CN107467075B - 一种短小芽孢杆菌作为水稻生长促进剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种短小芽孢杆菌作为水稻生长促进剂的用途，所述短小芽孢杆菌于2010年8月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号：CCTCC M2010202。本发明发现该短小芽孢杆菌在不同浓度下对水稻芽期和苗期的生长具有促进作用，促进能力卓越，效果显著，实施方法简便，绿色安全无污染，在水稻种植领域有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种短小芽孢杆菌作为水稻生长促进剂的用途。
背景技术
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)为芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、短小芽孢杆菌属，是自然界中广泛存在的非致病细菌，具有繁殖快、代谢迅速的特点，生理特性丰富多样，是土壤和植物微生态的优势种群，可以产生丰富的具有潜在植物病害防治价值的抗菌物质，是植物病害生防微生物的重要成员。其对有机质分解力强，增殖的同时会释放出高活性的分解酵素，合成多种有机酸、酶、生理活性等物质，促进作物生长。
水稻是世界上仅次于小麦的第二大粮食作物，全世界超过50％的人口都以稻米为主食，因此发展水稻生产对于保障全球粮食平稳生产与供应具有十分重要的意义，如何调节水稻生长，保障水稻稳产高产，是全球广泛关注的研究课题。
短小芽孢杆菌在农业领域的相关专利包括：CN 106577772 A公开了一种新型生物种衣剂及其应用，所述的生物种衣剂通过多粘类芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和短小芽孢杆菌三种微生物的协同作用，显著提高水稻、玉米等农作物种子的发芽率和成秧率，且对地下害虫的防治效率超过95％。CN 104789509 A涉及一种从杜仲植物活体中采用内生细菌微生物分离技术分离获得的短小芽孢杆菌，该菌株能够对植物病原真菌有明显的抑制作用，也可以促进苗期小麦植株生长，在防治小麦纹枯病中和促进小麦生长中有重要应用。CN105925497 A公开了一株短小芽孢杆菌及其在解磷解钾产酸中的应用。短小芽孢杆菌能够显著地促进水稻、油麦菜等作物的生长，可应用于各种农作物种植领域。
发明内容
基于上述已有技术，本发明提供一种短小芽孢杆菌作为水稻生长促进剂的用途，该短小芽孢杆菌的不同浓度在水稻的不同时期发挥促进生长的作用，促进能力卓越，效果显著，实施方法简便，绿色安全无污染。
第一方面，本发明提供短小芽孢杆菌作为水稻生长促进剂的用途；
在本发明中，所述生长促进剂可以为短小芽孢杆菌直接作为生长促进剂促进水稻的生长，也可以将短小芽孢杆菌进行发酵，将得到的发酵液制备为生长促进剂，发明人发现，所述生长促进剂在不同浓度对水稻芽期和苗期都具有生长促进作用；发酵液浓度在108cfu/mL时能明显提高水稻发芽率和发芽势，发芽率可达98％，发芽势可达64％；发酵液浓度在106cfu/mL对水稻苗长的促进作用明显，增高率达到5％，对水稻根长促进作用明显，根增长率为6.4％。
所述短小芽孢杆菌为发明人筛选并于2010年8月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号：CCTCC M2010202，保藏地址：中国武汉大学。所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)QHS-X8的具体信息在专利201010512757.0中有详细记载。
根据本发明，所述促进剂包括采用短小芽孢杆菌QHS-X8制备的发酵液；
优选地，所述发酵液的浓度为105-109cfu/mL，例如可以是105cfu/mL、2× 105cfu/mL、3×105cfu/mL、4×105cfu/mL、6×105cfu/mL、8×105cfu/mL、 106cfu/mL、2×106cfu/mL、4×106cfu/mL、6×106cfu/mL、8×106cfu/mL、 107cfu/mL、2×107cfu/mL、4×107cfu/mL、6×107cfu/mL、8×107cfu/mL、 108cfu/mL、2×108cfu/mL、4×108cfu/mL、6×108cfu/mL、8×108cfu/mL或 109cfu/mL。
所述发酵液按照如下步骤得到：将活化后的短小芽孢杆菌转接到LB培养基中进行培养发酵，得到发酵液；
优选地，所述发酵的温度为30-40℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、 33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，优选为35-38℃，进一步优选为37℃；
优选地，所述发酵的转速为100-200rpm，例如可以是100rpm、110rpm、 120rpm、130rpm、140rpm、150rpm、160rpm、170rpm、180rpm、190rpm或 200rpm，优选为150-180rpm，进一步优选为160rpm；
优选地，所述发酵的培养时间为40-60h，例如可以是40h、41h、42h、 43h、44h、45h、46h、47h、48h、49h、50h、51h、52h、53h、54h、55h、 56h、57h、58h、59h或60h，优选为45-50h，进一步优选为48h。
本发明中，所述促进剂能够促进水稻苗期和芽期的生长，具体包括：提高芽期的发芽势和发芽率，提高苗期的根长和苗长的增长率；
所述生长促进剂促进水稻芽期生长的具体方法包括：将水稻种子浸泡在所述发酵液中，将浸泡后的水稻种子恒温培养；
优选地，所述浸种温度为20-30℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、 23℃、24℃、25℃、26℃、28℃或30℃，优选为23-25℃，进一步优选为 25℃；
优选地，所述浸种时间为40-60h，例如可以是40h、42h、44h、45h、 46h、48h、50h、52h、54h、56h、58h或60h，优选为45-50h，进一步优选为 48h；
优选地，所述培养的温度为25-35℃，例如可以是25℃、26℃、28℃、 30℃、32℃或35℃，优选为28-32℃，进一步优选为30℃；
所述水稻种子浸泡在所述发酵液中10-15h后进行发酵液的更换，例如可以是10h、11h、12h、13h、14h或15h，优选为11-14h，进一步优选为12h；
优选地，所述促进水稻芽期生长的发酵液的浓度为105-109cfu/mL，优选为108cfu/mL。
所述促进剂调节水稻苗期生长的具体方法包括：向三叶期水稻喷洒发酵液，恒温培养；
优选地，所述培养的温度为25-35℃，例如可以是25℃、26℃、27℃、 28℃、30℃或35℃，优选为28-32℃，进一步优选为30℃；
优选地，所述培养的时间为3-7天，例如可以是3天、4天、5天、6天或 7天，优选为4-6天，进一步优选为5天；
优选地，所述促进水稻苗期生长的发酵液的浓度为105-109cfu/mL，优选为106cfu/mL。
与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明发现了短小芽孢杆菌QHS-X8在不同浓度对水稻芽期和苗期的生长促进作用，发酵液浓度在108cfu/mL时能明显提高水稻发芽率和发芽势，发芽率可达98％，发芽势可达64％；发酵液浓度在106cfu/mL对水稻苗长的促进作用明显，增高率达到5％，对水稻根长促进作用明显，根增长率为6.4％；
(2)本发明的短小芽孢杆菌对水稻的生长促进能力卓越，效果显著，实施方法简便，绿色安全无污染，在水稻种植领域有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
菌种筛选
1、短小芽孢杆菌菌株QHS-X8是从湖南省怀化市的怀化学院校园内及郊区的黄花蒿植株中分离筛选得到，其分离与筛选过程为：
①采集黄花蒿植株样品：采集青蒿植株，分别取根、茎和叶的小块，约 0.15cm×0.15cm大小，75％酒精漂洗(20～30s)→无菌水冲洗→0.2％升汞漂洗 (10～20s)→无菌水冲洗数次或直接取内层无污样；
②牛肉膏蛋白胨固体平板进行粗筛：分置于PDA、牛肉膏蛋白胨和高氏一号脂培养基平板，25～30℃下避光培养，培养5～20d，分别待平板上长出菌落，用划线、稀释以及直接用无菌小剪刀取尖端菌丝等分离方法，并根据青蒿素的显色反应，采用薄层色谱法检测青蒿素的存在与否进行筛选；
③三角瓶液体发酵进行复筛：分别对初筛所得菌株进行摇瓶培养，利用75％的乙醇浸提离心取上清液进行低温真空旋转蒸发，并用无菌水洗脱下来，用碱 (2％的NaOH溶液)处理后，50℃反应30min，生成在292nm波长处有明显吸收的化合物，称为Q292，α，β-不饱和酮酸盐，再进行紫外扫描进行比色测定，挑选并保留产量较高的菌种；
④获得产青蒿素的内生细菌菌株QHS-X8，对菌株QHS-X8的形态特征、生理生化及分子水平进行鉴定；
⑤确定获得菌株QHS-X8：短小芽孢杆菌，根据菌株的形态特征、生理生化及分子学参考《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行鉴定，确定为短小芽孢杆菌QHS-X8。
菌种活化：
取保存于冰箱中储藏在甘油管中的短小芽孢杆菌，无菌操作用划线法接种到装有牛肉膏蛋白胨的培养皿中。置于37℃恒温箱下倒置培养，1-2d直至长出菌落，此即活化的短小芽孢杆菌菌株。
实施例2
菌液制备：
活化菌种用接种环挑取形状、大小、颜色一致的菌落，接种于盛有70mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基的250mL三角烧瓶中，经充分摇匀后，放到恒温振荡箱，37℃以100rpm转速震荡培养16h得到液体种子液，液体菌种按1％接种量，用已灭菌的移液枪，吸取7mL转接到70mL的LB培养液中，37℃，160 rpm下培养48h，得到发酵液，后续实验所用稀释发酵液为十倍稀释法所得。
芽期培养：
将水选法筛选的水稻种子消毒后置于垫有纱布的培养皿中，分别加入无菌水、浓度为109cfu/mL的发酵液，12h后更换浸种液，25℃浸种48h，将盛有浸水充分的水稻种子的培养皿放在30℃人工气候箱里发芽，从种子萌动开始逐日统计发芽子数，统计发芽势和发芽率。
苗期培养：
水选法筛选饱满水稻种子，将种子消毒浸种催芽，使露白一致的种子放在装有河沙的培养皿中，每个培养皿50粒，共16组，人工气候箱内30℃培养，保持培养皿中河沙湿润。水稻生长5天约到三叶期，采用喷洒法，喷洒浓度为 109cfu/mL的发酵液。正常培养，生长5d后，水稻苗取出，测量水稻幼苗根长和苗长。
实施例3
与实施例2相比，除发酵液浓度为108cfu/mL外，其他条件与实施例2相同。
实施例4
与实施例2相比，除发酵液浓度为107cfu/mL外，其他条件与实施例2相同。
实施例5
与实施例2相比，除发酵液浓度为106cfu/mL外，其他条件与实施例2相同。
实施例6
与实施例2相比，除发酵液浓度为105cfu/mL外，其他条件与实施例2相同。
实施例7
菌液制备：
活化菌种用接种环挑取形状、大小、颜色一致的菌落，接种于盛有70mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基的250mL三角烧瓶中，经充分摇匀后，放到恒温振荡箱，37℃以100rpm转速震荡培养16h得到液体种子液，液体菌种按1％接种量，用已灭菌的移液枪，吸取7mL转接到70mL的LB培养液中，30℃， 100rpm下培养40h，得到发酵液，后续实验所用稀释发酵液为十倍稀释法所得。
芽期培养：
将水选法筛选的水稻种子消毒后置于垫有纱布的培养皿中，分别加入无菌水、浓度为10-1的发酵液，10h后更换浸种液，20℃浸种40h，将盛有浸水充分的水稻种子的培养皿放在25℃人工气候箱里发芽，从种子萌动开始逐日统计发芽子数，统计发芽势和发芽率。
苗期培养：
水选法筛选饱满水稻种子，将种子消毒浸种催芽，使露白一致的种子放在装有河沙的培养皿中，每个培养皿50粒，共16组，人工气候箱内25℃培养，保持培养皿中河沙湿润。水稻生长5天约到三叶期，采用喷洒法，喷洒浓度为 109cfu/mL的发酵液。正常培养，生长3d后，水稻苗取出，测量水稻幼苗根长和苗长。
实施例8
菌液制备：
活化菌种用接种环挑取形状、大小、颜色一致的菌落，接种于盛有70mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基的250mL三角烧瓶中，经充分摇匀后，放到恒温振荡箱，37℃以100rpm转速震荡培养16h得到液体种子液，液体菌种按1％接种量，用已灭菌的移液枪，吸取7mL转接到70mL的LB培养液中，40℃， 200rpm下培养60h，得到发酵液，后续实验所用稀释发酵液为十倍稀释法所得。
芽期培养：
将水选法筛选的水稻种子消毒后置于垫有纱布的培养皿中，分别加入无菌水、浓度为109cfu/mL的发酵液，15h后更换浸种液，30℃浸种60h，将盛有浸水充分的水稻种子的培养皿放在35℃人工气候箱里发芽，从种子萌动开始逐日统计发芽子数，统计发芽势和发芽率；
苗期培养：
水选法筛选饱满水稻种子，将种子消毒浸种催芽，使露白一致的种子放在装有河沙的培养皿中，每个培养皿50粒，共16组，人工气候箱内35℃培养，保持培养皿中河沙湿润。水稻生长5天约到三叶期，采用喷洒法，喷洒浓度为 109cfu/mL的发酵液。正常培养，生长7d后，水稻苗取出，测量水稻幼苗根长和苗长；
对比例1
与实施例2相比，用无菌水替换发酵液的对照组，其他条件与实施例2相同。
对比例2
与实施例2相比，用市售短小芽孢杆菌发酵液替换本发明所述短小芽孢杆菌发酵液，其他条件与实施例2相同。
对比例3
与实施例2相比，除发酵液浓度为1010cfu/mL外，其他条件与实施例2相同。
对比例4
与实施例2相比，除发酵液浓度为103cfu/mL外，其他条件与实施例2相同。
表1
结果分析
由表1可知，QHS-X8发酵液浓度在108cfu/mL时能明显提高水稻发芽率和发芽势，发芽率可达98％，发芽势可达64％；发酵液浓度在106cfu/mL对水稻苗长的促进作用明显，增高率达到5％，对水稻根长促进作用明显，根增长率为6.4％。将对比例2与实施例中最优的促进效果比较可知，本发明所述短小芽孢杆菌发酵液的促进水稻生长作用优于市售枯草芽孢杆菌发酵液。将实施例 1、3和4与实施例中最优的促进效果比较可知，发酵液浓度在本发明所提供的范围之外无法达到最优效果。发酵液的不同浓度对水稻同时期的生长状况产生不同效果，因此在生产过程中可以根据不同需要选择不同浓度。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (23)
1.一种短小芽孢杆菌作为水稻芽期或苗期生长促进剂的用途；
所述短小芽孢杆菌于2010年8月12日保藏在中国典型培养物保藏中心(China Centerfor Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏号：CCTCC M2010202；
所述促进剂促进水稻芽期生长的具体方法包括：将水稻种子浸泡在发酵液中，将浸泡后的水稻种子恒温培养；所述促进水稻芽期生长的发酵液的浓度为8×107cfu/mL-2×108cfu/mL；
所述促进剂促进水稻苗期生长的具体方法包括：向三叶期水稻喷洒发酵液，恒温培养；所述促进水稻苗期生长的发酵液的浓度为8×105cfu/mL-2×106cfu/mL；
所述发酵液的制备方法包括如下步骤：将活化后的短小芽孢杆菌转接到LB培养基中在35-38℃下进行发酵45-50h，发酵的转速为150-180rpm，得到发酵液。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述发酵的温度为37℃。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述发酵的转速为160rpm。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述发酵的培养时间为48h。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促进水稻芽期生长的发酵液的浓度为108cfu/mL。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述浸泡的温度为20-30℃。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述浸泡的温度为23-25℃。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述浸泡的温度为25℃。
9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述浸泡的时间为40-60h。
10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述浸泡的时间为45-50h。
11.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述浸泡的时间为48h。
12.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促进水稻芽期生长时恒温培养的温度为25-35℃。
13.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促进水稻芽期生长时恒温培养的温度为28-32℃。
14.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促进水稻芽期生长时恒温培养的温度为30℃。
15.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述水稻种子浸泡在所述发酵液中10-15h后进行发酵液的更换。
16.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述水稻种子浸泡在所述发酵液中12h后进行发酵液的更换。
17.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促进水稻苗期生长的发酵液的浓度为106cfu/mL。
18.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促进水稻苗期生长时培养的温度为25-35℃。
19.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促进水稻苗期生长时培养的温度为28-32℃。
20.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促进水稻苗期生长时培养的温度为30℃。
21.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促进水稻苗期生长时培养的时间为3-7天。
22.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促进水稻苗期生长时培养的时间为4-6天。
23.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述促进水稻苗期生长时培养的时间为5天。
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