CN114230635B - 一种高活性富硒牡蛎抗氧化肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高活性富硒牡蛎抗氧化肽及其应用。所述高活性富硒牡蛎抗氧化肽具有如SEQIDNO：1所示序列的肽，且所述肽中的甲硫氨酸M中的硫元素被硒取代。本发明提供的高活性富硒牡蛎抗氧化肽呈现出良好的细胞抗氧化活性，可通过降低ROS水平、保护细胞膜完整性和增强内源性抗氧化酶（SOD、CAT）活性，发挥其对HepG2细胞的氧化损伤保护作用；另外LLVSeMY可作为Keap1‑Nrf2相互作用抑制剂，激活Nrf2功能，促使ARE所调控的具有抗氧化和细胞保护作用的蛋白质（CAT和SOD）基因的表达，最终导致CAT、SOD活力上升，从而增强机体清除自由基的能力。

Description

一种高活性富硒牡蛎抗氧化肽及其应用
技术领域
本发明属于抗氧化技术领域，具体涉及一种高活性富硒牡蛎抗氧化肽及其应用。
背景技术
在机体正常生理条件下，ROS（活性氧）可被抗氧化防御系统有效地清除，然而，当病理条件下，ROS的产生和消除会出现不平衡，进而导致细胞损伤或死亡。世界卫生组织2019年报道慢性非传染性疾病，如糖尿病、心血管疾病和肥胖，是全球健康的十大威胁之一，导致全球70%的死亡，而氧化损伤是各种慢性非传染性疾病的主要危害因素。
近年来，生物活性肽因其广泛的生理功能，如抗氧化、降血压、免疫调节、抗癌和抗菌等特性而受到广泛关注。其中，抗氧化肽可以预防和治疗非传染性慢性退行性疾病，如心脑血管疾病、癌症、类风湿性关节炎或糖尿病，对改善人类健康做出了重要贡献，是极具发展前景的功能因子。研究表明，利用鲍鱼、罗非鱼、沙丁鱼、安康鱼、虾等海洋来源的食品原料，通过酶解制备、纯化鉴定得到的生物活性肽具有理想的抗氧化特性，包括自由基清除能力、还原能力以及抑制脂质和蛋白质氧化的能力、ROS清除能力、细胞保护能力等。牡蛎作为中国传统药食两用食品原料，具有极高的营养价值和药用价值，其蛋白质含量高达45%-52%，氨基酸组成完善，必需氨基酸的完全程度和品质优于人乳和牛乳，是制备生物活性肽的优质原料。
目前关于牡蛎的研究多以混合物形式开展，对其多肽组成、氨基酸序列及活性机制研究有待深入。例如已有专利公开了一种牡蛎抗氧化活性肽的制备方法，利用两级酶解来得到牡蛎抗氧化活性肽，但其得到的仍是一种混合产物。
因此，对牡蛎进行更为深入研究，开发一种结构明确且抗氧化活性较佳的抗氧化活性肽具有较大的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷或不足，提供一种高活性富硒牡蛎抗氧化肽。本发明提供的高活性富硒牡蛎抗氧化肽具有较佳的抗氧化活性和富硒特性，可通过降低ROS水平、保护细胞膜完整性和增强内源性抗氧化酶（SOD、CAT）活性，发挥其对HepG2细胞的氧化损伤保护作用；另外LLVSeMY可作为Keap1-Nrf2相互作用抑制剂，激活Nrf2功能，促使ARE所调控的具有抗氧化和细胞保护作用的蛋白质（CAT和SOD）基因的表达，最终导致CAT、SOD活力上升，从而增强机体清除自由基的能力。
本发明的另一目的在于提供上述高活性富硒牡蛎抗氧化肽在制备抗氧化剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述高活性富硒牡蛎抗氧化肽在制备Keap1-Nrf2相互作用抑制剂中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种高活性富硒牡蛎抗氧化肽，所述高活性富硒牡蛎抗氧化肽具有如SEQIDNO：1所示序列的肽，且所述肽中的甲硫氨酸M中的硫元素被硒取代。
具体地，SEQIDNO：1所示序列的肽为LLVMY（Leu-Leu-Val-Met-Tyr）。
本发明的发明人本研究采用10 kDa超滤膜分离和两步制备液相色谱纯化从富硒牡蛎蛋白水解物中获取高活性富硒牡蛎抗氧化肽组分，其序列为LLVMY，且甲硫氨酸M中的硫元素被硒取代（记为LLVSeMY）。
经测定，本发明提供的高活性富硒牡蛎抗氧化肽呈现出良好的细胞抗氧化活性，可通过降低ROS水平、保护细胞膜完整性和增强内源性抗氧化酶（SOD、CAT）活性，发挥其对HepG2细胞的氧化损伤保护作用；另外LLVSeMY可作为Keap1-Nrf2相互作用抑制剂，激活Nrf2功能，促使ARE所调控的具有抗氧化和细胞保护作用的蛋白质（CAT和SOD）基因的表达，最终导致CAT、SOD活力上升，从而增强机体清除自由基的能力。
优选地，所述高活性富硒牡蛎抗氧化肽来源于富硒牡蛎。
更为优选地，所述高活性富硒牡蛎抗氧化肽来源于富硒牡蛎蛋白。
优选地，所述高活性富硒牡蛎抗氧化肽的分子量为685.2953 Da。
上述高活性富硒牡蛎抗氧化肽在制备抗氧化剂中的应用在本发明的保护范围内。
优选地，所述高活性富硒牡蛎抗氧化肽在制备保健品、化妆品、食品或药品中的应用。
更为所述高活性富硒牡蛎抗氧化肽在食品、化妆品、保健品或药品中的添加量为0.5~50 µg/mL。
本发明研究发现，LLVSeMY通过降低ROS水平、保护细胞膜完整性和增强内源性抗氧化酶（SOD、CAT）活性，发挥其对HepG2细胞的氧化损伤保护作用。
上述高活性富硒牡蛎抗氧化肽在制备Keap1-Nrf2相互作用抑制剂中的应用也在本发明的保护范围内。
优选地，所述高活性富硒牡蛎抗氧化肽在制备Keap1蛋白的氨基酸残基Ser363、Gly364、Asn382、Gly509、Gln530、Ser555、Ala556、Gly603与Nrf2相互作用的抑制剂中的应用。
优选地，所述高活性富硒牡蛎抗氧化肽在制备Keap1蛋白的氨基酸残基Tyr334、Tyr572与Nrf2相互作用的抑制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的高活性富硒牡蛎抗氧化肽呈现出良好的细胞抗氧化活性，可通过降低ROS水平、保护细胞膜完整性和增强内源性抗氧化酶（SOD、CAT）活性，发挥其对HepG2细胞的氧化损伤保护作用；另外LLVSeMY可作为Keap1-Nrf2相互作用抑制剂，激活Nrf2功能，促使ARE所调控的具有抗氧化和细胞保护作用的蛋白质（CAT和SOD）基因的表达，最终导致CAT、SOD活力上升，从而增强机体清除自由基的能力。
附图说明
图1为一次制备液相分离色谱图；
图2为二次制备液相分离色谱图；
图3为富硒牡蛎抗氧化肽的二级质谱图；
图4为富硒牡蛎抗氧化肽对HepG2细胞毒性作用实验结果；
图5为富硒牡蛎抗氧化肽的细胞抗氧化活性实验结果；
图6为富硒牡蛎抗氧化肽对AAPH诱导损伤的HepG2细胞的保护作用；
图7为富硒牡蛎抗氧化肽对乳酸脱氢酶（LDH）的含量的影响；
图8为富硒牡蛎抗氧化肽对AAPH诱导损伤的HepG2细胞内ROS的抑制效果；
图9为富硒牡蛎抗氧化肽对AAPH诱导损伤的HepG2细胞中SOD（图9A）和CAT（图9B）抗氧化酶活性的影响试验结果；
图10为高活性富硒牡蛎抗氧化肽与人源性Keap1蛋白的结合模式；图10A为Keap1蛋白与该富硒牡蛎抗氧化肽分子对接能量最低的3D结构图；图10B为对应理论结合模式。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
各实施例中使用的材料与仪器信息例举如下：
富硒牡蛎蛋白由北部湾滨海富硒功能农业研究院提供；
胃蛋白酶（3000 NF）购自南宁庞博生物工程有限公司；
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）购自上海源叶生物科技有限公司；
2,2-气联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）购自广州市齐云生物技术有限公司；
DMEM高糖培养基、胎牛血清、双抗（青霉素/链霉素）购自美国Gibico公司；
DCFH-DA活性氧ROS荧光探针、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）购自美国Sigma-Aldrich公司；
BCA蛋白浓度测定试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒、过氧化氢酶（catalase，CAT）测定试剂盒和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）测定试剂盒购自南京建成生物研究工程所；
其他化学品和试剂均为分析纯。
AL104电子天平购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；
PHS-3CW pH计购自赛多利斯科学仪器（京）有限公司；
DF-101S数显恒温水浴锅购自巩义予华仪器有限公司；
L530台式低速自动平衡离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；
FD-1型冷冻干燥机购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司；
DH5000BII电热恒温培养箱购自天津泰斯特仪器有限公司；
AFS-9530原子荧光光度计购自北京海光仪器有限公司；
EnSpire2300多功能酶标仪购自珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司。
各实施例中DPPH自由基清除率和ABTS自由基清除率按照如下过程测定得到：
（1）DPPH自由基清除率
DPPH自由基清除活性的测定过程如下：将100 μL不同浓度的样品溶液和100 μLDPPH溶液加入96孔板中，混匀后于室温、避光条件下反应30 min，立即测定其在517 nm波长处的吸光值。按以下公式计算DPPH自由基清除率：
Figure 348599DEST_PATH_IMAGE001
式中：A 0 —100 μL无水乙醇+100 μL DPPH溶液的吸光值
A i —100 μL样品溶液+100 μL DPPH溶液的吸光值
A j —100 μL样品溶液+100 μL无水乙醇的吸光值。
（2）ABTS自由基清除率
ABTS自由基清除能力的测定过程如下：在96孔板中加入100 μL的ABTS工作液，再加入100 μL不同浓度的样品溶液，震荡1~2 min，于37℃下避光放置10 min后，在734 nm处测定吸光值。按以下公式计算ABTS自由基清除率：
Figure 428550DEST_PATH_IMAGE002
式中：A 0 —100 μL去离子水+100 μL ABTS工作液的吸光值
A i —100 μL样品溶液+100μL ABTS工作液的吸光值
A j —100 μL样品溶液+100 μL去离子水的吸光值。
实施例1 富硒牡蛎蛋白酶解物的制备
采用胃蛋白酶水解法制备富硒牡蛎蛋白酶解物：将富硒牡蛎蛋白粉按7%的固液比溶于去离子水中，调节溶液pH至1.0。随后加入0.5%（E/S）的胃蛋白酶。37℃水解4 h后，90℃加热10 min终止反应，冷却至室温后4000 r/min离心20 min，收集上清液，即为富硒牡蛎蛋白酶解液，冻干后得到富硒牡蛎蛋白酶解物，-20 ℃保存备用。
实施例2 高活性富硒牡蛎抗氧化肽的分离纯化
（1）超滤
使用超滤管（Amicon Ultra-15，过滤膜分子量为10 kDa）对富硒牡蛎蛋白酶解液进行分离，4000 r/min离心30 min。收集分子量小于10 kDa的组分（超滤组分），-20℃保存用于后续分析。
（2）制备液相色谱分离
一次分离：
在制备液相（LC-8, Shimadzu, Japan）系统中，采用反向C18柱（20 mm×450 mm，10 μm）对超滤组分（<10 kDa）进行制备液相色谱分离。制备条件为：流动相（A：一级水+0.1%TFA；B：甲醇＋0.1% TFA）；洗脱程序：0~10 min，6%~10%流动相B；10~30 min，10%~20%流动相B；30~60 min，20%~50%流动相B；60~65 min，50%~90%流动相B；65~75 min，90%~90%流动相B；75~80 min，90%~6%流动相B；进样量5 mL；洗脱流速10 mL/min；检测波长为214 nm和280nm。将相同洗脱峰汇集，蒸发浓缩后冻干，检测其DPPH、ABTS自由基清除活性。
一次制备液相分离色谱图如图1。在检测波长214nm和280nm下，根据出峰时间及峰形，共分离得到7个色谱峰。将这7个组分（F1-F7，按收集时间排序）分别收集，尽快进行蒸发浓缩及真空冻干，减少多肽降解。随后测定其DPPH、ABTS自由基清除活性，样品浓度为1mg/mL时，F1-F7都具有不同程度的DPPH和ABTS自由基清除活性，F1-F7对DPPH自由基清除率分别为25.52 ± 2.34%、26.97 ± 2.34%、23.16 ± 1.88%、30.90 ± 0.89%、37.29 ±1.01%、39.01 ± 0.98%、32.29 ± 3.87%，对ABTS自由基清除率分别为19.32 ± 2.12%、19.39 ± 2.22%、15.39 ± 1.17%、23.05 ± 2.41%、34.16 ± 1.28%、38.72 ± 1.36%、28.82 ± 1.71%，其中，F6组分的DPPH清除率最高，达到39.01 ± 0.98%，除F5外，与其他组分均具有显著性差异（p<0.05）。F6的ABTS自由基清除率为38.72 ± 1.36%，显著高于其它6个组分（p<0.05），故选择F6进行下一步的分离和分析。
二次分离：
采用Prep 150制备液相系统，反相柱SunFire Prep C18 OBD™ (19 mm×250 mm,5 μm, Waters)，进一步纯化抗氧化活性最强的组分（F6）。制备条件：流动相（A：双蒸水+0.1%三氟乙酸；B：甲醇+0.1%三氟乙酸）；梯度洗脱：0~25 min，30%~40%流动相B；25~35 min，40%~90%流动相B；进样量1 mL；洗脱流速10 mL/min，在214 nm的紫外波长下监测洗脱峰。收集活性组分旋转蒸发浓缩并进行冻干，复溶成0.5 mg/mL溶液，检测其DPPH和ABTS自由基清除率，筛选抗氧化活性最强的组分进行质谱鉴定。
实验结果如图2。按照出峰情况及分离度，F6组分被进一步纯化为5个峰，分别被命名为F6-1、F6-2、F6-3、F6-4和F6-5。收集5个组分，浓缩冻干后评价其DPPH、ABTS自由基清除活性。当样品浓度为0.5 mg/mL时，F6-1、F6-2、F6-3、F6-4和F6-5对DPPH自由基清除率分别为20.79 ± 2.23%、22.37 ± 2.79%、21.84 ± 2.32%、55.56 ± 0.82%、39.98 ± 1.75%，对ABTS自由基清除率分别为25.35 ± 0.14%、25.61 ± 1.13%、26.26 ± 0.46%、78.11 ±0.38%、58.68 ± 0.51%。其中，F6-4组分的ABTS自由基清除率高达78.11 ± 0.38%，DPPH自由基清除率为55.56 ± 0.82%，与其它四个组分相比，皆具有显著性差异（p<0.05）。相比于一次分离抗氧化最强组分F6，在浓度减半的条件下，F6-4的DPPH自由基清除活性提高142%、ABTS自由基清除率提高202%。因此，大量收集F6-4组分用于后续分析。
同时，对富硒牡蛎蛋白酶解物纯化组分的硒含量进行测定，测试结果如表1。
表1 富硒牡蛎蛋白酶解物纯化组分的硒含量
Figure 454275DEST_PATH_IMAGE003
由表1可知，富硒牡蛎蛋白酶解物分子量小于10 kDa的组分（超滤组分）经一次分离后，F6组分的硒含量增加至2.83 ± 0.17 mg/kg，经二次分离后，最强抗氧化组分F6-4的硒含量高达24.64 ± 0.38 mg/kg，相比F6组分的硒含量增加了近8.71倍。表明分离纯化过程中硒得到了极好地富集，也说明硒元素的存在对抗氧化活性有重要贡献。
（3）富硒牡蛎抗氧化肽的氨基酸序列分析
采用LC-MS/MS对高活性组分F6-4进行分子质量测定和肽组成表征：富硒牡蛎抗氧化肽组分经离心干燥后，重新溶解于含0.1%甲酸的去离子水中进行在线LC/MS分析。液相为Easy nLC 1200纳升液相系统（ThermoFisher, USA），样品在nanoViper C18预柱上（3μm，100Å）脱盐保留后再经C18反相色谱柱（Acclaim PepMap RSLC，75 μm×25 cm C18-2 μm100 Å）分离，实验所用梯度为60 min内流动相B（80%乙腈，0.1%甲酸）由5%升高至38%。质谱采用ThermoFisher Q Exactive系统（ThermoFisher, USA）结合纳升喷雾Nano Flex离子源（ThermoFisher, USA），喷雾电压为1.9kV，离子传输管加热温度为275℃。质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下（DDA，Data Dependent Analysis），一级质谱扫描分辨率为70000，扫描范围设定100-1500 m/z，AGC target设定3×106，最大注入时间100 ms。每次DDA循环下最多采集20个电荷为1+到3+的二级图谱，二级质谱AGC target设定为8000，最大注入时间为50 ms。高能碰撞诱导解离（HCD）设定为28 eV，动态排除设置为6 s。采用PEAKSStudio 8.5 (Bioinformatics Solutions Inc.Waterloo, Canada)软件进行数据加工处理和检索分析。在Crassostrea gigas数据库中搜索，PSM的局部错误发现率为1.0%，最大缺失了两个解理。选择甲硫氨酸氧化，乙酰化，脱酰胺化，谷氨酸及谷氨酰胺环化，氨基甲基化和硒取代硫进行可变修饰。前体和片段质量耐受性分别为10 ppm和0.05 Da。
高活性组分F6-4中共鉴定得到135个ALC（%）大于60的硒肽序列。如表2，为其中1个序列（即高活性富硒牡蛎抗氧化肽）的鉴定信息，图3为该序列的二级质谱图。
表2 高活性组分F6-4中高活性富硒牡蛎抗氧化肽的鉴定
Figure 190150DEST_PATH_IMAGE004
SeM、m代表SeMet，表明该甲流氨酸M中的硫元素被硒Se取代。
实施例3 富硒牡蛎抗氧化肽的细胞抗氧化活性测定
对实施例2得到的富硒牡蛎抗氧化肽的抗氧化活性进行测定。
（1）富硒牡蛎抗氧化肽对HepG2细胞毒性作用（MTT）检测
HepG2细胞培养：将100 μL HepG2细胞细胞悬液（1×105 cells/mL）接种于96孔板中，37 ℃培养24 h后弃去培养液，样品组加入100 µL富硒牡蛎抗氧化肽溶液（0.0001、0.005、0.05、0.1、0.25、0.5 mg/mL），对照组加入100 µL培养基继续培养24 h。用PBS清洗后，加入100 μL MTT 溶液（0.5 mg/mL）继续孵育4 h。弃去MTT溶液，加入100 µL DMSO，震荡10 min使蓝紫色结晶全部溶解后，酶标仪检测490 nm处的OD值。
细胞存活率计算公式：
HepG2细胞存活率（%）=As/Ab× 100 式（3）
As为样品组的吸光值，Ab为空白组的吸光值。
测试结果如图4，该富硒牡蛎抗氧化肽的浓度小于0.1 mg/mL处理24 h后对HepG2无显著细胞毒性（p<0.05）。后续研究选择浓度范围为0.0005-0.05 mg/mL的富硒牡蛎抗氧化肽进行后续细胞抗氧化活性评价实验。
（2）细胞抗氧化活性（CAA）的测定
在黑色96孔板中每孔接种100 µL HepG2细胞悬液（6×105 cells/mL），分为对照组（PC），空白组（NC）和样品组（TC），细胞培养24 h后，对照组和空白组中加入50 µL 50 μmol/L DCFH-DA工作溶液和50 µL无菌水；样品组中加入50 µL 50 µM DCFH-DA工作溶液和50 µL不同浓度的富硒牡蛎抗氧化肽溶液，37 ℃下孵育1 h。弃去处理培养基，用PBS洗涤三次，在空白组中加入培养基，在对照组和样品组中加入100 µL 600 μmol/L ABAP工作溶液。酶标仪测定波长528 nm的荧光值，激发波长为485 nm，测定时长为1 h，每5 min测一次。AUC代表荧光强度-时间曲线下的积分面积。按以下公式计算CAA值：
Figure 654629DEST_PATH_IMAGE005
其中，AUC (TC) 为样品组荧光强度-时间曲线下的积分面积；AUC (NC) 为空白组荧光强度-时间曲线下的积分面积；AUC (PC) 为对照组荧光强度-时间曲线下的积分面积。
如图5，为富硒牡蛎抗氧化肽的细胞抗氧化活性实验结果。从图5可知，即使在极低的浓度（0.0005 mg/mL）下，该富硒牡蛎抗氧化肽也能发挥较好的细胞抗氧化作用，并且随着浓度的增加，细胞抗氧化作用不断增强，具有浓度依赖性，呈现出极低的EC50值（表3），LLVSeMY的EC50值为0.739 μg/mL，显著低于玉米蛋白肽AGLPM（1200 μg/mL）、HALGA（1090 μg/mL）和松仁蛋白肽KWFCT（1090 μg/mL）、QWFCT（950 μg/mL）。因此，从结果可知，该富硒抗氧化肽能有效清除细胞内的自由基，呈现出极强的抗氧化效果，有机硒能增强活性肽的抗氧化效力。
表3富硒牡蛎抗氧化肽细胞抗氧化活性的EC50值
Figure 792350DEST_PATH_IMAGE006
（3）富硒牡蛎抗氧化肽对AAPH诱导损伤的HepG2细胞的保护作用
当用0.5 mM AAPH处理HepG2细胞时，会诱导细胞氧化应激状态。将100 μL HepG2细胞细胞悬液（2×105 cells/mL）接种于96孔板中，37 ℃孵育24 h。实验分三组进行：（1）对照组：每孔加入100μL培养基培养24 h后加入50μL培养基；（2）损伤组：每孔加入100 μL培养基培养24 h后加入50 μL AAPH溶液（终浓度为0.5 mmol/L）；（3）保护组：每孔加入100 μL的富硒牡蛎抗氧化肽溶液（0.005，0.01，0.025 mg/mL）培养24 h后加入50 μL AAPH溶液（终浓度为0.5 mmol/L）。37 ℃继续孵育24 h后，弃去培养基，用PBS清洗后，采用MTT比色法测定细胞存活率。
富硒牡蛎抗氧化肽对AAPH诱导损伤的HepG2细胞的保护作用见图6。从图6可知，与空白组比较，AAPH损伤组细胞存活率降低至75.99±0.79%，具有极其显著的损伤效果（p<0.001）。当用不同浓度的富硒牡蛎抗氧化肽预处理细胞后，细胞存活率随肽浓度增加逐渐增加，表明其对氧化损伤细胞的保护作用也越强，且具有剂量依赖性。与损伤组相比，该富硒牡蛎抗氧化肽对细胞的氧化损伤具有保护作用。当浓度大于0.01 mg/mL时，该富硒牡蛎抗氧化肽对细胞活力有显著改善作用（p<0.05）。
细胞培养基中乳酸脱氢酶（LDH）的含量反映了细胞膜损伤的程度。如图7所示，空白对照组细胞上清液中LDH的释放量为74.56 ± 18.08 U/L，而损伤组的LDH释放量明显上升为164.50±12.52 U/L，表明AAPH对HepG2细胞有损伤作用。与损伤组相比，富硒牡蛎抗氧化肽预处理组LDH含量呈剂量依赖性降低，具有显著性差异（p<0.05），当肽浓度为0.025mg/mL时，LLVSeMY处理组的LDH含量下降到与空白组接近的水平，为98.59 ± 17.78 U/L。这一现象说明富硒牡蛎抗氧化肽预处理细胞的细胞膜完整性得到了保护，富硒牡蛎抗氧化肽能有效保护HepG2细胞免受氧化损伤。
（4）富硒牡蛎抗氧化肽对AAPH诱导损伤的HepG2细胞ROS水平影响
AAPH可以通过细胞膜渗透到细胞内部，引起ROS的生成。因此，AAPH常被用于诱导氧化应激，细胞内ROS的浓度是评价HepG2细胞氧化损伤的良好指标。细胞内ROS将非荧光的DCFH-DA氧化为荧光物质DCF。通过检测DCF的荧光强度，可以获得细胞内ROS的水平。
使用DCFH-DA荧光探针，对AAPH诱导损伤的HepG2细胞中富硒牡蛎抗氧化肽清除细胞内ROS能力进行了评价。将密度为1×105 cells/mL的HepG2细胞接种于黑色96孔板中，37℃孵育24 h。实验分三组进行：（1）对照组：每孔加入100μL培养基培养24 h后加入50μL培养基；（2）损伤组：每孔加入100 μL培养基培养24 h后加入50 μL AAPH溶液（终浓度为0.5mmol/L）；（3）保护组：每孔加入100 μL的富硒牡蛎抗氧化肽溶液（0.005，0.01，0.025 mg/mL）培养24 h后加入50 μL AAPH溶液（终浓度为0.5 mmol/L）。37 ℃继续孵育24 h后，弃去各孔培养液，并加入100 μL浓度为10 μmol/L的DCFH-DA溶液反应30 min，弃上清液，用PBS洗涤3次。用多功能酶标仪（激发波长485 nm，发射波长528 nm）检测荧光强度。
富硒牡蛎抗氧化肽对ROS的抑制效果见图8。从图8可知，AAPH作用于HepG2细胞24h后，细胞内ROS水平为135.85 ± 7.99%，与空白对照组相比具有极显著性（p<0.01），表明AAPH导致细胞内ROS水平升高。然而，LLVSeMY处理组细胞内ROS水平明显减少，当浓度为0.01和0.025 mg/mL时，皆显著低于AAPH损伤组（p<0.05）。过量的ROS会损伤一些关键的生物大分子，并在各种人类疾病的发病机制中发挥负面作用。本实验结果表明经富硒牡蛎抗氧化肽处理的细胞得到了有效保护，使其免受氧化损伤。
（5）富硒牡蛎抗氧化肽对AAPH诱导损伤的HepG2细胞内抗氧化酶活性的影响
将密度为0.5×106 cells/mL的HepG2细胞接种于6孔板中，每孔2 mL，培养24 h后，弃去培养基，分三组进行处理：1）对照组：加入2 mL培养基；2）损伤组：加入2 mL培养基；3）保护组：加入2 mL的富硒牡蛎抗氧化肽溶液（0.005，0.01，0.025 mg/mL），培养24 h后，对照组加入500 μL培养基，损伤组和保护组加入500 μL AAPH溶液（终浓度为0.5 mmol/L），继续培养24 h。分组处理完细胞后，吸取细胞培养液，用于检测LDH含量。细胞用0.25%胰酶消化，培养基终止，用PBS洗涤细胞，1000 r/min离心10 min收集细胞，-20 ℃保存备用。SOD和CAT实验操作严格按试剂盒说明进行。细胞裂解液中的蛋白浓度采用BCA法测定。测试结果如图9。
在AAPH诱导氧化损伤细胞模型下，SOD和CAT的活性出现极显著降低（p<0.01），SOD活性从33.44±1.33 U/mg prot降至21.91±0.70 U/mg prot，CAT活性从17.43±0.99 U/mg prot降至7.77±1.64 U/mg prot，说明氧化应激严重破坏了HepG2细胞内抗氧化酶体系。然而，经过不同浓度的富硒牡蛎抗氧化肽处理后，SOD和CAT的活性均有所增加（图9），且呈剂量效应。即使在低浓度下，富硒牡蛎抗氧化肽预处理组的SOD酶活性显著高于损伤组（p<0.05），在0.025 mg/mL浓度下，LLVSeMY预处理组的SOD酶活性增加了123.41%。在0.025mg/mL浓度下，LLVSeMY预处理组的CAT活性分别从7.77±1.64 U/mg prot提高至23.65±0.98 U/mg prot，恢复甚至超过空白组正常细胞的水平，这一变化趋势与细胞活力的实验结果类似（图6）。上述结果表明，LLVSeMY可通过恢复内源性抗氧化作用来减轻氧化损伤，进而达到对细胞的保护作用。
实施例4 基于分子对接技术研究高活性富硒牡蛎抗氧化肽的抗氧化机制
Keap1-Nrf2-ARE信号通路是人体细胞减轻外来氧化损伤的重要防御途径，通过抑制Keap1-Nrf2的相互作用能够激活该通路所调控的具有抗氧化和细胞保护作用的蛋白相关基因的表达，从而提高机体的抗氧化能力。Keap1蛋白（PBD ID：4L7B）自带配体分子，进行分子对接试验时，能够以其自带的配体分子为基准设计出合适的结合位点，更适合作为分子对接的受体文件。
本实施例通过分子对接研究富硒牡蛎抗氧化肽LLVSeMY对Keap1-Nrf2相互作用的影响，从分子水平阐明该富硒牡蛎抗氧化肽的抗氧化机制。结果如表4所示，LLVSeMY与Keap1蛋白的亲和力为-9.6 Kcal/mol，表明该富硒牡蛎抗氧化肽可以自发地与Keap1蛋白结合。图10A为Keap1蛋白与该富硒牡蛎抗氧化肽分子对接能量最低的3D结构图，图10B为对应理论结合模式。结果表明，该富硒牡蛎抗氧化肽能嵌入到Keap1的活性空腔内，形成稳定的对接构象。LLVSeMY与Keap1蛋白的Ser363、Gly364、Asn382、Gly509、Gln530、Ser555、Ala556、Gly603氨基酸残基形成氢键作用力。此外，该富硒牡蛎抗氧化肽被Keap1蛋白的关键氨基酸残基Tyr334和Tyr572包围，形成稳定的疏水结合。据报道，Arg380、Arg415、Arg483氨基酸残基为Keap1-Nrf2结合的关键位点，而Tyr334、Asn382、His436、Tyr525和Tyr572这些氨基酸残基被丙氨酸残基替换后，Keap1与Nrf2的结合能力会受到严重破坏。已报道的Keap1-Nrf2相互作用直接抑制剂(S,R,S)-1a，也是通过占据Keap1蛋白的活性口袋，与氨基酸残基Asn414、Arg415和Ser602形成氢键，与Tyr572形成π-堆积等方式抑制Keap1-Nrf2的相互作用，进而激活Nrf2功能。因此，推测LLVSeMY是良好的Keap1-Nrf2相互作用抑制剂。此外，LLVSeMY中的SeMet与Arg415形成疏水相互作用，硒肽是特殊的含硒有机物，研究报道，Se对肽的抗氧化能力起到关键作用，且硒和肽对抗氧化活性具有协同作用。综上，LLVSeMY，具有激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路的潜能。结合细胞实验结果，推测LLVSeMY可能通过占据Nrf2与Keap1的结合位点，维持组织内高Nrf2水平，促使ARE所调控的具有抗氧化和细胞保护作用的蛋白质（CAT和SOD）基因的表达，最终导致CAT、SOD活力上升，从而增强机体清除自由基的能力。
表4 富硒牡蛎抗氧化肽与Keap1（4L7B）的分子对接结果
Figure 988976DEST_PATH_IMAGE007
本发明从富硒牡蛎蛋白酶解物中分离得到富硒牡蛎抗氧化肽LLVSeMY。该富硒牡蛎抗氧化肽呈现出良好的细胞抗氧化活性，更重要的是，LLVSeMY可通过降低ROS水平、保护细胞膜完整性和增强内源性抗氧化酶（CAT和SOD）活性，发挥其对HepG2细胞的氧化损伤保护作用。分子对接结果进一步表明LLVSeMY可作为Keap1-Nrf2相互作用抑制剂，激活Nrf2功能，促使ARE所调控的具有抗氧化和细胞保护作用的蛋白质（CAT和SOD）基因的表达，最终导致CAT、SOD活力上升，从而增强机体清除自由基的能力。富硒牡蛎抗氧化肽具有高效的抗氧化能力，作为天然抗氧化剂在功能性食品中具有广阔的应用前景。
最后应当指出的是，以上实施例仅是本发明的具有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明内容直接导出或联想到所有变形，均应认为是本发明的权利要求的保护范围。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种高活性富硒牡蛎抗氧化肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 高活性富硒牡蛎抗氧化肽(1)
<400> 1
Leu Leu Val Met Tyr
1 5

Claims (7)

1.一种高活性富硒牡蛎抗氧化肽，其特征在于，所述高活性富硒牡蛎抗氧化肽为如SEQIDNO：1所示序列的肽，且所述肽中的甲硫氨酸M中的硫元素被硒取代。
2.权利要求1所述高活性富硒牡蛎抗氧化肽在制备抗氧化剂中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述高活性富硒牡蛎抗氧化肽在制备保健品、化妆品或药品中的应用。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述高活性富硒牡蛎抗氧化肽在化妆品、保健品或药品中的添加量为0.5~50 µg/mL。
5.权利要求1所述高活性富硒牡蛎抗氧化肽在制备Keap1-Nrf2相互作用抑制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述高活性富硒牡蛎抗氧化肽在制备Keap1蛋白的氨基酸残基Ser363、Gly364、Asn382、Gly509、Gln530、Ser555、Ala556、Gly603与Nrf2相互作用的抑制剂中的应用。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述高活性富硒牡蛎抗氧化肽在制备Keap1蛋白的氨基酸残基Tyr334、Tyr572与Nrf2相互作用的抑制剂中的应用。
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