CN117384807B - 一种蕈状芽孢杆菌hdcm2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蕈状芽孢杆菌HDCM2及其应用，具体涉及一种耐盐碱、广谱抗病和具有促生作用的蕈状芽孢杆菌HDCM2，属于微生物技术领域。所述蕈状芽孢杆菌HDCM2的保藏信息为：保藏编号为CGMCC No：28574，保藏日期为2023年9月28日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）。本发明对葡萄灰霉、草莓暹罗炭疽菌、玉米胶孢炭疽菌、梨轮纹病、大豆疫霉和马铃薯致病疫霉这六种供试植物病原真菌具有较好的抑菌效果，耐盐碱，对多种植物具有促生作用。可作为土壤改良、广谱防病和促生的微生物菌剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种蕈状芽孢杆菌HDCM2及其应用，具体涉及一种耐盐碱、广谱抗病和具有促生作用的蕈状芽孢杆菌HDCM2，属于微生物技术领域。
背景技术
化学农药具有种类多、见效快的优点，在农作物病虫害防控中发挥着重要作用。然而，过度使用化学农药常常导致药物残留超标和环境污染等问题，严重威胁食品安全和人类健康。相比之下，生物防治是一种可持续的方法，通过利用有益生物或其产生的次生代谢产物来抑制病虫害的发生、发展或流行。生物防治不仅具有特异性强、无残留的优点，还对环境友好，对人畜安全。
芽孢杆菌属广泛存在于自然环境中，是目前开发利用较为普遍的生物防治细菌。作为一类革兰氏阳性细菌，芽孢杆菌具有抗逆能力强、耐高温和易于定殖等特点。除此之外，芽孢杆菌还能产生多种抗生素类抑菌物质，有效抑制植物病原菌的生长，且具有广谱抗性。因此，在开发微生物制剂并将其商品化生产方面，芽孢杆菌具有独特的优势。目前，已经成功商品化的芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌等。
葡萄灰霉病是由灰葡萄孢引起的真菌病害，是葡萄生产中的主要病害之一，对葡萄的生长期和采收后的贮藏期都会造成危害。该病菌可以侵染葡萄的幼嫩茎叶、花序和花冠等部位，在运输和储存过程中，灰霉还会对果实造成严重的损害，导致果实存储期缩短、品质下降，进而增加存储难度和成本。据不完全统计，全球范围内，葡萄灰霉病每年造成的经济损失高达100亿到1000亿美元。
大豆疫霉病的防治主要依赖于科学的耕作方式、高效的化学药剂、抗病或耐病的大豆品种，以及生物防治方法。然而，科学的耕作方式在某些环境下的防治效果有限；化学药剂不仅对环境造成污染，还会引起食品质量问题；抗病品种的选择压力使得大豆疫霉病的毒力变异更加频繁。这些问题已经引起了人们的高度关注，迫切需要寻找一种环境友好的防治方式——生物防治方法。
目前，全球的盐碱地面积呈现增加的趋势，这已经成为农业可持续发展的一个重要制约因素，而盐碱地的治理和开发更是一个世界性难题。近年来，微生物菌剂作为一种绿色、可持续的解决方案，在盐碱土壤修复方面显示出巨大的潜力。通过引入特定的微生物菌株，利用它们的生理代谢产物和活性成分，可以实现对盐碱土壤的修复。因此，微生物在盐碱地修复领域将展现出巨大的潜力。
发明内容
本发明提供了一种耐盐碱、广谱抗病和具有促生作用的蕈状芽孢杆菌HDCM2（Bacillus mycoides）及其应用。本发明获得的蕈状芽孢杆菌不仅可以有效改良酸、碱土壤，还有效拮抗葡萄灰霉（Botrytis cinerea）、草莓暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）、梨轮纹菌(Physalospora piricola)、玉米胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、大豆疫霉（Phytophthora sojae）和马铃薯致病疫霉（Phytophthora infestans），且在葡萄灰霉的离体接种实验中能显著降低葡萄的发病率，减少由此带来的产量损失，在植物真菌病害的防治方面具有广阔的应用前景；所述菌株还能有效促进生菜和黄瓜的生长，在100mM NaCl环境中，能显著提高水稻种子的萌发率。所述蕈状芽孢杆菌HDCM2的保藏信息为：保藏编号为CGMCC No：28574，保藏日期为2023年9月28日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）。
所述蕈状芽孢杆菌HDCM2在 NA固体培养基上能顺时针旋转生长，形成类似真菌的乳白色菌落，且液体发酵物也类似真菌，能形成菌丝球，菌体细胞呈杆状，串生，有刺鼻的气味。此外，所述蕈状芽孢杆菌HDCM2更适宜在NaCl浓度为0~700mM的NA培养基中生长。
本发明还包括所述蕈状芽孢杆菌HDCM2的发酵液，所述发酵液的制备方法，步骤如下：
挑取所述蕈状芽孢杆菌HDCM2的单菌落，接种于NA液体培养基，180rpm，过夜培养，得到种子液；按照1％（v/v）的接种量将种子液接种于NA液体培养基，180rpm，培养48 h，得到蕈状芽孢杆菌HDCM2的发酵液；所述培养条件pH为5.0-10.0，培养温度为25-28℃；优选培养条件为pH 7.0~8.0，培养温度为28℃，装液量为40%。
本发明还包括含有所述蕈状芽孢杆菌HDCM2的制剂，或者含有所述蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液的制剂。
本发明还包括，所述蕈状芽孢杆菌HDCM2、蕈状芽孢杆菌HDCM2的发酵液、含有所述蕈状芽孢杆菌HDCM2的制剂，或者含有所述蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液的制剂在耐盐、酸土和盐碱土改良、植物真菌病害的防治，以及促进植物生长中的应用。所述蕈状芽孢杆菌HDCM2在接种到酸性或碱性土壤培养后，能调节酸土或碱土的pH接近中性。
所述植物病原菌为葡萄灰霉（Botrytis cinerea）、草莓暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）、玉米胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和梨轮纹菌(Physalospora piricola)、大豆疫霉（Phytophthora sojae）和马铃薯致病疫霉（Phytophthora infestans）。
所述植物为黄瓜或者生菜。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
（1）本发明获得的蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液以及含有发酵液的制剂具有耐盐碱性能，显著提高了含盐环境下水稻种子的萌发率，且可以有效调节酸性或碱性土壤的pH。
（2）本发明获得的蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液以及含有发酵液的制剂均具有广谱抑菌效果，对葡萄灰霉菌（Botrytis cinerea）、草莓暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）、玉米胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、梨轮纹菌(Physalospora piricola)、大豆疫霉（Phytophthora sojae）和马铃薯致病疫霉（Phytophthora infestans）抑菌率分别为63.13%、60.78%、71.21%、57.56%、68.26%和76.72%。
（3）本发明获得的蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液以及含有发酵液的制剂可以提高生菜的叶片数、鲜重和叶绿素含量，还能够提高黄瓜的株高和叶绿素含量，具有显著的促生作用。
综上，本发明提供的蕈状芽孢杆菌HDCM2、其发酵液以及含有发酵液的制剂具有良好的土壤改良作用，提高含盐环境下种子的萌发率，且可作为广谱防病和促生的微生物菌剂。
附图说明
图1 为蕈状芽孢杆菌HDCM2的形态特征图；其中，A为蕈状芽孢杆菌HDCM2在NA固体培养基上的形态特征图；B为蕈状芽孢杆菌HDCM2在NA液体培养基中的摇瓶发酵物形态特征图；C为蕈状芽孢杆菌HDCM2的杆状菌体细胞图。
图2为基于16S rDNA序列构建的蕈状芽孢杆菌HDCM2的系统进化树。
图3为蕈状芽孢杆菌HDCM2的生长曲线图；其中A为蕈状芽孢杆菌HDCM2在24小时内的生长曲线图；B为蕈状芽孢杆菌HDCM2在11天内的生长曲线图。
图4 为NA固体培养基上的蕈状芽孢杆菌HDCM2在不同温度条件下的生长情况图。
图5 为NA液体培养基中的蕈状芽孢杆菌HDCM2在不同pH条件下的生长情况图。
图6为蕈状芽孢杆菌HDCM2的耐盐特性图。
图7为蕈状芽孢杆菌HDCM2耐盐特性的应用情况图。
图8为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液对酸性土壤pH的改良效果图。
图9为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液对碱性土壤pH的改良效果图。
图10为蕈状芽孢杆菌HDCM2的平板抑菌效果图。
图11蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液对葡萄灰霉病的防治效果图；A为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液在葡萄灰霉离体接种葡萄叶片上的防治效果图；B为葡萄灰霉离体接种的病斑面积图。
图12为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液对大豆疫霉的防治效果图。A为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液对大豆疫霉离体接种大豆苗下胚轴的防治效果图；B为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液对大豆疫霉离体接种大豆叶片的防治效果图；C为大豆苗下胚轴接种的病斑长度图；D为大豆叶片离体接种的病斑面积图。
图13为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液对生菜的促生效果图；A为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液对盆栽生菜的促生效果图；B为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液对生菜株高的影响图；C为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液对生菜叶片数量的影响图；D为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液对生菜鲜重的影响图； E为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液对生菜叶绿素含量的影响图。
图14为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液对黄瓜的促生效果图；A为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液对盆栽黄瓜的促生效果图； B为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液对黄瓜株高的影响图； C为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液对黄瓜叶绿素含量的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步描述本发明内容，使本发明的优点和特点更加清楚。但实施例仅是范例性的，对本发明的范围并不构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和实质的情况下，可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均属于本发明的保护范围。
实施例1蕈状芽孢杆菌HDCM2的分离与鉴定
1.1菌株的分离
菌株HDCM2分离自北京市海淀区土壤样品。采用稀释涂布法，将稀释后澄清的土壤上清液涂布于NA固体培养基上（每升含胰蛋白胨10 g，牛肉浸膏5 g，氯化钠10 g，琼脂粉15g，pH 8，121℃灭菌20min），28℃，培养3天，经过2轮筛选分离得到所述蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）HDCM2，该菌株的保藏编号CGMCC No：28574，保藏日期2023年9月28日，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
1 .2菌株的形态学鉴定
将菌株HDCM2的NA液体摇培物（OD600=0.8）5μL接种于NA固体培养基上，28℃过夜培养，可形成乳白色菌落，形态类似真菌菌落，且呈顺时针旋转生长（图1A）；其液体摇培物（发酵物）也类似真菌，能形成菌丝球（图1B），且有刺鼻的气味；显微镜下观察，其菌体细胞呈杆状，串生（图1C）。
1 .3菌株的分子生物学鉴定
挑取菌株HDCM2的一个单菌落加入到50μL的PCR反应体系中，并加入10 μmol/L的16SrRNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）各1 μL、2×Taq PCR Master Mix 25 μL和ddH2O 23 μL。混匀，进行PCR扩增，扩增条件为：95℃ 5 min； 95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，35个循环；72℃ 10 min。扩增产物经1％（w/v）琼脂糖凝胶电泳确定目的条带大小无误后，送至擎科生物科技有限公司进行测序。登录NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，对测序结果进行BLASTn比对分析，并利用MEGA 11.0的邻接法构建进化树，聚类结果显示，菌株HDCM2与蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）KX023234的序列一致性为99.86%，置信度为98%（图2）。因此，综合菌株HDCM2的菌落形态特征及分子生物学鉴定结果，将该菌株鉴定为蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）。
实施例2蕈状芽孢杆菌HDCM2的生长曲线
用牙签挑取菌株HDCM2在NA固体培养基上的单菌落，接种到装有40 ml NA液体培养基的100 ml三角瓶中，pH为8.0，180 rpm、28 ℃培养24 h，获得种子液。按1%（v/v）的接种量将种子液接种到40 ml的NA液体培养基中，180 rpm、28℃培养48h，获得OD600为2.0或以上的发酵液，稀释OD600至0.8后，用于下述实施例中。
吸取稀释好的发酵液400μl至装有40 ml NA液体培养基的100 ml三角瓶中，180rpm、28℃培养，每2小时测定一次OD600，24 h之后每24h测定一次OD600。以培养时间为横坐标、以OD600为纵坐标绘制蕈状芽孢杆菌HDCM2的生长曲线，结果显示，菌株HDCM2接种后的0~2 h为延迟期；2~24 h为对数增长期，之后菌株缓慢增长，24 h后进入稳定期，168h后开始进入衰亡期，如图3所示，其中，图3A为蕈状芽孢杆菌HDCM2在24小时内的生长曲线图；图3B为蕈状芽孢杆菌HDCM2在11天内的生长曲线图。
实施例3蕈状芽孢杆菌HDCM2摇瓶发酵条件的优化
3.1 最适生长温度
按照实施例2获得菌株HDCM2的发酵稀释液，取5 μl接种于NA固体培养基，分别置于4℃、10℃、19℃、25℃、28℃、37℃，培养48 h。结果发现，在 25℃~28℃温度范围内，菌株HDCM2均生长良好，其最适生长温度为28℃；而在4~19 ℃范围内，菌株HDCM2虽能生长，但生长缓慢，如图4所示。
3.2 最适生长pH
按照实施例2获得菌株HDCM2的发酵稀释液（OD600=0.8），以1%（v/v）的接种量分别接种于pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的NA液体培养基中，180rpm、28℃培养48 h，测定其OD600。结果发现，在pH 5~10之间，菌株HDCM2生长良好，发酵液的OD600值均能达到2.0或以上，其更适宜pH为7.0~8.0；在pH4.0和11.0条件下，菌株HDCM2虽能生长，但生长显著缓慢，如图5所示。
实施例4蕈状芽孢杆菌HDCM2的耐盐特性及应用
4.1蕈状芽孢杆菌HDCM2的耐盐特性
按照实施例2获得菌株HDCM2的发酵稀释液（OD600=0.8），以1%（v/v）的接种量接种于NaC1浓度依次为0、100、200、300、400、500、600、700、800、900和1000 mM的NA液体培养基中，180 rpm、28℃培养48 h，测定OD600。结果发现，在0~1000 mM 的NaCl 浓度范围内，菌株HDCM2均能生长；在 0~700 mM的NaCl 浓度范围内，菌株HDCM2发酵液的OD600值均能达到或超过2.0，尤其在0~500mM的NaCl浓度范围内生长最好；在 800~900 mM的NaCl 浓度范围内，菌株HDCM2发酵液的OD600值在1到2之间，生长较好；NaCl浓度为1000mM时，菌株HDCM2的生长显著缓慢，OD600值也能达到0.8。因此，NaC1浓度为0~700 mM时菌株HDCM2生长更优，如图6所示。
4.2蕈状芽孢杆菌HDCM2耐盐特性的应用
挑取50粒饱满的丽江新团黑谷水稻种子，整齐摆放在垫有无菌滤纸的10cm×10cm方皿中。按照实施例2获得菌株HDCM2的发酵稀释液（OD600=0.8），分别取三管各20ml发酵稀释液，5000rpm，离心10min，收集HDCM2菌体细胞；用0mM、100mM、200mM的无菌NaCl溶液各20ml重悬菌体；分别取NaCl菌悬液4ml转入上述含水稻种子的方皿，并以4ml的0mM、100mM、200mM无菌NaCl溶液作为对照。28℃，光照培养3天，统计萌发率。结果发现，NaCl不存在时，HDCM2菌悬液处理的水稻种子和对照组种子的萌发率无显著性差异；NaCl浓度为100mM时，HDCM2菌悬液处理种子的萌发率为72%，而对照组的萌发率为40%，差异极显著（p<0.01），HDCM2使水稻萌发率显著提高32%；NaCl浓度为200mM时，HDCM2菌悬液处理的种子萌发率为18%，对照组的萌发率仅为4%，虽然差异显著（p<0.05），能促进萌发，但萌发率总体相对偏低，如图7所示。因此，NaCl浓度为100mM时，菌株HDCM2的发酵液能极显著提高水稻种子的萌发率。
实施例5蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液在改良酸碱土中的应用
5.1酸性土壤的改良效果
称取酸性土壤10 g置于150 ml三角瓶，加入50 ml NA液体培养基和500μl按照实施例2获得的菌株HDCM2发酵稀释液（OD600=0.8），180 rpm、28℃培养，每24小时测定一次pH。结果发现，经过24小时，酸性土壤的pH由4.94变为7.41，且后续6天pH一直持续稳定在7.40~7.53之间，而对照组酸性土壤的pH值几乎没有变化，如图8所示。这说明菌株HDCM2的发酵液具有调节酸性土壤的pH接近中性，并使其pH保持稳定的潜能和应用。
5.2碱性土壤的改良效果
称取碱性土壤10 g置于150 ml三角瓶内，加入50 ml NA液体培养基和500μl按照实施例2获得的HDCM2发酵稀释液（OD600=0.8），180 rpm、28℃培养，每24小时测定一次pH值。经过24小时，碱性土壤的pH从9.85降低到8.35，后续6天pH一直稳定在8.35~8.46之间，而对照组碱性土壤的pH几乎没有变化，如图9所示。说明菌株HDCM2的发酵液具有调节碱性土壤的pH接近中性，并使其pH保持稳定的潜能和应用。
实施例6蕈状芽孢杆菌HDCM2的生防应用
6.1蕈状芽胞杆菌HDCM2有效抑制多种真菌的生长
将葡萄灰霉（Botrytis cinerea）、草莓暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）、玉米胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、梨轮纹菌(Physalospora piricola)、大豆疫霉（Phytophthora sojae）和马铃薯致病疫霉（Phytophthora infestans）这些植物病原真菌分别接种于直径为90 mm PDA固体培养基（土豆200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水补足1000 ml，添加浓度20 g琼脂粉，121 ℃灭菌20min）中央，28℃培养，待菌落长至直径4~5 cm用于打孔接种。采用平板对峙法，分别吸取5μL按照实施例2获得的菌株HDCM2发酵稀释液（OD600=0.8）和ddH2O滴于病原菌菌饼两侧20mm处，置于超净工作台中自然风干，28℃，黑暗倒置培养4~6天。采用十字交叉法测量病原真菌菌落的直径，按下式计算抑菌率：抑制率（％）＝（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径× 100%。 结果发现，菌株HDCM2对供试多种植物病原真菌均具有显著的抑菌效果，对葡萄灰霉菌（Botrytis cinerea）、草莓暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）、玉米胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、梨轮纹菌(Physalospora piricola)、大豆疫霉（Phytophthora sojae）和马铃薯致病疫霉（Phytophthora infestans）抑菌率分别为63.13%、60.78%、71.21%、57.56%、68.26%和76.72%，如图10所示。因此，菌株HDCM2具有广谱抑菌效果。
6.2蕈状芽胞杆菌HDCM2发酵液在葡萄灰霉离体接种时的生防效果
选取红地球葡萄的新鲜叶片，用无菌水冲洗3次，晾干表面水滴后，在每片叶面喷洒0.5 mL按照实施例2获得的菌株HDCM2发酵稀释液（OD600=0.8），以喷洒无菌NA液体培养基做空白对照，取直径为6 mm 的葡萄灰霉菌饼置于叶脉两侧，19℃，保湿培养3天。结果发现，喷施菌株HDCM2发酵液的叶片，葡萄灰霉病斑没有显著扩展，病斑面积仅为0.56cm2，而对照组的发病面积却高达6.37cm2，如图11所示，其中图11A为蕈状芽孢杆菌HDCM2发酵液在葡萄灰霉离体接种葡萄叶片上的防治效果图；图11B为葡萄灰霉离体接种的病斑面积图。这说明该菌株HDCM2发酵液可以有效抑制葡萄灰霉的侵染，降低葡萄灰霉病的发病程度。
6.3蕈状芽胞杆菌HDCM2发酵液在大豆疫霉离体接种时的生防效果
大豆黄化苗下胚轴接种时的生防效果：将合丰大豆种子播种于蛭石中，置于25℃（RH=60%-80%）黑暗条件下，培养5~7天，收集黄化苗。在每株大豆的下胚轴上喷洒0.1 mL按照实施例2获得的菌株HDCM2发酵稀释液（OD600=0.8），以喷洒无菌NA液体培养基做空白对照，在生长5天的大豆疫霉菌落边缘取直径为6 mm的菌饼，接种于上述大豆黄化苗下胚轴，每个处理接种20株黄化苗，25℃黑暗培养3天。结果发现，喷施菌株HDCM2发酵液的下胚轴，大豆疫霉病斑没有显著扩展，病斑长度仅为0.10cm，而对照组的病斑长度却高达4.60cm（图12A和图12C）。这说明该菌株HDCM2发酵液可以有效抑制大豆疫霉对大豆下胚轴的侵染，降低大豆疫病的发病程度。
离体叶片接种时的生防效果：将合丰大豆种子播种于蛭石中，置于25℃（RH=60%-80%）黑暗条件下，培养7~10天。选取叶龄相同和大小均匀的大豆叶片，在每片叶面喷洒0.5mL按照实施例2获得的菌株HDCM2发酵稀释液（OD600=0.8），以喷洒无菌NA液体培养基做空白对照，取直径为6 mm 的大豆疫霉菌饼接种于大豆叶脉中央，并以无菌NA培养基为空白对照，每个处理20片叶，25℃，保湿培养72 h。结果发现，喷施菌株HDCM2发酵液的大豆叶片，大豆疫霉病斑没有显著扩展，病斑面积仅为2.35cm2，而对照组的发病面积却高达5.75cm2（图12B和12D）。这说明该菌株HDCM2发酵液可以有效抑制大豆疫霉对大豆叶片的侵染，降低大豆疫病的发病程度。
实施例7蕈状芽孢杆菌HDCM2的促生效果
7.1 菌株HDCM2发酵液对生菜的促生效果
采用盆栽方式，挑选饱满的小奶油绿生菜种子，4℃春化24 小时后，播种于育苗盘；待生菜苗长至第二片真叶时，移栽至90 mm×65 mm花盆中，每盆一株；按照实施例2获得菌株HDCM2的发酵稀释液（OD600=0.8），进行灌根处理，每盆60mL，并以无菌NA液体培养基做空白对照，每个处理3株生菜苗。置于温室，定期浇水管理。本实验独立重复了3次。45天后发现，相对于浇灌NA液体培养基的对照组生菜，经菌株HDCM2发酵液处理的生菜的叶片数、鲜重和叶绿素含量均有显著提高（p<0.05），如图13C、图13D和图13E所示；但对株高无显著影响，如图13B所示。这些数据表明菌株HDCM2的发酵液对生菜具有显著的促生作用，如图13A所示。
7.2 菌株HDCM2发酵液对黄瓜的促生效果
采用盆栽方式，挑选饱满的中农2号黄瓜种子，4℃春化24 小时后，播种于育苗盘中；待黄瓜苗生长至第二片真叶时，移栽到25 cm×16.5 cm花盆中，每盆一株；按照实施例2获得菌株HDCM2的发酵稀释液（OD600=0.8），进行灌根处理，每盆20mL；并以无菌NA液体培养基做空白对照，每个处理3株黄瓜苗。将处理好的黄瓜苗放置于温室，定期浇水管理。本实验独立重复了2次。14天后发现，相对于浇灌NA液体培养基的对照组黄瓜苗，经菌株HDCM2发酵液处理的黄瓜幼苗的株高和叶绿素均有显著提高（p<0.05），如图14A、图14B和图14C所示，这表明菌株HDCM2的发酵液对黄瓜幼苗具有显著的促生作用，如图14所示。
Claims (7)
1. 一种蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）HDCM2，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：28574，保藏日期为2023年9月28日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种含有如权利要求1所述蕈状芽孢杆菌HDCM2的发酵液。
3.如权利要求2所述发酵液的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：
挑取所述蕈状芽孢杆菌HDCM2的单菌落接种于液体营养琼脂培养基NA中，180 rpm，过夜培养得到种子液；将种子液接种于所述液体营养琼脂培养基NA液体培养基中，接种量1％，v/v，180rpm，培养48小时，得到蕈状芽孢杆菌HDCM2的摇瓶发酵液；培养条件pH为5.0~10.0，培养温度为25~28℃。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养条件中pH为 7.0~8.0，培养温度为28℃。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养基中装液量为40%。
6.一种含有如权利要求1所述的蕈状芽孢杆菌HDCM2，或如权利要求2所述发酵液的制剂。
7. 如权利要求1所述的蕈状芽孢杆菌HDCM2、或如权利要求2所述的发酵液、或如权利要求6所述的制剂在耐盐、酸土和碱土的改良、植物真菌病害的防治，以及促进植物生长中的应用；在耐盐方面，适宜蕈状芽孢杆菌HDCM2生长的NaCl浓度为0~700 mM，在100mM NaCl盐胁迫环境下，蕈状芽孢杆菌HDCM2的发酵液能极显著提高水稻种子的萌发率；在植物真菌病害防治方面，所述植物真菌病害的病原真菌为葡萄灰霉（Botrytis cinerea）、草莓暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）、梨轮纹菌(Physalospora piricola)和玉米胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、大豆疫霉（Phytophthora sojae）和马铃薯致病疫霉（Phytophthora infestans）；在促进植物生长方面，所述植物为黄瓜或者生菜。
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