CN102174436A

CN102174436A - 一株高效固氮的大豆慢生根瘤菌及其培养方法与它的用途

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Publication number: CN102174436A
Application number: CN 201110024851
Authority: CN
Inventors: 杜迎辉; 苏海榆; 高玉爽; 王琰; 李春艳; 杜月芳; 徐志文
Original assignee: LEADING BIO-AGRICULTURAL Co Ltd
Current assignee: LEADING BIO-AGRICULTURAL Co Ltd
Priority date: 2011-01-24
Filing date: 2011-01-24
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2031-01-24
Also published as: CN102174436B

Abstract

本发明涉及一株高效固氮大豆慢生根瘤菌及其培养方法与它的用途。本发明的大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346采用菌种的活化、种子培养与发酵培养等步骤进行培养。本发明利用山梨醇、二甘醇替代传统YEM培养基中的碳源甘露醇，采用此改进发酵培养基进行培养时，发酵液活菌数高于传统YEM培养基。本发明高效固氮大豆慢生根瘤菌剂接种于大豆，与不接根瘤菌剂对比，大豆理论产量增加16.7～17.2％，粗脂肪含量提高0.65～1.21％，蛋白质含量增加1.29～1.60％，是大豆根瘤菌生产及大豆接种的优良菌株。本发明所述培养方法简便易行，原料来源广泛、价格低廉，适合大规模工业化生产。

Description

一株高效固氮的大豆慢生根瘤菌及其培养方法与它的用途

【技术领域】

本发明属于根瘤菌技术领域。更具体地，本发明涉及一株高效固氮大豆慢生根瘤菌，还涉及所述根瘤菌的培养方法以及它的用途。

【背景技术】

接种根瘤菌是国际上公认的生物固氮技术，目前先进农业国家都已采用。大豆栽培由于长期施用大量化肥尤其是氮肥给环境带来了很大的污染，接种大豆根瘤菌可以减少大豆种植时的氮肥使用量，促进大豆根部结瘤，增强共生固氮作用，提高大豆产量及其蛋白质含量。目前我国各地都已十分重视大豆接种根瘤菌技术的应用。

当前，大豆在我国已经有了一定的种植面积，特别是东北地区。但由于大豆品种和自然条件、土壤性质不同，选择与大豆接种相匹配的高效根瘤菌难度较大。为了提高大豆根瘤菌的结瘤率和固氮效果，必须筛选结瘤竞争性能和固氮性能优良的广谱性根瘤菌株相适应。

培养根瘤菌的通用传统培养基为YEM培养基，其组成成分为：甘露醇10g/L，酵母膏1.0g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，NaCl 0.2g/L。其中，主要成分甘露醇价格较高，从而直接造成其发酵成本高，从而制约了根瘤菌的工业化生产。

本发明人经过大量实验研究，分离选育出具有结瘤固氮能力强的大豆慢生根瘤菌菌株，并且从替换碳源入手，通过改良培养基，有效降低了生产成本，并提高了发酵水平，适合大规模生产，适应我国大豆根瘤菌生产以及发展大豆种植的要求。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一株高效固氮的大豆慢生根瘤菌。

本发明的另一个目的是提供所述高效固氮的大豆慢生根瘤菌的培养方法。

本发明的另一个目的是提供所述高效固氮的大豆慢生根瘤菌剂的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及一株高效固氮的大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)CGMCC No.4346。

本发明还涉及所述大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346的培养方法。该方法的步骤如下：

(1)菌种的活化：接种大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346至斜面培养基，在温度28℃下培养120小时；

所述的斜面培养基组成如下：甘露醇10g/L、酵母膏1.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L、琼脂18g/L，pH6.8～7.0；

(2)种子培养：将活化菌种转接至灭菌液体培养基中，在温度28℃与160～180rpm条件下摇床培养72小时；

所述的种子培养基组成如下：甘露醇10g/L、酵母膏1.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L，pH6.8～7.0；

(3)发酵培养：以体积计按照5～15％接种量将步骤2)得到的种子液转接入发酵培养基中，在温度28℃与150rpm的条件下培养72小时，得到所述液体大豆慢生根瘤菌剂；

所述的发酵培养基组成如下：①山梨醇8～12g/L、酵母膏1.0～5.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L，pH6.8～7.0，或

②二甘醇8～12g/L、、酵母膏1.0～5.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L，pH6.8～7.0。

根据本发明的一种优选实施方式，采用本发明培养方法所得到的液体大豆慢生根瘤菌剂活菌数达到45亿/ml以上。

本发明还涉及所述大豆慢生根瘤菌菌剂在大豆种植中的用途。

根据本发明的另一种优选实施方式，在种植大豆时，按照每亩地为采用本发明方法制备的液体大豆慢生根瘤菌剂10～20ml与大豆种子混拌均匀，阴干后播种。

下面将更详细地描述本发明。

本发明涉及一株高效固氮的大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346。该菌株已于2010年11月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.4346。

本发明的大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346菌株是从黑龙江省采集野生大豆根瘤，采用从根瘤中分离根瘤菌的常规方法分离筛选获得的，具体方法参见联合国粮食及农业组织编写的《共生固氮技术手册》。

大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346属于革兰氏阴性杆菌，无芽孢，菌体大小为0.5～0.9微米×1.0～3.0微米，在液体培养条件下，菌体染色不均匀。

大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346需好氧发酵培养，最适生长温度为28℃，最适pH为6.8～7.0，生长后期会稍升至7.2～7.8。

本发明还涉及所述大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346的培养方法。

该方法的步骤如下：

所述的发酵培养基组成如下：

①山梨醇8～12g/L、酵母膏1.0～5.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L，pH6.8～7.0。

②二甘醇8～12g/L、酵母膏1.0～5.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L，pH6.8～7.0。

目前，培养根瘤菌的常规培养基为YEM培养基，其组成如下：甘露醇10g/L，酵母膏1.0g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠0.2g/L。

本发明对该YEM培养基进行了修改，增加了工业副产物二甘醇和山梨醇为碳源，通过选择不同的配比，测定发酵液的最终活菌数，对发酵水平进行评价，最后确定本发明的发酵培养基。

二甘醇主要来自于环氧乙烷(EO)水合生产乙二醇(EG)的副产物，在副产物中二甘醇含量约占8～9％。目前我国二甘醇的产量估计约可达10万吨/年左右。例如广州市耿达贸易有限公司、青岛中化油贸易有限公司销售的二甘醇。

山梨醇为甘露醇的异构体，作用与甘露醇相似。山梨醇的原料来源广阔，价格低廉，是营养性甜味剂糖醇中产量最大、用途最广的品种。近年来我国山梨醇生产发展很快，新装置不断投产，已经成为全球最大生产基地。例如北京兴建永祥化工有限责任公司销售的山梨醇

在本发明中，所述的斜面培养基、种子培养基与发酵培养基所使用的原料都是目前市场上销售的在菌种培养中通常使用的原料。

所述的斜面培养、种子培养与发酵培养所使用的设备与器具都是目前市场上销售的在菌种培养中通常使用的设备与器具，这些设备与器具消毒处理都是常规的。

运用本技术领域的技术人员熟知的稀释平板计数法，测定了采用本发明培养方法得到的液体大豆慢生根瘤菌剂，确定液体大豆慢生根瘤菌剂活菌数是45亿/ml以上。

本发明还涉及采用本发明得到的大豆慢生根瘤菌剂在种植大豆中的用途。

在种植大豆时，按照每亩地为采用本发明方法制备的液体大豆慢生根瘤菌剂10～20ml与大豆种混拌均匀，阴干后播种。

[有益效果]

本发明具有下述有益效果：

采用本发明改进的发酵培养基进行培养时，本发明高效固氮大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346发酵活菌数高于传统YEM培养基。本发明高效固氮大豆慢生根瘤菌剂接种于大豆的田间应用试验表明：与不接根瘤菌剂对比，大豆理论产量增加16.7～17.2％，粗脂肪含量提高0.65～1.21％，蛋白质含量增加1.29～1.60％。本发明提供的大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346是大豆根瘤菌生产及大豆接种的优良菌株，并且其培养方法简便易行，所用培养基原料来源广泛，价格低廉，适合大规模的工业化生产。

本发明所述的大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)已于2010年11月15日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.4346。

【具体实施方式】

实施例1：大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346的培养

培养步骤如下：

制备斜面培养基：按照甘露醇10g/L、酵母膏1.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L、琼脂18g/L分别准确称取甘露醇、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠和琼脂，然后用水溶解，溶解完全后用酸或碱调节达到pH6.8～7.0，再补充水达到上述浓度，待混合均匀后，分装到试管中，在温度121℃下高压灭菌30分钟后，趁热将试管斜放，制成斜面培养基。

制备种子培养基：按照甘露醇10g/L、酵母膏1.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L分别准确称取甘露醇、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠，然后用水溶解，溶解完全后用酸或碱调节达到pH6.8～7.0，再补充水达到上述浓度，待混合均匀后，分装到三角瓶中在温度121℃下高压灭菌30分钟。

制备发酵培养基：按照山梨醇10g/L、酵母膏3.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L制备发酵培养基。分别准确称取甘露醇、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠，然后用水溶解，溶解完全后用酸或碱调节达到pH6.8～7.0，再补充水达到上述浓度待混合均匀后，分装到发酵罐中在温度121℃下高压灭菌30分钟。

首先，菌种的活化：接种大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346至上述制备的斜面培养基，在温度28℃下培养120小时。

然后，种子培养：将活化菌种转接至上述制备的种子液体培养基中，在温度28℃与160～180rpm条件下摇床培养72小时；

发酵培养：以体积计按照10％接种量将前面步骤得到的种子液转接入上述制备的发酵培养基中，在温度28℃与150rpm的条件下培养72小时，得到活菌数为46.9亿/ml的液体大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346菌剂。

实施例2：大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346的培养

按照与实施例1相同的实施方式进行，只是发酵培养基不同。按照二甘醇12g/L、酵母膏3.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.2g/L，pH6.8～7.0制备发酵培养基。得到活菌数为45.8亿/ml的液体大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346菌剂。

实施例3：大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346发酵培养基的优化

选择价格低廉的工业副产物二甘醇和山梨醇作为碳源，代替YEM培养基中的碳源甘露醇，即前面描述的发酵培养基①和②。按照与实施例1同样的培养方法进行发酵培养基的优化。

本发明的改进培养基与传统YEM培养基试验结果比较列于表1。

表1：大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346培养基的改进

由表1的结果清楚地表明，采用本发明的2种改进发酵培养基，培养72h后，通过稀释平板计数，液体大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346菌剂活菌数分别可达50.3亿/ml和45.7亿/ml，高于传统YEM培养基的培养结果。

实施例4：大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346水培接种试验

本实验所用的大豆品种共8个，分别为绥农11、垦鉴18、垦丰25、黑农37、合丰42、辽豆13、吉林35、吉育57。

试验于2006年4月在秦皇岛领先科技公司的阳光温室中进行。大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346与上述大豆品种形成不同的组合，用滤纸桥试管水培的方法进行大豆接种组合效果的水培试验，同时以不接菌的同品种植株为对照。

1)滤纸桥水培试管的制作：将裁成合适的滤纸对折，中间剪一用来托住种子的小孔放在大试管中，然后加入专用的无氮营养液，用牛皮纸封好后使用蒸汽121℃灭菌30分钟备用。

2)种子的催芽：挑选饱满、无损伤大豆种子，用0.1％升汞(氯化高汞)溶液浸泡，后用无菌水冲洗干净，在温度28～30℃的培养箱中进行催芽。

3)接种处理：接种处理：将催好芽的种子放到无菌小烧杯中，倒入按实施例2所述培养方法得到的大豆慢生根瘤菌剂，浸泡20分钟，然后用镊子将种子栽到滤纸孔中。放置在正常光照及温度条件下培养，定期进行水分补充。大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346水培试验效果列于表2。

4)试验调查：种植40天后，通过对大豆植株的结瘤数及株鲜重来对大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346的水培接种效果进行评价。

表2：大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346的水培试验效果

表2中“接种根瘤菌”系接种本发明的大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346。对照系没有接种根瘤菌，下面表也具有同样的意义。

表2试验结果表明，将大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346接种到大豆种子后，与不接菌对比，明显促进大豆植株结瘤及生长，植株鲜重增加5.74～13.11％。

实施例5：大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346土壤盆栽接种试验

本次试验于2006年8月在秦皇岛领先科技公司的阳光温室中进行。盆栽试验所用的土壤分别为辽宁的棕壤土，吉林的沙壤土、黑钙土，黑龙江的白浆土、暗棕壤土和草甸黑土。

使用根据实施例1培养方法制备的大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346菌剂与大豆种子混拌均匀，阴干后播种，同时设置不接菌对照，每处理10次重复。在植株第一片真叶期调查根瘤数量和结瘤率，初花期调查植株的根瘤固氮酶活性及植株地上干重。大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346土壤盆栽试验结果列于表3～4。

表3：大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346土壤盆栽试验结果一

表4：大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346土壤盆栽试验结果二

由表3～4结果表明，接种大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346，与不接根瘤菌相比，大豆植株的根瘤数量增加124～199％，结瘤率增加75～178％，植株的固氮酶活性增加19.5～40.6％，植株地上干重增加15.5～18.5％。即，接种大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346对大豆植株的结瘤固氮以及生长起到了明显的促进作用。

实施例6：大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346田间接种试验

1、黑龙江北安田间接种试验

本次试验在黑龙江省北安市农技中心试验基地进行，地块总面积为16.4亩，垄长700m，垄距65cm。土壤类型为黑壤土。

种植地块地势平坦，排水良好，肥力中等，前茬大豆。使用的底肥为尿素2.9 kg/亩、磷酸二铵3.9 kg/亩、硫酸钾2.2 kg/亩，大豆品种为北江05-38。起垄播种，其它播种密度、灌溉、杂草和病虫害等均按大豆常规管理。

使用根据实施例1制备的液体大豆根瘤菌USDA110菌剂与液体大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346菌剂。

使用本发明制备的液体大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346菌剂和USDA110菌剂与上述北江05-38大豆种子混拌均匀，每亩地使用液体大豆慢生根瘤菌剂15ml，阴干后播种，以不接菌剂为对照，每处理3次重复。以大豆植株根部结瘤数、株高、植株鲜重、根瘤鲜重、植株干重、根瘤干重为评价指标，具体数据见表5：

表5：大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346北安田间接种试验调查结果

由表5结果可见，接种根瘤菌剂，可明显促进大豆植株生长、结瘤。接种大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346菌剂于大豆，与不接根瘤菌剂(CK)相比，可使大豆植株株高、株鲜重和结瘤数分别增加24.6％、43.6％和267.7％；与接种对照菌株USDA110相比，可使大豆植株株高、株鲜重和结瘤数分别增加5.89％、10.1％和41.2％.

2、黑龙江绥化田间接种试验

本次试验在黑龙江省绥化市兴聚农业科技合作社进行，地块总面积为28.8亩，垄长900m，垄距65cm。土壤类型为黑壤土。

种植地块地势平坦，排水良好，肥力中等，前茬玉米。使用的底肥为大豆复合肥1(N-P-K 14-22-12)和大豆复合肥2(N-P-K 11-18-16)，用肥量20kg/亩，大豆品种为黑农44、绥农26和垦鉴豆25。起垄播种，其它播种密度、灌溉、杂草和病虫害等均按大豆常规管理。

使用本发明制备的液体大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346菌剂和USDA110菌剂与上述大豆种子混拌均匀，每亩地使用液体大豆慢生根瘤菌剂15ml，阴干后播种，以不接菌剂为对照，每处理4次重复。以大豆植株根部结瘤数、瘤干重、株高、植株地上干重、单株有效荚数、单株粒数、百粒重、理论产量、粗脂肪含量以及蛋白质含量等方面为评价指标，具体数据见表6～7：

表6：大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346绥化田间接种试验结果一

表7：大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346绥化田间接种试验结果二

从表6～7可见，与不接菌剂相比，接种本发明大豆慢生根瘤菌CGMCCNo.4346可以明显促进大豆植株生长、结瘤以及大豆增产提质。将大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346接种于大豆后，与不接根瘤菌剂对比，大豆植株结瘤数增加38.1～50％，大豆理论产量增加16.7～17.2％，粗脂肪含量提高0.65～1.21％，蛋白质含量增加1.29～1.60％；与对照大豆慢生根瘤菌USDA菌剂相比，大豆植株结瘤数增加5.7～10.2％，大豆理论产量增加2.79～6.45％，粗脂肪含量提高0.15～0.39％，蛋白质含量增加0.33～0.40％。

以上结果充分地表明，本发明的大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346对大豆具有显著的促结瘤、固氮及增产提质的效果，为一株高效固氮大豆慢生根瘤菌菌株，并具有广谱性，可用于根瘤菌生产及大面积应用。

Claims

1.一株高效固氮的大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)CGMCC No.4346。

2.根据权利要求1所述大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346的培养方法，其特征在于该方法的步骤如下：

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于所得到的液体大豆慢生根瘤菌CGMCC No.4346菌剂活菌数均达到45亿/ml以上。

4.根据权利要求2所述方法得到的大豆慢生根瘤菌剂在大豆种植中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于在种植大豆时，按照每亩地为根据权利要求2所述方法制备的液体大豆慢生根瘤菌剂10～20ml与大豆种子混拌均匀，阴干后播种。