JP2015116191A

JP2015116191A - 抗菌作用を有するバチルス・メチロトロフィカス

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Publication number: JP2015116191A
Application number: JP2014232960A
Authority: JP
Inventors: 幸男岡田; Yukio Okada
Original assignee: Prima Meat Packers Ltd
Current assignee: Prima Meat Packers Ltd
Priority date: 2013-11-15
Filing date: 2014-11-17
Publication date: 2015-06-25
Anticipated expiration: 2034-11-17
Also published as: JP6440463B2

Abstract

【課題】食中毒菌等の病原菌に対して広く抗菌性を有し、それ自身は病原性を有さない新規微生物を提供すること。【解決手段】大腸菌Ｏ１５７（Escherichia coli O157：H7）、サルモネラ腸炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、及びセラチア・マルセッセンスに対する抗菌作用を有するバチルス・メチロトロフィカスやその培養物や、該培養物の菌体除去上清を抗菌剤として使用する。【選択図】なし

Description

本発明は、大腸菌Ｏ１５７（Escherichia coli O157：H7）、サルモネラ腸炎菌（Salmonella Enteritidis)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、セレウス菌(Bacillus cereus)、及びセラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）に対する抗菌作用を有するバチルス・メチロトロフィカス（Bacillus methylotrophicus）、該バチルス・メチロトロフィカスを含有する抗菌剤、該バチルス・メチロトロフィカスの培養物の菌体除去上清である抗菌剤、及び前記抗菌剤を用いる抗菌方法に関する。

近年、人口増加に伴い世界的に野菜の消費量が増加し、野菜の生産量も増加している。また、かいわれ大根に代表される芽もの野菜は、その栄養価の高さが注目され、世界的に栽培や販売が広まっている。しかしながら、野菜は発芽と生育に適した温度と湿度のもとで栽培されるため、その生育環境は各種微生物にとっても繁殖に適した環境となる場合が多い。

時代の変化から土を使用しない閉鎖的環境において野菜等の栽培を行う植物工場など新たな栽培技術の開発や実施も進められている一方で、明確な定義はないが、天然由来の土壌改良材や肥料を用い、農薬を使用しない有機農業によって栽培された有機野菜の流通も増加している。このような新たな栽培方法においては病原菌に対する制御方法について未知な部分も多く、多大なリスクを有する可能性もあるとされる。事実、野菜に付着した菌が原因とみられる食中毒事件が近年欧米を中心に散発している。いくつかの例を以下に示す（例えば、非特許文献１参照）。

かかる食中毒の汚染源は、栽培過程で用いられる土壌、堆肥又は液肥、潅水等であるとされる。例えば、感染により重篤な症状を引き起こし、時には死に至らしめる腸管出血性大腸菌である大腸菌Ｏ１５７は恒常的に健康な牛の糞便中に見いだされ、汚染された食物若しくは水、又は感染した人若しくは動物との接触によって、人に感染するとされている（例えば非特許文献２参照）。発酵による発熱が不十分である牛糞由来の未完熟な堆肥を使用すること等により、大腸菌Ｏ１５７が農作物へ付着する可能性も考えられる。開放的環境において食中毒菌を制御することは困難であり、農薬や化学合成殺菌剤等の使用低減が求められる中、先人の経験や自然の摂理に依存することが多かった微生物の制御について新たな技術が求められている。

一方、自然界から単離した微生物について有用性の検討が進んでおり、バチルス・アミロリクエファシエンスに属し、コレトトリカム・デマティウム、ロゼリニア・ネカトリクス等の生育を抑制する物質を生産する微生物の培養産物を有効成分として含有する植物病害の防除剤（例えば、特許文献１参照）や、ブドウ晩腐病、灰色かび病、イチゴ炭疽病に有効に作用する、バチルス・アミロリクエファシエンスに属する一菌株を含む植物病害防除資材（例えば、特許文献２参照）や、白モンパ病やフラン病に対する拮抗微生物を有効成分として含有する植物病害防除資材であって、前記拮抗微生物が、バチルス・メチロトロフィカスＫＢ−１株（ＮＩＴＥＰ−１２３４）を含む３種類のバチルス属菌、及びストレプトミセス・エスピーとミレロジマ・エスピーからなる群より選択された一種以上の微生物である植物病害防除資材（例えば、特許文献３参照）が報告されている。

他方、リステリア・モノサイトゲネス、セレウス菌、セラチア・マルセッセンス、パスツレラ・ヘモリティカ（Pasteurella haemolytica）等の食物腐敗菌に対して抗菌性を示す、土壌から単離したバチルス・アミロリクエファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)菌由来のバクテリオシン様物質が同定されたことが報告されている（例えば、非特許文献３参照）。また、リステリア・モノサイトゲネス等のグラム陽性菌に対して拮抗作用を示すが、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）以外のグラム陰性に対しては拮抗作用を示さない、牛糞尿堆肥から単離されたバチルス・リチェニホルミス（Bacillus licheniformis）由来のバクテリオシンが報告されている（例えば、非特許文献４参照）。

特開平１１−２４６３２４号公報特開２０１３−０４２６９０号公報特開２０１３−１７３７０７号公報

食品と開発 Vol.48 No.1、４頁、2013 The Lancet (1998) 352(9135):1207-1212 International Microbiology (2006) 9:111-118 Animal Science Journal (2011) 82:340-351

一般に植物病害防除資材は、有用微生物の抗真菌作用を利用するものがほとんどであり、また、既報のバチルス属菌類は、抗菌スペクトルが狭く、食中毒の予防という観点では実用化が困難であるという問題があった。

本発明の課題は、食中毒菌等の病原菌に対して広く抗菌性を有し、それ自身は病原性を有さない新規微生物を提供することにある。

本発明者らは、これまで有機系廃棄物を連続分解することのできる微生物や、油脂を含む排水の処理方法に使用することができる微生物について研究を進めてきたが、一連の有用微生物の研究において、有機系廃棄物の処理物由来の微生物群を培養していたところ、シャーレ上に明瞭な増殖阻止円を形成する菌株を偶然に見いだした。本発明者らは、かかる菌株を分離し詳細に検討を進めたところ、得られた菌株の形態や菌学的性質は以下のとおりであった。

上記菌株は、好気性の有芽胞グラム陽性桿菌であり、カタラーゼに陽性である。また、ＡＰＩ５０ＣＨＢ（シスメックス・ビオメリュー株式会社製）による上記菌株の資化性を以下に示す。

得られた菌株について、株式会社テクノスルガ・ラボに同定試験を依頼し、Cromas Pro1.5を用いて１６ＳｒＲＮＡ領域をコードする完全長塩基配列を決定し、解析ソフト（アポロンDB-BA8.0）を用いて相同性検索を行った。かかる配列を配列番号１に示す。上記菌株は、バチルス・メチロトロフィカスと非常に近縁なバチルス属菌であることを確認し、この菌株をバチルス属菌ＴＫ−２株と命名した。かかるＴＫ−２株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番８号）に２０１３年１０月２５日付で、受領番号ＮＩＴＥＰ−０１７４２として受領されている。上記バチルス属菌ＴＫ−２株は、大腸菌Ｏ１５７をはじめとして、サルモネラ腸炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、黄色ブドウ球菌、セレウス菌等の各種食中毒原因細菌の他、セラチア・マルセッセンス等の日和見感染を起こす細菌などの有害菌に対しても優れた抗菌性を有することを確認し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明を以下に示す。
（１）大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ腸炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、及びセラチア・マルセッセンスに対する抗菌作用を有するバチルス・メチロトロフィカス。
（２）バチルス属菌ＴＫ−２株（ＮＩＴＥＰ−０１７４２）であることを特徴とする上記（１）記載のバチルス・メチロトロフィカス。
（３）バチルス属菌ＴＫ−２株の変異株であって、かつ、大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ腸炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、及びセラチア・マルセッセンスに対する抗菌作用を有するバチルス・メチロトロフィカス。
（４）上記（１）〜（３）のいずれか記載のバチルス・メチロトロフィカスを含有する抗菌剤。
（５）上記（１）〜（３）のいずれか記載のバチルス・メチロトロフィカスの培養物であることを特徴とする上記（４）記載の抗菌剤。
（６）上記（１）〜（３）のいずれか記載のバチルス・メチロトロフィカスの培養物の菌体除去上清であることを特徴とする抗菌剤。
（７）上記（４）〜（６）のいずれか記載の抗菌剤を用いる、農作物、土壌改良材、土壌、水又は培養液を処理する抗菌方法。

本発明のバチルス・メチロトロフィカスや、その培養物や、その培養物の菌体除去上清は、土壌、土壌改良材、水、培養液中に存在する、又は野菜等の農作物に付着する食中毒菌を防除することができ、また、農作物摂取者における、大腸菌Ｏ１５７に起因する出血性大腸炎をはじめとする各種の食中毒菌や有害菌の感染予防に有用である。

バチルス属菌ＴＫ−２株の大腸菌ＪＣＭ１６４９株に対する抗菌性を示す図である。バチルス属菌ＴＫ−２株の大腸菌ＪＣＭ１６４９株に対する抗菌性を示す図である。バチルス属菌ＴＫ−２株培養物の菌体除去上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド濃度：１２％）を用いて電気泳動し、染色用ゲル断片（ａ）と抗菌活性測定用ゲル断片（ｂ）とした図である。

本発明のバチルス・メチロトロフィカスとしては、大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ腸炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、及び／又はセラチア・マルセッセンスに対する抗菌作用を有するバチルス・メチロトロフィカスであれば特に限定されるものではなく、具体的にはバチルス属菌ＴＫ−２株（ＮＩＴＥＰ−０１７４２）や、バチルス属菌ＴＫ−２株の変異株であって、かつ、大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ腸炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、セラチア・マルセッセンスに対する抗菌作用を有するバチルス・メチロトロフィカスを挙げることができる。ここで、バチルス・メチロトロフィカスとは、２０１０年にバチルス・アミロリクエファシエンスから再分類されたバチルス属に属する菌種である。また、バチルス属菌ＴＫ−２株の変異株の作製方法としては、自然的に発生する自然変異や、紫外線照射やアルキル化剤などの薬品で強制的に変異を生じさせる人為的変異による変異株の作製方法を挙げることができる。

他方、大腸菌Ｏ１５７は、ベロ毒素の作用により腸管出血性大腸炎を引き起こすことで知られるグラム陰性桿菌であり、サルモネラ腸炎菌は感染型食中毒菌として知られるグラム陰性桿菌であり、リステリア・モノサイトゲネスは感染型食中毒菌として知られるグラム陽性桿菌であり、黄色ブドウ球菌は、菌が食品中で増殖しエンテロトキシン毒素を産生した場合に、耐熱性の毒素が残り、激しい嘔吐を伴う毒素型食中毒を引き起こすグラム陽性球菌であり、セレウス菌は毒素型食中毒菌として知られるグラム陽性大桿菌であり、セラチア・マルセッセンスは、抵抗力の低下した人に感染した場合に肺炎や敗血症のような重篤な症状を引き起こすこともある日和見菌として知られるグラム陰性桿菌である。また、本発明において、大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ腸炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、及びセラチア・マルセッセンスに対して抗菌作用を有するとは、後述の実施例１に記載の抗菌性評価により、培養開始後４８時間後に測定した増殖阻止円の直径がいずれの上記各菌においても１０ｍｍ以上である場合をいう。

本発明のバチルス・メチロトロフィカスは、例えば、土壌、堆肥、排水、植物生体等に存在する微生物を供試菌とし、大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ腸炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、及びセラチア・マルセッセンスに対して抗菌作用を有する供試菌を選抜し、この選抜した供試菌の中から菌学的性質や１６ＳｒＲＮＡ領域をコードする完全長塩基配列に基づきバチルス・メチロトロフィカスと同定される菌株を選択するか、供試菌の中から菌学的性質や１６ＳｒＲＮＡ領域をコードする完全長塩基配列に基づきバチルス・メチロトロフィカスと同定される菌株を選抜し、この選抜した供試菌の中から大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ腸炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、及びセラチア・マルセッセンスに対して抗菌作用を有する供試菌を選択することにより得ることができる。あるいは、バチルス属菌ＴＫ−２株に変異処理を施し、この変異株の中から大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ腸炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、及びセラチア・マルセッセンスに対して抗菌作用を有する菌株を選択することにより得ることができる。また、かかるバチルス・メチロトロフィカスの増殖方法としては、菌体が増殖する方法であれば、特に培地の種類や培養条件等を問わずいずれの方法でもよいが、例えば、固体培養の場合は、標準寒天培地、普通寒天培地、トリプトソーヤ寒天培地等における３０℃での静置培養を、液体培養の場合は、トリプトソーヤブイヨン、ニュートリエントブロス、ブレインハートインヒュージョンブロス等における３０℃での振盪培養を挙げることができる。

本発明の抗菌剤としては、本発明のバチルス・メチロトロフィカスを含有する抗菌剤や、本発明のバチルス・メチロトロフィカスの培養物の菌体除去上清である抗菌剤であれば特に制限されず、本発明のバチルス・メチロトロフィカスを含有する抗菌剤における使用形態としては、その栄養細胞、芽胞等の菌体自体の形態のほか、その懸濁液、培養液、又はこれらの濃縮物、ペースト状物、乾燥物、希釈物等のいずれの培養物の形態であっても適用することができ、具体的には、上記バチルス・メチロトロフィカスの芽胞を含む培養液（芽胞液）や、その芽胞を遠心分離にて回収後、滅菌蒸留水又は緩衝液を用いて菌体洗浄することを数回繰り返したのち、芽胞を滅菌蒸留水又は緩衝液に懸濁した芽胞懸濁液を好適に例示することができる。また、本発明のバチルス・メチロトロフィカスの培養物の菌体除去上清における使用形態としては、本発明のバチルス・メチロトロフィカスを増殖培養後、培養物を遠心分離し、培養物から菌体を除去した、培養物の菌体除去上清を挙げることができる。

上記バチルス・メチロトロフィカスの培養物の菌体除去上清である抗菌剤の耐熱性としては、６０℃、好ましくは８０℃、より好ましくは１００℃に加熱した場合に、本発明における抗菌活性を６７％維持する、好ましくは８０％維持する、より好ましくは８７％維持する、さらに好ましくは１００％維持することができる耐熱性を挙げることができ、例えば、８０℃にて３０分間の加熱処理によって、１００％の抗菌作用を維持する耐熱性を挙げることができる。

本発明のバチルス・メチロトロフィカスを含有する抗菌剤におけるバチルス・メチロトロフィカスの濃度としては、例えば、１００〜２００倍に希釈した際に、芽胞濃度に換算して、１×１０^１〜１×１０^１０ＣＦＵ／ｍＬ、好ましくは１×１０^２〜１×１０^７ＣＦＵ／ｍＬ、より好ましくは１×１０^３〜１×１０^５ＣＦＵ／ｍＬの範囲を挙げることができる。

本発明のバチルス・メチロトロフィカスの培養物の菌体除去上清である抗菌剤の濃度としては、例えば、バチルス・メチロトロフィカスの培養物から菌体除去した菌体除去上清を１〜１００倍に希釈した範囲を挙げることができる。

また、本発明の抗菌剤には、通常使用される担体、界面活性剤、分散剤、補助剤等を配合させることができ、本発明の抗菌剤の態様としては、本発明のバチルス・メチロトロフィカスの抗菌活性を阻害しない性状のものである限りにおいて、粉剤、水和剤、乳剤、粒剤等の態様を採用することができる。

本発明の抗菌作用を有するタンパク質は、本発明のバチルス・メチロトロフィカスの培養物の菌体除去上清を、６２．５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセリン、０．０２％ブロモフェノールブルーからなる緩衝液に溶解（緩衝液で希釈）し、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量を測定した場合に１０ｋＤａ付近を示す、抗菌作用を有するタンパク質であれば特に制限されない。ここで、１０ｋＤａ付近とは、７ｋＤａや、８ｋＤａや、９ｋＤａや、１０ｋＤａや、１１ｋＤａや、１２ｋＤａを表す場合もある。

上記抗菌剤や抗菌作用を有するタンパク質の使用対象としては、各種の葉菜類、茎菜類、花菜類、根菜類、豆類、イモ類、穀類、発芽野菜類、果菜類、菌茸類、果実的野菜類、果物等の農作物：牛糞、豚糞等の堆肥、腐葉土などの、有機物を使用する未熟及び／又は完熟土壌改良材：農作物栽培用土壌：水耕栽培を含む農作物栽培用の水及び／又は培養液：を挙げることができる。

上記抗菌剤や抗菌作用を有するタンパク質を用いる抗菌方法としては、農作物、土壌改良材、土壌、水又は培養液を処理することにより行うことができ、具体的には、栽培中の農作物へ直接散布する方法や、収穫した農作物を浸漬処理する方法や、収穫した農作物に噴霧する方法や、土壌中に散布することにより病害菌を防除する方法や、土壌改良材に散布後混合する方法や、上記抗菌剤が散布・混合された土壌改良材を農作物栽培用の土壌に施すことにより土壌中の病害菌を防除する方法や、水耕栽培用の水や培養液に混合することにより病害菌を防除する方法を挙げることができる。

上記散布、浸漬、噴霧処理にあたっては、本発明の抗菌剤や抗菌作用を有するタンパク質を適当量の水等で希釈して使用することができ、本発明のタンパク質の使用時の濃度としては、０．００１〜１ｇ／ｍＬ、好ましくは０．０１〜０．１ｇ／ｍＬを挙げることができる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。

（本発明のバチルス・メチロトロフィカスの各種バクテリアに対する抗細菌性評価）
大腸菌Ｏ１５７（ＡＴＣＣ４３８９４株）、サルモネラ腸炎菌（ＩＦＯ３３１３株）、リステリア・モノサイトゲネス（ＡＴＣＣ４３２５６株）、黄色ブドウ球菌（ＡＴＣＣ１３５６５株）、セレウス菌（ＩＦＯ１５３０５株）、セラチア・マルセッセンス（ＡＴＣＣ１３４７７株）、バクテリオシンであるナイシンの指標菌として通常用いられているマイクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）（ＡＴＣＣ１０２４０株）、バチルス属菌ＴＫ−２株の近縁菌であるバチルス・アミロリクエファシエンス（ＮＢＲＣ１５５３５株）を用いて、バチルス属菌ＴＫ−２株の上記各菌に対する抗菌性を検討した。１２１℃にて１５分間高圧蒸気滅菌した標準寒天培地（日水製薬株式会社製）２５ｍＬ毎に、上記各菌をそれぞれ１０^６ＣＦＵ／ｍＬ添加して、上記各菌のいずれか一つの菌が添加された平板のセットを作製した。平板が固化した後に各平板の中央に直径８ｍｍの孔を無菌的に開け、該孔に吸光値０．２（波長６６０ｎｍ）に調整したバチルス属菌ＴＫ−２株の懸濁液を２０μＬ添加した。３０℃にて４８時間培養を行い、増殖阻止円の形成の有無の判定、及び増殖阻止円の直径の計測を行い、直径１０ｍｍ以上の増殖阻止円を形成した場合に抗菌性ありと評価した。結果を以下の表３に示す。

（結果）
上記表３から明らかなとおり、バチルス属菌ＴＫ−２株は、大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ腸炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、セラチア・マルセッセンス、マイクロコッカス・ルテウスの各菌に対して抗細菌性を有し、また、ナイシンの指標菌として通常用いられているマイクロコッカス・ルテウスに対して非常に強い抗細菌性を有しているが、バチルス・アミロリクエファシエンスに対しては抗細菌性を有さないことが確認された。

［比較例］
（本発明のバチルス・メチロトロフィカスの各種カビに対する抗真菌性評価）
ゲオトリクム・キャンディダム（Geotricum candidum）（ＩＦＯ４５９８株）と本出願人が分離したペニシリウム・ベロッコサム（Penicillium verrucosum）とを用いて、バチルス属菌ＴＫ−２株の抗真菌性・防カビ性を検討した。ゲオトリクム・キャンディダムは、白カビ病の原因因子として知られており（例えば、特開２００９−２１５２９２号公報参照）、レモン、オレンジ、グレープフルーツ等の果物を流通中又は貯蔵中に腐敗させることが知られている（例えば、特開平６−４０８２５号公報参照）。ペニシリウム・ベロッコサムは、オクラトキシンやペニシリン酸等のカビ毒を産生することが知られている（例えば、特開２０１２−１４９０２３号公報参照）。

上記各菌は、１２１℃にて１５分間高圧蒸気滅菌したポテトデキストロース寒天培地（日水製薬株式会社製）２５ｍＬの平板を作製し、平板が固化した後に中央に直径８ｍｍの孔を無菌的に開け、該孔に吸光値０．２（波長６６０ｎｍ）に調整したバチルス属菌ＴＫ−２株の懸濁液を２０μＬ添加した。その後、各カビを平板表面に塗沫し、２５℃にて１２０時間培養を行い、増殖阻止円の形成の有無の判定、及び増殖阻止円の直径の計測を行い、直径１０ｍｍ以上の増殖阻止円を形成した場合に抗菌性ありと評価した。結果を以下の表４に示す。

（結果）
上記表４から明らかなとおり、バチルス属菌ＴＫ−２株は、ゲオトリクム・キャンディダムとペニシリウム・ベロッコサム等の真菌に対して抗（真）菌性を有さないことが確認された。

（本発明のバチルス・メチロトロフィカスの大腸菌に対する抗菌性評価）
試験培地としてトリプトソーヤブイヨン（日水製薬株式会社製）を９００ｍＬ作製し、１２１℃にて１５分間高圧蒸気滅菌を行った。大腸菌（Escherichia coli）ＪＣＭ１６４９株を１０^３ＣＦＵ／ｍＬになるように上記トリプトソーヤブイヨンに添加した。かかる大腸菌添加トリプトソーヤブイヨンを３００ｍＬ毎に３分割し、１０^５ＣＦＵ／ｍＬのバチルス属菌ＴＫ−２株を大腸菌添加トリプトソーヤブイヨンに添加した第１試験区、１０^５ＣＦＵ／ｍＬの上記バチルス・アミロリクエファシエンス（ＮＢＲＣ１５５３５株）を大腸菌添加トリプトソーヤブイヨンに添加した第２試験区、菌を添加しない大腸菌添加トリプトソーヤブイヨンを第３試験区とした。各試験区につき、３０℃にて振盪培養し、経時的に各試験区の大腸菌数をデゾキシコレート寒天培地（日水製薬株式会社製）による混釈培養法により計測した。結果を図１に示す。

（結果）
図１から明らかなとおり、バチルス属菌ＴＫ−２株を添加した第１試験区（ＴＫ−２株添加あり）においては、培養開始後３日目に大腸菌ＪＣＭ１６４９株の菌数はほぼ検出限界以下となり、バチルス属菌ＴＫ−２株の大腸菌に対する高い抗菌性が確認された。バチルス・アミロリクエファシエンスを大腸菌添加トリプトソーヤブイヨンに添加した第２試験区（B. amylo添加あり）においては、大腸菌群数は第３試験区と比較すると多少抑制されているが、これはバチルス・アミロリクエファシエンスの生育と拮抗している結果であると思われる。大腸菌のみ添加した第３試験区（添加なし）においては、大腸菌の生育は抑制されなかった。

牛糞を精製水にて４倍希釈を行った牛糞溶液を９００ｍＬ作製し、１２１℃にて１５分間高圧蒸気滅菌を行った。大腸菌ＪＣＭ１６４９株を１０^３ＣＦＵ／ｍＬになるように上記牛糞溶液に添加した。かかる大腸菌添加牛糞溶液３００ｍＬ毎に３分割し、１０^５ＣＦＵ／ｍＬのバチルス属菌ＴＫ−２株を大腸菌添加牛糞溶液に添加した第１試験区、１０^５ＣＦＵ／ｍＬの上記バチルス・アミロリクエファシエンス（ＮＢＲＣ１５５３５株）を大腸菌添加牛糞溶液に添加した第２試験区、菌を添加しない大腸菌添加牛糞溶液を第３試験区とした。各試験区につき、３０℃にて振盪培養し、経時的に各試験区の大腸菌数をデゾキシコレート寒天培地（日水製薬株式会社製）による混釈培養法により計測した。結果を図２に示す。

図２から明らかなとおり、バチルス属菌ＴＫ−２株を添加した第１試験区（ＴＫ−２株添加あり）においては、培養開始後３日目に大腸菌ＪＣＭ１６４９株の菌数はほぼ検出限界以下となり、バチルス属菌ＴＫ−２株の大腸菌に対する高い抗菌性が確認された。バチルス・アミロリクエファシエンスを大腸菌添加トリプトソーヤブイヨンに添加した第２試験区（B. amylo添加あり）においては、大腸菌群数は第３試験区と比較すると多少抑制されているが、これはバチルス・アミロリクエファシエンスの生育と拮抗している結果であると思われる。大腸菌のみ添加した第３試験区（添加なし）においては、大腸菌の生育は抑制されなかった。

（バチルス属菌ＴＫ−２株の培養物の菌体除去上清の調製）
トリプトソーヤブイヨン（日水製薬株式会社製）を１Ｌ作製し、１２１℃にて１５分間高圧蒸気滅菌を行った。バチルス属菌ＴＫ−２株を上記トリプトソーヤブイヨンに一白金耳接種し、３０℃にて４８時間振とう培養を行った。培養物を５，０００ｇにて２０分間遠心分離した後、上清を０．４５μｍの滅菌フィルターを用いて菌体を除去し、バチルス属菌ＴＫ−２株培養物菌体除去上清を得た。

（バチルス・メチルトロフィカスの抗菌物質の熱安定性評価）
上記バチルス属菌ＴＫ−２株培養物菌体除去上清を１ｍＬ毎に７分割し、６０℃、８０℃、１００℃にて、３０分もしくは６０分間それぞれ熱処理を行い、又は１２１℃で１５分間熱処理を行った後、室温まで冷却した。１２１℃にて１５分間高圧蒸気滅菌した標準寒天培地（日水製薬株式会社製）２５ｍＬにリステリア・モノサイトゲネス（ＡＴＣＣ４３２５６株）を１０^５ＣＦＵ／ｍＬ添加して、平板のセットを作製した。各平板の中央に直径８ｍｍの孔を無菌的に開け、該孔に上記熱処理を行った各培養物の菌体除去上清を２０μＬ添加した。３０℃にて４８時間培養を行い、増殖阻止円の有無の判定、及び増殖阻止円の直径の計測を行い、熱処理をしていない培養物菌体除去上清における増殖阻止円の直径を１００％（コントロール）とした場合の抗菌活性（率：％）として算出した。結果を以下の表５に示す。

（結果）
上記表５から明らかなとおり、バチルス属菌ＴＫ−２株の培養物の菌体除去上清は、６０℃にて処理した場合は、処理時間が３０分、６０分のいずれにおいても抗菌活性は１００％を示し、低下しなかった。８０℃にて処理した場合は、処理時間が３０分では抗菌活性は１００％を示したが、６０分では８７％であった。１００℃にて処理した場合は、処理時間が３０分で８０％、６０分で６７％の抗菌活性を示し、上記菌体除去上清は、８０℃にて３０分間の加熱処理によって、１００％の抗菌作用を維持することができる。なお、１２１℃にて１５分処理した場合は、抗菌活性は消失した。

（抗菌作用を有する物質の同定）
上記バチルス属菌ＴＫ−２株培養物の菌体除去上清を緩衝液（６２．５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ、１０％グリセリン、０．０２％ブロモフェノールブルー）に溶解した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミド濃度：１２％）を用いて２０ｍＡ定電流下で電気泳動を行った。同一のゲル上に同じ試料を２つ電気泳動し、泳動後に切り分け、染色用ゲル断片と抗菌活性測定用ゲル断片とした。染色用ゲル断片は、クマシーブリリアントブルー溶液を用いて染色した後、脱色溶液（１０％メタノール、７．５％酢酸）を用いて脱色を行った。抗菌活性測定用ゲル断片は、滅菌蒸留水で洗浄を行った後、シャーレ内にゲル断片を設置した。リステリア・モノサイトゲネス（ＡＴＣＣ４３２５６株）１０^５ＣＦＵ／ｍＬが添加された寒天培地（ペプトン０．５％、酵母エキス０．２５％、ブドウ糖０．１％、アガロース０．７％）をシャーレ内に注入して固化させた後、３２℃にて４８時間培養を行った。培養後に増殖阻止された箇所と染色によって得られたバンドの位置から増殖阻止した物質の分子量を確認した。結果を図３に示す。

（結果）
図３から明らかなとおり、バチルス属ＴＫ−２株の培養物の菌体除去上清の抗菌活性測定用ゲル断片（ｂ）から抗菌活性が検出され、その抗菌物質の分子量は染色用ゲル断片（ａ）上の９〜１１ｋＤａ付近にバンドが見いだされた。

本発明は、食中毒菌等の有害菌による食品汚染を防止することができる。

Claims

大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ腸炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、及びセラチア・マルセッセンスに対する抗菌作用を有するバチルス・メチロトロフィカス。
バチルス属菌ＴＫ−２株（ＮＩＴＥＰ−０１７４２）であることを特徴とする請求項１記載のバチルス・メチロトロフィカス。
バチルス属菌ＴＫ−２株の変異株であって、かつ、大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ腸炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、及びセラチア・マルセッセンスに対する抗菌作用を有するバチルス・メチロトロフィカス。
請求項１〜３のいずれか記載のバチルス・メチロトロフィカスを含有する抗菌剤。
請求項１〜３のいずれか記載のバチルス・メチロトロフィカスの培養物であることを特徴とする請求項４記載の抗菌剤。
請求項１〜３のいずれか記載のバチルス・メチロトロフィカスの培養物の菌体除去上清であることを特徴とする抗菌剤。
請求項４〜６のいずれか記載の抗菌剤を用いる、農作物、土壌改良材、土壌、水又は培養液を処理する抗菌方法。