CN116004419A - 一株萎缩芽孢杆菌cy-2、菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及疮痂病生物防治技术领域，具体涉及一株萎缩芽孢杆菌CY‑2、菌剂及其制备方法和应用，萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)CY‑2在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)的保藏编号为CGMCC NO.25057，实验证明，萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)CY‑2培养周期短，固氮且耐盐碱，能快速在土壤中定殖，抑制疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)的生长。在盆栽试验中萎缩芽孢杆菌CY‑2对马铃薯疮痂病的防治效果达51.51％，在马铃薯疮痂病的生物防治中有良好的应用前景。

Description

一株萎缩芽孢杆菌CY-2、菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及疮痂病生物防治技术领域，尤其涉及一株萎缩芽孢杆菌CY-2、菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

马铃薯疮痂病是由致病性疮痂链霉菌(Streptomyces spp.)引起的一种土传性病害，表现症状是在马铃薯表面形成凸起或凹陷的结痂，影响马铃薯商品价值，并且带病马铃薯会侵染储存期健康的马铃薯及土壤，增加了经济损失且造成土壤污染。马铃薯疮痂病的防治措施如化学防治、熏蒸、降低土壤pH、轮作、选育抗病品种等，虽有一定的防治效果，但都存在一定的局限性。植物病害的生物防治被认为是一种安全无污染，高效无毒的防治措施，符合绿色农业可持续发展的需求，其中因微生物制剂对环境影响低，防治效果显著而备受关注。

微生物菌剂是一种新型绿肥，根据微生物的生理生化特性开发成不同功能的菌剂产品。微生物菌剂在农业生产、畜牧业养殖、环境治理、土壤改良等方面有良好的应用前景。微生物菌剂可以提高土壤酶活性，加速土壤养分转化，提高土壤肥力，改善土壤条件，提高农作物产量。由植物根际促生细菌制成的微生物菌剂能够定殖于植物根际及根际土壤中，通过多种方式促进植物生长，提高植物抵抗力。植物根际促生细菌在植物根际可以稳定定殖，形成生物膜，分泌植物生长调节物质和抑菌活性物质，改变植物根际土壤菌群组成，招募更多植物有益菌，与病原菌竞争生态位，抑制病原菌的生长，提高植物的抗病能力，预防植物病害的发生。

然而，现有技术中构建得到的萎缩芽孢杆菌在用于预防疮痂链霉菌所引起的马铃薯疮痂病时，形成的抑菌圈面积有待增加，防治效果也有待提升。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一株萎缩芽孢杆菌CY-2、菌剂及其制备方法和应用，以解决现有萎缩芽孢杆菌防治效果不佳的问题，同时还具有固氮效果。

基于上述目的，本发明提供了一株萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)其名称为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)CY-2，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)的保藏编号为CGMCCNO.25057，保藏时间为2022年06月10日。

本发明还提供一种萎缩芽孢杆菌菌剂，所述菌剂包括所述萎缩芽孢杆菌CY-2。

优选的，所述菌剂中的活菌数≥10⁶CFU/ml。

本发明还提供所述萎缩芽孢杆菌菌剂的制备方法，采用细菌培养基培养所述萎缩芽孢杆菌CY-2得到所述菌剂，培养条件为27～37℃，180～220rpm培养1-3天。

所述细菌培养基为LB培养基。所述LB培养基可为利用酵母粉、蛋白胨、氯化钠制备得到的培养基。所述LB培养基各组分浓度可分别为0.5％、1％、1％。

所述菌剂中，所述活性成分可以为被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞与滤液的混合物的形式存在。

本发明还提供所述萎缩芽孢杆菌CY-2或所述菌剂在防治马铃薯疮痂病中的应用。

所述萎缩芽孢杆菌CY-2或菌剂用于抑制马铃薯疮痂链霉菌的生长和孢子的萌发。

在防治马铃薯疮痂病时，施用浓度为CY-2活性菌数量≥10⁶CFU/ml的萎缩芽孢杆菌。

施用方法为灌根或喷施。施用时期为马铃薯发病初期。

本发明还提供所述萎缩芽孢杆菌CY-2或所述菌剂在生物固氮和复合菌肥中的应用。

本发明的有益效果：采用本发明的萎缩芽孢杆菌CY-2制成的微生物菌剂可以有效的抑制疮痂链霉菌，定殖能力强，能在短时间内定殖于根际土壤中形成生物膜。在实验室试验中，萎缩芽孢杆菌CY-2抑制疮痂链霉菌抑菌圈达22mm，抑制率为56％。盆栽试验中，马铃薯疮痂病的发病率由75％下降到55.56％，防治效果为51.5％。适合用于防治种植期疮痂链霉菌侵染马铃薯形成疮痂影响马铃薯的品质及预防带病马铃薯在储存期侵染土壤，造成土壤污染，影响作物种植。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明萎缩芽孢杆菌CY-2对疮痂链霉菌4.1765的抑制效果图；

图2为本发明萎缩芽孢杆菌CY-2在LB培养基中培养的前期效果图；

图3为本发明萎缩芽孢杆菌CY-2在Ashby无氮培养基中的生长结果图；

图4为本发明萎缩芽孢杆菌CY-2的耐盐结果图；

图5为本发明萎缩芽孢杆菌CY-2的pH敏感性测试结果图；

图6为本发明萎缩芽孢杆菌CY-2在载玻片上形成生物膜的结果图；

图7为本发明萎缩芽孢杆菌CY-2防治马铃薯疮痂病的盆栽效果图；

图8为本发明萎缩芽孢杆菌CY-2和其他生防菌复合使用防治马铃薯疮痂病的效果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

需要说明的是，除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

ISP-2培养基：酵母提取物4.0g,麦芽提取物10.0g，葡萄糖4.0g，琼脂15.0g,蒸馏水1000ml，pH 7.3。

LB液体培养基：酵母粉5.0g,蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g,蒸馏水1.0L，pH 7.0。

LB固体培养基:酵母粉5.0g,蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g,琼脂15.0g,蒸馏水1.0L，pH 7.0。

明胶液化试验所用培养基：蛋白胨5g，明胶100-150g，蒸馏水1000ml，115℃蒸汽灭菌20min。

实施例1

马铃薯疮痂链霉菌拮抗菌株的分离、鉴定及保藏

一、菌株分离

1、土壤样品的处理

萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)分离自网购山东临沂带病土豆附着土壤。取1g土样加入100ml无菌水中，37℃200rpm震荡1h，此为稀释100倍的土壤悬浮液。在超级工作台中对土壤悬浮液进行梯度稀释，分别取50ul的10^-4、10^-5、10^-6、10^-7倍土壤稀释样品涂布在LB固体培养基上，置于37℃培养箱中培养过夜。挑选出不同形态、颜色、大小的单菌落在LB平板上三区划线进行菌种的第一步纯化，置于37℃培养箱中过夜培养。再将长出的单菌落进行两次三区划线以确保纯种，将纯化后的菌株置于15％的甘油中保存。

2、病原菌孢子悬浮液的制备

取病原菌疮痂链霉菌4.1765(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为：CGMCC NO.4.1765)，接种于ISP-2培养基中30℃培养7天，用无菌接种环刮取适当孢子于1ml无菌水中用漩涡振荡器混匀后置于4℃冰箱中备用。

3、筛选结果

完成步骤1和步骤2后采用平板对峙的方法筛选拮抗菌，挑取出现抑菌圈的菌落，在LB固体培养基中进一步纯化。

将筛选到的一株细菌命名为拮抗菌CY-2(萎缩芽孢杆菌CY-2)。

二、鉴定

1、形态学鉴定

将得到的拮抗菌接种于LB固体培养基中，37℃倒置培养，24h后观察单菌落的形态。

如图2所示，拮抗菌CY-2(萎缩芽孢杆菌CY-2)为杆状革兰氏阳性细菌，菌落前期为乳白色不透明，无褶皱，后期菌落变为微黄色有褶皱，有黑色素产生，接触酶实验为阳性，能使明胶液化。

2、16SrDNA序列同源性比对

根据细菌基因组DNA提取试剂盒[天根-DP302-02]的相应步骤提取待测菌株基因组DNA，送至通用生物(安徽)股份有限公司对待测菌株16SrDNA进行扩增并测序。

拮抗菌CY-2(萎缩芽孢杆菌CY-2)的16SrDNA如序列表中的序列1所示。

16SrDNA基因序列分析，经过NCBI序列比对鉴定，菌株CY-2与萎缩芽孢杆菌的同源性最高，达到100％。

拮抗菌CY-2(萎缩芽孢杆菌CY-2)为萎缩芽孢杆菌。

三、保藏

步骤一筛选得到的细菌已于2022年06月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.25057细菌CY-2的全称为萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)CY-2CGMCCNO.25057，简称为萎缩芽孢杆菌CY-2。

菌株对疮痂链霉菌(Stretpomyces scabies)的抑制作用

采用滤纸片法观察萎缩芽孢杆菌CY-2对疮痂链霉菌(Stretpomyces scabies)的抑制作用。

马铃薯疮痂病病原菌4.1765(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏编号为：CGMCC NO.4.1765)在马铃薯培养基上30℃培养7天；用1ml无菌水刮取适量孢子和菌丝体，制成一定浓度的病原菌悬液，取50ul病原菌悬液均匀涂布于ISP-2固体培养基上。

将从土壤中筛选出的菌株CY-2接种到LB液体培养基，于37℃200rpm震荡培养24h。用酒精灼烧的镊子夹取直径为6mm的无菌滤纸片放在涂有病原菌的平板上，用移液枪吸取4μL的供试菌株发酵液加到培养皿的滤纸片上，LB液体培养基为阴性对照，置于30℃培养箱中培养5-6d。观察是否有抑菌圈出现，并用十字交叉法测量抑菌圈直径，做好试验记录。

抑制率＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100％

如图1所示，萎缩芽孢杆菌能有效抑制马铃薯疮痂链霉菌(Stretpomycesscabies)的生长和孢子的萌发，抑制直径达22mm，抑制率为56％。

菌株固氮能力试验

Ashby无氮培养基(g/L)：磷酸二氢钾0.2g，硫酸镁0.2g，NaCl 0.2g，碳酸钙5.0g，葡萄糖10g，硫酸钙0.1g，琼脂20g，pH自然。

用无菌移液枪枪头挑取单菌落接种于阿什比无氮培养基于37℃下倒置培养，四天后观察其结果。结果如图3所示，萎缩芽孢杆菌CY-2能在阿什比无氮培养基中稳定生长，其菌落直径为1.5mm，周围有微黄色晕染圈。萎缩芽孢杆菌CY-2能利用空气中的氮，将无效氮转化为有效氮，提高土壤中的有效氮，促进植株生长。

菌株对不同pH的敏感性测试

将LB液体培养基的初始pH调至3，4，5，6，7，8，9，10，11。将种子培养液按1％的接种量接种到不同初始pH的LB液体培养基中，每个变量重复三组，37℃200rpm震荡培养24h，观察特测菌株生长情况，将发酵液稀释6倍后，测定其浓度OD₆₀₀。

结果如图4，萎缩芽孢杆菌CY-2的正常pH生长范围为5～10，当pH达到11时，萎缩芽孢杆菌CY-2虽受酸胁迫的影响较大，仍能缓慢生长。盐碱地分为轻盐碱地、中度盐碱地和重盐碱地，其中重盐碱地的pH为9.5以上，萎缩芽孢杆菌CY-2在pH达到10时仍能正常生长，可以作为盐碱地的微生物菌剂，改善土壤条件，增强土壤肥力，促进盐碱地作物生长，降低经济损失。

菌株耐盐测试实验

将种子培养液按1％的接种量接种到含有不同浓度NaCl(2％、5％、7％、10％、12％、15％)的LB液体培养基中，每个变量重复三组，37℃200rpm震荡培养24h,观察待测菌株的生长情况，并测定浓度OD₆₀₀。

结果如图5，萎缩芽孢杆菌CY-2的菌液浓度随着盐浓度的增加而降低，当盐浓度达到12％时，萎缩芽孢杆菌CY-2仍能正常生长，说明萎缩芽孢杆菌CY-2具有耐盐性，能在环境较为恶劣的盐碱地中定殖生长，可以作为盐碱地的微生物菌剂。

菌株聚集趋化成膜

将过夜培养的菌液稀释一定倍数备用，在无菌培养皿中放置一片无菌载玻片，将稀释后的菌液倒入培养皿中与玻片齐平，置37摄氏度培养24h。用无菌生理盐水冲洗带有菌落的载波片，甲醇固定30min，弃甲醇，用无菌水冲洗3次，用0.1％结晶紫染色10min，弃染液，用无菌水冲洗3次。

结果如图6所示，萎缩芽孢杆菌CY-2在培养24h后，菌株定殖于载玻片，载玻片上黏附大量细菌，并聚集形成菌落，逐渐形成生物膜。萎缩芽孢杆菌CY-2定殖能力强，以植物根际分泌物为营养物质趋向植物根际生长，形成生物膜建立种群，抑制病原微生物的生长。

盆栽实验

挑选健康的马铃薯，用清水清洗干净，用75％的酒精对马铃薯表面进行消毒，然后用无菌水冲洗数次，通风晾干。用无菌的手术刀将马铃薯切成大小相似的块茎且每个块茎上有1-2个芽眼，挑取芽长长度较统一的块茎进行播种。病原菌孢子悬浮液的浓度为10⁶CFU/ml，萎缩芽孢杆菌CY-2发酵液的菌浓OD₆₀₀为0.4，试验组分为4组：CK：以等量无菌水处理的薯块盆栽作为空白对照，SS：浇灌50ml孢子悬浮液，CY：浇灌100mlCY-2的发酵液，SC：浇灌50ml孢子悬浮液+100mlCY-2的发酵液。栽培10天后对出苗马铃薯进行接种病原菌和生防菌的灌根处理，栽种3个月后收获成熟的马铃薯并进行病情分析，计算发病率、病情指数和防治效果。

发病率＝发病粒数/马铃薯总数×100％

病情指数＝∑(每级患病马铃薯数×每级数值)/(马铃薯总数×最高病级数)×100％；

防治效率＝(对照组病情指数－处理组病情指数)/对照组病情指数×100％。

表1马铃薯疮痂病分级标准

结果如图7所示，CK组和CY组没有侵染马铃薯疮痂病，SS组的病情指数为34.38％，发病率为75％，SC组的病情指数为16.67％，发病率为55.56％。萎缩芽孢杆菌CY-2对马铃薯疮痂病的防治效果为51.51％。萎缩芽孢杆菌CY-2能降低马铃薯疮痂病的发病率，改善病情，在防治马铃薯疮痂病上有较好的应用前景。

萎缩芽孢杆菌CY-2在复合菌肥中的应用

接种适量萎缩芽孢杆菌CY-2和菌株CY-1于同一LB液体培养基中，180rpm37℃培养24h。用酒精灼烧的镊子夹取直径为6mm的无菌滤纸片放在涂有病原菌的平板上，用移液枪吸取4μL的复合菌剂发酵液于培养皿的滤纸片上，置于30℃培养箱中培养5-6天，观察抑菌圈直径大小。

结果如图8所示，复合菌液拮抗疮痂链霉菌的直径达27mm,萎缩芽孢杆菌CY-2可以与其他生防菌复合使用制成微生物复合菌剂以进一步提高拮抗病原菌的能力。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本发明旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株萎缩芽孢杆菌CY-2，其特征在于，所述萎缩芽孢杆菌CY-2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.25057。

2.一种萎缩芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述萎缩芽孢杆菌CY-2。

3.根据权利要求2所述萎缩芽孢杆菌菌剂，其特征在于，所述菌剂中的活菌数≥10⁶CFU/ml。

4.根据权利要求2或3所述萎缩芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，采用细菌培养基培养所述萎缩芽孢杆菌CY-2得到所述菌剂，培养条件为27～37℃，180～220rpm培养1-3天。

5.根据权利要求4所述萎缩芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，所述细菌培养基为LB培养基。

6.权利要求1所述萎缩芽孢杆菌CY-2或权利要求2-3任一项所述菌剂在防治马铃薯疮痂病中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述萎缩芽孢杆菌CY-2或菌剂用于抑制马铃薯疮痂链霉菌的生长和孢子的萌发。

8.根据权利要求6所述应用，其特征在于，在防治马铃薯疮痂病时，施用浓度为CY-2活性菌数量≥10⁶CFU/ml的萎缩芽孢杆菌。

9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，施用方法为灌根或喷施。

10.权利要求1所述萎缩芽孢杆菌CY-2或权利要求2-3任一项所述菌剂在生物固氮和复合菌肥中的应用。

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