CN106748286A

CN106748286A - 一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥及其制备方法

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Publication number: CN106748286A
Application number: CN201710066557.9A
Authority: CN
Inventors: 侯昌萍; 余劲聪; 林克明
Original assignee: FUJIAN SANJU BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: FUJIAN SANJU BIOLOGICAL SCIENCE & TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2017-02-07
Filing date: 2017-02-07
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明提供了一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥及其制备方法，所述的生物有机肥为颗粒状，分为内外两层结构，其中内层是由基质和赖氨酸芽孢杆菌菌粉造粒而成，外层是由基质、胶冻样芽孢杆菌菌液、枯草芽孢杆菌菌粉造粒而成。本发明的生物有机肥的制备方法简单，不仅为功能菌株降解高氯酸盐提供了充足的电子供体和碳源，而且通过微生物的代谢活动，为高氯酸盐降解提供微厌氧环境。

Description

一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥及其制备方法

技术领域

本发明属于高氯酸盐污染的防控措施，具体涉及一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥及其制备方法。

背景技术

高氯酸盐通过竞争性地抑制人体甲状腺对碘的吸收，导致人类新陈代谢功能紊乱，较低浓度的高氯酸盐即可影响机体发育，特别是神经系统的发育。近年来，研究人员在蔬菜、水果、稻米、茶叶等多种农产品中检测到了高氯酸盐，美国科学院建议饮用水中高氯酸盐含量不能超过24.5 μg/L。2015年5月26日，欧洲食品安全局根据健康人群甲状腺碘摄入产生抑制作用的含量，设定了每公斤体重每天0.3 μg的每日容许摄入量。

在农业领域，富含高氯酸盐的硝基肥料（智力硝石）的应用是人为高氯酸盐污染之一（Orris et al. 2003），研究表明，烟草种植过程中施用了含高氯酸根的化肥，所产的香烟产品中高氯酸盐的浓度最高可达149.3±3.0 mg/kg（Ellington et al. 2001），微生物修复由于环境扰动小，无二次污染，修复效果好，成为研究的热点。利用功能微生物，研究如何加快高氯酸盐的降解，减少植物对高氯酸盐的吸收，从而减少高氯酸盐进入食物链而造成更为严重的风险，具有重要的研究意义。

目前现有技术中仍然缺少对农业环境领域中高氯酸盐污染的防控技术，特别是用于做为肥料的高氯酸盐防控技术，本发明利用生物有机肥同时富含有机质和功能微生物，有机肥中的有机质为功能微生物提供电子供体和碳源，促进高氯酸盐的降解。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥及其制备方法。该生物有机肥通过胶冻样芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的代谢活动，促进土壤中的高氯酸盐的降解，促进植物生长，抑制病虫害的发生和改善土壤微生态。

一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥，主要是由胶冻样芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌组成，有效活菌数≥10亿/g，每种菌有效菌≥0.5亿/g，有机质含量≥60%，该肥料为颗粒状，分为内外两层结构，其中内层是由基质和赖氨酸芽孢杆菌菌粉造粒而成，外层是由基质、胶冻样芽孢杆菌菌液、枯草芽孢杆菌菌粉造粒而成，按质量百分比肥料颗粒中含赖氨酸芽孢杆菌粉15%~30%，胶冻样芽孢杆菌菌液5%~10%、枯草芽孢杆菌菌粉5%~10%，余量为基质。

所述的胶冻样芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌用于在含1000 mg/L高氯酸盐培养基上正常生长，与对照相比，菌落形态没有显著差异。其中胶冻样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的主要作用为促进植物生长，抑制病虫害的发生和改善土壤微生态，而赖氨酸芽孢杆菌的主要作用为降解高氯酸盐。

该肥料外层含胶冻样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，两种有益微生物用于协同改良土壤微生态，具有固氮、解磷、分泌植物激素、抑制病原菌等作用；该肥料内层含赖氨酸芽孢杆菌，能够降解高氯酸盐，且外层包被的好氧微生物能够为赖氨酸芽孢杆菌提供降解高氯酸盐所需的厌氧微环境。

所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）为三炬-07菌株，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点，北京市朝阳区，中国科学院微生物研究所，保藏时间2014年12月29日；保藏编号为CGMCC No.10248。

所述的赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sp.）为三炬-12号菌株，保藏机构：中国典型培养物保藏中心，保藏地点：湖北省武汉市，武汉大学；保藏时间2015年5月22日；保藏编号为CCTCC NO:M2015313。

所述的胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）为三炬01号菌株，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点，北京市朝阳区，中国科学院微生物研究所，保藏时间2010年7月2日；保藏编号为CGMCC No.3995。

一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥的制备方法如下：

1）功能菌株种子液的制备；

2）功能菌株的二级发酵；

3）生物有机肥基质的制备：将龙须菜渣、畜禽粪便、菇渣、秸秆等有机废弃物料过滤水分后进行粉碎发酵，发酵完成后添加一定量的腐殖酸，作为有机肥的基质；

4）分层造粒：添加功能菌株，利用造粒机造粒，使颗粒成为内层和外层双层结构，其中内层是由基质和赖氨酸芽孢杆菌菌粉造粒而成，外层是由基质、胶冻样芽孢杆菌菌液、枯草芽孢杆菌菌粉造粒而成，按质量百分比肥料颗粒中含赖氨酸芽孢杆菌粉15%~30%，胶冻样芽孢杆菌菌液5%~10%、枯草芽孢杆菌菌粉5%~10%，余量为基质。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1）本发明的生物有机肥中的功能菌株能够提高植物抗逆性，促进植物生长，抑制病虫害的发生和改善土壤肥力，是一种具有高氯酸盐修复、病虫害防治、促生增产三效合一的农用产品。

2）本发明的生物有机肥的制备方法简单，不仅为功能菌株降解高氯酸盐提供了充足的电子供体和碳源，而且通过微生物的代谢活动，为高氯酸盐降解提供微厌氧环境。

具体实施方式

实施例1：功能菌株对高氯酸盐的耐受性和降解能力

将菌株胶冻样芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌分别接种在含有高浓度（1000mg/L）的ClO₄ ^-的培养基平板上，并设置ClO₄ ^-空白对照，pH 7.3~7.5，30℃恒温箱培养2 d，观察菌株生长状况，结果表明，与对照相比，菌株胶冻样芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌能够耐受高浓度的高氯酸盐，菌落形态与对照相比没有显著差异。

配置液态培养基，并与若干50 mL三角瓶一起灭菌，在灭菌后的培养基里加入高氯酸盐，浓度为1000 mg/L，之后分装到三角瓶中，分别按10％的接种量接种胶冻样芽孢杆菌、赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌种子液到培养基中，并设置ClO₄ ^-空白对照，封口，将接种过菌的三角瓶放到摇床中200 r/min，30℃培养若干天，每个处理，取15 mL菌液5000 rpm离心10 min，将上清液过0.22 μm尼龙膜，检测高氯酸根浓度。

首先制备高氯酸盐标准曲线，在5个25mL的容量瓶中，分别加入高氯酸钠标准溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL，再各加亚甲兰标准溶液5 mL。混匀并间歇振摇10 min后定容，置于30℃水浴1 h。取出容量瓶用干燥清洁的过滤器过滤沉淀，弃去10~15 mL先滤出的滤液，收集剩余的部分滤液于试管中，此滤液为待测样品溶液。测定此标准系列中亚甲兰的吸光度，绘制校准曲线。

然后对样品中高氯酸盐的浓度进行检测，从待测溶液中分别取出0.10 mL注入到比色皿中，用稀释液稀释，摇匀后用分光光度计在620 nm波长处测量，用稀释液校零后，测定标准系列溶液及样品溶液。绘制校准曲线，从校准曲线上查出样品所对应的高氯酸钠含量，即为样品中的高氯酸含量。

结果如表1所示，降解能力最强的是赖氨酸芽孢杆菌，其降解能力为91%，另外枯草芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌也有一定的降解能力，但效果较弱。

表1菌株高氯酸盐降解能力

编号	菌株	吸光度	高氯酸盐含量(mg)	浓度（mg/L）	7 d降解率
						1	赖氨酸芽孢杆菌	0.548	0.439	88	91%
2	枯草芽孢杆菌	0.474	4.415	883	12%
						3	胶冻样芽孢杆菌	0.476	4.289	858	14%

实施例2：一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥的制备方法

1）在营养琼脂培养基上活化赖氨酸芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，在ACCC55固氮培养基上活化胶冻样芽孢杆菌，将活化好的菌株转接到相应的液体培养基上制备种子液；

营养琼脂培养基组成为：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化钠5 g/L、琼脂20 g/L，自然pH。ACCC55固氮菌培养基组成为：蔗糖1%、K₂HPO₄·3H₂O 0.05%、NaCl 0.02%、CaCO₃0.1%、MgSO₄·7H₂O0.02%，琼脂1.8%，pH 7.0~7.2；

2）赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌分别以100 mL/kg的比例接种至固体发酵培养基中，发酵7~10 d。胶冻样芽孢杆菌以5%~15%体积比的接种量接种至二级液态发酵培养基中，发酵2~3 d；

所述的固态发酵培养基的组成为：麸皮90%、豆粕粉5%、酵母粉4.7%、磷酸二氢钾0.1%、七水硫酸镁0.1%、硫酸铵0.1%，加入培养料总质量50%的水后混匀121℃灭菌1 h。所述的胶冻样芽孢杆菌二级液态发酵培养基的组成为：淀粉0.55%、酵母膏0.157%、硫酸镁0.14%、磷酸氢二钾0.2%、碳酸钙0.05%、氯化钠0.02%，氯化铁0.0005%，其余为水，pH 7.0~7.2；

3）将龙须菜渣、畜禽粪便、菇渣、秸秆等有机废弃物料过滤水分后进行粉碎发酵，发酵完成后添加一定量的腐殖酸，作为有机肥的基质。

添加功能菌株，利用造粒机造粒，使颗粒成为内层和外层双层结构，其中内层是由基质和赖氨酸芽孢杆菌菌粉造粒而成，外层是由基质、胶冻样芽孢杆菌菌液、枯草芽孢杆菌菌粉造粒而成，按质量百分比肥料颗粒中含赖氨酸芽孢杆菌粉15%~30%，胶冻样芽孢杆菌菌液5%~10%、枯草芽孢杆菌菌粉5%~10%，余量为基质。

所述的生物有机肥肥料内径1~3 mm，内外径总计3~5 mm。

实施例3：一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥对土壤中的高氯酸盐降解效果

试验设计6个试验组，分别为：

空白对照CK；

试验组A：粉状，基质；

试验组B：粉状，基质+10％枯草芽孢杆菌菌粉+10％胶冻样芽孢杆菌菌液；

试验组C：粉状，基质+20％的赖氨酸芽孢杆菌菌粉；

试验组D：粉状产品，基质+20％的赖氨酸芽孢杆菌菌粉+10％枯草芽孢杆菌菌粉+10％胶冻样芽孢杆菌菌液；

试验组E：颗粒产品，基质+20％的赖氨酸芽孢杆菌菌粉+10％枯草芽孢杆菌菌粉+10％胶冻样芽孢杆菌菌液；

土壤过筛，去除杂物、石头等，拌匀，添加高氯酸盐溶液，混匀制成含高氯酸盐10 mg/kg的供试土壤，每个烧杯中放200 g土，按以上实验设计，每个实验组重复3次，每个处理添加相应的材料10 g，混匀，调节土壤水分，使得田间持水量在70％，烧杯口封上保鲜膜，置于恒温培养箱中培养，分别于第3 d、7 d、10 d、14 d取样，对土壤中的高氯酸盐进行定期检测。

高氯酸盐检测方法：将土壤烘干称取5 g，转移到50 mL锥形瓶，加入20 mL水，室温下200 r/min震荡3 h。之后6000 r/min离心25 min，取上清液，之后将上清液通过0.22 μm尼龙膜。通过离子色谱法检测溶液中高氯酸根的含量，仪器参数如表2：

表2 离子色谱法相关参数

条件	参数
		仪器	戴安IC-3000
进样量	25 μl
		分离柱	AS16
柱温	25℃
		淋洗液	50 mMNaOH
电流	87 mA
		流速	1 mL/min
时间	20 min

样品处理均需稀释1000倍，用注射器吸取3.5 mL，经固相萃取柱，分三次进样。第一次进样1.5 mL(使分离柱得到充分洗涤)，其余两次进样1 mL记录分析结果。

试验结果如表3所示，随着时间的推移，对照组中的高氯酸盐也在缓慢的降解，分析可能是由于土壤中土著微生物对高氯酸根离子进行了降解；试验组A由于外源添加了基质，基质为土著微生物降解高氯酸盐提供了碳源和电子供体；试验组B和试验组A的降解效果差异不显著；试验组C和试验组D的降解效果差异不显著；试验组E的降解效果最好，并在10天内将土壤样品的中的高氯酸全部降解，说明颗粒状的有机肥相对于粉状的有机肥更能促进高氯酸盐的降解。

表3 不同处理组的高氯酸盐浓度

实施例4：一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥肥效

试验材料为铁观音，种植年限8年。

试验地点为福建漳州市南靖县书阳镇双峰村，试验地土壤为黄红壤，土壤有机质19.4 g/kg、全氮0.96 g/kg、碱解氮49.7 mg/kg、有效磷21.9 mg/kg、速效钾76 mg/kg、pH值4.9。

试验设4个处理。处理A为空白对照；处理B为常规施肥；处理C为生物有机肥+80％常规施肥；处理D为生物有机肥+常规施肥。所述的生物有机肥中有效活菌数≥10亿/g，每种菌有效菌≥0.5亿/g，有机质含量≥60%。

试验设3次重复，各处理面积各1亩，样品采摘小区面积为30m²，采用随机区组排列。生物有机肥在茶树上的使用方法：作为基肥，施在茶树根部。生长期间其他管理方法一致。

于2016年6月4日进行施肥，其中处理A 不施肥，处理B常规施肥，每亩施茶叶配方肥（N∶P₂O₅∶K₂O为21∶6∶13）75kg。处理C，每亩根施生物有机肥 300 kg，另外每亩施茶叶配方肥（N∶P₂O₅∶K₂O为21∶6∶13）60 kg。处理D，每亩根施生物有机肥 300 kg，另外每亩施茶叶配方肥（N∶P₂O₅∶K₂O为21∶6∶13）75 kg。夏茶于2016年8月20日采收，实测产量。

结果如下所示：

1）处理A、B、C、D茶树平均芽头密度（个/0.1m²）分别为45.9、58.1、64.2、64.6。处理C、D比处理B分别增加了6.1、6.5个/0.1m²；处理A、B、C、D茶树平均百芽重（1芽3叶）分别为203.0g、226.7 g、273.0 g、270.3 g。处理C、D比处理B分别增加了46.3 g和43.6 g。

2）各小区试验产量见表4，处理D每666.7m²鲜茶产量比处理B、C分别增加23.7 kg和11.1 kg，分别增产4.95％、11.27％。

表4 不同处理对茶叶产量的影响

对试验处理小区产量方差分析（见表5），F=175.94>F_0.01=9.78，说明处理间产量差异达极显著水平。

表5 不同处理茶叶产量方差分析

变异来源	自由度	平方和	均方	F值	F_0.05	F_0.01
							处理间	3	34.02	11.34	175.94**	4.76	9.78
重复间	2	0.38	0.19	2.95	5.14	10.92
							误差	6	0.38	4.701	/	/	/
总变异	11	34.78	/	/	/	/

对试验处理小区产量进行LSD法多重比较，结果表明：处理D与处理A、B产量差异极显著，处理D与处理C差异不显著，说明生物有机肥增产效果较好。同时，在常规施肥减少20％情况下施生物有机肥效与常规施肥处理产量差异不显著。

3）处理D鲜茶中茶多酚含量13.6％（以干基计）、Vc含量26.7mg/100g，处理B茶多酚含量12.9％（以干基计）、Vc含量15.1 mg/100g，处理D比B鲜茶中茶多酚含量增加0.7％（以干基计）、Vc含量增加11.6mg/100g。茶叶施用生物有机肥能促进鲜茶品质的提高。

以上试验验证了本发明的一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥具有显著的增产、增进肥效、改善品质的效果。

Claims

1.一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥，其特征在于，所述的生物有机肥为颗粒状，分为内外两层结构，其中内层是由基质和赖氨酸芽孢杆菌菌粉造粒而成，外层是由基质、胶冻样芽孢杆菌菌液、枯草芽孢杆菌菌粉造粒而成。

2.根据权利要求1所述的一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥，其特征在于，所述的基质是由龙须菜渣、畜禽粪便、菇渣、秸秆等有机废弃物料发酵完成后添加一定量的腐殖酸制成的。

3.根据权利要求1所述的一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥，其特征在于，按质量百分比肥料颗粒中含赖氨酸芽孢杆菌粉15%~30%，胶冻样芽孢杆菌菌液5%~10%、枯草芽孢杆菌菌粉5%~10%，余量为基质。

4.根据权利要求1所述的一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥，其特征在于，所述的生物有机肥有效活菌数≥10亿/g，每种菌有效菌≥0.5亿/g，有机质含量≥60%。

5.根据权利要求1所述的一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥，其特征在于，所述的赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sp.）为三炬-12号菌株，保藏编号为CCTCC NO:M2015313。

6.如权利要求1至5任一项所述的一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥的制备方法，包括如下步骤：

1）制备赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌种子液；

2）制备赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌固态发酵菌粉，制备胶冻样芽孢杆菌发酵液；

3）生物有机肥基质的制备：将龙须菜渣、畜禽粪便、菇渣、秸秆等有机废弃物料过滤水分后进行粉碎，固态发酵，发酵完成后添加一定量的腐殖酸；

4）分层造粒：添加功能菌株，利用造粒机造粒，使颗粒成为内层和外层双层结构，其中内层是由基质和赖氨酸芽孢杆菌菌粉造粒而成，外层是由基质、胶冻样芽孢杆菌菌液、枯草芽孢杆菌菌粉造粒而成。

7.根据权利要求6所述的一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥的制备方法，其特征在于，按质量百分比肥料中含赖氨酸芽孢杆菌粉15%~30%，胶冻样芽孢杆菌菌液5%~10%、枯草芽孢杆菌菌粉5%~10%，余量为基质。

8.如权利要求1至5任一项所述的一种用于降解高氯酸盐的生物有机肥的应用，其用于土壤高氯酸盐污染修复，和/或用于茶树增产。