CN110885872A - 一种具有芥子苷高降解能力的菌种筛选鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有芥子苷高降解能力的菌种筛选鉴定方法，包括以下步骤：s1.进行芥子苷的提取和含量的测定，并设定芥子苷标准品的浓度；s2.利用MRS和PDA为培养基纯化菌种并进行形态学观察，将单个菌落进行液体培养之后做菌种的保藏和革兰氏染色；s3.对菌株进行芥子苷降解率的测定并进行第一次筛选，将筛选出的菌株进行耐受性实验并进行第二次筛选；s4.将筛选出来的菌株以16S rDNA基因序列分析法进行分子生物学快速鉴定。

Description

一种具有芥子苷高降解能力的菌种筛选鉴定方法
技术领域
本发明属于微生物对芥子苷的降解测定技术领域，具体涉及一种具有芥子 苷高降解能力的菌种筛选鉴定方法。
背景技术
1.芥子苷的简介
芥子苷又称硫代葡萄糖苷，是含巯基(-SH)的苷原与葡萄糖结合而成的苷， 主要存在于十字花科植物中。结构简式如图1，其中R是各种芳基和链烷。芥子 苷是一种抗营养因子，而且芥子苷能在芥子苷酶或者加热的情况下降解生成异 硫氰酸盐。
2.对芥子苷降解产物异硫氰酸盐的特性研究
异硫氰酸盐是以含有N＝C＝S官能团的硫为特征的一族化合物。它是一个重 要而独特的二类植物产品。异硫氰酸盐在食品，医药和农业领域有着广泛的应 用。烯丙基异硫氰酸盐诱导结直肠癌细胞和前列腺癌细胞死亡，并抑制各种类 型的人类癌细胞的增殖。其他药理学性质包括对一系列革兰氏阴性和革兰氏阳 性致病菌的抗菌活性、抗真菌活性、致甲状腺特性，并且它们也显示为有效的 II期酶诱导剂，它可以保护细胞免受致癌物质的毒性和致瘤作用，抑制一氧化氮 的产生并抑制参与炎症和癌症的诱导型一氧化氮合酶的表达。
芥子苷的降解对榨菜风味的形成非常重要，但更重要异硫氰酸盐具备保健 作用，如涪陵青菜头芥子苷经水解产生的丙烯基异硫氰酸化合物、2-苯乙基异硫 氰酸化合物、3-丁烯氰腈、3-苯基丙氰等物质具有独特的药用和保健作用，可抑 制乳腺癌、胃癌、肠癌、肺癌等肿瘤的生长，有镇咳平喘、缓慢降压等多种药 理活性和调节内分泌功能，能有效预防心肌梗塞，具抗氧化、改善性功能和抗 菌功效。异硫氰酸盐也确实能够提高免疫力、增强抗突变、抗氧化和抗癌的能 力；而且人体肠道的微生物可以降解萝卜硫苷，其产物萝卜硫素是常见的抗氧 化剂，是目前发现的蔬菜中抗癌效果最好的植物活性物质，后面也确认了大肠 杆菌具有降解芥子苷的基因且能降解芥子苷。但是人体对其的降解率却得不到 保障，而大多研究只是研究了其性质，对芥子苷的降解率方面的研究相对较少。 所以，如果能在榨菜腌制过程中提高芥子苷的降解率，不仅能提升榨菜的风味 更能让榨菜的功效将会得到提升，促进人们的健康生活。
3.芥子苷的降解
早在1983年，经过实验确定蜡状芽孢杆菌能降解芥子苷；之后又研究了沙 门氏菌和单增李斯特菌产生的芥子苷酶降解芥子苷这一过程的影响因素(如温 度、葡萄糖浓度)，所以细菌具有降解芥子苷的能力在很早就得到了确认。
在1992年，研究发现曲霉菌能产生芥子苷酶，之后从土壤中分离筛选出了 能降解芥子苷的曲霉菌；不仅曲霉菌，还发现乳酸菌能有效的将芥子苷转化为 腈,而发酵时间也会影响乳酸菌对芥子苷的降解，还观察到乳酸菌发酵促进了芥 子苷的完全降解和异硫氰酸盐的产生。因此近几年对芥子苷降解的研究偏向了 真菌方面。
4.传统的微生物鉴定方法
传统微生物分类鉴定方法是让细菌进行纯培养分离，使用的培养基为人工 配制的适合微生物生长繁殖。常规方法为稀释涂布平板法、平板划线法。常规 鉴定技术为培养特性观察和形态结构、生物生化试验等。但研究表明，有很多 微生物使用目前的培养技术是无法达成效果的。因此传统的方法有其局限性， 侧面说明的微生物的多样性。
发明内容
本发明的目的是：以从榨菜腌制液中纯化保藏后的菌株为原料，进行培养 纯化，然后用氯化钯法测定各个菌株降解芥子苷的降解率，初步筛选出降解能 力较强的菌株，然后进行耐受性(耐酸、耐盐)实验，进行二次筛选，将二次 筛选出的菌株使用16S rDNA序列同源性分析进行鉴定并构建系统进化树。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一种具有芥子苷高降解能力的菌种筛选鉴定方法，包括以下步骤：
s1.进行芥子苷的提取和含量的测定，并设定芥子苷标准品的浓度；
s2.利用MRS和PDA为培养基纯化菌种并进行形态学观察，将单个菌落进 行液体培养之后做菌种的保藏和革兰氏染色；
s3.对菌株进行芥子苷降解率的测定并进行第一次筛选，将筛选出的菌株进 行耐受性实验并进行第二次筛选；
s4.将筛选出来的菌株以16S rDNA基因序列分析法进行分子生物学快速鉴 定。
进一步，步骤s1中，所述芥子苷的提取和含量测定的具体步骤，包括：
s11.称取设定重量的含芥子苷原材料(白萝卜或者榨菜)并进行水浴预热；
s12.将所述原材料搅拌打碎后，加入甲醇溶液水浴提取；
s13.加入乙酸钡混合后，采用离心管将混合物进行分装并离心；
s14.将离心后的上清液水浴至甲醇完全去除，利用超纯水将所得干物质溶解
过滤；
s15.在设定量的样品液中加入氯化钯显色液和羧甲基纤维素钠后静置显色， 并设置标准液对照组和空白对照组作为a系列；
将所述a系列中的氯化钯显色液替换为蒸馏水作为b系列；
将所述a系列，b系列的溶液进行振荡、混匀后静置显色，并将二者进行分 光光度测定，利用下式计算芥子苷含量：
Figure BDA0002135141370000031
其中，C为芥子苷的含量(mg/g)；E1为a系列样品显色液扣除空白对照 后的OD值；E2为b系列样品显色液扣除空白对照后的OD值；E1标为a系列 标准显色液扣除空白后的OD值；E2标为b系列标准显色液扣除空白后的OD 值。
进一步，步骤s2具体包括：
s21.制备PDA和MRS的无菌平板若干，待冷却凝固后，在相应的平板中滴 入设定量的菌液；
s22.用加热杀菌后的接种环进行划线,对划线后的培养皿进行标记类型时间 和编号，完成后取出培养皿放入培养箱中培养；
s23.第一次培养完成后，对单个菌落用加热杀菌后的接种环挑取放入相应的 液体培养基，并记录类型、编号和日期，全部完成后再将其放入培养箱培养；
s24.吸取第二次培养后的菌液，置于载玻片上，将载玻片于酒精灯火焰上加 热使菌体固定，经革兰氏染色后于显微镜下观察其形态并拍照；
s25.取二次培养后的菌液加到甘油中震荡混匀后冷冻保存。
进一步，步骤s3中，所述菌种第一次筛选的步骤为：
s31.取设定量的芥子苷溶液，用滤膜加到灭菌后的液体培养基中，然后分装 到试管中；
s32.取设定量第二次培养后的菌液加入相应的含有PDA或者MRS培养基的 试管中，同时设置空白对照，并进行标记日期\编号；
s33.放入培养箱中培养，培养结束后测定各试管中芥子苷的浓度并计算出降 解率，筛选出降解率较高的菌液并记录编号。
进一步，步骤s3中，所述菌种第二次筛选的步骤为：
s34.在耐酸实验培养基中加入芥子苷溶液使其浓度达到设定值后分装至试 管中并接种设定量的菌液，且确保每个pH都留下一个不接种的试管作为空白测 芥子苷的初始浓度；培养后测量芥子苷的浓度，用培养后的初始值和降解芥子 苷的量，算出降解率；
s35.在耐盐实验培养基中加入芥子苷溶液使其浓度达到设定值后分装至试 管中并接种设定量的菌液，且确保每个盐度都留下一个不接种的试管作为空白 测芥子苷的初始浓度；培养后测量芥子苷的浓度，用培养后的初始值和降解芥 子苷的量，算出降解率；
s36.将各菌株在耐酸性实验和耐盐度实验中的降解率进行整合，筛选出耐受 性相对较好的菌株进行记录。
进一步，步骤s4中，所述菌种鉴定的具体步骤为：
s41.基因组DNA的提取：
s42.将提取的基因组DNA溶液进行凝胶电泳；
s43.进行16S rDNAPCR扩增；
s44.扩增全部成功后将PCR扩增产物进行16S rDNA序列测定。
附图说明
图1为芥子苷结构简式；
图2为芥子苷浓度与E1标-E2标关系图；
图3为DNA凝胶电泳图；
图4为16S rDNA片段PCR扩增图；
图5为基于16S rDNA的菌株系统进化树。
具体实施方式
本实施例的具有芥子苷高降解能力的菌种筛选鉴定方法所需的实验材料如 下：
实验样品：采用从榨菜腌制液中培养、分离、纯化和保种后的的菌株培养 液。
主要试剂：PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g。将200g 马铃薯去皮切成小块，放入烧杯中煮沸30min，用玻璃棒搅拌防止糊底，用双 层纱布过滤。滤液中加入20g葡萄糖，15g琼脂，加热充分溶解之后加蒸馏水定 容到1000mL，121℃高压灭菌15min。
MRS培养基：称取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2 g，葡萄糖20g，吐温试剂1mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钠2g，硫酸镁0.58g，硫 酸锰0.25g，琼脂18g，加入1000mL蒸馏水中，加热溶解，定容后调pH 6.2～6.6， 121℃高压灭菌15min。
MRS液体培养基：上述MRS培养基不加入琼脂，其余成分完全相同，121℃ 高压灭菌15min。
PDA液体培养基：上述PDA培养基不加入琼脂，其余成分完全相同，完全 溶解后121℃高压灭菌15min。
耐酸实验培养基：配制含5.5mmol葡萄糖、7g/L酵母提取物、10g/L NaH2PO4、10g/LNa2HPO4的溶液，用旋涡振荡器混匀，均分装到6个锥形瓶 中，用乳酸分别将pH值调至3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.5(对照)。将调好的 液体分装到高温灭菌瓶，在121℃高压灭菌15min。
耐盐实验培养基：配制含5.5mmol葡萄糖、7g/L酵母提取物、10g/L NaH2PO4、10g/LNa2HPO4的溶液后用旋涡振荡器混匀，均分装到7个锥形瓶中， 用氯化钠分别将盐度调至4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％。将调好的液 体分装到高温灭菌瓶，在121℃高压灭菌15min。
本实验使用主要药品见表1。
表1主要药品
Figure BDA0002135141370000061
Figure BDA0002135141370000071
(1)50×TAE：分别称取121gTris和18.6g Na2EDTA·2H2O入烧杯中，加 400mL去离子水和28.55mL的冰醋酸搅拌使其溶解，用NaOH调pH值至8.3， 加去离子水定容至500mL，室温保存。
(2)8mmol/L氯化钯显色液：精确称取354mg氯化钯粉末于150mL烧杯 中，分别加入2mol/L盐酸溶液4.0mL和20mL蒸馏水，加热溶解(加热过程中 用玻璃棒不断搅拌)后，加蒸馏水定容至250mL，再转入棕色瓶保存备用。
(3)1.5％羧甲基纤维素钠溶液(CMC)：精确称取1.5g羧甲基纤维素钠 于250mL烧杯中，加入少量蒸馏水，加热并用玻璃棒不断搅拌至完全溶解后， 加蒸馏水稀释并用容量瓶定容至100mL，静置过夜，次日取上清液至棕色试剂 瓶中保存备用。
实验仪器设备
本实验使用的主要仪器设备见表2。
表2主要仪器设备
Figure BDA0002135141370000081
本实施例的具有芥子苷高降解能力的菌种筛选鉴定方法，包括以下步骤：
s1.进行芥子苷的提取和含量的测定，并设定芥子苷标准品的浓度；
(1)原材料中芥子苷的提取
将萝卜冷藏，切碎后称取400g。放入80℃水浴预热10min。将萝卜连同汁 液放入搅拌机打碎后取出，加入200mL70％甲醇溶液于75℃水浴提取20min。 待冷却后加入1mL乙酸钡，用旋涡仪充分混合。将所得混合物用50mL离心管 分装，不超过离心管2/3高度，4000r/min离心10min，保存上清液。将上清液 分装到锥形瓶中水浴直至甲醇完全去除，所得干物质用少量超纯水溶解过滤备 用。
(2)芥子苷含量的测定
吸取各样品液1mL置于刻度小试管中，加入1mL 8mmol/L氯化钯显色液与 2mL0.15％羧甲基纤维素钠(CMC)溶液，静置显色；取1mL芥子苷标准液加 入1mL 8mmol/L氯化钯显色液与2mL 0.15％羧甲基纤维素钠(CMC)溶液做标 准对照；同时以1mL蒸馏水加入1mL8mmol/L氯化钯显色液与2mL 0.15％CMC 溶液做空白对照(a系列)。为校正样品液吸光值可能造成的误差，同时配备不 加入显色液的b系列，即以1mL蒸馏水取代1mL 8mmol/L氯化钯显色液加入到 混有1mL样品液(标准液)和2mL 0.15％CMC溶液的刻度小试管中，显色，同时做空白对照。
即a系列：样品液1mL+PdCl2显色液1mL+CMC 2mL
标准液1mL+PdCl2显色液1mL+CMC 2mL
蒸馏水1mL+PdCl2显色液1mL+CMC 2mL
b系列：样品液1mL+蒸馏水1mL+CMC 2mL
标准液1mL+蒸馏水1mL+CMC 2mL
蒸馏水1mL+蒸馏水1mL+CMC 2mL
分别将a系列，b系列的溶液转移至离心管中，置于旋涡振荡器上振荡几秒， 混匀后于室温下显色6h后，二者均在540nm下进行分光光度测定，每个样品进 行4次重复，取平均值。
芥子苷含量计算公式：
Figure BDA0002135141370000091
C：原材料中芥子苷的含量(mg/g)
E1：a系列样品显色液扣除空白对照后的OD值
E2：b系列样品显色液扣除空白对照后的OD值
E1标：a系列标准显色液扣除空白后的OD值
E2标：b系列标准显色液扣除空白后的OD值
C标：芥子苷标准液的浓度(mg/mL)
V：芥子苷样品的定容体积(mL)
M：提取芥子苷所用原材料的质量(g)
(3)芥子苷标准品浓度的确定
取少量制得的芥子苷溶液分别配制成0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、 2.0mg/mL，作为标准液进行测定E1标和E2标的差值，做出方差线，确定后面实验 使用的标准品浓度。
s2.利用MRS和PDA为培养基纯化菌种并进行形态学观察，将单个菌落进 行液体培养之后做菌种的保藏和革兰氏染色；
(1)菌液的分离和纯化
对无菌操作台进行酒精杀毒后，将培养基、枪头、移液枪、培养皿等放入 无菌操作台紫外消毒杀菌30min，然后制备PDA和MRS的无菌平板若干，待冷 却凝固后，在相应的平板中用移液枪滴入0.1mL菌液，然后用加热杀菌后的接 种环进行划线。对划线后的培养皿进行标记类型时间和编号，全部完成后取出 培养皿放入28℃恒温培养箱中培养3天。
第一次培养完成后，在无菌操作台中对单个菌落用加热杀菌后的接种环挑 取放入相应的液体培养基，并记录类型、编号和日期，全部完成后将其放入28℃ 恒温培养箱中培养3天。
(2)形态观察
对平板培养后的菌落进行颜色、边缘、透明度、形状的观察。
在无菌操作台中用移液枪吸取少量第二次培养后的菌液，置于载玻片上， 将载玻片于酒精灯火焰上加热使菌体固定，经革兰氏染色后于显微镜下观察其 形态并拍照。
(3)菌种的保藏
将二次培养后的菌液，用移液枪取500μL液体培养的菌液加到500μL 30％ 甘油中(甘油终浓度为15％)振荡混匀后置于-20℃的冰箱中冷冻保存。
s3.对菌株进行芥子苷降解率的测定并进行第一次筛选，将筛选出的菌株进 行耐受性实验并进行第二次筛选；
(1)菌株的筛选
在无菌操作台中取25μL芥子苷溶液，用20μm滤膜加到高压灭菌后的液 体培养基中，然后分装到试管中。用移液枪取25μL第二次培养后的菌液加入 相应的含有PDA或者MRS培养基的试管中，同时做好空白对照，并进行标记 日期、编号。全部完成后将其放入28℃恒温培养箱中培养3天。培养结束后测 定各试管中芥子苷的浓度并计算出降解率。筛选出降解率较高的菌液并记录编 号。
(2)耐酸性实验
耐酸实验培养基灭菌完成，待冷却后加入芥子苷溶液使其浓度为1.5g/L。用 移液枪分装3.5mL至灭菌后的试管中接种100～200mL菌液，每个pH都留下一 个不接种的试管作为空白测芥子苷的初始浓度。培养3天后测量芥子苷的浓度。 用培养后的初始值和降解芥子苷的量，算出降解率。
(3)耐盐度实验
耐盐实验培养基灭菌完成，待液体冷却后加入芥子苷溶液使其浓度为 1.5g/L。用移液枪分装3.5mL至灭菌后的试管中接种100～200mL菌液，每个盐 度都留下一个不接种的试管作为空白测芥子苷的初始浓度。培养3天后测量芥 子苷的浓度。用培养后的初始值和降解芥子苷的量，算出降解率。
s4.将筛选出来的菌株以16S rDNA基因序列分析法进行分子生物学快速鉴 定。
(1)基因组DNA的提取
采用天根“细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)”提取细菌基因组 DNA，按照说明书操作。
1.取细菌培养液1mL，1000rpm离心1min，尽量吸尽上清液；
2.向菌体沉淀中加入180mL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮，加入溶菌 酶10μL，37℃水浴15min；
3.向管中加入10μLProteinase K溶液，混匀，37℃水浴中放置30min；
4.加入220μL缓冲液GB，振荡15s，70℃水浴放置10min，溶液应变清亮， 简短离心除去管盖内壁的水珠；
5.加入220μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能出现絮状沉淀，简 短离心除去管盖内壁水珠；
6.将上一步所得的溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱加入 吸附管中)，12000rpm离心30s。倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中
7.向吸附柱CB3中加入500mL GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸 附柱GB3放入收集管中；
8.向吸附柱GB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液， 吸附柱GB3放入收集管中；
9.重复操作8；
10.将吸附柱GB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸 附柱GB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中残留的漂洗液；
11.将吸附柱GB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜中心部位悬空滴加 50～200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12000rpm离心2min将溶液收 集到离心管。
(2)DNA凝胶电泳
将提取的基因组DNA溶液在90V电压下进行1.5％琼脂糖凝胶电泳30min， 使用凝胶成像仪对其进行成像分析。
(3)16S rDNAPCR扩增
将上述提取的基因组DNA作为PCR扩增的模版，选择细菌最常用的通用 引物，正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；反向引物1492R： 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。反应体系和反应程序如表3表4所示。
表3 PCR反应体系
Table 3 Reaction system of PCR amplification
Figure BDA0002135141370000131
表4 PCR反应程序
Table 4 Procedure of PCR amplification
Figure BDA0002135141370000132
将PCR所得的产物在90V电压下进行1.5％琼脂糖凝胶电泳30～40min。如 果PCR扩增成功，就可以看到约为1500bp的条带。
(4)16S rNDA序列测定
对扩增失败的重新扩增，直至全部成功后将PCR扩增产物送生工生物工程 (上海)股份有限公司进行测序。
s5.结果与分析
(1)芥子苷浓度的选择
从图2中可以明显观察到使用芥子苷浓度为1mg/mL时最符合要求。
(2)初次筛选时各菌株芥子苷含量及降解率的测定
将培养后的菌株使用氯化钯法进行芥子苷含量的测定。各个培养基中芥子 苷的含量和降解率见表5。
表5菌株芥子苷浓度和降解率
Table 5 Concentration and degradation rate of glucosides
Figure BDA0002135141370000141
由上表结果可见，各菌株的降解率高低不同且差值明显，极值达到了 77.65％，只选取降解率大于50％的菌株即13-1、13-2、13-6、13-9、13-11、13-14、 13-18、13-19、13-20、13-23、13-26共十一种菌株进行耐受性实验。
(3)二次筛选时各菌株芥子苷含量及降解率的测定
将培养后的菌株使用氯化钯法进行芥子苷含量的测定。各个培养基中芥子 苷的含量和降解率见下表。
各个pH值下的结果：
表6芥子苷的浓度(mg/mL)
Table 6 Concentration of glucosides
Figure BDA0002135141370000142
Figure BDA0002135141370000151
表7芥子苷的降解率
Table 7 Degradation rate of glucosinolates
Figure BDA0002135141370000152
各个盐度下的结果：
表8芥子苷的浓度(mg/mL)
Table 8 Concentration of glucosides
Figure BDA0002135141370000153
Figure BDA0002135141370000161
表9芥子苷的降解率
Table 9 Degradation rate of glucosinolates
Figure BDA0002135141370000162
各菌株在各酸度和盐度的降解率如上表所示，筛选出能力较强的菌株即在 各个pH和盐度下降解率均高于45％的菌株。
(4)菌落、菌体形态特征
对筛选出的菌株的单个菌落进行形态学观察，记录菌落的颜色、边缘、透 明度、形状等，且记录其在显微镜下的形状和颜色，见表10。
表10菌种形态及镜检结果
Table 10 Strain morphology and microscopic examination resuLts
Figure BDA0002135141370000163
(5)基因组DNA凝胶电泳
琼脂糖凝胶用于分离大小在0.2～50kb范围内的DNA片段，与本实验的 DNA检测完全符合。将提取的基因组DNA进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，通过凝 胶成像仪进行照相和观察，结果见图3。
由图3可见出现荧光带，说明确实提取出了DNA，虽然亮度不同但是能进 行16SrDNA的扩增和测序。
(6)16S rDNA的PCR扩增结果
将各菌株经16S rDNA的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，通过凝 胶成像仪进行照相和观察，结果见图4。
(7)测序的结果和相似性分析
登录NCBI官网的DNA数据库，将测得的菌株序列使用Blast进行相似性 分析，结果见表11。
表11 16S rDNA序列同源性比较结果
Table 11 Homology comparison of 16S rDNA Sequence
Figure BDA0002135141370000171
由表11可见，相似度均大于97.5％，测序成功。
将鉴定结果的序列与测得的菌株的序列利用MEGA 6软件以 Neighbor-Joining法构建系统进化树，包括进化树外群序列的放线菌 (Actinobacteria strain PB90-5)对所有序列进行比对后，删除两端未对齐的碱基， 生成进化树。采用“Compute Linearizedtree”的方法显示进化树，并通过 “Image→Save as Enhanced Metafile(EMF)”功能将其转化为图片文件，使结果更 加清晰直观结果如图5。
结论
(1)本次研究从榨菜腌制液中分离纯化保种后的菌株中选取了26个菌株， 经初次培养用氯化钯法测定其芥子苷含量，筛选出了11个降解能力较强的菌株； 对这11个菌株进行6个pH(3、3.5、4、4.5、5、6.5)和7个盐度(4％、6％、 8％、10％、12％、14％、16％)下的培养，筛选出了5个耐受性较强的菌株：13-9、 13-14、13-18、13-19、13-23。其中13-9、13-19、13-23鉴定为解淀粉芽孢杆菌； 13-14鉴定为变异棒杆菌；13-18为海洋细菌。
(2)本实验将各个菌株在多个pH和盐度下降解芥子苷的能力进行测定， 为榨菜腌制过程中的生产用菌种提供参考。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管 参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的 宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.一种具有芥子苷高降解能力的菌种筛选鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1.进行芥子苷的提取和含量的测定，并设定芥子苷标准品的浓度；
s2.利用MRS和PDA为培养基纯化菌种并进行形态学观察，将单个菌落进行液体培养之后做菌种的保藏和革兰氏染色；
s3.对菌株进行芥子苷降解率的测定并进行第一次筛选，将筛选出的菌株进行耐受性实验并进行第二次筛选；
s4.将筛选出来的菌株以16S rDNA基因序列分析法进行分子生物学快速鉴定。
2.根据权利要求1所述的具有芥子苷高降解能力的菌种筛选鉴定方法，其特征在于：步骤s1中，所述芥子苷的提取和含量测定的具体步骤，包括：
s11.称取一定质量含芥子苷的原材料并进行水浴预热；
s12.将原材料搅拌打碎后，加入甲醇溶液水浴提取；
s13.加入乙酸钡混合后，采用离心管将混合物进行分装并离心；
s14.将离心后的上清液水浴至甲醇完全去除，利用超纯水将所得干物质溶解过滤；
s15.在设定量的样品液中加入氯化钯显色液和羧甲基纤维素钠后静置显色，并设置标准液对照组和空白对照组作为a系列；
将所述a系列中的氯化钯显色液替换为蒸馏水作为b系列；
将所述a系列，b系列的溶液进行振荡、混匀后静置显色，并将二者进行分光光度测定，利用下式计算芥子苷含量：
Figure RE-FDA0002365130990000011
其中，C为芥子苷的含量(mg/g)；E1为a系列样品显色液扣除空白对照后的OD值；E2为b系列样品显色液扣除空白对照后的OD值；E1标为a系列标准显色液扣除空白后的OD值；E2标为b系列标准显色液扣除空白后的OD值；C标为芥子苷标准液的浓度(mg/mL)；V是芥子苷样品的定容体积(mL)；M是提取芥子苷所用原材料的质量(g)。
3.根据权利要求1所述的具有芥子苷高降解能力的菌种筛选鉴定方法，其特征在于：步骤s2具体包括：
s21.制备PDA和MRS的无菌平板若干，待冷却凝固后，在相应的平板中滴入设定量的菌液；
s22.用加热杀菌后的接种环进行划线,对划线后的培养皿进行标记类型时间和编号，完成后取出培养皿放入培养箱中培养；
s23.第一次培养完成后，对单个菌落用加热杀菌后的接种环挑取放入相应的液体培养基，并记录类型，编号和日期，全部完成后再将其放入培养箱培养；
s24.吸取第二次培养后的菌液，置于载玻片上，将载玻片于酒精灯火焰上加热使菌体固定，经革兰氏染色后于显微镜下观察其形态并拍照；
s25.取二次培养后的菌液加到甘油中震荡混匀后冷冻保存。
4.根据权利要求1所述的具有芥子苷高降解能力的菌种筛选鉴定方法，其特征在于：步骤s3中，所述菌种第一次筛选的步骤为：
s31.取设定量的芥子苷溶液，用滤膜加到灭菌后的液体培养基中，然后分装到试管中；
s32.取设定量第二次培养后的菌液加入相应的含有PDA或者MRS培养基的试管中，同时设置空白对照，并进行标记日期，编号；
s33.放入培养箱中培养，培养结束后测定各试管中芥子苷的浓度并计算出降解率，筛选出降解率较高的菌液并记录编号。
5.根据权利要求1所述的具有芥子苷高降解能力的菌种筛选鉴定方法，其特征在于：步骤s3中，所述菌种第二次筛选的步骤为：
s34.在耐酸实验培养基中加入芥子苷溶液使其浓度达到设定值后分装至试管中并接种设定量的菌液，且确保每个pH都留下一个不接种的试管作为空白测芥子苷的初始浓度；培养后测量芥子苷的浓度，用培养后的初始值和降解芥子苷的量，算出降解率；
s35.在耐盐实验培养基中加入芥子苷溶液使其浓度达到设定值后分装至试管中并接种设定量的菌液，且确保每个盐度都留下一个不接种的试管作为空白测芥子苷的初始浓度；培养后测量芥子苷的浓度，用培养后的初始值和降解芥子苷的量，算出降解率；
s36.将各菌株在耐酸性实验和耐盐度实验中的降解率进行整合，筛选出耐受性相对较好的菌株进行记录。
6.根据权利要求1所述的具有芥子苷高降解能力的菌种筛选鉴定方法，其特征在于：步骤s4中，所述菌种鉴定的具体步骤为：
s41.基因组DNA的提取：
s42.将提取的基因组DNA溶液进行凝胶电泳；
s43.进行16S rDNAPCR扩增；
s44.扩增全部成功后将PCR扩增产物进行16S rDNA序列测定；
S45.用NCBI官网的Blast进行菌株16S rDNA序列比对鉴定菌种。
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