CN114164145B - 一种波茨坦短芽孢杆菌、中性蛋白分解酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种波茨坦短芽孢杆菌、中性蛋白分解酶及其应用；具体为本发明燕窝原料中筛选出一株产中性蛋白酶的波茨坦短芽孢杆菌，命名为波茨坦短芽孢杆菌Fjfst‑20210713，已于2021年7月19日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M2021906，并特别提出了一种利用此菌株制备燕窝中性蛋白分解酶的方法，以满足此类实际应用需求。该菌株可在60℃温度条件下高效生产中性蛋白酶，酶活力可达60.3U/mL；同时在60℃水解条件下，将该分解酶用于燕窝蛋白降解，底物浓度为3％，酶加量为5％，酶解时间为3.5h，即可得到富有经济价值的燕窝肽，且高温短时酶解不易引起燕窝微生物污染，产品的相对分子质量分布较窄，容易控制。

Description

一种波茨坦短芽孢杆菌、中性蛋白分解酶及其应用

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，涉及一种波茨坦短芽孢杆菌、中性蛋白分解酶及其应用。

背景技术

燕窝是指雨燕科几种金丝燕分泌出来的唾液，再混合苔鲜、海藻和柔软植物筑成的巢穴，又称燕菜、燕根、燕蔬菜，自明代以来就是我国名贵的滋补食品之一。燕窝富含蛋白质、氨基酸，且其富含的唾液酸具有很高的营养价值和保健功效，如：抗病毒活性作用、免疫调节作用等。但传统燕窝炖制麻烦，温度控制不好容易造成营养成分流失，而燕窝多肽，开盖即食，配方复配，功效更好。且一般未处理的燕窝水溶性差，沉淀物多，而制备的燕窝肽水溶性佳，容易用于配方食品。

燕窝肽是指从燕窝中分解降解所得的小分子蛋白，是一种氨基酸形成的链状结构。燕窝肽是燕窝蛋白经过生物酶切割技术，切割成500道尔顿的小分子肽，以小分子肽的形式更加容易被人体吸收，吸收率高达99％。同时，燕窝肽是由燕窝制备而来，保留了燕窝酸的成分，燕窝酸含量高达3.04％，是人体生长发育、智力发展必不可少的物质。此外，皱纹及细小皱纹的产生与胶原蛋白的自然流失有关，补充燕窝肽后可直接渗透到皮肤真皮层，重整肌肤纤维组织机构，促进细胞新陈代谢，延缓细胞衰老，使细小皱纹得到舒缓。目前在国内外，燕窝肽产品已作为商品出售，占有可观的市场份额并展现很大的市场潜力，目前市场对燕窝肽的需求越来越大，对产品质量要求也很高。

中性蛋白酶一般是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。在一定温度(最适温度：45℃-50℃)、pH值(稳定pH：5.5-8.5)下，中性蛋白酶能将大分子蛋白质水解为氨基酸等产物，可用于动植物蛋白的水解。由于中性蛋白酶能够将动、植物的大分子蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，以利于蛋白质的有效吸收和利用，其水解液AN％高，水解度高，风味佳，主要用于各种动物来源性抽提物生产蛋白胨、肽等。

目前利用酶法生产燕窝肽，是可以获得高质量、相对分子量范围较窄燕窝肽产品的一种有效生产技术。但市售的中性蛋白酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、花果蛋白酶等，在燕窝酶解过程中由于其酶作用的位点特异性不够，且最适酶解温度在45℃左右，导致酶解时间较长，一般为4-6小时，而燕窝富含蛋白质等营养物质，适温下(45℃左右)酶解时间过长，就容易引起微生物污染。因此，找到一种高效低成本的燕窝肽生产用酶是制约燕窝肽生产的瓶颈。但目前尚未见到利用燕窝原料中微生物发酵法生产燕窝蛋白分解用酶，从而进行燕窝肽生产的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种波茨坦短芽孢杆菌、中性蛋白分解酶及其应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

一种波茨坦短芽孢杆菌，所述波茨坦短芽孢杆筛选自燕条和燕碎中的细菌，命名为波茨坦短芽孢杆菌Fjfst-20210713(Brevibacillus borstelensisFjfst-20210713)，已于2021年7月19 日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M2021906。保藏地址为武汉大学。波茨坦短芽孢杆菌基因核酸序列如SEQ ID No.1所示；其用于制备燕窝蛋白分解酶。

进一步的，所述波茨坦短芽孢杆菌的筛分方法如下：

取燕条和燕碎，消毒之后，放入液体培养基中，在45℃下，200rpm培养48h；

将0.1mL菌落接种入琼脂筛选培养基中进行划线分离纯化，纯种接到发酵培养基25℃， 120rpm，摇瓶培养24-72h；

检测培养基中的燕窝蛋白分解酶活力，最终筛选出目标菌株波茨坦短芽孢杆菌。

对目标菌株波茨坦短芽孢杆菌进行生理生化特性鉴定和分子生物学实验指南进行16s rRNA序列分析，可确定其属于芽孢杆菌，拟命名为波茨坦短芽孢杆菌Fjfst-20210713。

波茨坦短芽孢杆菌Fjfst-20210713为革兰氏阳性菌，菌体的形态特征为短杆状，细胞大小为(0.2μm-0.5μm)×(1μm-6μm)，有明显的凹陷，周生鞭毛，中生芽孢；菌落呈圆形，颜色为乳白色，表面光滑，不透明，不凸起。

波茨坦短芽孢杆菌Fjfst-20210713的最适生长温度为45℃-60℃，最适合生长环境的pH 值为6.5-7.0。

波茨坦短芽孢杆菌Fjfst-20210713通过16S rRNA基因序列比对分析，与波茨坦短芽孢杆菌的16S rRNA基因序列的相似性为同源性97.67％，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定，确定为波茨坦短芽孢杆菌Fjfst-20210713。

本发明还提供了一种中性蛋白分解酶的制备方法，包括如下步骤：

1)液体培养基灭菌、冷却后接种芽孢杆菌落，所述芽孢杆菌的基因核酸序列如SEQID No.1所示，接种后于45℃，200rpm摇床培养24h后得到种子发酵液；

2)发酵培养基灭菌、冷却后，按2％-10％的接种量将种子发酵液接入发酵培养基中，接着在60℃培养24h后得到含中性蛋白酶的发酵液；

3)将含燕窝蛋白分解酶的发酵液经过4℃，8000g冷冻离心15min后取上清液；

4)将上清液加入质量分数为60％的饱和硫酸铵溶液中进行盐析，放置冰箱过夜后，4℃、 8000g离心35min取沉淀；

5)沉淀置于0.1mol/L PBS缓冲液中溶解，而后置于透析袋中透析；

6)取透析后的透析液，用0.1mol/LPBS缓冲液对Q-Sepharose Fast Flow冲过2-3床体积后，取5ml透析液上样，上样平衡后，用2-3床0.01-0.1mol/L PBS缓冲液洗去杂质，然后用含2mol/L的NaCl的0.1mol/L PBS缓冲液进行梯度洗脱，收集有活性的中性蛋白酶，将有活性的中性蛋白酶合并，充分透析脱盐，进行冷冻干燥，得粗酶粉；

7)取粗酶粉0.1g，溶于5ml的0.01-0.1mol/L PBS缓冲液中，待使用0.01-0.1mol/LPBS 缓冲液对Sephacryl S-100凝胶柱冲过4-5床体积之后取5ml样液上柱，并用0.01-0.1mol/L PBS缓冲液洗脱，将液体合并进行冷冻干燥，即成中性蛋白酶。

进一步的，步骤6)中收集的中性蛋白酶酶活力达60.3U/mL。

上述制备的中性蛋白酶酶可用于燕窝蛋白降解制备燕窝肽。

中性蛋白分解酶用于燕窝蛋白降解制备燕窝肽，具体步骤如下：

将燕窝粉末用去离子水浸泡，然后通过超声，破壁得燕窝混合液，调节燕窝混合液的pH 值为5.5-8.5；加入中性蛋白酶在恒温加热及间歇式搅拌的条件下酶解；

酶解结束后在沸水浴中灭活6-8min，将酶解液通过分离设备进行分离得清液，将清液浓缩干燥，得到燕窝小分子肽。

本发明从燕窝原料中筛选出一株产中性蛋白酶的波茨坦短芽孢杆菌，命名为波茨坦短芽孢杆菌Fjfst-20210713(Brevibacillus borstelensis Fjfst-20210713)，已于2021年7月19日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M 2021906。该菌株可在60℃温度条件下高效生产中性蛋白酶，酶活力可达60.3U/mL。同时在60℃水解条件下，将该分解酶用于燕窝蛋白降解，底物浓度为3％，酶加量为5％，酶解时间为3.5h，即可得到富有经济价值的燕窝肽，且高温短时酶解不易引起燕窝微生物污染，产品的相对分子质量分布较窄，容易控制。

本发明具备如下有益效果：

1)相比从枯草芽孢杆菌经发酵提取中性蛋白酶，该法可从燕窝生产中副产物(燕碎等) 中通过微生物发酵法生产燕窝蛋白分解用酶，可有效节省生产成本。

2)Fjfst-20210713菌株可在60℃温度条件下高效生产中性蛋白酶，酶活力可达60.3U/mL；在60℃水解条件下，将该分解酶用于燕窝蛋白降解，底物浓度为3％，酶加量为5％，酶解时间为3.5h，即可得到富有经济价值的燕窝肽。

3)相比于常用的中性蛋白酶，该分解酶水解温度高且水解时间大幅度缩短，不易引起燕窝生产中微生物污染。产品的相对分子质量分布较窄，容易控制。

附图说明

图1为波茨坦短芽孢杆菌Fjfst-20210713菌落观察图。

具体实施方法

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法及装置，如无特殊说明，均为常规方法及装置。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购得。以下实施例中对突变体突变位点的确定，均由常规测序公司测序确定。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

波茨坦短芽孢杆筛选自燕条和燕碎中的细菌，用于制备燕窝蛋白分解酶，命名为波茨坦短芽孢杆菌Fjfst-20210713(Brevibacillus borstelensis Fjfst-20210713)，已于2021年7月19 日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M2021906。保藏地址为武汉大学。波茨坦短芽孢杆菌基因核酸序列如SEQ ID No.1所示。

实施例1：

将波茨坦短芽孢杆菌Fjfst-20210713在种子培养基中，用250mL锥形瓶装30mL种子培养基，按常规方法灭菌，冷却，并接种菌落，接种后于55℃，摇床培养24h后得到种子发酵液，所述种子培养基为：海水晶25g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，琼脂2g/L，调节pH为7.4，去离子水配制。用250mL锥形瓶装30mL发酵培养基，按常规方法灭菌，冷却，并按4％的接种量，将种子发酵液接入发酵培养基，接种后于55℃，摇床培养培养48h 后得到含中性蛋白酶的发酵液，所述发酵培养基为：海水晶25g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，琼脂2g/L，调节pH为7.4，去离子水配制。该实施例所得的中性蛋白酶的活力为57.1U/mL。

实施例2：

本实施方式波茨坦短芽孢杆菌Fjfst-20210713以4％的接种量接种于牛肉膏蛋白胨发酵培养基中，在220r/min的不同温度条件下培养72h，之后在10000r/min、4℃条件下冷冻离心 30min，收集上清液采用Folin-酚显色法测定粗酶液的中性蛋白酶活性。不同温度条件下发酵培养液中中性蛋白酶的酶活如表1所示。

表1同温度条件下发酵培养液中中性蛋白酶的酶活

发酵温度℃	酶活U/mL
		45	48.5
50	50.6
		55	57.1
60	60.3

从上表可以看出，本发明制得的中性蛋白酶的酶活可达60.3U/mL。

以上所述仅为本发明的部分实施例，并非因此限制本发明的保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效装置或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

<110> 福建农林大学

<120> 一种波茨坦短芽孢杆菌、中性蛋白分解酶及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 1498

<212> DNA

<213> 波茨坦短芽孢杆菌（Brevibacillus borstelesis）

<400> 1

ggttaccttg ttacgacttc accccagtca tctaccccac cttcggcggc tggctccttg 60

cggttacctc accgacttcg ggtgttgcaa actcccgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca 120

aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga ttccgacttc 180

atgcaggcga gttgcagcct gcaatccgaa ctgagactgg ttttaagaga ttggcatact 240

ctcgcgagct agcttcccgt tgtaccagcc attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa 300

ggggcatgat gatttgacgt catccccgcc ttcctccgtc ttgtcgacgg cagtctctct 360

agagtgccca actgaatgct ggcaactaaa gataagggtt gcgctcgttg cgggacttaa 420

cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtcacc gctgccccga 480

agggaagccc tatctctagg acggtcagcg ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg 540

ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag 600

tttcactctt gcgagcgtac tccccaggcg gagtgcttat tgcgttagct gcggcactga 660

gggtattgaa accccccaac acctagcact catcgtttac ggcgtggact accagggtat 720

ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgcg cctcagcgtc agttacagac cagaaagccg 780

ccttcgccac tggtgttcct cccacatctc tacgcatttc accgctacac gtggaatacc 840

gctttcctct tctgcactca agctacacag tttccgatgc gaaccggggt tgagccccgg 900

gctttaacac cagacttaca tagccgcctg cgcgcgcttt acgcccaata attccggaca 960

acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg gctttctcgt 1020

caggtaccgt caaggtaccg ccctgttcga acggtacttg ttcgtctctg acaacagaac 1080

tttacaatcc gaagaccttc atcgttcacg cggcgttgct ccatcagact ttcgtccatt 1140

gtggaaaatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt 1200

ggccggtcac cctctcaggt cggctacgca tcgtcgcctt ggtaggccgt taccccacca 1260

actagctaat gcgccgcagg cccatccgta agtggtagct tgcgccacct ttccgtctcc 1320

tctcatgcga gagaagaccc tatccggtat tagcatgagt ttccccatgt tatcccgagc 1380

ttacgggcag gttgcctacg tgttactcac ccgtccgccg ctagcccccg aagggactcg 1440

ctcgacttgc atgtattagg caacgccgcc agcgttcgtc ctgagccagg atcaaact 1498

Claims (4)

1.一种波茨坦短芽孢杆菌（Brevibacillus borstelensis），被命名为Fjfst-20210713，其保藏编号为CCTCC NO：2021906。

2.一种中性蛋白分解酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）液体培养基灭菌、冷却后接种权利要求1中的波茨坦短芽孢杆菌落，接种后于45℃，200 rpm 摇床培养24 h 后得到种子发酵液；

2）发酵培养基灭菌、冷却后，按2%-10%的接种量将种子发酵液接入发酵培养基中，接着在60℃培养24 h 后得到含中性蛋白分解酶的发酵液；

3）将含中性蛋白分解酶的发酵液经过4℃，8000 g冷冻离心15 min后取上清液；

4）将上清液加入质量分数为60% 的饱和硫酸铵溶液中进行盐析，放置冰箱过夜后，4℃、8000 g 离心35 min 取沉淀；

5）沉淀置于0.1 mol/L PBS 缓冲液中溶解，而后置于透析袋中透析；

6）用0.1 mol/L PBS缓冲液对Q-Sepharose Fast Flow 冲过2-3 床体积后，取5 ml 透析液上样，上样平衡后，用2-3 床0.01-0.1 mol/L PBS 缓冲液洗去杂质，然后用含2 mol/L的NaCl 的0.1 mol/L PBS 缓冲液进行梯度洗脱，收集有活性的中性蛋白分解酶，将有活性的中性蛋白分解酶合并，充分透析脱盐，进行冷冻干燥，得粗酶粉；

7）取粗酶粉0.1 g，溶于5 ml的0.01-0.1 mol/L PBS 缓冲液中，待使用0.01-0.1 mol/L PBS 缓冲液对Sephacryl S-100 凝胶柱冲过4-5 床体积之后取5 ml样液上柱，并用0.01-0.1 mol/L PBS 缓冲液洗脱，将液体合并进行冷冻干燥，即成中性蛋白分解酶。

3.一种如权利要求2制备方法制得的中性蛋白分解酶的应用，其特征在于，所述中性蛋白分解酶用于燕窝蛋白降解制备燕窝肽。

4.根据权利要求3所述的中性蛋白分解酶的应用，其特征在于，所述中性蛋白分解酶用于燕窝蛋白降解制备燕窝肽，具体步骤如下：

将燕窝粉末用去离子水浸泡，然后通过超声，破壁得燕窝混合液，调节燕窝混合液的pH值为5.5-8.5；加入中性蛋白酶在恒温加热及间歇式搅拌的条件下酶解；

酶解结束后在沸水浴中灭活6-8min，将酶解液通过分离设备进行分离得清液，将清液浓缩干燥，得到燕窝小分子肽。

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