CN107974421A - 一种嗜酸乳杆菌及其筛选方法和应用、一种菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域,具体涉及一种嗜酸乳杆菌及其筛选方法和应用、一种菌剂。该嗜酸乳杆菌保藏编号为CGMCC NO.14437,具有强的硫甙降解功能,能够单独的作用发酵用菌剂应用于菜籽粕的脱毒处理,应用于菜籽粕发酵过程中能够促进产生多肽和乳酸,具有强的产酸和抑有害菌的能力,作为肉鸡饲料添加剂,能够促进动物对营养物质的消化吸收、抑制动物胃肠道病原菌繁殖、促进肠道微生物平衡。本发明嗜酸乳杆菌为兼性厌氧型微生物,环境适用性强,生长速度快,能耐受高浓度的硫甙、安全性高。

Description

一种嗜酸乳杆菌及其筛选方法和应用、一种菌剂
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,具体涉及一种嗜酸乳杆菌及其筛选方法和应用、一种菌剂。
背景技术
菜籽粕是油菜籽在榨油过程中产生的具有菜籽油香味的一种副产物,是我国重要的动物蛋白饲料资源。其粗蛋白含量在35%~45%之间,氨基酸含量丰富且组成合理,是一种质优价廉的饲料蛋白原料资源。但菜籽粕中含有包括硫甙、单宁、植酸等一系列的抗营养因子,且蛋白质分子质量大,纤维素含量高,限制了其在动物饲粮中的添加比例。随着我国畜牧养殖业的快速发展,常规饲料原料,尤其是蛋白原料供应紧缺,传统型的玉米-豆粕型动物饲粮结构正在发生变化,引入各种杂粕的多元化饲粮配方将会成为我国畜牧养殖业的新常态。通过微生物发酵对菜籽粕进行脱毒处理是解决当前饲料蛋白原料短缺的有效途径,对我国畜牧养殖业的健康发展有着积极的意义。
研究表明,硫甙是菜籽粕中的主要抗营养因子,动物饲粮中硫甙含量高于动物可承受能力范围会造成肉鸡甲状腺肿大、采食量下降、蛋鸡破蛋率增加、、奶牛体脂变软、产奶量下降等危害,而传统的菜籽粕脱毒措施大都采用遗传育种法、物理法、化学法,这些方法虽然能在一定程度上降低菜籽粕中硫甙的含量,但同时会对破坏菜籽粕本身营养成分,尤其是化学法造成的化学试剂残留对菜籽粕造成二次污染。采用微生物发酵法则能够克服上述方法中的诸多缺陷,不但能够高效的祛除菜籽粕中的抗营养因子硫甙,同时还可改善菜籽粕的营养价值和风味,在菜籽粕品质改良方面具有较高的应用价值。
现有技术中虽然实现了通过加入微生物菌剂的方式实现菜籽粕的脱毒,但是现有的微生物菌剂的脱毒效果不能满足实际的需求,通常需要多种微生物菌种结合使用,甚至需要在发酵培养基中加入脱毒增效剂才能满足菜籽粕的脱毒需求。因此需要针对现有的微生物菌种进行改进和创新,提升对菜籽粕的脱毒效果和营养价值、风味的提升。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷,本发明的目的之一是提供一种嗜酸乳杆菌,能够单独作为微生物菌剂发酵菜籽粕,显著降解菜籽粕中的硫甙和大分子蛋白,产生多肽,提升菜籽粕中的总酸含量。
本发明的目的之二在于提供一种菌剂。
本发明的目的之三在于提供一种嗜酸乳杆菌的筛选方法。
本发明的目的之四在于提供一种嗜酸乳杆菌的应用。
为了实现以上目的,本发明采用如下技术方案:
一种嗜酸乳杆菌,已于2017年07月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),保藏登记号为CGMCC NO.14437。
一种菌剂,包含上述嗜酸乳杆菌的培养物。其中嗜酸乳杆菌培养物包括培养嗜酸乳杆菌的培养基和代谢产物。
一种菌剂,包含上述嗜酸乳杆菌的菌悬液。该菌悬液为采用无菌生理水重悬嗜酸乳杆菌,菌悬液的菌浓度通常为8.0×108cfu/mL~9.0×108cfu/mL
上述嗜酸乳杆菌的筛选方法,包括以下操作步骤:1)菌的分离:取发酵玉米青贮,加入无菌水,振荡摇匀后,静置,取上清接种于含有菜籽粕的固体发酵培养基中,静置培养后,静置取上清液作为菌株原液;
2)初筛:
取步骤1)制备的菌株原液稀释不同的倍数涂布在MRS+硫甙固体筛选培养基上,静置培养后,挑去数量多、生长快、菌落大的菌株进行划线、分离、纯化;然后将分离纯化后的菌株按照5%的接种量接种在MRS+硫甙液体复筛培养基上,静置培养后,选取硫甙降解率最高的五株菌株再次划线、分离、纯化保存;
3)复筛:
将步骤2)分离纯化的五株菌株按照10%的接种量,1:1的料水比,接种于含有菜籽粕的固体发酵培养基中,静置培养后,选取五株菌株中硫甙降解效果最好的一株菌,即为所述的嗜酸乳杆菌。
可选的,所述含有菜籽粕的固体发酵培养基重量份组成为:菜籽粕50份,无菌水50份;
所述MRS+硫甙固体筛选培养基的各组分质量浓度组成为:蛋白胨10g,酵母膏5 g,牛肉膏10 g,硫甙5 g,磷酸氢二钾 2 g,乙酸钠5 g,柠檬酸三铵2 g,硫酸镁 0.1 g,硫酸锰0.05 g,吐温-80 1 g,琼脂20 g,溶于1L蒸馏水中;
所述MRS+硫甙液体复筛培养基的各组分质量浓度组成为:蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,牛肉膏10 g/L,硫甙5 g/L,磷酸氢二钾 2 g/L,乙酸钠5 g/L,柠檬酸三铵2 g/L,硫酸镁0.1 g/L,硫酸锰 0.05 g/L,吐温-80 1 g/L。
可选的,所述静置培养为36~38℃恒温静置培养44~48h;
步骤1)中振荡摇匀为在36~38℃温度下,150~250r/min的摇床充分震荡15~20min。
上述嗜酸乳杆菌在降解菜籽粕硫甙、提升菜籽粕多肽和总酸含量、或降解菜籽粕大分子蛋白方面的应用。
可选的,上述应用的具体方法为,将嗜酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌的培养物或嗜酸乳杆菌的菌悬液作为菜籽粕饲料的添加剂或菜籽粕饲料发酵用菌剂。
可选的,上述应用的具体方法为,将嗜酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌的培养物或嗜酸乳杆菌的菌悬液与菜籽粕混合发酵。通常发酵温度为33~37℃,发酵pH=3.0~7.0,通常可以采用葡萄糖作为嗜酸乳杆菌生长所需的碳源。
上述嗜酸乳杆菌在制备饲料添加剂方面的应用,具体为将嗜酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌的培养物或嗜酸乳杆菌的菌悬液作为饲料添加剂。
本发明嗜酸乳杆菌的功能包括降解硫甙、降解菜籽粕大分子蛋白、产多肽、产酸。
本发明嗜酸乳杆菌具有强的硫甙降解作用,能够单独的作用发酵用菌剂应用于菜籽粕的脱毒处理,应用于菜籽粕发酵过程中能够促进产生多肽和乳酸,具有强的产酸和抑有害菌能力,作为肉鸡饲料添加剂,能够促进动物对营养物质的消化吸收、抑制动物胃肠道病原菌繁殖、促进肠道微生物平衡。
本发明嗜酸乳杆菌为兼性厌氧型微生物,环境适用性强,生长速度快,能耐受高浓度的硫甙、安全性高。
附图说明
图1为实施例1筛选的嗜酸乳杆菌的菌落图片;
图2为实施例1筛选的嗜酸乳杆菌的显微镜图片;
图3为实施例1筛选的嗜酸乳杆菌的生长曲线;
图4为温度对实施例1筛选的嗜酸乳杆菌生长的影响;
图5为PH对实施例1筛选的嗜酸乳杆菌生长的影响;
图6为实施例1筛选的嗜酸乳杆菌接种MRS液体培养基培养前后的pH变化;
图7为温度对实施例1筛选的嗜酸乳杆菌LA降解硫甙的影响;
图8为发酵时间对实施例1筛选的嗜酸乳杆菌LA降解硫甙的影响;
图9为料水比对实施例1筛选的嗜酸乳杆菌LA降解硫甙的影响;
图10为实施例1筛选的嗜酸乳杆菌对菜籽粕总酸和多肽的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。以下实施例中,用于制备各个培养基的水均为去离子水。以下实施例中用OD600nm值表征菌体生长量。以下实施例,如无特殊说明,所用菜籽粕均购自北京金盛祥科技发展有限公司普通菜籽粕。
MRS+硫甙固体筛选培养基:蛋白胨10g,酵母膏5g,牛肉膏10g,硫甙5g,磷酸氢二钾2g,乙酸钠5g,柠檬酸三铵2g,硫酸镁 0.1g,硫酸锰 0.05g,吐温-80 1g,琼脂20g,溶于1L蒸馏水中,121℃灭菌20min。
MRS+硫甙液体复筛培养基(g/L):蛋白胨10,酵母膏5,牛肉膏10,硫甙5,磷酸氢二钾 2,乙酸钠5,柠檬酸三铵2,硫酸镁0.1,硫酸锰 0.05,吐温-80 1,121℃灭菌20min。
MRS液体培养基(g/L):蛋白胨10,酵母膏5,牛肉膏10,葡萄糖20,磷酸氢二钾 2,乙酸钠5,柠檬酸三铵2,硫酸镁 0.1,硫酸锰 0.05,吐温-80 1,121℃灭菌20min。
YPD培养基(g/L):蛋白胨20,酵母膏10,葡萄糖20,121℃灭菌20min。
LB培养基(g/L):蛋白胨10,酵母膏5,氯化钠10,121℃灭菌20min。
菜籽粕发酵培养基:菜籽粕50g,无菌水50ml,105℃灭菌15min。
硫甙含量的测定方法采用氯化钯比色法测定。
实施例1 嗜酸乳杆菌的筛选与鉴定
本实施提供一种嗜酸乳杆菌的筛选方法,具体操作步骤为:
1)硫甙降解菌的分离
取发酵玉米青贮20g接种于装有120ml无菌水的250ml锥形瓶中,于37℃,200r/min的摇床充分震荡20min,随后静置30min,并取上清液20ml接种于菜籽粕发酵培养基中,于37℃恒温静置培养48h,用灭菌玻璃棒搅拌均匀后,取出5g用无菌水震荡稀释,取上清液制成菌株原液;
2)硫甙降解菌的初筛
取上述菌株原液按10-1、10-2、10-3、10-4倍比稀释涂布于MRS+硫甙固体筛选培养基上,于36~38℃恒温静置培养44~48h,挑取数量多、生长快、菌落大的菌株进行划线、分离、纯化保存;
将分离纯化后的菌种按5%的接种量接种于MRS+硫甙液体复筛培养基,36~38℃恒温静置培养44~48h,150~250rpm离心15~25min,取上清液测硫甙含量,选取硫甙降解率最高的五株菌再次划线、分离、纯化保存,得初筛菌株;
3)硫甙降解菌的复筛
将初筛得到的5株硫甙降解菌按10%的接种量,1:1的料水比接种于菜籽粕发酵培养基,37℃恒温静置发酵48h;发酵结束后一部分50℃烘干粉碎后测硫甙含量,另一部分-20℃保存,选取五株菌中硫甙降解效果最好的一株菌,即完成。
菌种的鉴定:
1、形态观察
将上述筛选得到的菌株接种在MRS固体培养基平板上,观察菌落形态特征,菌落照片见图1,电镜照片见图2,筛选得到的菌株呈圆形透明菌落,边缘整齐,菌落光滑,在倒置显微镜下观察菌体细胞呈棒状。
2、分子生物学鉴定
对筛选得到的菌株的16S rDNA进行扩增,将纯化后的PCR产物测序,测序结果如序列表的序列1所示。
综合形态鉴定、分子生物学鉴定的结果,筛选得到的菌株属于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
上述筛选得到的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)LA,已于2017年07月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),保藏登记号为CGMCC NO.14437。
试验例1 嗜酸乳杆菌生长曲线
1、培养基甲
培养基甲(g/L):蛋白胨10,酵母膏5,牛肉膏10,葡萄糖20,磷酸氢二钾 2,乙酸钠5,柠檬酸三铵2,硫酸镁 0.1,硫酸锰 0.05,吐温-80 1,121℃灭菌20min。
2、将实施例1筛选的嗜酸乳杆菌平板划线培养,挑取平板上单菌落于10ml MRS液体培养基中37℃恒温培养24h制成种子液,并按1%的接种量接种于150ml MRS液体培养基中,37℃静置培养48h,每3h取样一次,在紫外可见分光光度计600nm处测其光密度(OD)值,并绘制OD600与时间的关系曲线图。
结果见图3,实施例1筛选的嗜酸乳杆菌经过短暂的延滞期,在第3-21h进入对数生长期,在第30h达到最大生长浓度,随后进入衰亡期。因此,在后续培养与发酵试验中均选取培养21h的活化菌液作为种子液。
试验例2 温度和pH对菌株生长的影响,具体试验步骤为:
1、挑取实施例1筛选的嗜酸乳杆菌单菌落,接种于100mLMRS液体培养基中,37℃恒温静置培养24~36h,4000rpm离心10min,收集菌体,用无菌生理盐水洗涤3次;
2、取步骤1得到的菌体,用无菌生理盐水重悬;
3、将0.8ml步骤2得到的菌悬液接种至80mL MRS液体培养基(pH7.0),改变不同温度下恒温静置培养24h,然后检测OD600nm值,采用的培养温度分别为29℃、33℃、37℃、或41℃,结果见图4。在29~41℃的温度范围内,嗜酸乳杆菌LA的生长曲线呈抛物线状,最佳生长温度在33~37℃之间,温度过高或过低均影响嗜酸乳杆菌LA的生长;
4、将0.8ml步骤2得到的菌悬液接种至80ml MRS液体培养基(PH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0或8.0),37℃恒温静置培养24h,然后检测OD600nm值,结果见图5。PH4~8的范围内,嗜酸乳杆菌LA能够保持良好的生长状态。碱性环境下,嗜酸乳杆菌的生长则受到一定的抑制作用,嗜酸乳杆菌较适宜在偏酸性环境下生长,且在生长发酵过程中产生有机酸,进一步降低培养基PH,结果见图6。
结果表明,嗜酸乳杆菌具有较强的环境耐受性,其适宜的温度和pH生长条件,与鸡舍中的环境相适应,利于其生长,具有在舍内应用的潜力。嗜酸乳杆菌在pH为4的强酸环境下和33℃的温度下生长良好,此环境接近鸡胃肠道内的微环境,因此,嗜酸乳杆菌LA同时具有作为饲料添加剂的潜力。
试验例3 嗜酸乳杆菌发酵菜籽粕降解硫甙功能的研究,具体操作步骤为:
1、制备培养基与发酵液
(1)菜籽粕发酵培养基:菜籽粕50g,无菌水50ml,105℃灭菌15min。
(2)挑取实施例1筛选的嗜酸乳杆菌单菌落,接种于100mL MRS液体培养基中,37℃恒温静置培养24h;
(3)取步骤(2)得到的菌体,用无菌生理盐水重悬;
(4)将0.8ml步骤(3)得到的菌悬液接种至80mL步骤(1)的菜籽粕发酵培养基上,37℃恒温静置培养21h,制成发酵液。
硫甙降解率=(未发酵菜籽粕硫甙含量-发酵后菜籽粕硫甙含量)*100%/未发酵菜籽粕硫甙含量。
2、温度、发酵时间、料水比对嗜酸乳杆菌LA降解硫甙的影响
(1)温度对嗜酸乳杆菌降解硫甙的影响
取步骤1制备的菜籽粕发酵培养基(料水比1:1)与发酵液,按10%接种量将发酵液接种在菜籽粕发酵培养基上,发酵温度分别设定为29℃、32℃、35℃、38℃,静置发酵72h,发酵结束后50℃烘干粉碎测硫甙含量,计算硫甙降解率。
结果见图7,当接种量为10%、发酵时间为72h时,嗜酸乳杆菌对硫甙的降解随温度的增加先升高后降低,在32℃时发酵菜籽粕硫甙降解率达到峰值,温度过低或过高均会影响硫甙降解率。
(2)发酵时间对嗜酸乳杆菌降解硫甙的影响
取步骤1制备的菜籽粕发酵培养基(料水比1:1)与发酵液,按10%接种量将发酵液接种在菜籽粕发酵培养基上,32℃发酵,发酵时间分别为48h、60h、72h、84h,发酵结束后50℃烘干粉碎测硫甙含量,计算硫甙降解率。
结果见图8,当接种量为10%、温度32℃时,随着时间的延长,硫甙降解率呈现升高的趋势,在第84h的时候达到最高,硫甙降解率为48.8%。
(3)料水比对嗜酸乳杆菌降解硫甙的影响
改变步骤1制备菜籽粕发酵培养基的加水量,使料水比分别为1:0.8、1:1.0、1:1.2、1:1.4,按10%的接种量加入步骤1制备的发酵液,32℃发酵72h,发酵结束后50℃烘干粉碎测硫甙含量,计算硫甙降解率。
结果见图9,当接种量为10%、温度为32℃、发酵72h,随着料水比的增加,硫甙降解率先升高后增加,料水比为1:1.0的时候,硫甙降解率达到最高,水分太低和太高都导致硫甙降解率降低。
由上述试验结果可知,实施例1筛选得到的嗜酸乳杆菌可用于降解菜籽粕硫甙,适宜的发酵条件为:菜籽发酵培养基料水比1:1.0,发酵温度32℃,发酵时间84h。
试验例4 嗜酸乳杆菌对菜籽粕多肽和总酸含量的影响,具体操作步骤为:
1、制备菜籽粕发酵培养基与发酵液
(1)菜籽粕发酵培养基:菜籽粕50g,无菌水50ml,105℃灭菌15min;
(2)挑取实施例1筛选的嗜酸乳杆菌单菌落,接种于100mL MRS液体培养基中,37℃恒温静置培养24h;
(3)取步骤(2)得到的菌体,用无菌生理盐水重悬。
(4)将0.8ml步骤(3)得到的菌悬液接种至80mL步骤(1)菜籽粕发酵培养基,37℃恒温静置培养21h,制成发酵液。
2、 取步骤1制备的菜籽粕发酵培养基(料水比1:1)与发酵液,按10%接种量将发酵液接种在菜籽粕发酵培养基上、,37℃恒温静置发酵72h,发酵结束后50℃烘干粉碎测发酵菜籽粕多肽和总酸含量。
结果见图10,当接种量为10%、发酵温度为37℃、静置发酵72h,菜籽粕总酸含量和多肽含量显著提高。
试验例5 不同菌株在发酵菜籽粕降解硫甙脱毒、提高多肽和乳酸含量效果的比较
1、比较菌株:实施例1筛选的嗜酸乳杆菌、保藏编号为CICC 6074的嗜酸乳杆菌、保藏编号为ACCC11073的嗜酸乳杆菌
2、环境性状对比:实施例1筛选的嗜酸乳杆菌为兼性厌氧型微生物,而保藏编号为CICC6074的嗜酸乳杆菌和保藏编号为ACCC11073的嗜酸乳杆菌为严格厌氧型微生物,相比较而言,兼性厌氧型嗜酸乳杆菌在发酵菜籽粕及发酵饲料方面环境适用性强,有较大的应用空间;
3、按照试验例3筛选得到的发酵条件,发酵温度为32℃,料水比为1:1,发酵时间为84h,将上述三种不同的嗜酸乳杆菌接种在未灭菌的菜籽粕中,进行发酵培养,发酵结束后发现保藏编号为CICC6074的嗜酸乳杆菌和保藏编号为ACCC11073的嗜酸乳杆菌三个重复均出现不同程度的染菌、发霉现象,不能产生嗜酸乳杆菌发酵菜籽粕特有的酸香味;实施例1筛选的嗜酸乳杆菌生长快,而且产生了大量的乳酸,有效的抑制了未灭菌菜籽粕中霉菌等有害微生物的生长,表明本发明所保护的嗜酸乳杆菌在发酵菜籽粕的开发应用方面有更大的实用价值;
4、按照试验例3筛选得到的发酵条件,发酵温度为32℃,料水比为1:1,发酵时间为84h,按照试验例3同样的方法计算不同嗜酸乳杆菌的硫甙降解率,结果显示,实施例1筛选的嗜酸乳杆菌的硫甙降解率为48.8%,保藏编号为CICC6074的嗜酸乳杆菌的硫甙降解率为28.6%,保藏编号为ACCC11073的嗜酸乳杆菌的硫甙降解率为16.8%,结果显示本发明嗜酸乳杆菌具有更强的硫甙降解性能,应用于菜籽粕脱毒效果更好。
最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种嗜酸乳杆菌,其特征在于,其保藏编号为CGMCC NO.14437。
2.一种菌剂,其特征在于,包含如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌的培养物。
3.一种菌剂,其特征在于,包含如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌的菌悬液。
4.一种如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌的筛选方法,其特征在于,包括以下操作步骤:
1)菌的分离:取发酵的玉米青贮,加入无菌水,振荡摇匀后,静置,取上清接种于含有菜籽粕的固体发酵培养基中,静置培养后,静置取上清液作为菌株原液;
2)初筛:
取步骤1)制备的菌株原液稀释不同的倍数涂布在MRS+硫甙固体筛选培养基上,静置培养后,挑去数量多、生长快、菌落大的菌株进行划线、分离、纯化;然后将分离纯化后的菌株按照5%的接种量接种在MRS+硫甙液体复筛培养基上,静置培养后,选取硫甙降解率最高的五株菌株再次划线、分离、纯化保存;
3)复筛:
将步骤2)分离纯化的五株菌株按照10%的接种量,1:1的料水比,接种于含有菜籽粕的固体发酵培养基中,静置培养后,选取五株菌株中硫甙降解效果最好的一株菌,即为所述的嗜酸乳杆菌。
5.如权利要求4所述的嗜酸乳杆菌的筛选方法,其特征在于,所述含有菜籽粕的固体发酵培养基重量份组成为:菜籽粕50份,无菌水50份;
所述MRS+硫甙固体筛选培养基的各组分质量浓度组成为:蛋白胨10g,酵母膏5 g,牛肉膏10 g,硫甙5 g,磷酸氢二钾 2 g,乙酸钠5 g,柠檬酸三铵2 g,硫酸镁 0.1 g,硫酸锰0.05 g,吐温-80 1 g,琼脂20 g,溶于1L蒸馏水中;
所述MRS+硫甙液体复筛培养基的各组分质量浓度组成为:蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,牛肉膏10 g/L,硫甙5 g/L,磷酸氢二钾 2 g/L,乙酸钠5 g/L,柠檬酸三铵2 g/L,硫酸镁0.1 g/L,硫酸锰 0.05 g/L,吐温-80 1 g/L。
6.如权利要求4所述的嗜酸乳杆菌的筛选方法,其特征在于,所述静置培养为36~38℃恒温静置培养44~48h;
步骤1)中振荡摇匀为在36~38℃温度下,150~250r/min的摇床充分震荡15~25min。
7.一种如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌在降解菜籽粕硫甙、提升菜籽粕多肽和总酸含量、或降解菜籽粕大分子蛋白方面的应用。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,将嗜酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌的培养物或嗜酸乳杆菌的菌悬液作为菜籽粕饲料发酵用菌剂。
9.如权利要求7所述的应用,其特征在于,将嗜酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌的培养物或嗜酸乳杆菌的菌悬液与菜籽粕混合发酵。
10.一种如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌在制备饲料添加剂方面的应用,其特征在于,将嗜酸乳杆菌、嗜酸乳杆菌的培养物或嗜酸乳杆菌的菌悬液作为饲料添加剂。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109329561A (zh) * 2018-10-16 2019-02-15 安佑生物科技集团股份有限公司 一种嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法
CN110885872A (zh) * 2019-07-18 2020-03-17 西南大学 一种具有芥子苷高降解能力的菌种筛选鉴定方法
CN111154677A (zh) * 2020-01-13 2020-05-15 中国农业大学 嗜酸乳杆菌及其应用
CN111349581A (zh) * 2020-02-20 2020-06-30 福建省新闽科生物科技开发有限公司 一种嗜酸乳酸菌的选育及其应用
CN113080312A (zh) * 2021-04-26 2021-07-09 中国农业科学院饲料研究所 一种富含小肽的菌酶协同发酵鸡肠及其制备方法
CN113151047A (zh) * 2021-03-05 2021-07-23 中国海洋大学 嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus及其应用
CN113862208A (zh) * 2021-11-11 2021-12-31 四川省畜牧科学研究院 芥子碱降解菌的多级优化筛选方法及得到的芥子碱降解菌

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010143939A1 (en) * 2009-06-09 2010-12-16 N.V. Nutricia Nutrition for improving muscle strength in elderly
CN102499321A (zh) * 2011-10-26 2012-06-20 北京大北农科技集团股份有限公司 一种复合菌无抗发酵饲料及其制备方法
CN102919624A (zh) * 2012-11-22 2013-02-13 湖南农业大学 菜籽饼粕的微生物发酵脱毒方法
CN104388482A (zh) * 2014-10-28 2015-03-04 南昌大学 一种利用静息乳酸菌技术转化菜油脚料生产共轭亚油酸的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010143939A1 (en) * 2009-06-09 2010-12-16 N.V. Nutricia Nutrition for improving muscle strength in elderly
CN102499321A (zh) * 2011-10-26 2012-06-20 北京大北农科技集团股份有限公司 一种复合菌无抗发酵饲料及其制备方法
CN102919624A (zh) * 2012-11-22 2013-02-13 湖南农业大学 菜籽饼粕的微生物发酵脱毒方法
CN104388482A (zh) * 2014-10-28 2015-03-04 南昌大学 一种利用静息乳酸菌技术转化菜油脚料生产共轭亚油酸的方法

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109329561A (zh) * 2018-10-16 2019-02-15 安佑生物科技集团股份有限公司 一种嗜酸乳杆菌发酵液体饲料的制备方法
CN110885872A (zh) * 2019-07-18 2020-03-17 西南大学 一种具有芥子苷高降解能力的菌种筛选鉴定方法
CN111154677A (zh) * 2020-01-13 2020-05-15 中国农业大学 嗜酸乳杆菌及其应用
CN111154677B (zh) * 2020-01-13 2022-02-01 中国农业大学 嗜酸乳杆菌及其应用
CN111349581A (zh) * 2020-02-20 2020-06-30 福建省新闽科生物科技开发有限公司 一种嗜酸乳酸菌的选育及其应用
CN113151047A (zh) * 2021-03-05 2021-07-23 中国海洋大学 嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus及其应用
CN113080312A (zh) * 2021-04-26 2021-07-09 中国农业科学院饲料研究所 一种富含小肽的菌酶协同发酵鸡肠及其制备方法
CN113862208A (zh) * 2021-11-11 2021-12-31 四川省畜牧科学研究院 芥子碱降解菌的多级优化筛选方法及得到的芥子碱降解菌

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