CN107325158B - 抗菌肽cnap-ⅰ、抗菌肽cnap-ⅱ及其制备方法和应用 - Google Patents
抗菌肽cnap-ⅰ、抗菌肽cnap-ⅱ及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及抗菌肽CNAP‑Ⅰ、抗菌肽CNAP‑Ⅱ及其制备方法和应用，属于生物技术领域。抗菌肽CNAP‑Ⅰ的氨基酸序列为QLASREPDGTFFFYI，抗菌肽CNAP‑Ⅱ的氨基酸序列QLASREPDGT。其制备方法为：取新鲜的梅鱼鱼肉，利用B.cereus蛋白酶水解梅鱼蛋白，制取梅鱼蛋白酶解液，经分离纯化后，得到抗菌肽CNAP‑Ⅰ和CNAP‑Ⅱ，B.cereus蛋白酶可先经弱磁场处理。制得的抗菌肽CNAP‑Ⅰ、抗菌肽CNAP‑Ⅱ用作抑菌剂，在食品抗菌防腐领域具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及抗菌肽，尤其涉及抗菌肽CNAP-Ⅰ、抗菌肽CNAP-Ⅱ及其制备方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术
近年来，食源性疾病的发生率居高不下，全球每年发生40-60亿食源性腹泻病例，其中70％是由各类致病微生物污染食品或饮水所致。因为，畜禽、水产养殖过程中抗生素的广泛使用，致使许多病原菌对其产生了耐药性，且容易在动物体内残留，严重影响产品品质。因此，寻找无毒、无公害、高效的食品抑菌方法已成为食品保鲜和畜禽、水产养殖领域的当务之急。
抗菌肽以其优良的抗菌性在抗菌保鲜领域得到广泛应用。目前，抗菌肽的制备方法主要有直接提取法、化学合成法、基因工程表达法、酶解法。其中，酶解法具有反应条件温和、反应过程容易控制、易于得到新型抗菌肽等优点，已成为大批量生产抗菌肽有前景的方法。然而，迄今已获得规模化制备的抗菌肽的活性普遍偏低，而菌肽改性和修饰技术成本较昂贵，仅在医药领域具有较高的应用前景，仍难以达到食品防腐和水产、畜禽养殖领域的抗菌防腐要求(低成本、高活性)。因此，开发新型高活性抗菌肽已成为食品加工与安全领域的重中之重。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种抗菌肽CNAP-Ⅰ，所述抗菌肽CNAP-Ⅰ的氨基酸序列为QLASREPDGTFFFYI。该富含苯丙氨酸(Phe)残基的抗菌肽CNAP-Ⅰ对大肠杆菌等有显著的抑制作用，抑菌圈直径达20.5±0.4mm，显示了极高的抗菌活性，在食品抗菌防腐领域具有很好的应用前景。
本发明还提供了抗菌肽CNAP-Ⅱ，所述抗菌肽CNAP-Ⅱ的氨基酸序列为QLASREPDGT。抗菌肽CNAP-Ⅱ是由抗菌肽CNAP-Ⅰ进一步酶解以Phe为-NH-供体的肽键获得的，抗菌肽CNAP-Ⅱ不含苯丙氨酸(Phe)残基。
本发明还提供了抗菌肽CNAP-Ⅰ和CNAP-Ⅱ的制备方法，所述制备方法为：取新鲜的梅鱼鱼肉，利用B.cereus蛋白酶(即蜡状芽孢杆菌)水解梅鱼蛋白，制取梅鱼蛋白酶解液，经分离纯化后，得到抗菌肽CNAP-Ⅰ和CNAP-Ⅱ。优质的前体物质是开发高活性抗菌肽的基础。近年来，海洋生物源抗菌肽因其优越的营养功能和广泛的生物学活性，被认为是优质的抗菌肽类型之一。本发明以梅鱼为原料，作为抗菌肽的前体物质，梅鱼分布广、价格便宜，符合食品领域抗菌肽的原料要求。
在上述的抗菌肽CNAP-Ⅰ和CNAP-Ⅱ的制备方法中，所述B.cereus蛋白酶经弱磁场处理。
在上述的抗菌肽CNAP-Ⅰ和CNAP-Ⅱ的制备方法中，所述弱磁场的磁场强度为5-15mT。
本发明利用B.cereus蛋白酶水解梅鱼蛋白可获得具有抗菌活性的酶解产物，经进一步分离纯化和结构解析后，得到富含Phe残基的抗菌肽CNAP-Ⅰ，然而，酶解粗提液中抗菌肽CNAP-Ⅰ的含量很低，抗菌肽CNAP-Ⅱ较多。因为，B.cereus蛋白酶具有一定的专一性，但是该酶对多种类型的肽键都可以水解，导致蛋白酶水解反应没有针对性而使目标产物产率低下。抗菌肽CNAP-Ⅰ的生成与产量很大程度上取决于B.cereus蛋白酶的底物专一性。然而通过对抗菌肽CNAP-Ⅱ(由CNAP-Ⅰ进一步酶解脱除Phe而获得)的分析，发现B.cereus蛋白酶较易水解以Phe为-NH-供体的肽键，这使得抗菌肽CNAP-Ⅰ在反应体系中不甚稳定，极易变成抗菌肽CNAP-Ⅱ，但抗菌肽CNAP-Ⅱ抗菌活性较低，致使抗菌肽CNAP-Ⅰ的产率与抗菌活性显著降低。而且，通过控制酶解条件(如pH、温度、反应时间等)入手控制CNAP-Ⅱ的生成，均无法获得理想的结果，成为限制抗菌肽CNAP-Ⅰ规模化应用的瓶颈问题。
近年来，生物磁学的研究和应用发展极为迅速，磁场改变酶活性的研究也日益成为人们关注的焦点。本发明抗菌肽CNAP-Ⅰ和CNAP-Ⅱ的制备方法中，B.cereus蛋白酶是依赖于顺磁性金属离子Zn2+的金属蛋白酶，并且该酶的特性会受弱磁场影响。因此，本发明利用5-15mT弱磁场处理B.cereus蛋白酶后，再将其用于水解梅鱼蛋白，获得的酶解液抗菌活性高于B.cereus蛋白酶不经磁场处理直接水解梅鱼蛋白得到的酶解液抗菌活性，通过液质联用分析发现抗菌肽CNAP-Ⅰ的含量显著提高，而副产物抗菌肽CNAP-Ⅱ的含量明显降低，提高了目标抗菌肽CNAP-Ⅰ得率。
本发明构建的弱磁场-蛋白酶体系中，磁场处理后的B.cereus蛋白酶不仅能抑制B.cereus蛋白酶对Phe肽键的水解，同时对产抗菌肽CNAP-Ⅰ的主要酶解过程不产生严重影响。利用磁场处理B.cereus蛋白酶，对B.cereus蛋白酶酶解过程具有选择性抑制作用，控制副产物抗菌肽CNAP-Ⅱ产生以提高抗菌肽CNAP-Ⅰ得率与表观抗菌活性，为其它抗菌肽的制备提供了极富价值的研究思路。在此基础上，利用弱磁场作用，对蛋白酶Phe肽键水解活性的选择性抑制作用，减少副产物生成，提高抗菌肽CNAP-Ⅰ的得率，为海洋生物源高效抗菌肽的大规模、低成本生产奠定基础。
本发明还提供了抗菌肽CNAP-Ⅰ的应用，所述抗菌肽CNAP-Ⅰ用作抑菌剂。
本发明还提供了抗菌肽CNAP-Ⅱ的应用，所述抗菌肽CNAP-Ⅱ用作抑菌剂。
附图说明
图1为实施例1和实施例2的酶解液中的抗菌肽CNAP-Ⅰ和抗菌肽CNAP-Ⅱ的含量变化图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，并结合附图说明对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1：
取新鲜的梅鱼鱼肉，将梅鱼鱼肉打成肉泥，增加梅鱼鱼肉与B.cereus蛋白酶的接触面积，从而提高B.cereus蛋白酶和梅鱼鱼肉的反应效率。按25000U/100g鱼糜液的用量加入B.cereus蛋白酶，在pH为6.0、温度为40℃的条件下酶解4h，制取梅鱼蛋白酶解液。再将梅鱼蛋白酶解液离心后，取上清液进行分离纯化，包括超滤，Sephadex G-25凝胶过滤层析和RP-HPLC，收集经RP-HPLC分离纯化后的抗菌肽CNAP-Ⅰ和抗菌肽CNAP-Ⅱ，抗菌肽CNAP-Ⅰ的相对含量占4％，抗菌肽CNAP-Ⅱ的相对含量占80％，两者含量相差较大。分别对其进行结构解析与氨基酸测序：抗菌肽CNAP-Ⅰ的氨基酸序列为QLASREPDGTFFFYI；抗菌肽CNAP-Ⅱ的氨基酸序列QLASREPDGT。
然后，测定两者的抑菌活性，以对大肠杆菌的抑菌圈直径表示，测试结果见表1。
表1：抗菌肽CNAP-Ⅰ和抗菌肽CNAP-Ⅱ抑菌活性比较
| 抗菌肽 | CNAP-Ⅰ | CNAP-Ⅱ |
| 抑菌圈直径(mm) | 20.5±0.4 | 4.6±0.3 |
从表1可知，抗菌肽CNAP-Ⅰ的抑菌效果远优于抗菌肽CNAP-Ⅱ。对抗菌肽CNAP-Ⅰ和抗菌肽CNAP-Ⅱ进行氨基酸含量分析发现，两者氨基酸组成很相似，但是抗菌肽CNAP-Ⅰ含有Phe残基，而抗菌肽CNAP-Ⅱ的结构中不含此残基。
实施例2：
磁场由一组直径40cm的亥姆霍兹线圈产生，线圈上缠绕铜线150圈，线圈之间相隔20cm，在线圈中轴线附近可产生均匀的、方向垂直的磁场。在中轴线附近，利用10mT磁场处理B.cereus蛋白酶1h。
取新鲜的梅鱼鱼肉，将梅鱼鱼肉打成肉泥，增加梅鱼鱼肉与B.cereus蛋白酶的接触面积，从而提高B.cereus蛋白酶和梅鱼鱼肉的反应效率。按25000U/100g鱼糜液的用量加入上述经磁场处理后的B.cereus蛋白酶，在pH为6.0、温度为40℃的条件下酶解4h，制取梅鱼蛋白酶解液。再将梅鱼蛋白酶解液离心后，取上清液进行分离纯化，包括超滤，SephadexG-25凝胶过滤层析和RP-HPLC，收集经RP-HPLC分离纯化后的抗菌肽CNAP-Ⅰ和抗菌肽CNAP-Ⅱ。分别对其进行结构解析与氨基酸测序：抗菌肽CNAP-Ⅰ的氨基酸序列为QLASREPDGTFFFYI；抗菌肽CNAP-Ⅱ的氨基酸序列QLASREPDGT。
表2为实施例1和实施例2梅鱼蛋白酶解液的抗菌活性(抑菌圈法)。
表2：
从表2可知，利用10mT磁场处理B.cereus蛋白酶后再水解梅鱼蛋白，获得的酶解抗菌液抗菌活性高于未经磁场处理的B.cereus蛋白酶酶解抗菌液抗菌活性，单位浓度酶解液对各种选择的指示菌的抑菌率都得到提高(以抑菌圈为指标)。
图1为实施例1和实施例2的酶解液中的抗菌肽CNAP-Ⅰ和抗菌肽CNAP-Ⅱ的含量变化图。从图1可知，未经磁场处理的B.cereus蛋白酶水解梅鱼蛋白获得的抗菌肽CNAP-Ⅰ的含量仅为0.18％(w/w)，抗菌肽CNAP-Ⅱ的含量为3.57％(w/w)；而经磁场处理后的B.cereus蛋白酶水解梅鱼蛋白获得的抗菌肽CNAP-Ⅰ的含量提高至0.97％(w/w)，抗菌肽CNAP-Ⅱ的含量为2.55％。
表2和图1说明，利用弱磁场作用，对蛋白酶Phe肽键水解活性的选择性抑制作用，可以控制副产物抗菌肽CNAP-Ⅱ产生，从而提高抗菌肽CNAP-Ⅰ得率以及表观抗菌活性。
在上述实施例及其替换方案中，弱磁场的磁场强度还可以为5mT、6mT、7mT、8mT、9mT、11mT、12mT、13mT、14mT、15mT以及5-15mT中的任意磁场强度。
鉴于本发明方案实施例众多，各实施例实验数据庞大众多，不适合于此处逐一列举说明，但是各实施例所需要验证的内容和得到的最终结论均接近，。故而此处不对各个实施例的验证内容进行逐一说明，仅以实施例1-2作为代表说明本发明申请优异之处。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
Claims (2)
1.抗菌肽CNAP-Ⅰ，其特征在于，所述抗菌肽CNAP-Ⅰ的氨基酸序列为QLASREPDGTFFFYI。
2.抗菌肽CNAP-Ⅱ，其特征在于，所述抗菌肽CNAP-Ⅱ的氨基酸序列为QLASREPDGT。
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