CN113248568A - 具有神经元保护功能的富硒蛹虫草活性硒肽及其制备方法和应用 - Google Patents

具有神经元保护功能的富硒蛹虫草活性硒肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了具有神经元保护功能的富硒蛹虫草活性硒肽及其制备方法和应用。具有神经元保护功能的富硒蛹虫草活性硒肽，氨基酸序列为Val‑Pro‑Arg‑Lys‑Leu‑(Se)Met或Arg‑Tyr‑Asn‑Ala‑(Se)Met‑Asn‑Asp‑Tyr‑Thr。本发明的富硒蛹虫草活性硒肽结构清楚，可以人工化学合成制得，也可以通过对富硒蛹虫草蛋白酶解液进行分离纯化获得。同时，本发明的富硒蛹虫草活性硒肽对H2O2诱导氧化损伤细胞具有预保护作用，可在H2O2诱导氧化损伤细胞中有效降低过度ROS的积累和提高抗氧化酶(CAT和SOD)的活力，在缓解神经退行性疾病的功效上极具潜力。

Description

具有神经元保护功能的富硒蛹虫草活性硒肽及其制备方法和 应用
技术领域：
本发明属于活性肽领域，具体涉及具有神经元保护功能的富硒蛹虫草活性硒肽及其制备方法和应用。
背景技术：
机体需要通过活性氧(reactive oxygen species，ROS)作用以维持体内的抗氧化防御系统，从而维持机体恒定的氧化还原状态，保证机体的内环境稳定。当机体的氧化还原平衡状态偏向氧化时，会引起氧化还原信号和控制的中断，以及分子损伤，称为氧化应激(oxidative stress，OS)，进而产生多种疾病。其中，脑部的氧化应激损伤神经元细胞可以引发多种神经退行性疾病，包括阿尔兹海默症、帕金森症和多发性硬化症等。这些疾病明显的影响着人们的生活质量，并给社会带来巨大的经济负担。
研究表明，神经元损伤和神经退行性疾病之间关系密切，对氧化损伤神经元具有保护作用的抗氧化剂可以缓解神经退行性疾病。食品源硒肽是一种天然抗氧化剂。硒肽同相似多肽相比，它兼具硒和多肽的多种生化功能，有更优越的神经元保护活性和抗氧化活性。硒肽的多种生物活性(如抗氧化、抗高血压、抗炎和免疫调节作用)在生物机体内参与各种生物过程。进一步研究结果显示硒肽通过抗氧化途径可有效干预阿尔兹海默症和衰老等进程的发展。硒肽可作为氧化剂清除神经元细胞中ROS的过度累积，还可提高神经元细胞的抗氧化酶系防御系统。因此，硒肽在通过保护氧化损伤神经元途径进而预防或治疗与年龄相关的神经退行性疾病中极具潜力。
目前硒肽主要来源于硒蛋白的酶促水解。根据硒与蛋白结合方式可分为有机硒和无机硒，有机硒相较于无机硒毒性低、生物利用率高且具有更好的抗氧化活性。通过生物强化方式获得的植物可将无机硒转化为有机硒，主要以硒蛋白的形式存在。前期实验结果表明蛹虫草具有强的硒积累能力，硒含量高达117.7mg/kg。因此，富硒蛹虫草中硒蛋白含量高，是一种极好的硒蛋白来源，可用于食源性硒肽的制备。
PC12细胞系来源于大鼠肾上腺髓质的嗜铬细胞瘤，通过体外神经生长因子(NGF)处理，可分化成具有许多类似于交感神经元特性的细胞，因此被广泛应用于神经元氧化损伤相关的神经退行性疾病的研究。已有许多的研究报道了高浓度的H2O2可引起细胞的氧化应激损伤，通常作为体外神经元氧化损伤发生的研究。因此，从富硒蛹虫草中制备生物活性硒肽，可通过H2O2诱导氧化损伤的PC12细胞模型筛选具有神经元保护作用的硒肽。
发明内容：
本发明的第一个目的在于提供两个具有神经元保护功能的富硒蛹虫草活性硒肽，其氨基酸序列为Val-Pro-Arg-Lys-Leu-(Se)Met和Arg-Tyr-Asn-Ala-(Se)Met-Asn-Asp-Tyr-Thr。
本发明的第二个目的在于提供上述富硒蛹虫草活性硒肽在制备保护神经元细胞的药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种保护神经元细胞的药物，其含有上述富硒蛹虫草活性硒肽作为活性成分。
所述的保护神经元是指对H2O2诱导氧化损伤细胞的预保护作用，包括硒肽对PC12细胞无明显毒性，以及提高H2O2损伤后PC12细胞的活力。同时，硒肽可以在H2O2诱导氧化损伤的细胞中有效降低过量的ROS积累和提高抗氧化酶系的活力。因此所述的保护神经元细胞的药物是保护神经元细胞免受氧化损伤的药物。
本发明的第四个目的是提供上述富硒蛹虫草活性硒肽的制备方法，其是从富硒蛹虫草中制备分离得到的。
上述的富硒蛹虫草活性硒肽可以采用现有化学技术进行人工固相合成。以Val-Pro-Arg-Lys-Leu-(Se)Met为例，将Fmoc-SeMet-wang Resin树脂溶胀、脱保护，称量下一个氨基酸酸Fmoc-Leu-oh，氨基酸同缩合剂和有机碱加入反应器中进行缩合反应，反应后洗涤，重复脱保护-称量-脱保护洗涤-投料-反应-反应后洗涤过程直至所有氨基酸连接完毕，最后通过检测、切割和纯化即获得多肽。
此外，本发明的富硒蛹虫草硒肽也可以采用超滤、Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析柱和反相高效液相色谱等分离方法从富硒蛹虫草蛋白酶解液中分离获得，具体步骤如下：
(1)将富硒蛹虫草干粉加入含0.1％β-巯基乙醇的5％乙酸溶液，搅拌后经离心过滤，收集滤液，加硫酸铵至75％饱和度，静置沉淀，离心，收集沉淀，沉淀复溶后透析，冷冻干燥获得富硒蛹虫草硒蛋白干粉；
(2)取硒蛋白干粉，加入超纯水混合，使用胃蛋白酶进行酶解，再用胰酶酶解，灭酶，离心，取上清液，获得硒蛋白模拟胃肠消化酶解液；
(3)将酶解液加纯水稀释后通过3kDa分子量超滤膜，收集＜3kDa组分并浓缩；
(4)将＜3kDa组分上样Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析柱，用超纯水洗脱，收集组分，浓缩，选择对神经元细胞保护效果好的GF1组分；
(5)将GF1组分上样反相高效液相色谱柱，采用水-乙腈洗脱液进行梯度洗脱，收集组分，浓缩，选择活性最好的硒肽组分通过UPLC-MS/MS检测，获得富硒蛹虫草硒肽。
本发明的第五个目的是提供富硒蛹虫草在制备上述富硒蛹虫草活性硒肽中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点及效果：
本发明的富硒蛹虫草活性硒肽结构清楚，可以人工化学合成制得，也可以通过对富硒蛹虫草蛋白酶解液进行分离纯化获得。同时，本发明的富硒蛹虫草活性硒肽对H2O2诱导氧化损伤细胞具有预保护作用，在缓解神经退行性疾病的功效上极具潜力。
附图说明
图1为富硒蛹虫草蛋白酶解液的Sephadex G-25葡聚糖凝胶色谱的洗脱曲线及不同分离组分对H2O2诱导氧化损伤PC12细胞活力的影响。
图2为富硒蛹虫草蛋白酶解液的反相液相高效色谱的洗脱曲线及不同分离组分对H2O2诱导氧化损伤PC12细胞活力的影响。
图3为富硒蛹虫草活性硒肽的二级质谱图。
图4为人工合成硒肽对H2O2诱导氧化损伤PC12细胞活力的影响。
图5为人工合成硒肽对H2O2诱导氧化损伤PC12细胞中ROS的影响。
图6为人工合成硒肽对H2O2诱导氧化损伤PC12细胞中CAT和SOD的影响。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中，通常按照实验室条件、常规条件或制造厂商的建议条件进行实验，如有特殊实验条件会另外注明。
实施例1、硒肽Val-Pro-Arg-Lys-Leu-(Se)Met和Arg-Tyr-Asn-Ala-(Se)Met-Asn- Asp-Tyr-Thr的分离纯化
(1)富硒蛹虫草蛋白干粉的制备：采用5％乙酸溶解-75％硫酸铵沉淀法从富硒蛹虫草中提取硒蛋白。具体过程如下，富硒蛹虫草烘干打粉后，以料液比1:15(g/mL)加入体积分数5％乙酸溶液(含体积分数0.1％β-巯基乙醇)溶解→4℃，搅拌3h→4℃，8500g离心10min→加硫酸铵至75％饱和度→搅拌0.5h→4℃，静置15h→4℃，8500g离心12min→纯水复溶沉淀→4℃，透析24h→冷冻干燥→硒蛋白干粉。
(2)富硒蛹虫草蛋白酶解液的制备：用硒蛋白干粉配制10mg/mL的硒蛋白溶液→加入质量分数4％胃蛋白酶，在pH值2.0和温度37℃下酶解2h，每0.5h使用0.1M的HCI和NaOH调节一次pH→调节pH值至7.0，加入质量分数4％胰酶，37℃下酶解2h，每0.5h使用0.1M的HCI和NaOH调节一次pH→沸水浴灭酶10min→冷却至室温→过0.22μm滤膜→分装，-80℃冻存。
(3)活性硒肽的分离纯化：使用3kDa分子量超滤膜收集透过的＜3kDa酶解液，将其浓缩并保存；使用Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析柱分离纯化＜3kDa组分，超纯水以1mL/min流速进行洗脱，280nm检测波长，洗脱曲线如图1A所示。收集各组分进行细胞毒性和保护效果测定。将细胞以1.5×104个/孔(每孔100μL培养基)的密度接种于96孔板孵育24h，随后添加硒肽10μg/孔(每孔100μL培养基)进行保护12h，再通过CCK-8试剂盒测定细胞活力以确定样品对细胞的毒性。其中对照组不添加硒肽，每个处理进行3个复孔重复(n＝3)。同时，将细胞以1.5×104个/孔(每孔100μL培养基)的密度接种于96孔板孵育24h，随后添加硒肽10μg/孔(每孔100μL培养基)进行保护12h，再使用80μM的H2O2处理1h诱导氧化损伤(每孔100μL)，最后通过CCK-8试剂盒测定细胞活力以确定样品对H2O2诱导氧化损伤细胞的保护效果。其中对照组不添加硒肽和H2O2，损伤组不添加硒肽但添加H2O2，每个处理进行3个复孔重复(n＝3)。收集对氧化损伤PC12细胞保护效果最好且无明显细胞毒性的GF1组分(图1B和C)，浓缩，-80℃冻存待用；使用反相高效液相色谱分离纯化GF1组分，色谱柱为(C18 column，10×250mm,5μm,Waters)。超纯水(流动相A)-乙腈(流动相B)进行梯度洗脱：0.01-1min，5％乙腈；1-35min，5-40％乙腈；35-36min，40％乙腈；36-40min，40-5％乙腈；40-45min，5％乙腈，流速为0.7mL/min，检测波长220nm，共收集5个组分(图2A)，收集对氧化损伤PC12细胞保护效果最好且无明显细胞毒性的硒肽组分GF1-2(图2B和C)，浓缩后获得含目标活性硒肽的组分。
(4)GF1-2组分通过UPLC-MS/MS技术进行氨基酸序列搜库分析，经过二级质谱分析结果证实含有目标硒肽，其二级质谱图如图3所示，获得两个富硒蛹虫草活性硒肽，其序列分别为Val-Pro-Arg-Lys-Leu-(Se)Met和Arg-Tyr-Asn-Ala-(Se)Met-Asn-Asp-Tyr-Thr。
实施例2、人工固相合成Val-Pro-Arg-Lys-Leu-(Se)Met或Arg-Tyr-Asn-Ala-(Se)Met-Asn-Asp-Tyr-Thr硒肽
以Val-Pro-Arg-Lys-Leu-(Se)Met为例，将Fmoc-SeMet-wangResin树脂溶胀、脱保护，称量下一个氨基酸酸Fmoc-Leu-oh加入反应器中进行缩合反应，反应后洗涤，重复脱保护-称量-脱保护洗涤-投料-反应-反应后洗涤过程直至所有氨基酸连接完毕。得到Val-Pro-Arg(pbf)-Lys(boc)-Leu-SeMet-wangresin树脂肽，通过切割液从树脂上取下多肽并去掉侧链保护基获得多肽粗品。最后通过反相高效制备色谱纯化获得多肽纯品(＞95％)。
Arg-Tyr-Asn-Ala-(Se)Met-Asn-Asp-Tyr-Thr可通过相同的固相合成方法获得。
实施例3、人工固相合成Val-Pro-Arg-Lys-Leu-(Se)Met和Arg-Tyr-Asn-Ala-(Se)Met-Asn-Asp-Tyr-Thr对H2O2诱导氧化损伤PC12细胞的保护作用
本研究采用H2O2诱导氧化损伤PC12细胞模型评估硒肽(Val-Pro-Arg-Lys-Leu-(Se)Met和Arg-Tyr-Asn-Ala-(Se)Met-Asn-Asp-Tyr-Thr)对神经元的保护作用。将细胞以1.5×104个/孔(每孔100μL培养基)的密度接种于96孔板孵育24h，随后添加硒肽10μg/孔(每孔100μL培养基)进行保护12h，再使用80μM的H2O2处理1h诱导氧化损伤(每孔100μL)。其中对照组不添加硒肽和H2O2，损伤组不添加硒肽但添加H2O2，每个处理进行3个复孔重复(n＝3)。细胞活力通过CCK-8试剂盒测定。硒肽预保护后立即测定细胞活力可知硒肽无明显细胞毒性(图4A)，而H2O2损伤结束后立即测定细胞活力可知硒肽具有明显的保护效果(图4B)。因此，本发明硒肽具有明显的神经元保护作用。
实施例4、人工合成硒肽对H2O2诱导氧化损伤PC12细胞中ROS的影响
本研究采用荧光探针法(DCFH-DA来测定)评估硒肽对H2O2诱导氧化损伤PC12细胞内ROS的影响。将细胞以1.5×104个/孔(每孔100μL培养基)的密度接种于96孔板孵育24h，随后添加硒肽10μg/孔(每孔100μL培养基)进行保护12h。接着将10μM DCFH-DA溶液(每孔100μL)与PC12细胞一起在37℃培养箱中孵育20min。孵育完成后使用DM EM清洗2遍后，使用80μM的H2O2处理1h诱导氧化损伤(每孔100μL)。其中对照组不添加硒肽和H2O2，损伤组不添加硒肽但添加H2O2。损伤后的细胞采用PBS清洗2遍,使用自动酶标仪(Biotek Cytation5,USA)对细胞荧光进行拍摄(Ex＝488nm，Em＝525nm)。H2O2诱导氧化损伤PC12细胞中ROS明显增加，而硒肽预处理可以有效降低氧化损伤PC12细胞中过度的ROS(图5)。ROS的过度积累会造成氧化应激，从而导致细胞的氧化损伤。因此，硒肽可以通过清除氧化损伤中过度ROS积累来保护神经元。
实施例5、人工合成硒肽对H2O2诱导氧化损伤PC12细胞中CAT和SOD的影响
本研究采用H2O2诱导氧化损伤PC12细胞模型评估硒肽对氧化损伤细胞中CAT和SOD的影响。将细胞以2.5×105个/皿(每皿10mL培养基)的密度接种于平皿孵育24h，随后添加1μg/mL硒肽(每皿10mL培养基)进行保护12h。再使用80μM的H2O2处理1h诱导氧化损伤(每孔10mL)。其中对照组不添加硒肽和H2O2，损伤组不添加硒肽但添加H2O2。根据试剂盒说明书进行细胞的收集和裂解，最后进行CAT和SOD的测定。
内源酶抗氧化酶系(如CAT和SOD)在维持机体氧化还原平衡状态中具有重要作用。在氧化应激的细胞中，SOD可将O2-转化成为毒性较小的H2O2，而CAT可以进一步将H2O2转化为H2O和O2。因此，CAT和SOD的活力变化被用来评估硒肽对H2O2诱导氧化损伤PC12细胞的保护作用。测定结果如图6所示，与对照组比较可得，PC12细胞经H2O2损伤后CAT和SOD活力明显降低。但是，硒肽预处理后可有效改善H2O2损伤后细胞中CAT和SOD的活力降低。因此，硒肽可以有效提高细胞中抗氧化酶CAT和SOD的活力来保护神经元。
以上所述实施例仅表达了本发明较佳的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.具有神经元保护功能的富硒蛹虫草活性硒肽，其特征在于，氨基酸序列为Val-Pro-Arg-Lys-Leu-(Se)Met或Arg-Tyr-Asn-Ala-(Se)Met-Asn-Asp-Tyr-Thr。
2.权利要求1所述的富硒蛹虫草活性硒肽在制备保护神经元细胞的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的保护神经元细胞的药物是保护神经元细胞免受氧化损伤的药物。
4.一种保护神经元细胞的药物，其特征在于，含有权利要求1所述的富硒蛹虫草活性硒肽作为活性成分。
5.根据权利要求4所述的保护神经元细胞的药物，其特征在于，所述的保护神经元细胞的药物是保护神经元细胞免受氧化损伤的药物。
6.根据权利要求5所述的保护神经元细胞的药物，其特征在于，所述的保护神经元细胞免受氧化损伤，包括清除H2O2诱导的细胞中过量的ROS和提高氧化损伤细胞的抗氧化酶系活力。
7.一种权利要求1所述的富硒蛹虫草活性硒肽的制备方法，其特征在于，是从富硒蛹虫草中制备分离得到的。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将富硒蛹虫草干粉加入含0.1％β-巯基乙醇的5％乙酸溶液，搅拌后经离心过滤，收集滤液，加硫酸铵至75％饱和度，静置沉淀，离心，收集沉淀，沉淀复溶后透析，冷冻干燥获得富硒蛹虫草硒蛋白干粉；
(2)取硒蛋白干粉，加入超纯水混合，使用胃蛋白酶进行酶解，再用胰酶酶解，灭酶，离心，取上清液，获得硒蛋白模拟胃肠消化酶解液；
(3)将酶解液加纯水稀释后通过3kDa分子量超滤膜，收集＜3kDa组分并浓缩；
(4)将＜3kDa组分上样Sephadex G-25葡聚糖凝胶层析柱，用超纯水洗脱，收集组分，浓缩，选择对神经元细胞保护效果好的GF1组分；
(5)将GF1组分上样反相高效液相色谱柱，采用水-乙腈洗脱液进行梯度洗脱，收集组分，浓缩，选择活性最好的硒肽组分通过UPLC-MS/MS检测，获得富硒蛹虫草硒肽。
9.富硒蛹虫草在制备权利要求1所述的富硒蛹虫草活性硒肽中的应用。
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