CN105418204B

CN105418204B - 根瘤菌w33菌株的新应用

Info

Publication number: CN105418204B
Application number: CN201410444667.0A
Authority: CN
Inventors: 何琳燕; 盛下放; 黄智�; 闫亚南
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2014-09-02
Filing date: 2014-09-02
Publication date: 2019-06-25
Anticipated expiration: 2034-09-02
Also published as: CN105418204A

Abstract

本发明属于农业和农业技术和根瘤菌应用领域，公开了根瘤菌Rhizobium sp.W33菌株的新应用。以根瘤菌Rhizobium sp.W33为原料，经细菌活化后制备成菌悬液。接种在含钾液体培养基中，能够吸持溶液中的钾。接种在土壤中可以减少钾肥的淋失，显著促进植物生长及对钾、磷的吸收，提高钾肥吸收利用率。

Description

根瘤菌W33菌株的新应用

技术领域

本发明属于农业技术和根瘤菌应用领域，涉及根瘤菌Rhizobium sp.W33菌株的新应用，具体涉及根瘤菌Rhizobium sp.W33菌株在提高植物钾肥吸收利用率方面的应用。

背景技术

我国钾肥资源缺乏，进口依赖率高，农业生产中投入的钾肥易淋失，利用率仅为20％～60％，从而造成我国农业花费大量外汇进口钾肥，生产中使用越多、淋失越多、土壤结构破坏越严重、作物产量和品质下降的恶性循环。国际上提出了养分资源综合管理技术，强调减少化肥投入，保持或提高作物产量，保护生态环境的策略。我国也相应提出精确施肥、开发缓效钾肥、培育耐低钾植物品种、使用有机肥等技术。然而上述技术存在若干问题，比如缓效钾肥多用聚合材料包裹硫酸钾等，释放非常缓慢难以满足植物生长需求，包裹材料存在二次污染的问题；比如低钾植物品种培育周期长、不适应复杂土壤生态环境等。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的问题，提供根瘤菌Rhizobium sp.W33菌株的新应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

保藏号为CCTCC NO：M 2012357的根瘤菌(Rhizobium sp.)W33在提高植物钾吸收量和钾肥利用率中的应用。

所述的应用，优选将所述的根瘤菌W33进行活化，制备为细胞数量达到5亿CFU/ml以上的菌悬液施用于土壤中。

其中所述的活化方法优选为将所述的根瘤菌W33斜面菌种接种于固体培养基中，30℃培养3d；然后选取饱满、粘稠的W33菌落接种于液体培养基，30℃150rpm振荡培养16‐20h；将发酵液转移至无菌离心瓶中，5000rpm离心5min收集菌体，用无菌去离子水洗涤，重新悬浮，使细胞数量达到5亿CFU/ml以上；其中所述的固体培养基配方为蔗糖10.0g，(NH₄)₂SO₄0.5g，Na₂HPO₄2.0g，NaCl 0.1g，KCl 0.191g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，H₂O 1000ml，琼脂20g；所述的液体培养基配方为蔗糖10.0g，(NH₄)₂SO₄0.5g，Na₂HPO₄2.0g，NaCl 0.1g，KCl 0.191g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，H₂O 1000ml。

保藏号为CCTCC NO：M 2012357的根瘤菌(Rhizobium sp.)W33在吸持溶液中钾的应用。

保藏号为CCTCC NO：M 2012357的根瘤菌(Rhizobium sp.)W33在增加土壤多糖含量中的应用。

有益效果

(1)根瘤菌Rhizobium sp.W33菌株能够吸持溶液中的钾元素，对K的吸持率达到9％～17％。

(2)接种根瘤菌Rhizobium sp.W33处理的土柱渗漏水中钾淋失量显著降低21％‐24％。接菌W33处理10d时土壤多糖含量增加70％。

(3)施用80％钾加上接种根瘤菌Rhizobium sp.W33的处理，使得小麦幼苗生物量显著增加49％，钾素吸收量显著增加58％，磷素吸收量显著增加56％，钾肥吸收利用率显著增加5.7倍。

生物样品保藏信息

植物促生细菌W33，分类命名为根瘤菌W33(Rhizobium sp.W33)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2012年9月18日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2012357。

具体实施方式

实施例1 菌株W33对溶液中K的吸持能力

配制培养基(蔗糖10.0g，(NH₄)₂SO₄0.5g，Na₂HPO₄2.0g，NaCl 0.1g，KCl 0.038g、0.115g或0.191g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，H₂O 1000ml)，其中KCl添加量分别为0.038g、0.115g和0.191g，使得KCl含量设置为20％、60％和100％K，调节pH 7.0-7.5，115℃灭菌30min。将W33(CCTCC NO：M 2012357)接种于上述液体培养基中，30℃静置培养3d。取样测定发酵液中W33(CCTCC NO：M 2012357)OD₆₀₀值，将发酵液12000rpm离心5min，取上清液测定K元素含量，计算菌体对K的吸持率。由表1可知，在20％、60％和100％K含量条件下，发酵液中OD₆₀₀值达到0.8左右，没有差异，说明W33在减少K含量条件下也能生长良好。接菌处理后发酵液中K含量均比不接菌对照显著减少(P<0.01)，且在20％和60％K含量条件下，W33对K的吸持率可达17％。

表1 菌株W33在不同K含量的培养液中的生长及其对K的吸持率

条件	项目	接菌	不接菌对照
				20％K	OD<sub>600</sub>值	0.88±0.01
	发酵液中K含量(mg/L)	47.1±1.8	57.3±0.0
					吸持率	17.8％
60％K	OD<sub>600</sub>值	0.85±0.01
					发酵液中K含量(mg/L)	103.2±0.2	125.5±0.8
	吸持率	17.7％
				100％K	OD<sub>600</sub>值	0.79±0.01
	发酵液中K含量(mg/L)	179.4±0.8	197.5±1.7
					吸持率	9.2％

实施例2 菌株W33的活化和菌悬液制备

将W33(CCTCC NO：M 2012357)斜面菌种接种于固体培养基(蔗糖10.0g，(NH₄)₂SO₄0.5g，Na₂HPO₄2.0g，NaCl 0.1g，KCl 0.191g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，H₂O 1000ml，琼脂20g)中，30℃培养3d。然后选取饱满、粘稠的W33菌落接种于液体培养基(蔗糖10.0g，(NH₄)₂SO₄0.5g，Na₂HPO₄2.0g，NaCl 0.1g，KCl 0.191g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，H₂O 1000ml)，30℃150rpm振荡培养16‐20h。将发酵液转移至无菌离心瓶中，5000rpm离心5min收集菌体，用无菌去离子水洗涤，重新悬浮，使细胞数量达到5亿CFU/ml以上。

实施例3 菌株W33接种土壤减少K淋失

采用模拟土柱实验。土柱实验用高35cm、内壁直径4.5cm的PVC管，管下端使用尼龙网、滤纸、尼龙网依次包扎，并铺填30g洁净石英砂；取黄棕壤菜园土0‐20cm土层土样，风干过5mm孔径筛，然后装入PVC管，每个土柱总计装风干土样400g。在土柱表面放置一张直径42mm的滤纸片，以保证加水时表面平整和水分能够均匀地向土柱中渗透。加水160ml调节土柱含水量至田间饱和持水量的60％，静置24h后，按0.241g K₂O/kg土的施肥量将KCl溶液均匀滴注在土柱上，静置24h后去掉滤纸片。按10％的接种量(菌液体积∶土柱重量＝ml：100g)将实施例2所得的W33菌悬液均匀地滴注在土柱土层表面，对照用等量的无菌去离子水代替，每个处理设3个重复。将土柱放置于28℃的温室培养。采用间歇淋洗法，分别在第1d、10d、20d、30d 进行淋溶试验。用500mL量筒(精确度为1mL)准确量取500mL的去离子水,在4h内分次缓慢浇灌。用500mL纯净水瓶(于试验前用去离子水洗净并晾干)放在土柱下方在每次淋溶试验的12h内收集渗漏水。测定渗漏水中的K含量，计算钾的淋失量。在30d时取出土柱中的土壤，风干后测定土壤中多糖的含量。由表2结果表明，在接菌W33后第1d时，钾淋失量与对照相当。随着时间的延长，模拟土柱中钾素淋失量减少，与对照相比，接菌W33处理的土柱渗漏水中钾淋失量显著降低21％‐24％。与对照相比，接菌W33处理的土壤多糖含量增加40％‐70％，在接菌W33后的第10d，土壤多糖含量增加最多。

表2 菌株W33对模拟土柱渗漏水钾素淋失量和土壤多糖含量的影响

实施例4 菌株W33促进小麦幼苗生长及吸收钾磷

采集菜园土，风干磨碎，装入塑料盆钵，每盆2kg，设置5个施钾肥水平：0％K(不施钾肥)、40％K(0.096g K₂O/kg土)、60％K(0.145g K₂O/kg土)、80％K(0.193g K₂O/kg土)、100％K(0.241g K₂O/kg土)，使用氯化钾；其他肥料用量为N 0.1g/kg，P₂O₅0.229g/kg，使用硫酸铵和磷酸二氢铵。加水使盆栽土壤含水量为田间持水量的60％，保持2d。选取饱满的小麦种子，用70％酒精浸泡10min表面消毒，然后用无菌水洗涤，置于垫有无菌滤纸的无菌平皿中催芽。选取萌发一致的小麦种子播入盆钵，按10％的接种量将实施例2所得的W33菌悬液均匀滴注在种苗周围土壤中，对照接等量灭菌悬液。植株生长期间适量浇水，保持土壤湿度为田间持水量的60％。生长30d后再接种实施例2所得的W33菌悬液10ml。生长50d后收获小麦幼苗，取出整株幼苗，洗净，在105℃下杀青，70℃烘干，称量植物干重。植物样品磨碎后用H₂SO₄‐H₂O₂法消煮，用原子吸收分光光度法测定植株中钾含量。由表3可知，施用80％和100％钾时，小麦生物量显著降低，说明施用大量钾并没有促生作用，反而抑制了小麦幼苗的生长。在60％‐100％施钾水平条件下，接种W33后，小麦幼苗生物量显著增加15％‐69％，达到7.4‐8.3g/盆。由表4可知，随着施钾量的增加，小麦幼苗钾素吸收量增加，施用80％和100％钾时，接种W33处理使得小麦幼苗钾素吸收量显著增加53％和58％。施用80％和100％钾时，接种W33处理使得小麦幼苗磷素吸收量显著增加56％和50％。

表3 菌株W33对小麦幼苗生长的影响

表4 菌株W33对小麦幼苗吸收钾磷元素的影响

实施例5 菌株W33促进钾肥利用率

按照实施例4设计和进行试验，测试，按照下列公式计算钾肥吸收利用率(Krecovery efficiency,KRE)(％)，KRE＝(施钾区植株总吸钾量‐无钾区植株总吸钾量)/施钾量×100。由表5可知，在40％‐100％施钾水平条件下，未接菌处理的小麦盆栽中钾肥吸收利用率仅为1.7％‐6.7％，接种W33处理后钾肥利用率提高1.7倍‐5.7倍。施用80％和100％钾时，接种W33处理使得小麦幼苗钾肥利用率显著增加3.8倍和5.7倍。

表5 菌株W33对钾肥吸收利用率的影响

Claims

1. 保藏号为CCTCC NO：M 2012357的根瘤菌W33在降低土壤中钾淋失量和吸持溶液中钾的应用。