CN115851534B - 一株烟草根际贝莱斯芽孢杆菌及在烟草病害防控中的应用 - Google Patents
一株烟草根际贝莱斯芽孢杆菌及在烟草病害防控中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于农业微生物领域，公开了一株烟草根际贝莱斯芽孢杆菌及在烟草病害防控中的应用，所述的菌株的保藏编号为CCTCC NO:M 20211651。该菌株首次被报道可同时用于烟草黑胫病、根腐病、青枯病、赤星病、炭疽病和线虫的防治，与现有杀菌剂和杀虫剂无交互抗药性。与目前使用化学合成农药防治相比，由于其来自于自然环境，具有高效、低毒、不污染环境和不易产生抗药性等优点，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于农业微生物领域，具体涉及一株烟草根际贝莱斯芽孢杆菌及在烟草病害防控中的应用。
背景技术
由于耕地有限和经济利益的驱动，多数烟区存在连作种植习惯，连作已成为烟草种植地区的主要种植模式。长期连作和大量使用化学肥料等原因导致植烟土壤逐渐退化，生产力下降、病害加重、烟叶品质降低等问题。大量研究表明，长期连作会造成烟田土壤养分与土壤微生物区系非均衡性变化，土壤细菌多样性与均匀度降低，导致土传病原菌大量繁殖以及土壤酶活性下降，对作物的生长和优质生产极为不利。烟草黑胫病、青枯病和根结线虫是烟草的主要土传病害，在烟区普遍发生，并导致大量减产。近几年，近年来，镰刀菌根腐病在我国烟区的发病范围和发病程度呈上升趋势，在云南、河南、湖南、山东、贵州、福建、湖北、安徽等地均有发生，严重地块造成绝收。另外，烟草土传病害存在混合发生的情况，增加了防治的难度，进一步加重了土传病害的危害。烟草土传病害的防控主要依靠化学杀菌剂，易造成环境污染和病原菌抗药性，同时破坏烟草根际微生物群落，而有研究表明，土传性病害发生与土壤细菌多样性及种群结构的变化有直接关系。生物防治作为一种新型的病害防治措施，不仅对植物具有防病促生的作用，而且能有效克服生产中存在的农药残留和病菌抗药性问题。另外，微生物菌剂具有调控植物根际微生物群落结构功能，形成不利于病害发生的土壤微生物群落结构即“抑菌土”。
针对上述问题本发明分离出一株新的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisYC11，对烟草黑胫病、青枯病、根腐病和根结线虫均具有良好的防效，同时在烟草根系具有较好的定殖能力，并具有一定的耐酸性，在烟田具有良好定殖能力。对烟草黑胫病、青枯病、根腐病和根结线虫均具有良好的防控效果，并兼具对烟草地上部病害赤星病、炭疽病和病毒病达到防控效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种分离的贝莱斯芽孢杆菌，所述芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌YC11，其保藏编号为CCTCC NO:M20211651。所述贝莱斯芽孢杆菌可用于烟草黑胫病、青枯病、根腐病、赤星病、炭疽病等烟草病害的防治。
本发明的另一个目的在于提供贝莱斯芽孢杆菌YC11的在制备植物病原菌抑制剂或是线虫杀虫剂中的应用，特别是用于制备防治烟草病害药物。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案来实现：
一种分离的芽孢杆菌，从烟草根际分离，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis，已于2021年12月20日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis YC11；保藏编号为CCTCC NO:M20211651；地点：中国武汉武汉大学。
菌株在NA培养基上生长良好，淡黄色单菌落(图1)。
本发明的保护范围还包括贝莱斯芽孢杆菌YC11的发酵液，获得发酵液过程中使用的培养基包括但不限于LB培养基、或培养基：玉米粉12-14g/L、鱼粉14-16g/L、酵母粉14-16g/L、玉米浆4-6g/L、0.3-1g/L、磷酸二氢钾0.2-0.5g/L，pH6-7。
本发明的保护内容包括：
贝莱斯芽孢杆菌YC11或其发酵液或其发酵上清在防治烟草病害中的应用；
以上所述的应用中，其应用方式是将含有贝莱斯芽孢杆菌YC11或其发酵液或其发酵上清的制剂，对烟草进行灌根处理，或是直接喷施。
贝莱斯芽孢杆菌YC11或其发酵液或其发酵上清在制备烟草病害生防制剂中的应用；
以上所述的应用中，所述的烟草病害包括但不限于由烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)、镰刀菌(Fusarium sp.)、劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、链格孢菌(Alternariasp.)、烟草炭疽菌(Colletotrichum nicotianae)和/或烟草线虫导致的病害。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌，该菌株首次被报道可用于同时防治烟草黑胫病，青枯病、根腐病、赤星病、炭疽病和线虫病的防治。
(2)本发明的贝莱斯芽孢杆菌在ph4的环境下具备良好的耐受性，且具有烟田土壤和烟草根际的定殖能力，与现有杀菌剂和杀虫剂无交互抗药性。
(2)与目前使用化学合成农药防治相比，由于其来自于自然环境，具有高效、低毒、不污染环境和不易产生抗药性等优点。
附图说明
图1贝莱斯芽孢杆菌YC11菌株孢子和菌落形态示意图。
图2贝莱斯芽孢杆菌YC11离体抑菌作用。
图3贝莱斯芽孢杆菌YC11菌剂防治烟草黑胫病效果示意图。
图4贝莱斯芽孢杆菌YC11菌剂防治烟草青枯病效果示意图。
图5贝莱斯芽孢杆菌YC11的耐酸性。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
贝莱斯芽孢杆菌YC11的获得及鉴定
一株分离的芽孢杆菌，从恩施宣恩县烟草根际土壤分离得到，经分子生物学(16srDNA和gyrA基因)鉴定结合生理生化鉴定后属于贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis(图1，表1，表2，表3和表4)，已于2021年12月20日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensisYC11；保藏编号为CCTCC NO:M20211651；地点：中国，武汉，武汉大学。
在本发明中，贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis YC11或被简称为YC11。
表1：菌株YC11 16S rRNA基因测序BLAST结果
表2：gyrA基因测序BLAST结果
表3：菌株YC11生理生化特性–酶活、碳源氧化
+：阳性反应；-：阴性反应；
表4：菌株YC11生理生化特性–利用碳源产酸
+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应
实施例2：
贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis YC11对烟草病害病原菌的离体抑菌活性
烟草真菌病害病原菌从斜面活化至PDA平板，30℃培养6d备用。将YC11单菌落转至NB培养基，35℃，180rpm摇床振荡培养12h。发酵液10μL滴于PDA平板两端，24h后用4mm打孔器接入上述病原菌菌碟，以接培养基菌碟作为空白对照，病原菌和YC11菌碟距离为25mm。待对照长满平板后统计各处理和对照菌落直径，并计算抑菌率，病原菌为表5所示。
抑菌率＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100％
劳尔氏菌从甘油管划线得到单菌落后转入NB液体培养基摇床180r/min 37℃震荡培养48h后备用。将NA培养基融化后约45℃后倒入平板，随后加入劳尔氏菌菌液，NA和菌液比例为50:1，并充分混匀。随后在平板滴入YC11发酵液10μL，每个平板3个点，放入37℃培养48h观察是否产生抑菌圈，结果如图2所示，有明显的抑菌圈。
表5：YC11离体抑菌活性
通过离体抑菌试验表明，YC117对烟草病害病原菌烟草疫霉、尖孢镰刀菌、烟草炭疽菌、链格孢菌和劳尔氏菌病原菌具有良好的抑菌活性(表5，图2)。
实施例3：
贝莱斯芽孢杆菌YC11防控烟草黑胫病
YC11斜面菌种30℃活化后接种一环入LB液体培养基中，温度30℃、摇床转速180r/min条件下培养16h，作为摇瓶发酵的种子。种子按1％(v/v)接种量接至摇瓶发酵培养基中，温度30℃、转速180r/min培养至芽胞脱落20％时发酵结束，发酵液芽孢数为120亿cfu/mL，用于以下实施例。
发酵培养基组成如下：玉米粉13.74g/L、鱼粉15.00g/L、酵母粉15.73g/L、玉米浆5.00g/L、硫酸镁0.59g/L、磷酸二氢钾0.30g/L，pH7。
将烟草种子直播于32孔穴盘，温室常规培养，15d后移栽于育苗钵中，30d后用于盆栽试验。将烟草疫霉从斜面活化到PDA平板，随后在V8平板扩繁，28℃光照培养12d后刷取孢子，放入4℃冰箱半小时取出，用血球计数板将孢子调整至105孢子/ml备用。
YC11发酵液原液灌根，灌根量20ml/株，48h后接种烟草疫霉孢子，3ml/棵。处理设3次重复，每个重复15棵苗，清水作为对照，15d后统计对照和处理病情指数，并计算发病率。
烟草黑胫病病情指数分级标准参照中华人民共和国烟草行业标准(YC/T39-1996)
病情指数＝∑(各级植株数×级别)/(调查总株数×最高代表级别)×100。
防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％
盆栽生测结果显示YC11菌剂对烟草黑胫病防效为100％(图3)。
实施例4：贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis YC11防控烟草青枯病
将烟草种子直播于32孔穴盘，温室常规培养，15d后移栽于育苗钵中，45d后用于盆栽试验。将劳尔氏菌从甘油管活化至NA平板，随后将单菌落转只NB液体制备菌悬液，将浓度调至种3×108cfu/mL备用。
YC11菌剂原液灌根，灌根量20ml/株，48h后接种烟草青枯病菌悬液，20ml/棵。处理设3次重复，每个重复15棵苗，清水作为对照，待对照充分发病后后统计对照和处理病情指数，并计算发病率。
烟草青枯病病情指数分级标准参照中华人民共和国烟草行业标准(YC/T39-1996)
病情指数＝∑(各级植株数×级别)/(调查总株数×最高代表级别)×100。
防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％
盆栽生测结果显示YC11菌剂对烟草青枯病防效为100％(图4)。
实施例5：贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis YC11防控烟草线虫
试验位于湖北省枣阳市，烟草移栽定植10d后灌根YC11菌剂200倍稀释液，每隔10d灌根一次，200mL/棵，对照灌清水，每个处理3次重复，每个重复40m2，试验共灌根3次，采收前统计各处理根结指数并计算防效。
烟草病害发生情况按GB/23222—2008烟草病虫害分级及调查方法进行调查。
根结指数＝∑(各级植株数×级别)/(调查总株数×最高代表级别)×100。
防治效果＝(对照根结指数-处理根结指数)/对照根结指数×100％
试验结果表明，YC11菌剂对烟草根结线虫具有良好的防控效果，防效达60.24％(表6)表6：YC117菌剂对烟草根结线虫田间防效
| 处理 | 根结指数 | 防效(％) |
| YC117 | 17.65 | 60.24 |
| 对照 | 44.39 | - |
实施例6：
贝莱斯芽孢杆菌YC11耐酸性及在烟田酸性土壤的定殖能力
将YC11发酵液在pH4的NA划线，对照菌株为贝莱斯芽孢杆菌CY30(CN110564646A)；同时以pH7平板涂布YC11发酵液做对照(CK)，观察菌株耐酸能力。结果表明，YC11菌株在pH4的NA平板生长良好，而CY30菌株在pH4的NA平板无法生长，YC11在pH7平板上生长良好(图5)，说明YC11菌株具有较好的耐酸性。
将YC11和贝莱斯芽孢杆菌CY30在含不同梯度浓度利福平LB平板进行抗性突变体筛选，获得抗性突变菌株，获得的抗性菌株除了具备利福平抗性，其余性质与原始菌株相同，按实施例3对抗性突变菌株进行发酵。
采集烟田土壤，pH为4.5，将上述2个菌株发酵液调至1亿cfu/mL，分别与烟田按照1：50(v/m)混合，28℃放置15d后采用土壤稀释法，涂布抗性平板，对土壤中YC11和CY30计算。
结果表明，YC11芽孢数量约为0.032亿/g，CY30为0.009亿/g，说明YC11在烟田土壤具有良好的定殖能力，而CY30在烟田定殖能力较差。
实施例7：
贝莱斯芽孢杆菌YC11在烟草根部定殖能力
将YC11和贝莱斯芽孢杆菌CY30在含不同梯度浓度利福平LB平板进行抗性突变体筛选，获得抗性突变菌株，获得的抗性菌株除了具备利福平抗性，其余性质与原始菌株相同，按实施例3对抗性突变菌株进行发酵。将烟草在育苗钵培养至6叶期备用，将抗性YC11和CY30发酵液原液(均为120亿cfu/mL)稀释5倍灌根，10mL/棵，14d后取出植株，用无菌水反复冲洗根部3次，将根部剪下并称取1g，研磨并稀释后，涂布于含300μg·mL-1的利福平的LB平板，37℃培养24h后计数，测定YC11和CY30在烟草根系的定殖能力。
结果表明，YC11在烟草根部定殖量为9.36×106cfu/g，而CY30仅为4.1×102cfu/g。YC11这种定殖能力有助于烟草土传病害的防控。
Claims (7)
1. 一种分离的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），所述贝莱斯芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO: M20211651。
2.由权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵制备的发酵液，所述的发酵液含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌活菌。
3.根据权利要求2所述的发酵液，获得发酵液过程中使用的培养基为发酵培养基，其组分包括：玉米粉12-14g/L、鱼粉14-16g/L、酵母粉14-16g/L、玉米浆4-6g/L、硫酸镁0.3-1g/L、磷酸二氢钾0.2-0.5g/L，pH6-7。
4.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的发酵液在防治烟草病害中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其应用方式是将含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或其发酵液的制剂，对烟草进行灌根处理，或是直接喷施。
6.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的发酵液在制备烟草病害生防制剂中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，所述的烟草病害为由烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）、链格孢菌（Alternaria sp.）、烟草炭疽菌（Colletotrichum nicotianae）和/或烟草线虫导致的病害。
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