CN109735468A - 一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌及其应用和以其制备的复合根瘤菌剂 - Google Patents

一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌及其应用和以其制备的复合根瘤菌剂 Download PDF

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CN109735468A CN201910114862.XA CN201910114862A CN109735468A CN 109735468 A CN109735468 A CN 109735468A CN 201910114862 A CN201910114862 A CN 201910114862A CN 109735468 A CN109735468 A CN 109735468A
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牛彦波
吴晧琼
安琦
殷博
曹亚彬
王笑庸
原韬
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Abstract

本发明涉及一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌及其应用和以其制备的复合根瘤菌剂，属于农业微生物技术领域。为解决大豆根瘤菌结瘤率低、固氮效果差的问题，本发明提供了一株日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)HF25，保藏编号为CGMCC No.14857，该菌株具有较强的匹配亲和性、结瘤竞争力，结瘤及固氮能力。本发明还提供了一种复合根瘤菌剂，由日本慢生根瘤菌HF25和产酸克雷伯氏菌ASP‑15制成，两种菌复配显著提高了HF25根瘤菌的结瘤及固氮能力，将其应用于大豆种植，与未施菌剂的对照相比大豆结瘤数提高了170％，单株豆荚数增加了37.3％，大豆百粒重提高了5.5％。

Description

一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌及其应用和以其制 备的复合根瘤菌剂
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，尤其涉及一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌及其应用和以其制备的复合根瘤菌剂。
背景技术
大豆是重要的粮食作物和油料作物，其对氮素的吸收量较高，生产100kg大豆约吸收6.5～8.5kg氮素。人工接种根瘤菌是增强大豆结瘤固氮能力，增加氮素营养，提高大豆产量的有效措施。目前国际上，如美国、巴西和阿根廷等大豆出口大国，大豆氮肥主要依靠接种大豆根瘤菌形成根瘤来提供，30％～65％以上种植面积，甚至达到100％的种植面积仅接种大豆根瘤菌进行生物固氮即可满足作物对氮素的需求，其单位面积产量是中国大豆产量的1.4～1.5倍。而在我国，接种大豆根瘤菌的种植面积仅占全部种植面积的3％左右，根瘤菌的应用水平相差甚远。多年来，我国大豆的生产还主要依赖于化肥，截止到目前，全国正式登记的微生物肥料产品有5千多个，而与大豆根瘤菌有关的产品不到20个，以大豆主产区的黑龙江省为例，仅有3家正式登记的与大豆根瘤菌有关的产品，根瘤菌应用面积不足大豆总种植面积的10％。
缺乏高效的根瘤菌是造成根瘤菌应用水平较低的主要原因，制约着我国大豆产业的发展。土壤中固氮效率低的土著根瘤菌与大豆品种具有较强的匹配亲和性，从而大大降低了高效固氮根瘤菌接种剂的作用效果。为了提高大豆根瘤菌的结瘤率和固氮效果，必须筛选出结瘤竞争性能和固氮性能优良的广谱性根瘤菌株。
发明内容
为解决大豆根瘤菌结瘤率低、固氮效果差的问题，本发明提供了一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌及其应用和以其制备的复合根瘤菌剂。
本发明的技术方案：
本发明提供了一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌，其为日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)HF25，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年11月3日，保藏编号为CGMCC No.14857。
本发明提供的一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌在大豆种植中的应用。
进一步的，是将所述日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)HF25发酵培养后的菌液与大豆种子混拌均匀，阴干后播种。
进一步的，所述日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)HF25发酵培养后的菌液所含活菌数为2.3～3.8×1010cfu/mL。
本发明还提供了一种复合根瘤菌剂，包括日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ASP-15。
进一步的，所述产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ASP-15，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月17日，保藏编号为CGMCC No.4488。
进一步的，其为液体复合根瘤菌剂，包括日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25发酵培养后的菌液和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ASP-15发酵培养后的菌液。
进一步的，所述液体复合根瘤菌剂中含有日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25的活菌数为2.3～3.8×1010cfu/mL，含有产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)ASP-15的活菌数为1.2～2.1×1010cfu/mL。
本发明的有益效果：
本发明提供的日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)HF25具有广谱结瘤特性，与多种大豆品种匹配亲和性好，结瘤能力强，具有较强的结瘤竞争能力和固氮能力；将其应用于大豆种植，能将大豆百粒重提高3％，单株豆荚数增加25％。
本发明提供的复合根瘤菌剂将日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)HF25和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ASP-15相复配，进一步提高了日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)HF25的结瘤和固氮能力，将复合根瘤菌剂应用于大豆种植，与不施肥对照相比大豆的结瘤率提高了170％，大豆百粒重提高5.5％，单株豆荚数增加了37.3％，进一步提高了大豆的产量和品质。
附图说明
图1为日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)HF25的显微形态照片；
图2为日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)HF25的菌落形态照片；
图3为日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)HF25的生长曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
从黑龙江林口大豆种植田采集生长期的大豆，从大豆根部的根瘤中获得一株大豆根瘤菌，将其编号为HF25。参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》对该菌株进行形态特性、生理生化特性及分子生物学鉴定，结果如下：
(1)形态学特性：
在显微镜下观察，HF25根瘤菌属于革兰氏阴性菌，菌体呈短杆状，无芽孢，菌体细长，菌体大小为0.5～0.9μ×1.2～3.0μ，其微观形态见图1；HF25根瘤菌在甘露醇培养基上生长缓慢，菌落呈白色突起、圆形、菌落表面闪光、不透明、奶油状、有少量胶质形成，其菌落形态见图2。
(2)生理生化特性：
HF25根瘤菌在含有0.5％溴麝香草酚兰的YMA培养基中呈蓝色，在含有0.5％刚果红的YMA培养基上呈红色，在肉汤蛋白胨的培养基中不生长，在马铃薯块上不生长，以单鞭毛运动，好氧，最适PH范围为6.0～8.0，最适生长温度范围为25℃～30℃。
(3)16SrDNA序列测定及系统进化分析：
用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN BIOTECH)提取HF25根瘤菌的基因组DNA为模板，采用通用引物进行16S rDNAPCR扩增，利用胶回收试剂盒将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶进行胶回收，将PCR回收后产物交由CICC进行测序，得到HF25根瘤菌的16S rDNA的核苷酸序列；对HF25根瘤菌的16S rDNA核苷酸序列进行鉴定，将其提交到NCBI的GenBanK数据库中进行比对分析，并与已报道的序列进行同源性比对，比对结果为HF25与Bradyrhizobiumjaponicum的同源性达到了99％以上。
通过形态观察、生理生化特性鉴定和16S rDNA序列分析，将菌株HF25鉴定为日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)，并于2017年11月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.14857。
实施例2
本实施例测定了培养基pH值对HF25根瘤菌生长的影响：
采用无菌操作，用接种环挑取1环HF25根瘤菌斜面培养物接种于含100mlYM液体培养基的三角瓶中，将三角瓶置于30℃，转速150r/min的条件下，振荡培养48小时，获得种子液。将装有5mLYM培养基的试管中的培养基的pH值分别调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，在各试管中分别接种0.1ml HF25种子液，每处理3个重复，将培养试管置于30℃震荡培养箱中培养3天，测定各发酵液在420nm波长下的OD值。各不同处理以不接菌培养基为CK对照，取各重复的平均OD值，结果如表1所示。
表1
由表1中数据可以看出，HF25根瘤菌在pH值为6～8的培养基中生长更为旺盛，其最适生长pH条件为7.0，说明HF25根瘤菌生长的酸碱度为中性偏酸性。
实施例3
本实施例测定了培养温度对HF25根瘤菌生长的影响：
采用无菌操作，用接种环挑取1环HF25根瘤菌斜面培养物接种于含100mlYM液体培养基的三角瓶中，将三角瓶置于30℃，转速150r/min的条件下，振荡培养48小时，获得种子液。在含有5ml YM培养基的试管中各接种0.1mlHF25根瘤菌种子液，YM培养基的pH值均为7.0，将接种后的试管分别置于15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃和40℃培养温度下发酵培养2天，每处理3个重复，测定各发酵液在420nm波长下的OD值，各处理以不接菌培养基为CK对照，取各重复的平均OD值，结果如表2所示。
表2
由表2中数据可以看出，HF25根瘤菌在25℃～30℃培养温度下生长更为旺盛，其最适生长温度为28℃。
实施例4
本实施例测定了振荡培养器转速对HF25根瘤菌生长的影响：
采用无菌操作，用接种环挑取1环HF25根瘤菌斜面培养物接种于含100mlYM液体培养基的三角瓶中，将三角瓶置于30℃，转速150r/min的条件下，振荡培养48小时，获得种子液。在装液量为200mL YM培养液的500ml三角瓶中各接种1mlHF25根瘤菌种子液，YM培养液的pH为7.0，将接种后的三角瓶置于静置条件和转速分别为50r/min、100r/min、120r/min、150r/min、180r/min及200r/min的振荡培养器中，于28℃培养温度下发酵培养3天，每处理3个重复，测定各发酵液在420nm波长下的OD值，各处理以不接菌培养基为CK对照，取各重复的平均OD值，结果如表3所示。
表3
由表3中数据可以看出，HF25根瘤菌为需氧菌，在转数为120r/min～180r/min的培养条件下生长更为旺盛。
实施例5
本实施例测定了HF25根瘤菌的生长曲线：
采用无菌操作，用接种环挑取1环HF25根瘤菌斜面培养物接种于含100mlYM液体培养基的三角瓶中，将三角瓶置于30℃，转速150r/min的条件下，振荡培养48小时，获得种子液。用无菌移液管取0.5mlHF25根瘤菌种子液接种至装液量为50ml YM培养基的150ml三角瓶中，YM培养基pH为6.8，将三角瓶置于30℃，转数150r/min条件下进行发酵培养，分别在培养0、4、8、16、20、24、28、32、36、40、44、52、56、64、68、72和80小时取发酵液样品，用分光光度计在420nm测定发酵液的OD值，以纯净水为对照，绘制菌株的生长曲线，如图3所示。由图3可以看出，HF25根瘤菌在发酵培养32小时进入对数快速生长期，在68小时进入稳定期，72小时后，菌株生长进入后期。
实施例6
本实施例采用半固体培养法测定了HF25根瘤菌的广谱结瘤特性：
本实施使用的豆科植物结瘤试验培养基的配方：KH2PO40.22mg，KCl 155mg，MgSO4·7H2O 50mg，ZnSO4·7H2O0.25mg，CuSO4·5H2Omg，H3BO50.25mg，Na2MoO4·2H2O0.05mg，柠檬酸铁FeC6H5O230mg，NaNO330mg，琼脂5.0g，H2O 1000ml。
采用无菌操作，用接种环挑取1环HF25根瘤菌的斜面培养物接种于装液量为100mlYM液体培养基的250mL三角瓶中，将三角瓶置于30℃，150r/min条件下振荡培养68小时，获得发酵液待用。
取如下品种的大豆种子：垦农25、合丰51、黑农51、黑河45、绥农26、东农49，将每个品种的健康种子分别转入不同的无菌三角瓶中，每瓶约50l粒左右，加入95％酒精浸没种子摇动30秒，倒掉酒精，加入5％次氯酸钠溶液浸泡7分钟，倒掉次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗种子至少6次以除去消毒液，将清洗干净的种子置于1％的水琼脂平板上，放入28℃恒温箱中培养，待大豆根芽长到1cm左右进行半固体培养。
将处理好的种子，根芽向下插入半固体状态的豆科植物结瘤试验培养基中，每瓶2粒种子，每粒种子滴加0.5mlHF25根瘤菌发酵液，每个品种做2瓶重复。以不接种根瘤菌的种子作为对照。培养3周后，测定根瘤的生长数量，结果如表4所示。
表4
由表4中的数据可以看出，HF25根瘤菌与上述多个大豆品种均能够形成根瘤，经过根瘤的剖面观察，根瘤均为粉红色的有效根瘤。这说明HF25根瘤菌具有广谱结瘤特性。
实施例7
本实施例采用Lenard瓶培养法测定了HF25根瘤菌的广谱结瘤特性：
本实施例使用的栽培物料的配方；将蛭石与珍珠岩以3:1的量进行混合，用清水洗涤，灭菌备用。
采用无菌操作，用接种环挑取1环HF25根瘤菌的斜面培养物接种于装液量为100mlYM液体培养基的250mL三角瓶中，将三角瓶置于30℃，150r/min条件下振荡培养68小时，获得发酵液待用。
取如下品种的大豆种子：垦农25、合丰51、黑农51、黑河45、绥农26、东农49，将每个品种的健康种子分别转入不同的无菌三角瓶中，每瓶约50l粒左右，加入95％酒精浸没种子摇动30秒，倒掉酒精，加入5％次氯酸钠溶液浸泡7分钟，倒掉次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗种子至少6次以除去消毒液，将清洗干净的种子置于1％的水琼脂平板上，放入28℃恒温箱中培养，待大豆根芽长到1cm左右进行Lenard瓶培养。
将处理好的种子，根芽向下插入已灭菌的栽培物料中，每瓶2粒种子，每粒种子滴加1mlHF25根瘤菌发酵液，每个品种做2瓶重复；
以大豆慢生根瘤菌USDA110为对照菌株，在同样的培养条件下获得大豆慢生根瘤菌USDA110的发酵培养液，取1mlUSDA110的发酵培养液，滴加至对照大豆种子；以不接种根瘤菌的种子作为对照。培养3周后，测定根瘤的生长数量，结果如表5所示。
表5
由表5中的数据可以看出，HF25根瘤菌与上述多个大豆品种均能够形成根瘤，而大豆慢生根瘤菌USDA110仅能与垦农25、合丰51这两个大豆品种形成根瘤，且根瘤数量仅为1～2个。通过对比可知，HF25根瘤菌具有广谱结瘤特性和较强的结瘤竞争能力，且结瘤能力较强，具有较好的应用前景。
实施例8
本实施例提供了一种复合根瘤菌剂，包括日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ASP-15。
本实施例提供的产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ASP-15，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月17日，保藏编号为CGMCC No.4488。
本实施例还进行了ASP-15菌与HF25根瘤菌间的拮抗试验：
ASP-15菌与HF25根瘤菌间的拮抗试验采用“打块法”，即在YMA培养基平板上加入1-2滴根瘤菌悬液，用无菌刮刀涂匀后，将培养好的ASP-15菌平板切成直径1cm圆块，置于根瘤菌培养基上；同样，将ASP-15菌悬液滴入肉汤培养基平板上，涂匀，放置根瘤菌菌块，30℃培养48～72h观察各菌生长情况。
结果表明，ASP-15菌、HF25根瘤菌均生长良好，说明它们相互间无拮抗作用。
实施例9
本实施例提供了一种液体复合根瘤菌剂，由日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25根瘤菌剂和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ASP-15菌剂复合制备而成。
本实施例液体复合根瘤菌剂的制备方法如下：
本实施例用到的培养基配方如下：
ASP-15固体培养基:牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，H2O1000ml，琼脂15～20g。
ASP-15液体发酵培养基：糖蜜15.0～20.0g，玉米浆1.0～1.5g，无机盐0.2g，水1000ml。
HF25采用YM培养基:甘露醇10.0g，酵母粉1.0g，NaCl0.1g，MgSO4·7H2O0.2g，K2HPO40.5g，CaCO33.0g，H2O 1000ml，固体加入琼脂15～20g。
本实施例中豆科植物结瘤试验培养基配方与实施例6所用配方相同。
制备HF25根瘤菌菌剂：采用无菌操作，用接种环挑取1环HF25根瘤菌的斜面培养物接种于装液量为100mlYM液体培养基的250mL三角瓶中，将三角瓶置于30℃，150r/min条件下振荡培养68小时，获得HF25根瘤菌发酵液，将发酵液用无菌水稀释至10-3、10-4和10-5，制得三种稀释度的HF25根瘤菌剂，其中HF25根瘤菌发酵原液的活菌数为2.6×1010cfu/mL。
制备ASP-15菌菌剂：采用无菌操作，用接种环挑取1环ASP-15菌的斜面培养物接种于装液量为100mlASP-15液体发酵培养基的250mL三角瓶中，将三角瓶置于30℃，150r/min条件下振荡培养36小时，获得ASP-15菌发酵液，将发酵液用无菌水稀释至10-3、10-4和10-5，制得三种稀释度的ASP-15菌剂，其中ASP-15菌发酵原液的活菌数为1.4×1010cfu/mL。
制备液体复合根瘤菌剂：取上述HF25根瘤菌发酵液和ASP-15菌发酵液按体积比1:1混合均匀，将混合发酵液用无菌水稀释至10-3、10-4和10-5，制得三种稀释度的液体复合根瘤菌剂，其中HF25根瘤菌的发酵原液活菌数为2.6×1010cfu/mL，ASP-15菌的发酵原液活菌数为1.4×1010cfu/mL。
实施例10
本实施例测定了液体复合根瘤菌剂的结瘤能力：
将品种为黑农38的大豆种子表面用1～2％的次氯酸钠消毒液进行消毒，无菌水冲洗干净后置于含水量45％的无菌沙中催芽，2～3天后，当芽长2mm左右时，分别浸于无菌水、实施例9制备的三种稀释度的HF25根瘤菌剂、ASP-15菌剂及液体复合根瘤菌剂中30min后，用无菌水冲洗，植于豆科植物结瘤试验培养基上，各处理重复4次。植物培养温度20～25℃，植物叶面光照强度8000lx，每天光照12h。10～20d后观察结瘤状况，结果如表6所示。
表6
﹡“+”表示结瘤，“－”表示不结瘤
由表6中数据可以看出，无菌水和ASP-15菌剂均没有使大豆结瘤的能力，三种稀释度的HF25根瘤菌剂和复合根瘤菌剂均能促使大豆结瘤，而且复合根瘤菌剂的结瘤数与HF25根瘤菌剂相比提高了87.8％，这说明HF25根瘤菌和ASP-15菌相复配，能够进一步提高HF25根瘤菌的结瘤能力。
实施例11
本实施例测定了液体复合根瘤菌剂对大豆生长的影响：
实验采用小区随机区组设计，每小区面积10m2×10m2。
将品种为黑农38的大豆种子按如下四种方式处理：
(1)空白处理：不采用任何菌剂进行拌种处理，在种植过程中不施加任何肥料；
(2)常规化肥处理：不采用任何菌剂进行拌种处理，在种植过程中施加常规肥-亩施尿素2.8kg、磷酸二铵10.0kg、氯化钾4.0kg；
(3)HF25根瘤菌菌剂处理：采用实施例9制备的含有HF25根瘤菌活菌数为2.6×1010cfu/mL的HF25根瘤菌菌剂进行拌种处理，大豆种子表面用1～2％的次氯酸钠消毒液进行消毒，无菌水冲洗干净后，按照每亩地所施种子用100mlHF25根瘤菌剂进行拌种，阴干后播种，在种植过程中不施加任何肥料；
(4)复合根瘤菌剂处理：采用实施例9制备的含有活菌数为2.6×1010cfu/mL的HF25根瘤菌发酵原液和含有活菌数为1.4×1010cfu/mL的ASP-15菌发酵原液按体积比1:1混合制成的复合根瘤菌剂进行拌种处理，大豆种子表面用1～2％的次氯酸钠消毒液进行消毒，无菌水冲洗干净后，按照每亩地所施种子用100ml复合根瘤菌剂进行拌种，阴干后播种，在种植过程中不施加任何肥料。
每处理均设3次重复，田间管理一致。生育期进行田间调查，秋后考种测产。平均测定结果如表7所示：
表7
由表7中数据可知，各处理间存在着差异，施用微生物菌剂的处理从结瘤情况、豆荚数、百粒重等方面均优于不施用生物菌剂的处理组。
使用复合根瘤菌剂处理组的结瘤数与空白处理组相比提高了170％，与化肥处理组相比提高了77％，与HF25根瘤菌剂处理相比提高了35％。这说明本发明提供的外源复合根瘤菌剂具有较强的结瘤竞争力，与种植土壤中存在的土著根瘤菌相比，具有明显的匹配亲和性优势，能够与大豆进行有效结瘤，显著提高大豆的结瘤能力。
使用复合根瘤菌剂处理组的豆荚数、株高和百粒重均优于其他三组处理，使用复合菌剂处理的单株豆荚数比空白提高了37.3％，比化肥处理组提高了17％，使用复合根瘤菌剂处理组的大豆百粒重与空白组相比提高了5.5％，与化肥处理组相比提高了2.9％，与HF25根瘤菌剂处理相比提高了2.4％，这说明本发明提供的复合根瘤菌剂具有较强的固氮能力，能显著提高大豆的品质和产量。
序列表
<110> 黑龙江省科学院微生物研究所
<120> 一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌及其应用和以其制备的复合根瘤菌剂
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 616
<212> DNA
<213> 日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)
<400> 1
acgctggcgg caggcttaac acatgcaagt cgagcgggcg tagcaatacg tcagcggcag 60
acgggtgagt aacgcgtggg aacgtacctt ttggttcgga acaacacagg gaaacttgtg 120
ctaataccgg ataagccctt acggggaaag atttatcgcc gaaagatcgg cccgcgtctg 180
attagctagt tggtgaggta atggctcacc aaggcgacga tcagtagctg gtctgagagg 240
atgatcagcc acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtgggg 300
aatattggac aatgggggca accctgatcc agccatgccg cgtgagtgat gaaggcccta 360
gggttgtaaa gctcttttgt gcgggaagat aatgacggta ccgcaagaat aagccccggc 420
taacttcgtg ccagcagccg cggtaatacg aagggggcta gcgttgctcg gaatcactgg 480
gcgtaaaggg tgcgtaggcg ggtctttaag tcaggggtga aatcctggag ctcaactcca 540
gaactgcctt tgatactgag gatcttgagt tcgggagagg tgagtggaac tgcgagtgta 600
gaggtgaaat tcgtag 616

Claims (8)

1.一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌，其特征在于，其为日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)HF25，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年11月3日，保藏编号为CGMCC No.14857。
2.如权利要求1所述一株具有广谱结瘤特性的大豆慢生根瘤菌在大豆种植中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，是将所述日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25发酵培养后的菌液与大豆种子混拌均匀，阴干后播种。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25发酵培养后的菌液所含活菌数为2.3～3.8×1010cfu/mL。
5.一种复合根瘤菌剂，其特征在于，包括日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)HF25和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ASP-15。
6.根据权利要求5所述一种复合根瘤菌剂，其特征在于，所述产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ASP-15，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2010年12月17日，保藏编号为CGMCC No.4488。
7.根据权利要求5或6所述一种复合根瘤菌剂，其特征在于，其为液体复合根瘤菌剂，包括日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)HF25发酵培养后的菌液和产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ASP-15发酵培养后的菌液。
8.根据权利要求7所述一种复合根瘤菌剂，其特征在于，所述液体复合根瘤菌剂中含有日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)HF25的活菌数为2.3～3.8×1010cfu/mL，含有产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ASP-15的活菌数为1.2～2.1×1010cfu/mL。
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