

本发明属于生物活性肽技术领域，具体涉及一种带鱼鱼肉降血压肽。

背景技术

带鱼（Trichiurus lepturus），又叫刀鱼、裙带、肥带、油带、牙带鱼等，鲈形目，带鱼科，带鱼属。其体型侧扁如带，全身呈银色，在中国主要分布于黄海、东海、渤海以及南海，是中国四大经济鱼类之一。带鱼的鱼肉富含较高的蛋白质，有利活性肽的提取制备。

近年来，许多研究者从不同的原料中分离纯化出多种活性肽。由于活性肽具有较高的特异性和效价，以及较低的毒性，在长期服用的治疗中极具潜力。降血压肽是活性肽中的一种，它能够降低高血压患者的血压，且对正常血压的人无影响。降血压肽通过抑制ACE酶的活性，减少Ⅱ型血管紧张素（Ang Ⅱ）的生成，进而降低血压。有研究表明，除了肾素-血管紧张素系统，氧化应激以及炎症反应也能够引发高血压疾病。能够同时抑制ACE酶活性，减少氧化应激以及抗炎的降血压肽，降血压活性往往比单一通路降压的降血压肽要强。从带鱼鱼肉中分离纯化得到的降血压肽，能够通过多种降压途径有效降低血压，是效果显著的降血压物质。带鱼鱼肉降血压肽的出现，能给长期依赖降血压药的患者带去福音。

发明内容

本发明的目的在于提供一种带鱼鱼肉降血压肽，氨基酸序列为Ala–Asn–Ser–Glu–Val–Ala–Gln–Trp–Arg（ANSEVAQWR），该肽段在体外实验均显示出较好的ACE抑制活性，动物实验显示其能够通过降低血液中的Ang Ⅱ、抑制氧化应激以及抗炎进而降低大鼠的血压。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种带鱼鱼肉降血压肽，包括：选料、降血压肽酶解液的制备、降血压肽粗品的制备、降血压肽段组分的筛选、降血压肽的初次柱层析纯化以及降血压肽的柱层析二次纯化。具体步骤如下：

（1）选料：选择沿海附近的带鱼鱼肉，烘干粉碎为带鱼鱼肉粉末。

（2）降血压肽酶解液的制备：将带鱼鱼肉粉末与蒸馏水按1:10~1:20的质量比与蒸馏水混匀，按照酶与底物带鱼鱼肉粉末质量比1:25~1:100加入胰蛋白酶，酶解pH为7~8，酶解时间为4~6h。酶解液即为降血压肽酶解液。

（3）降血压肽粗品的制备：将步骤（2）中的降血压肽酶解液分别经过10kDa以及3kDa的超滤膜包进行超滤，超滤的流速为40~60r/min，超滤温度为4~8℃；超滤后将滤液浓缩冻干即为降血压肽粗品。

（4）降血压肽段组分的筛选：将步骤（3）所得粗品与蒸馏水按照质量比为1:50~1:100与蒸馏水混匀，随后进行反向高效液相色谱柱层析纯化；色谱柱的参数为：直径30mm，柱长250mm，粒径10 μm，上样体积为40~60mL；洗脱条件为：流动相：0~60min，0~60%乙腈，40~100%水；流速15~25mL/min，柱温20~30℃，检测波长220nm，收集主要峰检测ACE抑制活性，将活性最高的组分收集。

（5）降血压肽的初次柱层析纯化：将步骤（4）所收集的降血压肽组分滤出液进行反向高效液相色谱柱层析纯化；色谱柱的参数为：直径77mm，柱长450mm，粒径10 μm，上样体积为40~60mL；洗脱条件为：流动相：0~60min，0~60%乙腈，40~100%水；流速90~110mL/min，柱温20~30℃，检测波长220nm，收集主要峰检测ACE抑制活性，最高活性组分收集后准备下一轮纯化。

（6）降血压肽的柱层析二次纯化：将步骤（5）所收集的降血压肽组分滤出液进行二次反向高效液相色谱柱层析纯化；色谱柱的参数为：直径4.6mm，柱长250mm，粒径5μm，上样体积为40~60μL；洗脱条件为：流动相：0~20min，10~40%乙腈，60~90%水；流速0.8~1.2mL/min，柱温20~30℃，检测波长220nm，收集主要峰检测ACE抑制活性，最高活性组分收集冻干后即为降血压肽纯品。

本发明的优点在于：

本发明提供的一种降血压肽，除了体外具有很强的ACE抑制活性外，还具有很强的体内降血压活性。该降血压肽段组分能通过降低血管内皮细胞的Ang II含量、提升血管内皮细胞的抗氧化与抗炎能力的多通路达到降血压目的，降压活性强。

附图说明

图1为降血压肽段组分的筛选的色谱图。

图2为降血压肽段初次柱层析纯化的色谱图。

图3为降血压肽段二次柱层析纯化的色谱图。

图4为降血压肽段纯品的一级和二级质谱图。

图5为降血压肽段对自发性高血压大鼠的降压效应。

图6为降血压肽段对自发性高血压大鼠血管内皮细胞Ⅱ型血管紧张素（Ang Ⅱ）浓度的影响。

图7为降血压肽段对自发性高血压大鼠血管内皮细胞超氧化物歧化酶（SOD）浓度的影响。

图8为降血压肽段对自发性高血压大鼠血管内皮细胞细胞粘附分子ICAM-1表达的影响。其中图A表示生理盐水处理组与A肽处理组的ICAM-1相较于β肌动蛋白的表达量，图B表示对应的免疫印迹电泳条带。

具体实施方式

以下是本发明的几个具体实施例，进一步说明本发明，但是本发明不仅限于此实施。

胰蛋白酶（索莱宝生物科技有限公司），ACE活性抑制检测试剂盒（日本同仁化学研究所），超滤膜包（赛多利斯公司），C18色谱柱（10um 30*250mm、10um 77*450mm以及5um4.6*250mm，北京创新通恒科技有限公司），高效液相色谱系统（安捷伦科技有限公司），离子井色谱质谱连用仪（赛默飞世尔科技公司），电泳仪（北京六一仪器厂），酶标仪（赛默飞世尔科技公司），12~13周的自发性高血压大鼠（北京维通利华实验动物有限公司），II型血管紧张素ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司），超氧化物歧化酶（SOD）测试试剂盒（南京建成生物工程研究所），兔多抗VCAM-1（武汉三鹰生物技术有限公司）。

实施例1

一种降血压肽最优选制备方案，最终所得一种降血压肽段的序列为Ala–Asn–Ser–Glu–Val–Ala–Gln–Trp–Arg，包括以下步骤：

（1）选料：选择沿海附近的带鱼鱼肉作为降血压肽的提取原料。

（2）降血压肽酶解液的制备：将带鱼鱼肉粉末按1:15的质量比与蒸馏水混匀，按照酶与底物质量比1:50加入胰蛋白酶，酶解pH为8，酶解时间为5h。酶解液即为降血压肽酶解液。

（3）降血压肽粗品的制备：将步骤（2）中的降血压肽酶解液分别经过10kDa以及3kDa的超滤膜包进行超滤，超滤的流速为50r/min，超滤温度为6℃；超滤后将滤液浓缩冻干即为降血压肽粗品。

（4）降血压肽组分的筛选：将步骤（3）所得粗品按照质量比为1:100与蒸馏水混匀，随后反向高效液相色谱柱层析纯化；色谱柱的参数为：直径30mm，柱长250mm，粒径10μm，上样体积为50mL；洗脱条件为：流动相：0~60min，0~60%乙腈，40~100%水；流速20mL/min，柱温25℃，检测波长220nm，收集洗脱ACE抑制活性最强的组分，准备下一次纯化。

如图1所示，带鱼鱼肉降血压粗肽初次过柱后有12个峰，其中4、7、8、9和11号峰是活性最高的主要的峰，而7号显示出的ACE抑制活性最强，其IC₅₀（半抑制浓度）值为0.142。收集7号峰组分进行下一次柱层析纯化。

（5）降血压肽的初次柱层析纯化：将步骤（4）所收集的1种降血压肽段滤出液进行反向高效液相色谱二次柱层析纯化；色谱柱的参数为：直径77mm，柱长450mm，粒径10 μm，上样体积为50mL；洗脱条件为：流动相：0~60min，0~60%乙腈，40~100%水；流速100mL/min，柱温25℃，检测波长220nm，收集主要峰检测ACE抑制活性，最高活性组分收集后分别准备下一轮纯化。

如图2所示，从初次柱层析收集到的7号峰。其中P7-2组分的ACE抑制活性最强，将它收集进行下一次柱层析纯化。

（6）降血压肽的反向高效液相色谱柱层析二次纯化：将步骤（5）所收集的降血压肽滤出液进行二次柱层析纯化；色谱柱的参数为：直径4.6mm，柱长250mm，粒径5μm，上样体积为50μL；洗脱条件为：流动相：0~20min，10~40%乙腈，60~90%水；流速1mL/min，柱温25℃，检测波长220nm，收集主要峰检测ACE抑制活性，最高活性组分收集冻干后即为降血压肽纯品。

如图3所示，P7-2再经反向高效液相色谱柱层柱层析纯化后，得到两个组分。其中P7-2-a组分以的ACE抑制活性最高，将该组分收集后浓缩冻干，得到带鱼鱼肉降血压肽纯品。

如图4所示，经过一级质谱和二级质谱的鉴定后，分析得到降血压肽纯品的序列为Ala–Asn–Ser–Glu–Val–Ala–Gln–Trp–Arg，为未被发现的新型降血压肽段。

实施例2 降血压肽动物降血压实验

2.1 大鼠分组

自发性高血压大鼠（SHRs）的饲养温度为21±2℃，相对湿度为60±5%，每天光照12h，光照与黑暗相互交替。大鼠适应性培养一周后开始实验，自由进食和饮水，给药采用灌胃方式，每日给药一次。大鼠随机分成三组，分别为生理盐水组（空白对照组）、卡托普利组（15mg/kg，阳性对照组）以及降血压肽(实施例1获得的降血压肽)组（30mg/kg BW）。

2.2 血压的测定

用无创血压计测量大鼠灌胃前以及灌胃后2、4、6、8、14h的收缩压变化情况。

2.3 大鼠血管内皮原代细胞的培养

从SHRs大鼠肺部毛细血管内皮中分离细胞进行培养。传3代后，取对数生长细胞，加入0.25%胰蛋白酶浸润所有细胞表面后，吸出，于5% CO₂培养箱中37℃消化3~5min。加入3mL含血清培养基终止消化后，接种于96孔板，每孔100μL（3×10³~4×10³个cell/孔）。

2.4 大鼠血管内皮细胞II型血管紧张素（Ang II）的测定

加样50μg/mL带鱼鱼肉降血压肽处理大鼠血管内皮细胞24h，随后用Ang II ELISA试剂盒检测细胞内Ang II含量。操作过程严格遵守说明书。

2.5 大鼠血管内皮细胞超氧化物歧化酶（SOD）含量的测定

采用SOD生化试剂盒检测SHRs血管内皮细胞的SOD含量。操作过程严格遵守说明书。

2.6 大鼠血管内皮细胞ICAM-1的表达

采用Western Blot的方法检测血管内皮细胞的细胞粘附分子ICAM-1表达情况，用β肌动蛋白作为内参。

2.7 实验结果

如图5所示，相比灌胃前，带鱼鱼肉降血压肽在灌胃后的6小时内能够显著降低自发性高血压大鼠的收缩压，与空白对照组相比血压降低明显，这说明该降血压肽具有优秀的降血压功效。

如图6所示，其中A肽即为Ala–Asn–Ser–Glu–Val–Ala–Gln–Trp–Arg，该带鱼鱼肉降血压肽显著降低了自发性高血压大鼠血管内皮细胞的Ⅱ型血管紧张素（Ang Ⅱ）含量，这说明大鼠体内的血管紧张素转换酶活性被抑制，或者浓度被降低，这有利血压的降低。

如图7所示，带鱼鱼肉降血压肽显著提高了超氧化物歧化酶在自发性高血压大鼠血管内皮细胞的浓度，这说明带鱼鱼肉降血压肽能够提高抗氧化活性，降低氧化应激反应的发生。

如图8所示，带鱼鱼肉降血压肽都显著下调了细胞粘附分子ICAM-1的表达。ICAM-1与炎症反应相关，这表明带鱼鱼肉降血压肽能够抑制炎症反应发生，具有抗炎活性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种带鱼鱼肉降血压肽

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Asn Ser Glu Val Ala Gln Trp Arg

1 5

Claims

1.一种带鱼鱼肉降血压肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：在带鱼鱼肉粉末加入蒸馏水，充分搅匀后加入胰蛋白酶酶解，酶解结束后抽滤、离心，收集上清液，得到降血压肽酶解液；将降血压肽酶解液经过10k、3kDa超滤膜超滤后收集滤液浓缩冻干，得到降血压肽粗品；将降血压肽粗品粉末与蒸馏水混合，经过一次反向高效液相色谱柱后收集出血管紧张素转换酶抑制活性最高的一个组分，随后该组分再经过2次反向高效液相色谱柱层析纯化后得到降血压肽纯品；每次柱层析后使用血管紧张素转换酶抑制活性试剂盒检测主要组分活性，收集最强活性的组分，冻干后进行下一次柱层析纯化；所述带鱼鱼肉降血压肽氨基酸序列为Ala–Asn–Ser–Glu–Val–Ala–Gln–Trp–Arg。

2.根据权利要求1所述的一种带鱼鱼肉降血压肽的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

（1）选料：选择沿海附近的带鱼鱼肉，烘干粉碎为带鱼鱼肉粉末；

（2）降血压肽酶解液的制备：将带鱼鱼肉粉末按1:10~1:20的质量比与蒸馏水混匀，按照酶与底物带鱼鱼肉粉末质量比1:25~1:100加入胰蛋白酶，酶解pH为7~8，酶解时间为4~6h；酶解液即为降血压肽酶解液；

（3）降血压肽粗品的制备：将步骤（2）中的降血压肽酶解液分别经过10kDa以及3kDa的超滤膜包进行超滤，超滤的流速为40~60r/min，超滤温度为4~8℃；超滤后将滤液浓缩冻干即为降血压肽粗品；

（4）降血压肽段组分的筛选：将步骤（3）所得粗品按照质量比为1:50~1:100与蒸馏水混匀，随后反向高效液相色谱柱层析纯化；色谱柱的参数为：直径30mm，柱长250mm，粒径10μm，上样体积为40~60mL；洗脱条件为：流动相：0~60min，0~60%乙腈，40~100%水；流速15~25mL/min，柱温20~30℃，检测波长220nm，收集主要峰检测ACE抑制活性，将活性最高的组分收集；

（5）降血压肽的初次柱层析纯化：将步骤（4）所收集的降血压肽组分滤出液进行反向高效液相色谱柱层析纯化；色谱柱的参数为：直径77mm，柱长450mm，粒径10 μm，上样体积为40~60mL；洗脱条件为：流动相：0~60min，0~60%乙腈，40~100%水；流速90~110mL/min，柱温20~30℃，检测波长220nm，收集主要峰检测ACE抑制活性，最高活性组分收集后准备下一轮纯化；

（6）降血压肽的柱层析二次纯化：将步骤（5）所收集的降血压肽滤出液进行二次反向高效液相色谱柱层析纯化；色谱柱的参数为：直径4.6mm，柱长250mm，粒径5μm，上样体积为40~60μL；洗脱条件为：流动相：0~20min，10~40%乙腈，60~90%水；流速0.8~1.2mL/min，柱温20~30℃，检测波长220nm，收集主要峰检测ACE抑制活性，最高活性组分收集冻干后即为降血压肽纯品。