CN113215037A - 一株高效固氮慢生根瘤菌菌株及其应用 - Google Patents

一株高效固氮慢生根瘤菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)菌株Qian2及其应用，该菌株于2021年4月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC.NO：61612。该菌株具有水解酪蛋白、分泌生长素、弱产酸的特性，大豆接种该根瘤菌能显著提高大豆的生物量、根瘤数和氮含量，尤其适用于贵州石漠化地区大豆的栽培生产，具有很高的应用价值。

Description

一株高效固氮慢生根瘤菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及慢生根瘤菌菌株Qian2及其应用。
背景技术
根瘤菌(Rhizobium)是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，与豆科植物共生的根瘤菌以慢生根瘤菌属为主。根瘤菌与大豆形成共生固氮体系，为大豆生长提供氮素。另外，根瘤菌能够明显促进土壤团聚体的形成，改良土壤结构，增加土壤肥力，改善土壤蓄水状况，提高土壤的抗风蚀能力。
中国发明专利，一株高效固氮大豆慢生根瘤菌，公开号为CN102174436A。该大豆慢生根瘤菌的菌液与催好芽的种子混拌均匀，种子阴干后播种于土壤中。大豆的根瘤数量增加124～199％，结瘤率增加75～178％，植株的固氮酶活性增加19.5～40.6％，植株地上干重增加15.5～18.5％。在土壤肥沃的黑龙江绥化田间和黑龙江北安田间，用该菌株菌液处理大豆种子，也只是最多让大豆根瘤数量增加199％，结瘤率增加178％。但是该发明的菌株只适用于肥沃土地上的大豆，难以适用于土地贫瘠的石漠化地区的大豆。贵州石漠化地区面积较大，土质中下，其大豆生产粗放，产量低，效益不高(杨艳等.贵州石漠化区大豆生产品种优化方案研究[A].中国作物学会大豆专业委员会.第十届全国大豆学术讨论会论文摘要集[C].中国作物学会大豆专业委员会:中国作物学会,2017:1)。
发明内容
本发明的目的是提供了一株新的慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)菌株 Qian2，该菌株具有水解酪蛋白、分泌生长素、弱产酸的特性，大豆接种该根瘤菌能显著提高大豆的生物量、根瘤数和氮含量；而且大豆慢生根瘤菌Qian2适用于贵州石漠化地区大豆的栽培生产。
本发明的目的是提供一株慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)菌株Qian2。
本发明的另一目的是提供一种慢生根瘤菌菌株Qian2的菌剂。
本发明的另一目的是提供一种大豆的种植方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
申请人团队从贵州兴义石漠化地区种植的大豆根瘤中，经人工分离纯化获得了一株具有水解酪蛋白、分泌生长素、弱产酸的特性，能显著提高大豆生物量、根瘤数和氮含量的根瘤菌。该根瘤菌菌株的16S rDNA基因序列与慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)的菌株Bradyrhizobium japonicum strain NBRC 14783的序列相似性达到98.64％，从而确定分离出的根瘤菌为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)的新菌株，命名为Qian2。2021年4月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC.NO：61612。
菌株Qian2形态特征如下：慢生型，生长最适温度为28℃。在YMA平板培养基上，形成近似圆形、粘稠、光滑、突起、乳白色菌落。光学显微镜下为短杆状，大多数运动，无芽孢。革兰氏染色为红色，革兰氏阴性菌。
该慢生根瘤菌菌株Qian2显著提高大豆生物量、根瘤数和氮含量。
慢生根瘤菌菌株Qian2在制备促进植物根瘤生成的产品方面的应用和在制备促进植物生长促进剂方面的应用，其尤其适用于大豆属植物。
一种促进植物根瘤生成和/或促进植物生长的菌剂，该菌剂含有所述慢生根瘤菌菌株Qian2。
其中，优选地，所述菌剂含有慢生根瘤菌菌株Qian2的菌悬液。
其中，优选地，所述菌悬液OD600值为0.55～0.65。
其中，优选地，所述的菌悬液，其分散介质为低氮营养液，所述低氮营养液包含如下工作浓度的成分：
56.676g/L Ca(NO3)2·4H2O，13.24g/L(NH4)2SO4，38.418g/L KNO3，147.89g/LMgSO4·7H2O，34.025g/L KH2PO4，106.54g/L CaCl2·2H2O，264.88g/L K2SO4，
0.254g/L MnSO4·7H2O，0.431g/L ZnSO4.7H2O，0.125g/L CuSO4·5H2O，0.2 g/L(NH4)6MO7O24·4H2O，14.68g/L Na2-EDTA，0.95g/L NaB4O7·4H2O。
一种大豆的种植方法，在大豆种子萌发、子叶变绿尚未张开时，在大豆种子所在的栽培介质中接种含有所述慢生根瘤菌菌株Qian2的菌剂。
其中，优选地，在首次接种菌剂后，还需每隔1周接种1次，共接种3～6 次。
其中，优选地所述的大豆种子在种植前进行表皮消毒。
其中，优选地，所述的栽培介质为细砂、中砂、粗砂按照1:1:1比例(质量)混合制得培养砂。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一株高效固氮慢生根瘤菌菌株Qian2：
(1)根瘤菌分离自西南石漠化地区，可应用于石漠化地区土壤改良和促进石漠化地区大豆生产。
(2)提高大豆结瘤率和固氮能力。
(3)具有分泌长素(IAA)类似物以及水解酪蛋白的能力。
(4)在砂培的条件下，大豆不能结根瘤。但是接种上菌株Qian2后，平均每株大豆可结大根瘤43.2个，小根瘤73.4个，可检出根瘤固氮酶活性为77.13 μmol/h/g。大豆植株鲜重和干重也分别增加了27.3％和15.4％，其SPAD值和含氮量也分别增加了46.3％和131.63％。
附图说明
图1显示慢生根瘤菌Qian2经革兰氏染色后在显微镜下的形态特征。
图2显示慢生根瘤菌Qian2的16S rDNA序列系统发育树状图。
图3显示慢生根瘤菌Qian2柠檬酸盐反应、明胶液化反应、淀粉水解反应、 3-酮基乳糖反应、溶磷能力检测。
图4显示慢生根瘤菌Qian2水解酪蛋白胨化、IAA类似物及泌氢。
图5显示慢生根瘤菌Qian2砂培回接大豆效果。
图6显示砂培接种慢生根瘤菌Qian2菌株对大豆生物量，氮含量和固氮酶活性的影响。其中*:0.01<P<0.05，**:0.001<P<0.01，***:P<0.001。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1慢生根瘤菌Qian2的分离、纯化与鉴定
1、菌株的分离及纯化
在贵州兴义石漠化地区，从栽培的大豆根系上采集根瘤，选取新鲜饱满的根瘤，在超净台中先将根瘤放在无菌水中浸泡5～6min，清除表面的杂质，用75％无水乙醇表面消毒3～5min后，再用3.5％的NaClO消毒8min，之后用无菌水将其冲洗9～10次，用消过毒的刀子将单个根瘤切开后，再用镊子夹住根瘤在YMA 培养基上划线，在28℃恒温培养箱中倒置培养5～7d直至有清晰的菌落长出，并且根据菌体的形态、大小、透明度、黏稠度、颜色、光泽等特征，对分离得到的根瘤菌单克隆进行3～4次的划线纯化，直到长出清晰的单克隆，挑取单菌落转接斜面，4℃低温保存。
2、单菌落菌株16S rDNA基因的序列测序及分析
提取菌体总DNA。利用细菌通用引物对16S rDNA-F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和16S rDNA-R (5′-TACGGCTACCTTCTTGTTAC-3′)扩增16S rDNA序列。PCR反应体系(50 μL)：2×PCR Buffer 25μL，引物16S rDNA-F/16S rDNA-R各2.0μL，dNTP 1.0μL， TaqDNA聚合酶1μL，模板2μL，灭菌ddH2O 17μL。反应条件：94℃预变性 5min；94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸2min，扩增35个循环；72℃延伸10min。扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，由广州擎科生物技术有限公司对PCR产物进行克隆测序。
根据测序结果，得到3株根瘤菌，并从中挑选了一株，命名为Qian2。
2、菌株的种属鉴定
2.1菌株的形态学鉴定
将菌株Qian2接种在YMA固体培养基上进行培养，并观察记录。在最适生长条件(pH7.0，温度28℃)培养5～7天后，将分离并纯化得到的菌株Qian2进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。另一方面，对处于对数生长期的菌株Qian2，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
结果表明菌株Qian2属革兰氏染色阴性，短小杆状，无芽孢，大多数能运动(图1)。在酵母汁甘露醇琼脂培养基平板上生长，菌落形态近似为圆形、乳白色、半透明、边缘整齐，粘质较多，菌落直径达0.8mm～1mm，符合慢生根瘤菌的特性。
2.分子鉴定
根据上述的菌株16S rDNA基因测序结果，Qian2的16S rDNA核苷酸序列如SEQID.1所示。
将所得的序列结果在美国国立生物信息中心(NCBI)进行BLAST检索，从中选择了10个相似性高的模式菌株作为参比菌株，利用MEGA4.1软件中的邻接法(Neighbor-joining)进行16S rDNA基因系统发育树的构建。由比对结果和系统发育树(见图2)可知，根瘤菌Qian2 16S rDNA基因序列与慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)的模式菌株Bradyrhizobium japonicum strain NBRC 14783 的序列相似性达到98.64％，并位于同一进化分支。从而确定根瘤菌Qian2为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的新菌株系。
2.3菌株生理生化特征鉴定
参考《伯杰氏细菌鉴定手册》(布坎南，伯杰氏细菌鉴定手册中译第八版. 北京：科学出版社，2011.)测定菌株Qian2的生理生化特征。结果表明菌株Qian2 为化能异养型，好氧生长，能利用葡萄糖、乳糖生长；不能利用柠檬酸盐，明胶液化呈阴性(图3)，不能水解淀粉(图3)，不利用3-酮基乳糖(图3)，在培养基上生长常伴有较多胞外粘液，不具有活化难溶性磷源能力(图4)；石蕊牛奶反应为胨化(图4)。
综上鉴定结果，菌株Qian2属于慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)，并于2021 年4月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC.NO：61612，保藏地址：中国广东。
实施例2慢生根瘤菌Qian2菌株产IAA类似物能力的分析
IAA检测Salkowski比色液配制方法如下：0.45g氯化铁溶于30mL蒸馏水，缓慢加入58.7mL 98％的浓硫酸，待冷却后定容至100mL。
采用Salkowski比色法分析根瘤菌产IAA类似物的能力：将菌株接种于含有 L-色氨酸的50mL的YMA液体培养基的三角瓶中，置于28℃，125rpm·min-1摇床恒温培养，设置三个重复，培养9天后，取根瘤菌悬液100μL于白色陶瓷板上，同时加100μL Salkowski比色液，设100μL的灭菌YMA培养液作为阴性对照，将白色陶瓷板于室温、避光条件下放置30min后观察，颜色变粉红者表明该菌株具有产IAA类似物的能力。实验结果显示比色反应为浅粉色(图4)，说明慢生根瘤菌Qian2产IAA类似物的能力较强。
实施例3慢生根瘤菌Qian2菌株泌氢能力检测
泌氢检测改良PVK培养基配制方法如下：葡萄糖10g，酵母膏0.5g，磷酸二氢钾4.4g，硫酸铵5g，七水硫酸镁1g，氯化钾2g，一水硫酸锰0.02g，七水硫酸亚铁0.02g，蒸馏水1L，琼脂15g，PH8.0～8.5，115℃条件下灭菌30min，冷却后加入10mL溴甲酚紫指示剂(过滤灭菌)。
用灭菌固体YMA培养基活化根瘤菌Qian2后，挑取单克隆于液体于1mL 液体YMA培养基，在摇床中28℃180r/min培养至对数生长期，吸取5uL菌液于固体PVK改良培养基中心，在28℃摇床中培养至第6天后观察到菌落周围产生黄色晕圈，证明该菌株能够分泌氢离子，但泌氢能力有限(图4)。
实施例4慢生根瘤菌Qian2的回接大豆试验
大豆种子灭菌：挑选种皮无破损、饱满、大小一致的大豆种子，采用氯气干消毒的方法(100mL次氯酸钠加4.8mL盐酸)对种子表皮消毒12h，将豆子拿出于超净工作台上吹10min后置于室温待用。
菌体培养：配制1L YMA液体培养基，分装于3个三角瓶中，于121℃灭菌20min；将已纯化并达到对数生长期的根瘤菌菌液，吸取100μL菌液于装有 YMA培养基的三角瓶中，在28℃的摇床以180r/min的转速振荡过夜至菌液 OD600值达到0.6±0.05后，分装于灭过菌的50mL离心管中，在离心机中以5000 rpm离心10min后取出，倒掉上清液，用低氮营养液重悬得到菌悬液备用。
砂培及接种：将细砂、中砂、粗砂按照1:1:1比例混合制得培养砂，充分混合均匀后装入小盆中，每个盆中放入三颗上述步骤灭菌后的大豆种子并置于温室大棚中培养；待种子萌发、子叶变绿尚未张开时，在接种处理的盆中接种100mL 上述菌悬液。
上述步骤中的大豆低氮营养液成分为：
(1)大量元素：56.676g/L Ca(NO3)2·4H2O，13.24g/L(NH4)2SO4，38.418g/L KNO3，147.89g/L MgSO4·7H2O，34.025g/L KH2PO4，106.54g/L CaCl2·2H2O， 264.88g/L K2SO4；
(2)微量元素：0.254g/L MnSO4·7H2O，0.431g/L ZnSO4.7H2O，0.125g/L CuSO4·5H2O，0.2g/L(NH4)6MO7O24·4H2O，14.68g/L Na2-EDTA，0.95g/L NaB4O7·4H2O。
以不接种为对照，每个处理5个重复，接种35天后收获，以植株鲜重、结瘤数、固氮酶活、植株含氮量和SPAD值作为测定根瘤菌的结合性和固氮能力的判断指标。
结果显示，空白对照(-N)无结瘤现象，而接种根瘤菌Qian2能够促使大豆结瘤，即回接处理平均每株大豆可结大根瘤43.2个，小根瘤73.4个，根瘤剖面显示为深红色，测定其根瘤固氮酶活性为77.13μmol/h/g，初步判定供试菌株 Qian2为具有固氮效率的根瘤菌(图5和图6)。
由图5可知，与低氮不接种处理相比，接种根瘤菌的大豆叶片在35天后由缺氮状态的黄叶明显转绿，判定供试菌株Qian2具有较高的固氮效率。
由图6可见，接种根瘤菌Qian2对大豆的生物量有显著影响，即与不接种根瘤菌相比，接种处理的大豆植株鲜重和干重分别增加了27.3％和15.4％。同时，接种根瘤菌Qian2显著提高了大豆叶片的SPAD值和含氮量，与不接种对照相比分别增加幅度为46.3％和131.63％。进一步明确了供试菌株Qian2为具有较高固氮效率的根瘤菌。
本发明的根瘤菌Qian2能有效促进大豆结瘤固氮，增加植株氮素营养，促进植株生长。因此，由本研究室研制出来的根瘤菌Qian2可以用于大面积的推广施用，增强大豆对石漠化土壤环境的适应性，提高大豆产量和促进当地植被恢复。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 一株高效固氮慢生根瘤菌菌株及其应用
<130> YGZS213839
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1396
<212> DNA
<213> Bradyrhizobium sp.Qian2
<400> 1
cggcgacgct tacctgcagt cgagcgggcg tagcaatacg tcagcggcag acgggtgagt 60
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Claims (10)

1.一株慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)菌株Qian2，其特征在于，该菌株于2021年4月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC.NO：61612。
2.权利要求1所述慢生根瘤菌菌株Qian2的16s rDNA，其特征在于，其序列如SEQ IDNO.1所示。
3.权利要求1所述的慢生根瘤菌菌株Qian2在制备促进植物根瘤生成的产品方面的应用。
4.权利要求1所述的慢生根瘤菌菌株Qian2在制备促进植物生长促进剂方面的应用。
5.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述植物为大豆属植物。
6.一种促进植物根瘤生成和/或促进植物生长的菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述慢生根瘤菌菌株Qian2。
7.如权利要求6所述菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述慢生根瘤菌菌株Qian2的菌悬液，菌悬液的OD600值为0.55～0.65。
8.一种大豆的种植方法，其特征在于，在大豆种子萌发、子叶变绿尚未张开时，在大豆种子所在的栽培介质中接种权利要求6或7所述菌剂。
9.如权利要求8所述的一种大豆的种植方法，其特征在于，在首次接种菌剂后，还需每隔1周接种1次，共接种3～6次。
10.如权利要求8所述的一种大豆的种植方法，其特征在于，所述的大豆种子在种植前进行表皮消毒。
CN202110502433.7A 2021-05-08 2021-05-08 一株高效固氮慢生根瘤菌菌株及其应用 Active CN113215037B (zh)

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