CN114907445B - 一种高抗氧化活性富硒肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高抗氧化活性的富硒肽及其应用。所述富硒肽为如下氨基酸序列：MMDML或VMDML，且所述MMDML中的第三个甲硫氨酸M中的硫元素被硒取代；所述VMDML中的第一个甲硫氨酸M和第二个甲硫氨酸M中的硫元素均被硒取代。本发明从富硒牡蛎蛋白酶解物中分离纯化得到一种高抗氧化活性的富硒肽，该富硒肽具有高硒含量，且具有高抗氧化活性和细胞损伤保护作用，同时可抑制Keap1‑Nrf2的相互作用，具有广泛的用途。

Description

一种高抗氧化活性富硒肽及其应用
技术领域
本发明属于抗氧化技术领域，具体涉及一种高抗氧化活性的富硒肽及其应用。
背景技术
硒是一种人体所必需的微量元素，具有抗癌、提高自身机体免疫力、预防心脑血管疾病、抗氧化等多种生理功能。硒是一些生物酶的重要组成部分，如谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)，硫氧还蛋白还原酶(TrxR)和脱碘酶(DIOs)等，它们参与细胞内信号传导、氧化还原稳态和甲状腺激素代谢的氧化还原调节。硒摄入量不足与人类疾病，如癌症、克山病、病毒感染、免疫反应和甲状腺激素功能异常有很强的相关性。世界卫生组织(WHO)建议硒摄入量为30-50μg/d，然而，全世界约有十亿人存在硒缺乏。近年来，在均衡膳食框架下，有机硒因其安全性、较好的生物活性和生物利用度而更受推荐。
生物活性硒肽是有机硒补剂的重要来源，与单一的硒化合物和普通的生物活性肽相比，硒肽具有更有效的生物活性，是生物活性肽领域中极具研究价值的新颖肽。研究发现，广西北部湾地区所产富硒牡蛎的硒含量为1.30±0.07mg/kg，远高于《富硒农产品硒含量分类要求》(DB45/T 1061-2014)中富硒水产类硒含量的标准(0.10-0.50mg/kg)，证明其作为富硒产品具有良好的研究价值和开发前景。
目前已有专利公开了一种牡蛎抗氧化活性肽的制备方法，利用两级酶解来得到牡蛎抗氧化活性肽，但其得到的并非富硒多肽。从牡蛎中研发一种富硒肽将极具研究意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷或不足，提供一种高抗氧化活性的富硒肽。本发明从牡蛎蛋白酶解物中分离纯化得到一种高抗氧化活性的富硒肽，该富硒肽具有高硒含量，且具有高抗氧化活性和细胞损伤保护作用，同时可抑制Keap1-Nrf2的相互作用，具有广泛的用途。
本发明的另一目的在于提供上述富硒肽在制备抗氧化剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述富硒肽在制备细胞氧化损伤保护剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述富硒肽在制备Keap1-Nrf2相互作用抑制剂中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种高抗氧化活性的富硒肽，所述富硒肽为如下氨基酸序列：MMDML(如SEQ IDNO：1，Met-Met-Asp-Met-Leu)或VMDML(如SEQ ID NO：2，Val-Met-Asp-Met-Leu)，且所述MMDML中的第三个甲硫氨酸M中的硫元素被硒取代，记为MMDSeML；所述VMDML中的第一个甲硫氨酸M和第二个甲硫氨酸M中的硫元素均被硒取代，记为VSeMDSeML。
本发明的发明人从富硒牡蛎中分离出两种具有如下序列的富硒肽：MMDML和VMDML，且MMDML中的第三个甲硫氨酸M中的硫元素被硒取代；VMDML中的第一个甲硫氨酸M和第二个甲硫氨酸M中的硫元素均被硒取代。该两种富硒肽不仅具有高硒含量，且具有高抗氧化活性和细胞损伤保护作用，同时可抑制Keap1-Nrf2的相互作用，具有广泛的用途。
优选地，所述富硒肽来源于富硒牡蛎。
更为优选地，所述富硒肽来源于富硒牡蛎蛋白。
优选地，所述富硒肽具有如下氨基酸序列：MMDML时，所述富硒肽的分子量为687.1875Da。
优选地，所述富硒肽具有如下氨基酸序列：VMDML时，所述富硒肽的分子量为703.1599Da。
本发明还请求保护上述富硒肽在制备抗氧化剂中的应用。
本发明提供的富硒肽具有高抗氧化活性，其可作为天然抗氧化剂添加至食品、化妆品、保健品或药品。
优选地，所述富硒肽在制备化妆品中的应用。
优选地，所述富硒肽在制备保健品中的应用。
优选地，所述富硒肽在制备药品中的应用。
上述富硒肽在制备细胞氧化损伤保护剂中的应用也在本发明的保护范围内。
本发明的富硒肽能显著提高已损伤HepG2细胞的活力，并抑制AAPH诱导的氧化应激细胞中ROS的产生，同时提高抗氧化酶的活性来保护HepG2细胞免受AAPH诱导的氧化损伤。
上述富硒肽在制备Keap1-Nrf2相互作用抑制剂中的应用也在本发明的保护范围内。
本发明的富硒肽可以抑制Keap1-Nrf2的相互作用，使得其可作为Keap1-Nrf2相互作用抑制剂。
优选地，所述富硒肽为如下氨基酸序列：MMDML时，在制备Keap1蛋白的氨基酸残基Tyr334、Tyr572与Nrf2相互作用的抑制剂中的应用。
优选地，所述富硒肽为如下氨基酸序列：MMDML时，在制备Keap1蛋白的氨基酸残基Ser363、Asn414、Arg415、Gln530、Ser555与Nrf2相互作用的抑制剂中的应用。
优选地，所述富硒肽为如下氨基酸序列：VMDML时，在制备Keap1蛋白的氨基酸残基Asn414、Arg415、Ser508、Gln530、Ser555与Nrf2相互作用的抑制剂中的应用。
优选地，所述富硒肽为如下氨基酸序列：VMDML时，在制备Keap1蛋白的氨基酸残基Tyr334、Tyr572与Nrf2相互作用的抑制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明从牡蛎蛋白中分离提纯得到一种高抗氧化活性的富硒肽，该富硒肽具有高硒含量，且具有高抗氧化活性和细胞损伤保护作用，同时可抑制Keap1-Nrf2的相互作用，具有广泛的用途。
附图说明
图1为F6组分和F6-4组分对DPPH和ABTS自由基清除率；
图2为MMDSeML和VSeMDSeML的二级质谱图；
图3为MMDSeML和VSeMDSeML对HepG2细胞毒性作用实验结果；
图4为MMDSeML和VSeMDSeML的细胞抗氧化活性实验结果；
图5为MMDSeML和VSeMDSeML对细胞损伤的保护作用实验结果；
图6为MMDSeML和VSeMDSeML对乳酸脱氢酶(LDH)的含量的影响；
图7为MMDSeML和VSeMDSeML对HepG2细胞中ROS的抑制效果；
图8为MMDSeML和VSeMDSeML对AAPH诱导损伤的HepG2细胞中SOD(图8A)和CAT(图8B)抗氧化酶活性的影响试验结果；
图9为MMDSeML和VSeMDSeML与人源性Keap1蛋白的结合模式。图9A为Keap1蛋白与MMDSeML分子对接能量最低的3D结构图，图9B为对应理论结合模式；图9C为Keap1蛋白与VSeMDSeML分子对接能量最低的3D结构图，图9D为对应理论结合模式。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
实施例中提及的F6-4组分按照CN114230635A中的记载制备得到，具体过程如下：
1.富硒牡蛎蛋白酶解物的制备：将富硒牡蛎蛋白粉按7％的固液比溶于去离子水中，调节溶液pH至1.0。随后加入0.5％(E/S)的胃蛋白酶。37℃水解4h后，90℃加热10min终止反应，冷却至室温后4000r/min离心20min，收集上清液，即为富硒牡蛎蛋白酶解液，冻干后得到富硒牡蛎蛋白酶解物，-20℃保存备用。
2.富硒牡蛎蛋白酶解物的分离：
(1)使用超滤管(Amicon Ultra-15，过滤膜分子量为10kDa)对富硒牡蛎蛋白酶解液进行分离，4000r/min离心30min。收集分子量小于10kDa的组分，-20℃保存用于后续分析。
(2)在制备液相(LC-8,Shimadzu,Japan)系统中，采用反向C18柱(20mm×450mm，10μm)对超滤组分(<10kDa)进行制备液相色谱分离。制备条件为：流动相(A：一级水+0.1％TFA；B：甲醇+0.1％TFA)；洗脱程序：0～10min，6％～10％流动相B；10～30min，10％～20％流动相B；30～60min，20％～50％流动相B；60～65min，50％～90％流动相B；65～75min，90％～90％流动相B；75～80min，90％～6％流动相B；进样量5mL；洗脱流速10mL/min；检测波长为214nm和280nm。将相同洗脱峰汇集，按收集的时间顺序依次命名为F1～F7。
3.F6组分的分离纯化：对F6组分进行二次分离纯化，采用Prep 150制备液相系统，反相柱SunFire Prep C18 OBDTM(19mm×250mm,5μm,Waters)，进一步纯化抗氧化活性最强的组分(F6)。制备条件：流动相(A：双蒸水+0.1％三氟乙酸；B：甲醇+0.1％三氟乙酸)；梯度洗脱：0～25min，30％～40％流动相B；25～35min，40％～90％流动相B；进样量1mL；洗脱流速10mL/min，在214nm的紫外波长下监测洗脱峰。收集得到5个活性组分，按收集的时间顺序依次命名为F6-1～F6-5。F6-4组分进行后续处理。
实施例1组分F6-4对DPPH和ABTS自由基的清除率及硒含量
从富硒牡蛎蛋白酶解物中分离得到F6组分及F6-4组分，对该组分的DPPH和ABTS自由基清除率及硒含量进行测定。测试过程及结果如下：
(1)DPPH自由基清除率
DPPH自由基清除活性的测定过程如下：将100μL不同浓度的样品溶液和100μLDPPH溶液加入96孔板中，混匀后于室温、避光条件下反应30min，立即测定其在517nm波长处的吸光值。按以下公式计算DPPH自由基清除率：
Figure BDA0003637315760000051
式中：A0—100μL无水乙醇+100μL DPPH溶液的吸光值
Ai—100μL样品溶液+100μL DPPH溶液的吸光值
Aj—100μL样品溶液+100μL无水乙醇的吸光值。
(2)ABTS自由基清除率
ABTS自由基清除能力的测定过程如下：在96孔板中加入100μL的ABTS工作液，再加入100μL不同浓度的样品溶液，震荡1～2min，于37℃下避光放置10min后，在734nm处测定吸光值。按以下公式计算ABTS自由基清除率：
Figure BDA0003637315760000052
式中：A0—100μL去离子水+100μL ABTS工作液的吸光值
Ai—100μL样品溶液+100μL ABTS工作液的吸光值
Aj—100μL样品溶液+100μL去离子水的吸光值。
测试结果：如图1(左)，样品浓度为1mg/mL时，F1-F7都具有不同程度的DPPH和ABTS自由基清除活性，其中，F6组分的DPPH清除率最高，达到39.01％，除F5外，与其他组分均具有显著性差异(p<0.05)。F6的ABTS自由基清除率为38.72％，显著高于其它6个组分(p<0.05)。如图1(右)当样品浓度为0.5mg/mL时，F6-4组分的ABTS自由基清除率高达78.11％，DPPH自由基清除率为55.56％，与其它四个组分相比，皆具有显著性差异(p<0.05)。相比于一次分离抗氧化最强组分F6，在浓度减半的条件下，F6-4的DPPH自由基清除活性提高142％、ABTS自由基清除率提高202％。因此，大量收集F6-4组分用于后续分析。
(3)硒含量
根据国家标准GB 5009.93-2017《食品中硒的测定》。
除F6-4组分作为样品外，还以F6组分作为样品，对比硒含量的变化，测试结果如表1。
表1富硒牡蛎蛋白酶解物纯化组分的硒含量
Figure BDA0003637315760000061
由表1可知，富硒牡蛎蛋白酶解物分子量小于10kDa的组分(超滤组分)经一次分离后，F6组分的硒含量增加至2.83±0.17mg/kg，经二次分离后，最强抗氧化组分F6-4的硒含量高达24.64±0.38mg/kg，相比F6组分的硒含量增加了近8.71倍。表明分离纯化过程中硒得到了极好地富集，也说明硒元素的存在对抗氧化活性有重要贡献。
实施例2组分F6-4的氨基酸序列分析及富硒肽的合成
(1)组分F6-4的氨基酸序列分析
利用LC-MS/MS对组分F6-4中肽段的氨基酸序列进行鉴定，具体过程如下：F6-4组分经离心干燥后，重新溶解于含0.1％甲酸的去离子水中进行在线LC/MS分析。液相为EasynLC 1200纳升液相系统(ThermoFisher,USA)，样品在nanoViper C18预柱上(3μm，
Figure BDA0003637315760000062
)脱盐保留后再经C18反相色谱柱(Acclaim PepMap RSLC，75μm×25cm C18-2μm/>
Figure BDA0003637315760000063
)分离，实验所用梯度为60min内流动相B(80％乙腈，0.1％甲酸)由5％升高至38％。质谱采用ThermoFisher Q Exactive系统(ThermoFisher,USA)结合纳升喷雾Nano Flex离子源(ThermoFisher,USA)，喷雾电压为1.9kV，离子传输管加热温度为275℃。质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下(DDA，Data Dependent Analysis)，一级质谱扫描分辨率为70000，扫描范围设定100-1500m/z，AGC target设定3×106，最大注入时间100ms。每次DDA循环下最多采集20个电荷为1+到3+的二级图谱，二级质谱AGC target设定为8000，最大注入时间为50ms。高能碰撞诱导解离(HCD)设定为28eV，动态排除设置为6s。使用de novo工具PEAKS Studio 8.5对MS/MS数据进行分析。选择甲硫氨酸氧化，乙酰化，脱酰胺化，谷氨酸及谷氨酰胺环化，氨基甲基化和硒取代硫进行可变修饰。前体和片段质量耐受性分别为10ppm和0.05Da。
组分F6-4中共鉴定得到135个ALC(％)大于60的硒肽序列。如表2，为其中2个序列的鉴定信息，图2为该序列的二级质谱图。
表2 F6-4组分中富硒肽的鉴定
Figure BDA0003637315760000071
注：SeM代表SeMet，表明该甲硫氨酸(M)中的硫元素被硒(Se)取代。
(2)富硒肽的合成
富硒肽(MMDSeML和VSeMDSeML)委托南京杰肽生物科技有限公司合成，经高效液相色谱(HPLC)分析，纯度大于98％。富硒肽在-20℃下保存。实施例3富硒肽的抗氧化活性测定
对实施例2得到的两种富硒肽的抗氧化活性进行测定。
(1)富硒肽对HepG2细胞毒性作用(MTT)检测
HepG2细胞培养：将100μL HepG2细胞细胞悬液(1×105cells/mL)接种于96孔板中，37℃培养24h后弃去培养液，样品组加入100μL富硒牡蛎抗氧化肽溶液(0.0001、0.005、0.05、0.1、0.25、0.5mg/mL)，对照组加入100μL培养基继续培养24h。用PBS清洗后，加入100μL MTT溶液(0.5mg/mL)继续孵育4h。弃去MTT溶液，加入100μL DMSO，震荡10min使蓝紫色结晶全部溶解后，酶标仪检测490nm处的OD值。
细胞存活率计算公式：
HepG2细胞存活率(％)＝As/Ab×100 式(3)
As为样品组的吸光值，Ab为空白组的吸光值。
测试结果如图3，该富硒肽的浓度小于0.1mg/mL处理24h后对HepG2均无显著细胞毒性(p<0.05)。后续研究选择浓度范围为0.0005-0.05mg/mL的富硒肽进行后续细胞抗氧化活性评价实验。
(2)细胞抗氧化活性(CAA)的测定
CAA的测定方法如下：HepG2细胞以6×104cells/孔的密度接种在黑色96孔板上。培养24h后，除去培养基，用100μL PBS洗涤一遍。分为对照组(PC)，空白组(NC)和样品组(TC)，对照组和空白组中加入50μL 50μM DCFH-DA工作溶液和50μL无菌水；样品组中加入50μL 50μM DCFH-DA工作溶液和50μL不同浓度的富硒牡蛎抗氧化肽溶液，37℃下孵育1h。弃去处理培养基，用PBS洗涤三次，在空白组中加入培养基，在对照组和样品组中加入100μL 600μM ABAP工作溶液。酶标仪测定波长528nm的荧光值，激发波长为485nm，测定时长为1h，每5min测一次。AUC代表荧光强度-时间曲线下的积分面积。按以下公式计算CAA值：
Figure BDA0003637315760000081
其中，AUC(TC)为样品组荧光强度-时间曲线下的积分面积；AUC(NC)为空白组荧光强度-时间曲线下的积分面积；AUC(PC)为对照组荧光强度-时间曲线下的积分面积。
如图4，为富硒肽的细胞抗氧化活性实验结果。从图4可知，即使在极低的浓度(0.0005mg/mL)下，这两个富硒肽也能发挥较好的细胞抗氧化作用，并且随着浓度的增加，细胞抗氧化作用不断增强，具有浓度依赖性，呈现出极低的EC50值(表3)，MMDSeML和VSeMDSeML的EC50值分别为为0.423μg/mL和0.395μg/mL，显著低于玉米蛋白肽AGLPM(1200μg/mL)、HALGA(1090μg/mL)和松仁蛋白肽KWFCT(1090μg/mL)、QWFCT(950μg/mL)。因此，从结果可知，该两个富硒肽能有效清除细胞内的自由基，呈现出极强的抗氧化效果，有机硒能增强活性肽的抗氧化效力。
表3富硒肽细胞抗氧化活性的EC50值
Figure BDA0003637315760000091
(3)富硒肽对AAPH诱导损伤的HepG2细胞的保护作用
富硒牡蛎抗氧化肽对AAPH诱导损伤的HepG2细胞的保护作用见图5。从图5可知，与空白组比较，AAPH损伤组细胞存活率降低至75.99±0.79％，具有极其显著的损伤效果(p<0.001)。当用不同浓度的富硒肽预处理细胞后，细胞存活率随肽浓度增加逐渐增加，表明其对氧化损伤细胞的保护作用也越强，且具有剂量依赖性。与损伤组相比，该两个富硒肽对细胞的氧化损伤均具有保护作用，且在低浓度(0.005mg/mL)时也具有显著的损伤保护效果(p<0.05)。VSeMDSeML对HepG2细胞的保护作用最强，在0.025mg/mL浓度下，细胞存活率恢复至86.18±1.36％。
细胞培养基中乳酸脱氢酶(LDH)的含量反映了细胞膜损伤的程度。如图6所示，空白对照组细胞上清液中LDH的释放量为74.56±18.08U/L，而损伤组的LDH释放量明显上升为164.50±12.52U/L，表明AAPH对HepG2细胞有损伤作用。与损伤组相比，肽预处理组LDH含量呈剂量依赖性降低，具有显著性差异(p<0.05)，当肽浓度为0.025mg/mL时，MMDSeML和VSeMDSeML处理组的LDH含量下降到与空白组接近的水平，分别为89.76±9.67和79.37±8.17U/L。这一现象说明该两个富硒肽预处理细胞的细胞膜完整性得到了保护，富硒肽能有效保护HepG2细胞免受氧化损伤。
(4)富硒肽对AAPH诱导损伤的HepG2细胞内ROS含量的影响
富硒肽对ROS的抑制效果见图7。从图7可知，AAPH作用于HepG2细胞24h后，细胞内ROS水平为135.85±7.99％，与空白对照组相比具有极显著性(p<0.01)，表明AAPH导致细胞内ROS水平升高。然而，MMDSeML和VSeMDSeML处理组细胞内ROS水平明显减少，当浓度为0.01和0.025mg/mL时，皆显著低于AAPH损伤组(p<0.05)。过量的ROS会损伤一些关键的生物大分子，并在各种人类疾病的发病机制中发挥负面作用。本实验结果表明经富硒肽处理的细胞得到了有效保护，使其免受氧化损伤。
(5)富硒肽对AAPH诱导损伤的HepG2细胞内抗氧化酶活性的影响
将密度为0.5×106cells/mL的HepG2细胞接种于6孔板中，每孔2mL，培养24h后，弃去培养基，分三组进行处理：1)对照组：加入2mL培养基；2)损伤组：加入2mL培养基；3)保护组：加入2mL的富硒牡蛎抗氧化肽溶液(0.005，0.01，0.025mg/mL)，培养24h后，对照组加入500μL培养基，损伤组和保护组加入500μL AAPH溶液(终浓度为0.5mM)，继续培养24h。分组处理完细胞后，吸取细胞培养液，用于检测LDH含量。细胞用0.25％胰酶消化，培养基终止消化，用PBS洗涤细胞，1000r/min离心10min收集细胞，-20℃保存备用。SOD和CAT实验操作严格按试剂盒说明进行。细胞裂解液中的蛋白浓度采用BCA法测定。测试结果如图8。
在AAPH诱导氧化损伤细胞模型下，SOD和CAT的活性出现极显著降低(p<0.01)，SOD活性从33.44±1.33U/mg prot降至21.91±0.70U/mg prot，CAT活性从17.43±0.99U/mgprot降至7.77±1.64U/mg prot，说明氧化应激严重破坏了HepG2细胞内抗氧化酶体系。然而，经过不同浓度的富硒牡蛎抗氧化肽处理后，SOD和CAT的活性均有所增加(图8)，且呈剂量效应。即使在低浓度下，富硒肽预处理组的SOD酶活性显著高于损伤组(p<0.05)，在0.025mg/mL浓度下，MMDSeML和VSeMDSeML预处理组的SOD酶活性分别增加了131.66％和136.56％，其中以VSeMDSeML预处理组的SOD酶活性最高(29.92±1.08U/mg prot)，接近空白组水平。在0.025mg/mL浓度下，MMDSeML和VSeMDSeML预处理组的CAT活性分别从7.77±1.64U/mg prot提高至17.15±0.88和22.97±0.75U/mg prot，恢复甚至超过空白组正常细胞的水平，这一变化趋势与细胞活力的实验结果类似(图5)。上述结果表明，MMDSeML和VSeMDSeML可通过恢复内源性抗氧化作用来减轻氧化损伤，进而达到对细胞的保护作用。
实施例3基于分子对接技术研究富硒肽的抗氧化机制
Keap1-Nrf2-ARE信号通路是人体细胞减轻外来氧化损伤的重要防御途径，通过抑制Keap1-Nrf2的相互作用能够激活该通路所调控的具有抗氧化和细胞保护作用的蛋白相关基因的表达，从而提高机体的抗氧化能力。Keap1蛋白(PBD ID：4L7B)自带配体分子，进行分子对接试验时，能够以其自带的配体分子为基准设计出合适的结合位点，更适合作为分子对接的受体文件。
本实施例通过分子对接研究富硒肽MMDSeML和VSeMDSeML对Keap1-Nrf2相互作用的影响，从分子水平阐明这两个富硒肽的抗氧化机制。结果如表4所示，MMDSeML和VSeMDSeML与Keap1蛋白的亲和力分别为-7.4和-8.6Kcal/mol，表明这两个富硒肽都可以自发地与Keap1蛋白结合。图9A为Keap1蛋白与MMDSeML分子对接能量最低的3D结构图，图9B为对应理论结合模式。图9C为Keap1蛋白与VSeMDSeML分子对接能量最低的3D结构图，图9D为对应理论结合模式。结果表明，这两个富硒肽都能嵌入到Keap1的活性空腔内，形成稳定的对接构象。MMDSeML与Keap1蛋白的Ser363、Asn414、Arg415、Gln530、Ser555氨基酸残基形成氢键作用，而VSeMDSeML与Keap1蛋白的Asn414、Arg415、Ser508、Gln530、Ser555氨基酸残基形成了氢键作用。此外，这两个富硒肽都被Keap1蛋白的关键氨基酸残基Tyr334和Tyr572包围，形成稳定的疏水结合。据报道，Arg380、Arg415、Arg483氨基酸残基为Keap1-Nrf2结合的关键位点，而Tyr334、Asn382、His436、Tyr525和Tyr572这些氨基酸残基被丙氨酸残基替换后，Keap1与Nrf2的结合能力会受到严重破坏。已报道的Keap1-Nrf2相互作用直接抑制剂(S,R,S)-1a，也是通过占据Keap1蛋白的活性口袋，与氨基酸残基Asn414、Arg415和Ser602形成氢键，与Tyr572形成π-堆积等方式抑制Keap1-Nrf2的相互作用，进而激活Nrf2功能。因此，推测MMDSeML和VSeMDSeML是良好的Keap1-Nrf2相互作用抑制剂。此外，MMDSeML中的SeMet可与Arg415形成疏水相互作用，硒肽是特殊的含硒有机物，研究报道，Se对肽的抗氧化能力起到关键作用，且硒和肽对抗氧化活性具有协同作用。综上，MMDSeML和VSeMDSeML具有激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路的潜能。结合细胞实验结果，推测MMDSeML和VSeMDSeML可能通过占据Nrf2与Keap1的结合位点，维持组织内高Nrf2水平，促使ARE所调控的具有抗氧化和细胞保护作用的蛋白质(CAT和SOD)基因的表达，最终导致CAT、SOD活力上升，从而增强机体清除自由基的能力。
表4富硒肽与Keap1(4L7B)的分子对接结果
Figure BDA0003637315760000121
本发明从富硒牡蛎蛋白酶解物中分离得到两个新型富硒肽MMDSeML和VSeMDSeML。这两个富硒肽都呈现出良好的细胞抗氧化活性，更重要的是，MMDSeML和VSeMDSeML可通过降低ROS水平、保护细胞膜完整性和增强内源性抗氧化酶(SOD、CAT)活性，发挥其对HepG2细胞的氧化损伤保护作用。分子对接结果进一步表明MMDSeML和VSeMDSeML可能作为Keap1-Nrf2相互作用抑制剂，激活Nrf2功能，促使ARE所调控的具有抗氧化和细胞保护作用的蛋白质(CAT和SOD)基因的表达，最终导致CAT、SOD活力上升，从而增强机体清除自由基的能力。新型富硒牡蛎抗氧化肽具有高效的抗氧化能力，作为天然抗氧化剂在功能性食品中具有广阔的应用前景。
最后应当指出的是，以上实施例仅是本发明的具有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明内容直接导出或联想到所有变形，均应认为是本发明的权利要求的保护范围。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种高抗氧化活性的富硒肽
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 高抗氧化活性的富硒肽1(1)
<400> 1
Met Met Asp Met Leu
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 高抗氧化活性的富硒肽2(2)
<400> 2
Val Met Asp Met Leu
1 5

Claims (10)

1.一种高抗氧化活性的富硒肽，其特征在于，所述富硒肽为如下氨基酸序列：MMDML或VMDML，且所述MMDML中与亮氨酸L连接的甲硫氨酸M中的硫元素被硒取代；所述VMDML中的第一个甲硫氨酸M和第二个甲硫氨酸M中的硫元素均被硒取代。
2.权利要求1所述富硒肽在制备抗氧化剂中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述富硒肽在制备化妆品中的应用。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述富硒肽在制备保健品中的应用。
5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述富硒肽在制备药品中的应用。
6.权利要求1所述富硒肽在制备细胞氧化损伤保护剂中的应用。
7.权利要求1所述富硒肽在制备用于抗氧化的Keap1-Nrf2相互作用抑制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述富硒肽为如下氨基酸序列：MMDML时，在制备Keap1蛋白的氨基酸残基Ser363、Asn414、Arg415、Gln530、Ser555与Nrf2相互作用的抑制剂中的应用。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述富硒肽为如下氨基酸序列：MMDML时，在制备Keap1蛋白的氨基酸残基Tyr334、Tyr572与Nrf2相互作用的抑制剂中的应用。
10.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述富硒肽为如下氨基酸序列：VMDML时，在制备Keap1蛋白的氨基酸残基Asn414、Arg415、Ser508、Gln530、Ser555与Nrf2相互作用的抑制剂中的应用；或在制备Keap1蛋白的氨基酸残基Tyr334、Tyr572与Nrf2相互作用的抑制剂中的应用。
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