CN108004181B - 一株甲基营养型芽孢杆菌及其培养物和应用 - Google Patents

一株甲基营养型芽孢杆菌及其培养物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)2‑3,保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No:60242。本发明的甲基营养型芽孢杆菌2‑3易培养，生长速度快，能够在不用灭菌的固体培养基快速繁殖，同时生长过程中分泌的小肽丰富，其发酵培养物对金黄色葡萄球菌及大肠菌群表现出很强的抑制效果，能显著增强鸡的免疫力,而且其发酵培养物对治畜禽球虫病也有较好的效果。

Description

一株甲基营养型芽孢杆菌及其培养物和应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及甲基营养型芽孢杆菌及其培养物和应用。
背景技术
现阶段养殖户为了降低养殖成本，而我国又是抗生素生产大国，使用抗生素成本较低，促使养殖户大量使用抗生素。研究表明，人类在养殖动植物过程中使用的抗生素的某些化学成分，与使用在人类身上的抗生素的某些化学成分是一样的，所以抗生素的耐药性问题同样出现在动物领域，人类吃了可能会出现同样的问题，而动物的粪便又会污染土壤和水源，这与国家倡导的可持续发展战略相违背，因此开发新型微生物饲料替代抗生素是一个新的方向，新型微生物饲料与抗生素相比具有无污染、不生产耐药性、增强动物免疫力以及符合国家可持续发展战略等特点。
发明内容
为克服上述技术缺陷，本发明分离得到一株甲基营养型芽孢杆菌，可以增强动物的免疫力，增强动物抵抗疾病的能力。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明公开了一株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)2-3,保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No:60242。
本发明还公开了一种含有上述甲基营养型芽孢杆菌2-3的液体发酵培养物。
所述液体发酵培养物的制备方法为：将所述甲基营养型芽孢杆菌2-3在固体菌种培养基上划线37℃培养24小时，制得单克隆菌体，接种环挑取单可隆于液体培养基37℃培养24～30小时，所述固体菌种培养基为(1％酵母粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖、1.5％氯化钠、1.5％琼脂粉，余量为水)，所述液体培养基(1％酵母粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖、1.5％氯化钠，余量为水)。
本发明还公开了一种含有上述甲基营养型芽孢杆菌2-3的固体发酵产品。
所述固体发酵产品的制备方法为：将含有甲基营养型芽孢杆菌2-3的液体发酵培养物接种到固态培养基中进行发酵，然后烘干，得到含有活性蛋白的固体发酵产品。所述甲基营养型芽孢杆菌固态培养基配方为：豆粕35％、玉米粉45％、酒糟15％、玉米浆干粉4.2％、蔗糖0.8％，添加水使其含水量在50％～60％之间。
进一步地，所述固体发酵产品的制备方法为：将含有甲基营养型芽孢杆菌2-3的液体发酵培养物按5％～10％的接种量接种到固态培养基中，于35～40℃的条件下发酵72小时，然后在45～50℃的温度下烘干。
本发明还公开了上述甲基营养型芽孢杆菌2-3和其液体发酵培养物和固体发酵产品在抑菌中的应用。
本发明还公开了上述甲基营养型芽孢杆菌2-3和其液体发酵培养物和固体发酵产品在制备饲料添加剂中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明甲基营养型芽孢杆菌2-3易培养，生长速度快，能够在不用灭菌的固体培养基快速繁殖，生产成本低。同时生长过程中分泌的小肽丰富，其含量远高于已报告的同种菌株。
(2)本发明的甲基营养型芽孢杆菌2-3发酵培养物其溶出液对金黄色葡萄球菌及大肠菌群表现出很强的抑制效果。
(3)本发明的甲基营养型芽孢杆菌2-3发酵培养物与现有产品相比，更能显著增强鸡的免疫力，抵抗疾病的能力更强。
(4)喂养一定量的甲基营养型芽孢杆菌2-3发酵培养物对治畜禽球虫病有一定的效果，可以达到一般药物的水平，而且不产生耐药性。
保藏信息
本发明的甲基营养型芽孢杆菌2-3，分类命名为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)2-3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心,保藏编号为GDMCC No:60242，保藏日期为2017年9月13日。
附图说明
图1是实施例1中依据16S rRNA序列构建的系统发育树。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：甲基营养型芽孢杆菌2-3的分离、筛选、鉴定及保存
1.1目标菌株的获得
采集深圳红树林湿地土壤，称取10g样品，收集于150mL灭过菌三角瓶内，加入90mL无菌生理盐水，加入无菌玻璃珠30个，振荡3～5h后取1mL土壤悬浮液加至筛选培养基，28℃恒温培养5d，得到菌株。
筛选培养基：AMS培养基(％,w/v)：MgSO4·7H2O，0.1；CaCl，0.02；西奎斯特林铁复合物(sequestrene iron complex)，0.0004；NH4Cl,0.05，甲醇，0.5；琼脂粉,1.5。灭菌前将培养基pH调至6.8，灭菌后添加2ml无菌磷酸缓冲液(KH2P04和Na2HPO4·12H2O的混合物，15g溶于300ml蒸馏水中，pH值为6.8)到降温至60℃的培养基中。
1.2菌株形态学鉴定
取纯化菌的单菌落，转接到营养琼脂平板上，于37℃恒温培养箱中培养24h、36h和48h，分别观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等。结果显示，在营养琼脂培养基上，菌落呈纯白色、扁平、不透明、近似圆形。
1.3菌株的生理生化特征
对菌株进行生理生化试验。试验结果显示如下表：
表1菌株生理生化特征
特征 性能
染色 乳白色
厌氧生长 -
氧化酶 +
在10％NaCl中生长 -
最高生长温度(℃) 45
最低生长温度(℃) 15
对二乙醇胺的利用 -
对乙醇的利用 +
对甲醇的利用 +
对三甲胺的利用 w
硝酸盐还原为亚硝酸盐 +
己二酸 w
L-树胶醛糖 +
精氨酸双水解酶 -
β-半乳糖苷酶 -
L-组氨酸 +
肌醇 +
乳酸 +
苹果酸 +
蜜二糖 +
丙酸 -
L-鼠李糖 +
D-核糖 +
水杨苷 +
乙酸钠 -
D-山梨醇 +
蔗糖 +
柠檬酸三钠 +
脲酶 -
戊酸 -
DNA G+C含量(mol％) 45
1.4菌株的分子生物学鉴定
DNA的提取：取3mL细菌培养液于5mL离心管中，5000g离心5min，弃上清，收集菌体。离心管倒置于灭过菌的滤纸上，吸干残余的液体，加入2.5mL DNA抽提Buffer，震荡，菌体悬浮后，加入20μL10mg/mL的蛋白酶K，混匀，37℃，225r/min，水浴震荡30min。加入0.3mL120％SDS，混匀，65℃水浴2h。于室温6000r/min离心10min。将上清转至新的离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)抽提10min，后6000r/min离心10min。重复上述抽提步骤3次。将上清转至新的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温静置1h，14000r/min离心20min。沉淀再用70％的乙醇进行洗涤，后于干净工作台晾干。加入100μLdd H2O溶解。采用核酸蛋白浓度测定仪测定DNA浓度，-20℃保存。
16S rDNA序列扩增：以已提取的目的菌基因组总DNA为模板，用16S rDNA通用引物进行扩增。序列：上游5'-GAGATTTGATCCTGGCTCAG-3'；下游5'-ACGGCTACCTTGTTACGA。
PCR反映体系和条件如下：
Figure BDA0001535142880000051
PCR产物经2.0％琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外分析仪检测。利用凝胶回收试剂盒回收纯化目的片段后与载体PMD19-T连接，转化至大肠杆菌JM109。由上海英骏生物技术有限公司完成目的菌株的16S rDNA部分序列测序，测序结果见序列表。将所得16SrRNA基因序列在GenBank中进行比对，分析结果显示与甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)的同源性最近，高达100％。
用MEGA5.1软件构建系统发育树，见图1，菌株与甲基营养型芽孢杆菌属于同一个分支，且生理生化特征与Bacillus methylotrophicus相符，结合菌落形态、生理生化实验和分子生物学实验结果，鉴定菌株为甲基营养型芽孢杆菌，将其命名为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)2-3。
实施例2：甲基营养型芽孢杆菌2-3培养物的制备
(1)液体发酵培养物：将甲基营养型芽孢杆菌2-3在固体菌种培养基上划线37℃培养24小时，制得单克隆菌体，接种环挑取单可隆于液体培养基37℃培养28小时，所述固体菌种培养基为(1％酵母粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖、1.5％氯化钠、1.5％琼脂粉，余量为水)，所述液体培养基(1％酵母粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖、1.5％氯化钠，余量为水)。
(2)固体发酵产品：将液体发酵培养物按8％的接种量接种到固态培养基中于35～40℃的条件下发酵72小时，然后在45～50℃的温度下烘干，得到含有活性蛋白的固体发酵产品。所述甲基营养型芽孢杆菌固态培养基配方为：豆粕35％、玉米粉45％、酒糟15％、玉米浆干粉4.2％、蔗糖0.8％，添加水使其含水量在55％。
实施例3：小肽含量测定
(1)对照样品选取市场上销售的同类型甲基营养型芽孢杆菌产品2种，分别编号为A、B。
(2)样品处理：称取2g甲基营养型芽孢杆菌2-3固体发酵产品到无菌50ml的离心管里，再加4ml的无菌水，充分摇均5min，用离心机在10000r/min的条件下离心3min，然后用注射器取其上清液，用孔径为0.22nm无菌过滤器进行过滤，滤液放置50ml无菌三角瓶备用。对照品A、B处理方法同上。
(3)检测方法：福林酚法。
(4)通过福林酚法测出样品及对照样品的小肽含量结果，结果见表2
表2小肽含量对比检测结果
样品编号 小肽含量(mg/g)
甲基营养型芽孢杆菌2-3 540
对照A 236
对照B 340
从表2中的检测结果可以看出，甲基营养型芽孢杆菌2-3培养物中的小肽含量可达540mg/g，远远高于同类产品，。
实施例4：抑菌实验
对照样品选取市场上销售的同类型甲基营养型芽孢杆菌产品2种，分别编号为A、B。指示菌株为购买于广东微生物保藏中心的大肠杆菌(Escherichia coliATCC25923)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 13312)。本实验采取打孔法，方法如下。
(1)样品过滤液制备
称取2g甲基营养型芽孢杆菌2-3固体发酵产品到无菌50ml的离心管里，再加4ml的无菌水，充分摇均5min，用离心机在10000r/min的条件下离心3min，然后用注射器取其上清液，用孔径为0.22nm无菌过滤器进行过滤，滤液放置50ml无菌三角瓶备用。对照品A、B处理方法同上。
(2)经过高温高压灭菌的营养琼脂培养基，待其降到50℃左右的时候，吸取25ml培养基到50ml无菌三角瓶内，接着吸取25ul大肠菌液和培养基摇均，然后倒入相对应平皿内，待其凝固待用，金黄色葡萄球处理同上。
(3)将灭菌的不锈钢小管(外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑)，放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合(以防滤液渗漏，影响结果)。
(4)置于培养箱37℃培养15～20h，记录结果，试验结果见表3。
表3甲基营养型芽孢杆菌2-3抑菌试验对比结果
Figure BDA0001535142880000081
注：净直径为减去孔的直径
从试验结果可看出，各甲基营养型芽孢杆菌的培养物对供试菌都有抑菌作用，其中甲基营养型芽孢杆菌2-3对致病菌的抑制效果均强于另外两个对照组样品。
实施例5：球虫治疗试验
试验分四组，各30只鸡，一组空白对照组(无接种球虫)，二组阳性对照组，三组药物对照组，四组为添加1‰甲基营养型芽孢杆菌2-3固体发酵产品样品。试验鸡接种球虫后开始进行喂养试验。10天后开始称重，捕杀，采取盲肠内容物测定卵囊值，结果见表4。
表4甲基营养型芽孢杆菌2-3培养物对球虫治疗效果
Figure BDA0001535142880000082
从试验结果可以看出，甲基营养型芽孢杆菌2-3样品组对球虫的治疗效果与药物效果一致，但平均增重比使用药物的更好，而不会产生耐药性。
实施例6：免疫力试验
免疫力试验分三组，一组对照组，二组为某公司类似产品，三组为甲基营养型芽孢杆菌2-3，于试验第21天和42天，采集脾脏、胸腺和法氏囊，称重并计算免疫器官指数，试验结果如表5。
表5甲基营养型芽孢杆菌2-3培养物对肉鸡免疫力试验
Figure BDA0001535142880000091
备注：相关计算公式如下：免疫器官指数(mg/10g)＝(免疫器官重/全净膛重)×100000。
从试验结果可以看出喂养甲基营养型芽孢杆菌2-3培养物的肉鸡免疫力明显要强于对照组和某公司类似产品，说明甲基营养型芽孢杆菌2-3培养物使用效果要优于市场上相似产品。
综上所述，但本发明并不局限于上述实施方式，本领域一般技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化，均在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> OrganizationName : 深圳市善成生物技术有限公司
<120> Title : 一株甲基营养型芽孢杆菌及其培养物和应用
<130> AppFileReference :
<140> CurrentAppNumber :
<141> 2017-12-29
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1433
<212> RNA
<213> OrganismName : Bacillus methylotrophicus
<400> 1
gctataatgc aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg 60
gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta 120
ataccggatg gttgtttgaa ccgcatggtt cagacataaa aggtggcttc ggctaccact 180
tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcaacga 240
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tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg 360
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gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat cccacaaatc tgttctcagt 1260
tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag 1320
catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt 1380
tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt taggagccag ccgccgaagg tga 1433

Claims (2)

1.一种含有甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）2-3的液体发酵培养物的制备方法，其特征在于：将所述甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）2-3在固体菌种培养基上划线37℃培养24小时，接种环挑取单克隆于液体培养基37℃培养24～30小时，所述甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）2-3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60242。
2.一种含有甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）2-3的固体发酵产品的制备方法，其特征在于：将含有甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）2-3的液体发酵培养物按5%～10%的接种量接种到固态培养基中，于35～40℃的条件下发酵72小时，然后在45～50℃的温度下烘干，得到含有活性蛋白的固体发酵产品，所述甲基营养型芽孢杆菌（Bacillus methylotrophicus）2-3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60242。
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