CN104892730B - 一种带鱼肝脏抗菌肽 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种带鱼肝脏抗菌肽及其制备方法，该抗菌肽的氨基酸序列为Lys‑Val‑Phe‑Trp‑Gly‑Leu‑His‑Pro，ESI‑MS检测分子量为983.15 Da。制备时以带鱼肝脏作为原料，经肝脏粗蛋白抽提、酶解、超滤和色谱制备，得抗菌肽。该抗菌肽对革兰氏阴性菌（G‑）和革兰氏阳性菌（G+）均有抑制作用，具有广谱抑菌性，可应用于抗菌药物和食品。
Description
技术领域
本发明涉及一种鱼类内脏活性多肽，尤其涉及带鱼肝脏抗菌肽。
背景技术
抗菌肽(Antibacterial peptide，ABP)又叫抗微生物肽、多肽抗生素，是指氨基酸数目小于100，具广谱抗性的一类小肽。由于抗菌肽对细菌、真菌、寄生虫等有着广泛的抑制作用，并且随着越来越多的抗生素耐药微生物的出现，使得抗菌肽在医药行业和食品添加剂等领域有这更为良好的应用前景。抗菌肽在广义上是指存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子阳离子多肽。抗菌肽由生物细胞特定基因编码，经特定外界条件诱导产生。目前为止，世界上已知的抗菌肽共有1200多种，而以天然阳离子抗菌肽作模板进行人工合成的模拟肽有数千种。
基于此，申请人以带鱼肝脏为原料，利用现代生物技术制备抗菌肽，既增加了带鱼资源的利用率，减少了肝脏等下脚料对环境的危害，同时也为海洋抗菌药物的开发提供候选药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状提供一种对革兰氏阴性菌(G-)和革兰氏阳性菌(G+)均有抑菌作用的带鱼肝脏抗菌肽。
本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种带鱼肝脏抗菌肽，其特征在于该抗菌肽的氨基酸序列为Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro(KVFWGLHP)，ESI-MS检测分子量为983.15Da。
该带鱼肝脏抗菌肽的制备方法，可以通过以下方法制备：
1)带鱼肝脏酶解物的制备：带鱼肝脏从冰冻带鱼中取出、解冻，用高速组织捣碎机匀浆，然后按照固液比1g：8～10mL加入磷酸盐缓冲液(0.02mol/L，pH 6.5～7.5)混匀，加热至20～30℃，在功率为900W，频率为30～50kHz超声波发生器内超声提取90～120min，按照肝脏质量的0.3～0.5％加入中性蛋白酶(酶活力≥2.0×104U/g)，于温度55～65℃下酶解6～8h，10 000r/min离心25～30min，取上清液采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，冷冻干燥，得超滤酶解物；
2)带鱼肝脏抗菌肽的制备：将制备的带鱼肝脏超滤酶解物依次经大孔树脂除杂、凝胶过滤层析、细胞膜色谱纯化和反相高效液相色谱(RP-HPLC)制备，得到带鱼肝脏抗菌肽。
作为优选，所述步骤1)中的带鱼为带鱼(Trichiurus haumela)。
作为优选，所述步骤2)中的大孔树脂除杂、凝胶过滤层析、细胞膜色谱纯化和反相高效液相色谱(RP-HPLC)制备的具体过程为：
大孔树脂除杂：将得到的超滤酶解物用双蒸水制成浓度为10～15mg/mL溶液，以2～3mL/min的流速加入到D201大孔树脂层析柱，用2～3倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，然后用3～5倍柱体积75％乙醇进行洗脱，洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得大孔树脂制备酶解物。
凝胶过滤层析：将上述大孔树脂制备酶解物溶于三蒸水配成浓度为10～15mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用三蒸水进行洗脱，根据225nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对大肠杆菌(Escherichia coli)和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)抑制率最高组分为凝胶过滤层析酶解物。
细胞膜色谱纯化：将上述凝胶过滤层析酶解物用三蒸水配成80～100μg/mL的溶液，加入到细胞膜色谱柱进行纯化，根据225nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对大肠杆菌(Escherichia coli)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)抑制率最高组分为细胞膜色谱纯化酶解物。
RP-HPLC制备：将上述细胞膜色谱纯化酶解物用双蒸水配成80～100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对大肠杆菌(Escherichia coli)和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的抑制率得1个高活性抗菌肽Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro(KVFWGLHP)。
优选，所述细胞膜色谱条件为：细胞膜为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的细胞膜；进样量为15～20μL；细胞膜色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；柱温为37℃；流动相为三蒸水；紫外检测波长225nm；流速为0.3～0.5mL/min。
优选，所述RP-HPLC条件为：进样量为15～20μL；色谱柱为Zorbax C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为20％乙腈(含0.1％三氟乙酸)；洗脱速度为0.8～1.0mL/min；紫外检测波长为225nm。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明以带鱼肝脏为原料，提高了带鱼资源的利用率，减少了环境污染。
(2)本发明制备的抗菌肽Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro(KVFWGLHP)对革兰氏阴性菌(G-)(大肠杆菌(Escherichia coli)、荧光假单孢菌(Pseudomonasfluorescens)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))和革兰氏阳性菌(G+)(金黄色葡萄球(Staphylococcus aureus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、藤黄八叠球菌(Sarcina lutea))均有较强的抑制作用。
附图说明
图1.是本发明大孔树脂制备酶解物的葡聚糖凝胶G-25层析图；
图2.是本发明的葡聚糖凝胶G-25制备酶解物(Fr.C)的细胞膜色谱图。
图3.是本发明的细胞膜色谱制备酶解物(Fr.C-I)的反相高效液相色谱(RP-HPLC)图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一种带鱼肝脏抗菌肽的制备方法，制备工艺流程如下：带鱼肝脏→蛋白抽提、酶解→超滤→大孔树脂除杂→凝胶过滤层析→细胞膜色谱纯化→高效液相色谱制备→抗菌肽。
实施例：
1)带鱼肝脏酶解物的制备：带鱼(Trichiurus haumela)肝脏从冰冻带鱼中取出、解冻，用高速组织捣碎机匀浆，然后按照固液比1g：10mL加入磷酸盐缓冲液(0.02mol/L，pH7.0)混匀，加热至25℃，在功率为900W，频率为40kHz超声波发生器内超声提取120min，按照肝脏质量的0.5％加入中性蛋白酶(酶活力≥2.0×104U/g)，于温度60℃下酶解8h，10000r/min离心30min，取上清液采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，冷冻干燥，得超滤酶解物；
2)带鱼肝脏抗菌肽的制备：将制备的带鱼肝脏超滤酶解物依次经大孔树脂除杂、凝胶过滤层析、细胞膜色谱纯化和反相高效液相色谱(RP-HPLC)制备，得到带鱼肝脏抗菌肽。
①大孔树脂除杂：将得到的超滤酶解物用双蒸水制成浓度为15mg/mL溶液，以3mL/min的流速加入到D201大孔树脂层析柱，用2倍柱体积的双蒸水洗脱除去杂质，然后用5倍柱体积75％乙醇进行洗脱，洗脱液于50℃以下低压旋蒸除去乙醇后，冷冻干燥得大孔树脂制备酶解物。
②凝胶过滤层析：将上述大孔树脂制备酶解物溶于三蒸水配成浓度为15mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用三蒸水进行洗脱，根据225nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对大肠杆菌(Escherichia coli)和巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)抑制率最高组分为凝胶过滤层析酶解物Fr.C(图1)。
③细胞膜色谱纯化：将上述凝胶过滤层析酶解物用三蒸水配成100μg/mL的溶液，加入到细胞膜色谱柱进行纯化(条件：细胞膜为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的细胞膜；进样量为15μL；细胞膜色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；柱温为37℃；流动相为三蒸水；紫外检测波长225nm；流速为0.3mL/min)，根据225nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对大肠杆菌(Escherichia coli)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)抑制率最高组分为细胞膜色谱纯化酶解物Fr.C-I(图2)。
④RP-HPLC制备：将上述细胞膜色谱纯化酶解物用双蒸水配成100μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化(条件：进样量为20μL；色谱柱为Zorbax C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为20％乙腈(含0.1％三氟乙酸)；洗脱速度为0.8mL/min；紫外检测波长为225nm)，根据对大肠杆菌(Escherichia coli)和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)抑制率得1个高活性抗菌肽(图3)。
⑤结构测定：高活性抗菌肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro(KVFWGLHP)，ESI-MS检测分子量为983.15Da。
⑥抑菌活性测定：如表1所示：抗菌肽Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro(KVFWGLHP)对革兰氏阴性菌(G-)(大肠杆菌(Escherichia coli)、荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和革兰氏阳性菌(G+)(金黄色葡萄球(Staphylococcus aureus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、藤黄八叠球菌(Sarcina lutea))均有较强的抑制作用，具有广谱抑菌性，其中对G-菌抑菌效果总体强于G+菌。
表1抗菌肽Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro(KVFWGLHP)的抑菌谱(n＝3)
| 实验用菌 | 抑菌圈直径(mm) |
| 革兰氏阴性菌(G<sup>-</sup>) | |
| 大肠杆菌(Escherichia coli) | 19.03±0.98 |
| 荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescens) | 17.31±1.06 |
| 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa) | 15.92±1.34 |
| 革兰氏阳性菌(G<sup>+</sup>) | |
| 金黄色葡萄球(Staphylococcus aureus) | 15.25±0.97 |
| 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) | 14.16±1.25 |
| 藤黄八叠球菌(Sarcina lutea) | 15.75±0.9 |
注：灭菌打孔器(直径＝4mm)打孔，每孔加入抗菌液20μL；表中数据为抑菌圈直径平均值±标准差(n＝3)。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋学院
<120> 一种带鱼肝脏抗菌肽
<130> zjou-2015-wb0504
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Lys Val Phe Trp Gly Leu His Pro
1 5
Claims (1)
1.一种带鱼肝脏抗菌肽，其特征在于该带鱼肝脏抗菌肽的氨基酸序列为Lys-Val-Phe-Trp-Gly-Leu-His-Pro，ESI-MS检测分子量为983.15 Da。
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