CN109852565A

CN109852565A - 一种盐碱地复合改良剂及其施用方法

Info

Publication number: CN109852565A
Application number: CN201910198836.XA
Authority: CN
Inventors: 李东; 孙晓莹; 陈意超; 刘晓风
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2019-03-15
Filing date: 2019-03-15
Publication date: 2019-06-07
Anticipated expiration: 2039-03-15
Also published as: CN109852565B

Abstract

本发明属于土壤修复领域，具体涉及一种盐碱地复合改良剂及其施用方法。具体提供了一种新的枯草芽孢杆菌，并用其制备了一种土壤改良剂，土壤改良剂具体组分包括：微生物菌剂5～10份、有机肥70～80份、生物炭10～20份、脱盐剂5～10份。并基于该土壤改良剂提供了一系列改良盐碱地的方法。使用本发明提供的方法，无二次污染、环境友好，可将重度盐碱地彻底改良为可正常耕种的土地。

Description

一种盐碱地复合改良剂及其施用方法

技术领域

本发明属于土壤修复领域，具体涉及一种盐碱地复合改良剂及其施用方法。

背景技术

土壤中盐分积累是一系列作用于不同时空尺度上的自然和人为因素相互叠加作用的结果。土壤盐碱化严重制约着农业发展，改良修复大面积盐碱荒地资源，对农业生产发展、国土治理、生态环境保护等都具有极其重要的意义。

目前盐碱地改良方法主要包括物理法、化学法以及生物法等。物理法主要以淋洗排盐为主，结合翻耕、淋洗、淤积等措施达到改良盐碱土的目的；化学法是通过添加一些酸性化学品以及有机高分子材料等，结合有机肥的方式降低土壤盐碱化程度。但是这两种方法都存在成本高、容易造成土壤以及周边水源二次污染等问题。生物改良盐碱土是一种可持续利用的方法，包括种植耐盐植物、盐生植物和施用微生物菌肥等方法。但是当土壤盐分过高时，耐盐植物和盐生植物的生长同样会受到抑制；而且这种方法只能一定程度上降低盐碱地的含盐量，无法将盐碱地彻底转换为可耕种的土地，因此，实际应用价值和推广意义不大。

发明内容

本发明的目的是提供一种盐碱地复合改良剂及其施用方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株枯草芽孢杆菌，于2018年07月30日保藏至微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.16171。

相应的，一株枯草芽孢杆菌，其16Sr DNA序列如SEQ ID NO 2所示。

相应的，一种土壤改良剂，所述改良剂的组分包括微生物菌剂、有机肥、生物炭，所述微生物菌剂中的微生物包括所述枯草芽孢杆菌。

优选的，所述改良剂的组分包括微生物菌剂、有机肥、生物炭、脱盐剂。

优选的，所述改良剂的组分包括微生物菌剂5～10份、有机肥70～ 80份、生物炭10～20份、脱盐剂5～10份。

优选的，所述微生物菌剂中，所述微生物由所述枯草芽孢杆菌和油菜假单胞菌按活菌量为1:1组成。

优选的，所述生物炭的制备方法为：秸秆经厌氧碳化后，再依次经过碱处理、酸处理及磷酸活化后获得。

相应的，所述的土壤改良剂在改良盐碱地中的应用，所述应用在播种时进行，方法为：将所述土壤改良剂与种子混合均匀后，撒入已翻耕待种植的盐碱地中，所述土壤改良剂的用量为500～1000kg/亩。

相应的，所述应用在种苗时进行，方法为：移植或定植种苗后，在种苗根系周围挖一个3～5cm深的坑穴，将土壤改良剂撒入坑穴中再进行掩埋，所述土壤改良剂的用量为500～1000kg/亩。

相应的，所述应用至少包括四个阶段，每个阶段至少种植一季植物，每季中土壤改良剂的用量至少为120kg/亩。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一种盐碱地改良剂，主要由微生物菌剂、有机肥、生物炭和脱盐剂组成。其中，改良剂中的有机肥含较多有机质，此外，还含有氮磷钾等无机营养元素，施用后可增加土壤中有机质、无机营养元素和微量元素的含量，改善土壤结构，尤其对团聚体的形成及稳定起了决定性作用，可有效增加土壤通透性，加速淋盐下沉使耕层脱盐。

2、本发明使用的微生物菌剂在盐胁迫下具有1-氨基环丙烷-1-羧酸 (ACC)脱氨酶活性、分泌吲哚乙酸(IAA)、合成嗜铁素、固氮和溶磷能力的复合功能，同时，自制的改性生物炭和有机肥可以增强微生物对植物的促生作用，提高植物生长激素水平，向土壤基质中固定氮素，增加可溶性磷，分泌嗜铁素，抑制植物病原菌的生长。微生物还可对有机质进行分解，产生有机酸，有机酸可降低盐碱地pH值，同时与土壤中难溶盐分发生反应，将难溶盐分分解为可溶盐、二氧化碳和水等可以被植物吸收利用的物质，进一步加强对盐碱地的改良效果。

3、本发明提供的改良剂中，使用的生物炭为改性生物炭，与未改性生物炭相比具有更大的比表面积，能够更好地为微生物提供定殖环境。并且，经过基团活化后的酸性生物炭不仅能携带植物营养元素，还可以较好地降低土壤pH值，缓冲盐碱地过高的pH值对作物造成的pH 不适或其他不良条件。

总之，本发明中的微生物菌剂、有机肥和生物炭三位一体，充分发挥改良盐碱地土壤的协同作用，相辅相成，形成良性循环。

4、本发明还提供了三种使用所述土壤改良剂的方法，尤其提出了一种可以将重度盐碱地彻底转换为可耕种农地的方法，不仅解决了既往转换不彻底的问题，而且转换过程中生产了大量植物和作物，可进行堆肥、饲料、食用等，具有较好的经济效益。

附图说明

图1为油菜假单胞菌YZX4的菌落形态；

图2为枯草芽孢杆菌YX7的菌落形态；

图3为油菜假单胞菌YZX4的电镜扫描图；

图4为枯草芽孢杆菌YX7的电镜扫描图；

图5为油菜假单胞菌YZX4的生长曲线图；

图6为枯草芽孢杆菌YX7的生长曲线图；

图7为油菜假单胞菌YZX4和枯草芽孢杆菌YX7的耐盐结果示意图；

图8为油菜假单胞菌YZX4和枯草芽孢杆菌YX7的耐碱结果示意图。

具体实施方式

1、本发明提供了一种盐碱地改良剂，其配方为：微生物菌剂5～10 份、有机肥70～80份、生物炭10～20份、脱盐剂5～10份。

其中，所述微生物菌剂中的微生物优选由油菜假单胞菌 (Pseudomonasbrassicacearum YZX4)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis YX7)按活菌数为1:1组成。

所述生物炭可以直接购买获得，优选的方案为：将秸秆厌氧碳化后获得，具体方法为：将秸秆在600℃下进行厌氧碳化处理，制得生物炭。厌氧碳化是指完全隔绝氧气条件下，有机物不发生燃烧、直接碳化的过程。

更优选的方案为：所述经上述厌氧碳化获得生物炭为改性生物炭，经过改性活化后再使用。具体改性方法优选为：(1)碱改性：用2mol/L 的NaOH溶液浸泡24h处理上述生物炭以去掉其孔道中的硅类物质，处理后的样品用去离子水洗涤，直至pH值不再变化。(2)酸改性：再用2 mol/L的HCl溶液浸泡24h处理以去掉生物炭孔道中的无机盐离子，处理后的样品用去离子水洗涤，直至pH值不再变化，以达到扩大生物炭孔道和增加比表面积的目的。(3)磷酸活化：将处理好的生物炭放入 1mol/L的H₃PO₄溶液中浸泡处理24h，活化生物炭表面基团，同时起到携带营养元素磷、氮和缓冲/改良碱障碍型土壤的作用。

所述脱盐剂可以为D001型树脂、AB500型树脂、D113型树脂、沸石粉等常用脱盐剂，优选为D001型树脂。

2、本发明还提供了三种不同的改良盐碱地的方法：

(1)在播种时进行改良的方法：将所述改良剂与种子混合均匀后，撒入已翻耕待种植的盐碱地中即可，所述改良剂的用量为500～1000kg/ 亩。

(2)在种苗时进行改良的方法：移植/定植种苗时，在种苗根系周围挖一个3～5cm深的坑穴，将改良剂撒入坑穴中再进行掩埋，所述改良剂的用量为500～1000kg/亩。

(3)长期彻底改良的方法：本方法包括四个改良阶段，使用本方法可以实现盐碱地的彻底脱盐改良。

1)第一阶段，向待改良的重度盐碱地中施入改良剂，用量为130～ 160kg/亩，并栽培吸盐植物。所述吸盐植物可以为盐角草、盐地碱蓬等高度耐盐、吸盐的植物，所述吸盐植物可以多品种混合种植。此阶段进行2～4季种植，每种植一季后除去栽种的植物、进行翻土，并重新施入改良剂，再种下一季。

本阶段可以通过吸盐植物和脱盐剂带走土壤盐分，降低土壤盐度和 pH，利于后续耐盐植物生长。

2)第二阶段，向已经过第一阶段改良的盐碱地中施入不含脱盐剂的改良剂，用量为130～150kg/亩，同时混合栽培根系发达的耐盐植物。所述耐盐植物可以为披碱草、大麦草等，所述耐盐植物可以多品种混合种植。此阶段进行2～4季种植，每种一季后除去栽种的植物、进行翻土，并重新施入不含脱盐剂的改良剂，再种下一季。

本阶段可以改善土壤结构，增加土壤营养，同时利用耐盐植物的蒸腾作用代替土壤的蒸发作用，减少土壤水分蒸发，加速盐分淋洗、减少盐分表聚，且耐盐植物也可以吸收盐分，进一步降低土壤盐度。

3)第三阶段，向已经过第二阶段改良后的盐碱地中施入不含脱盐剂的改良剂，用量为130～150kg/亩，同时栽培常规农作物和耐盐植物。所述常规农作物需要选取具有一定耐盐能力的作物，例如玉米。所述常规农作物和耐盐植物要间作。本阶段进行1～3季种植，每种一季后，除去栽种的植物、进行翻土，再重新施入不含脱盐剂的改良剂，再种下一季，进一步改善土壤结构、增加土壤营养、降低盐度。

4)第四阶段，向已经过第三阶段改良后的盐碱地中施入不含脱盐剂的改良剂，用量为120～140kg/亩，同时栽培常规农作物，种植1～3 季，每种一季后进行翻土，施入复合微生物改良剂，将盐碱土壤彻底转化为农耕土地，恢复农业生产。所述复合微生物改良剂的制备方法为：将所述油菜假单胞菌YZX4和枯草芽孢杆菌YX7分别培养至 1×10⁹CFU/ml，再将各培养液按重量比为1:1混合，即得。

方法(3)的整个改良过程中，种植所得的吸盐植物、耐盐植物可以进行饲料化利用，所种作物可以正常使用。

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步阐释。

实施例一：筛选和鉴定所需微生物

1、本实施例涉及的培养基和试剂如下：

(1)牛肉膏蛋白胨液体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠 5g、蒸馏水1000mL，调节pH＝7.0，121℃灭菌20min。在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加18g琼脂，即得牛肉膏蛋白胨固体培养基。

(2)Ashby无氮液体培养基：甘露醇10g、CaCO₃ 5g、KH₂PO₃ 0.2g、 MgSO₄·7H₂O0.2g、NaCl 0.2g、CaSO₄·2H₂O 0.1g，pH＝7.4，去离子水1000mL。

(3)解磷液体培养基：葡萄糖10g、磷酸钙5g、硫酸铵0.1g、氯化钾0.2g、七水氯化镁0.25g、蒸馏水1000mL，pH为6.8～7.0，115℃高压灭菌30min。

(4)DF液体培养基：MnSO₄·7H₂O 0.2g、KH₂PO₄ 4.0g、Na₂HPO₄ 6.0g、柠檬酸2.0g、葡萄糖2.0g、葡萄糖酸钠2.0g、(NH₄)₂SO₄ 2.0g、组份一 0.1mL、组份二0.1mL、H₂O 1000mL，调节pH＝7.2。

其中，所述组份一的制备方法为：将CuSO₄·5H₂O 78.22mg、MoO₃ 10mg、 H₃BO₃10mg、ZnSO₄·7H₂O 124.6mg、MnSO₄·H₂O 11.9mg，溶解于100mL无菌蒸馏水中，-4℃保存备用。

所述组分二的制备方法为：将FeSO₄·7H₂O 100mg溶于10mL已灭菌的蒸馏水中，充分振荡，-4℃保存备用。

(5)ADF液体培养基：把ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)溶于超纯水，用细菌过滤器过滤灭菌，加入到不含(NH₄)₂SO₄且预先灭菌的DF液体培养基中，pH＝7.2。ACC添加的终浓度为3.0mmol/L。

(6)Salkowski试剂：准确称取FeCl₃ 4.5g，溶于10.8M H₂SO₄中，冷却后定容至1L。其测定范围为5～200mg·L^-1，一般超过100mg/L需要去离子水稀释。

(7)CCM液体培养基：NH₄NO₃ 1g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、KH₂PO₄ 0.2g、甘露醇5.0g、K₂HPO₄ 0.8g、CaCl₂·2H₂O 0.06g、蔗糖5.0g、NaMoO₄·2H₂O 2.5mg、酵母粉0.1g、乳酸0.5mL、NaCl 0.1g、1.64％乙二胺四乙酸钠铁(Na·Fe·EDTA)4mL、总体积1000mL(蒸馏水补足)；pH＝7.0。

注：灭菌时需将MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O和Na·Fe·EDTA分开灭菌，否则会产生沉淀。

(8)MKB液体培养基：K₂HPO₄ 2.5g、MgSO₄·7H₂O 2.5g、甘油15ml、酸水解酪蛋白5g，pH＝7.2。

(9)CAS检测液：

1)溶液A：将0.07g CAS溶于50ml去离子水，再加入10ml 1mmol/L 的Fe³⁺溶液(FeCl₃用10mmol/L的HCl溶解制得)。

2)溶液B：将0.06g十六烷基三甲基溴化铵溶解于40ml去离子水制得。

3)将溶液A沿着烧杯壁缓缓加入到溶液B中，慢慢混匀，即得到 CAS检测液。

2、菌株初筛：选取盐碱地的盐角草、盐地碱蓬、猪毛蒿、芦苇等原生植物，取原生植物带土壤的根系，装袋低温保藏、带回实验室。于超净工作台用灭菌毛刷辅以无菌水将土壤从根系上剥离、洗涤，洗涤完成后，将所述土壤转移到500mL三角瓶中，置于摇床中30℃，180r/min 震荡20min，静置10min，得到土壤悬浊液。取0.2mL土壤悬浊液于血球计数板，用显微镜观察并估算洗涤液中菌体大概数量，用灭菌水稀释至10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍，取0.2mL所述稀释液，分别均匀涂布于含有 10g/L、50g/L NaCl(w/v)的牛肉膏蛋白胨固体培养基中。将培养皿倒置30℃恒温培养1～4天，挑取不同类型的典型单菌落，经3次以上划线纯化后，4℃保存于对应的斜面牛肉膏蛋白胨固体培养基中待用。

3、耐盐指标测定和菌株复筛：通过步骤2初步筛选到具备耐盐特性的菌株后，进一步定量分析其在不同盐浓度(10g/L、20g/L、50g/L、100g/L NaCl(w/v))下的ACC脱氨酶活性、IAA合成能力、嗜铁素合成能力、固氮能力和溶磷能力，最终筛选出相关功能最强的2株菌，并保藏至牛肉膏蛋白胨固体培养基的斜面上。

所述各指标的测定方法如下：

(1)ACC脱氨酶活性测定：取一接种环菌株接种于5mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，180r/min振荡培养24h后,12000r/min，离心 10min收集菌体。将所述菌体重悬于ADF液体培养基中，30℃振荡培养 24h。收集菌体。将菌体用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(即0.1mol/L的 Tris溶液通过HCl调节pH＝7.6)于4℃12000r·min^-1离心5min、洗涤2次。取菌体重悬于1mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液中(pH＝7.6)，于 4℃12000r/min离心5min收集菌体，重悬于600μL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)中，添加30μL甲苯迅速振荡30s以破碎细胞，得到粗酶液。取100μL粗酶液4℃储存用于测定蛋白浓度。另取粗酶液 200μL并加入20μL 0.5mol/L ACC混匀进行水浴(30℃,15min)，以不添加ACC的空白作对照。同时加入1mL0.56mol/L HCl终止此反应，于12000r/min离心5min。取上清液1mL加入800μL 0.56mol/LHCl 和300μL 0.2％2,4-二硝基苯肼溶液，使其充分溶解，在30℃恒温30 min，再加入2mL2mol/L NaOH混匀，于540nm下测吸光度值，重复3 次并设置对照组。

(2)IAA合成能力测定：取一接种环菌体接种于5mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，180r/min培养20h，取1mL接种于50mL CCM液体培养基(含1g/L NH₄NO₃、100mg/L L-色氨酸)中，对照组接入1ml 牛肉膏蛋白胨液体培养基。28℃，180r/min培养3～4d后，取培养液，12000r/min，4℃，离心5min，取上清液1mL与5mL Salkowski试剂混合，室温暗处比色30min，在530nm下测定其吸光度值。

(3)嗜铁素合成能力测定：取一接种环菌体接种于MKB液体培养基中，28℃，180r/min培养48h。取培养液，10000r/min离心10min，取上清液按体积比1:1加入CAS检测液，充分混匀，以未接菌的MKB液体培养基与CAS检测液体积比1:1混合为对照。静置1h后，于630nm处测定样品吸光度值为A，测定对照吸光度值记为Ar，A/Ar代表样品中嗜铁素的相对含量。对铁载体活性单位SU进行定义：A/Ar从1.0～0之间以0.2作为间隔，每减少0.2增加一个+，“+++”则认为合成嗜铁素的能力高，这类菌株的A/Ar低于0.5。

(4)溶磷作用测定：取一接种环菌体接种于5mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃，180r/min培养20h，取菌液2mL接种于80mL解磷液体培养基中，对照组接入2ml牛肉膏蛋白胨液体培养基。30℃， 180r/min培养，隔12h取样(0h开始)，11000r/min离心5min，取上清液测定速效磷含量，同时测定上清液的pH。

(5)固氮能力测定：取一接种环菌体接种于5mL Ashby无氮液体培养基中，28℃，180r/min培养3天后，取1mL菌液重新接种于新的 30mL Ashby无氮液体培养基中，以等量未接种菌液的Ashby无氮液体培养基作为对照组。28℃，120r/min培养6d后，用凯氏定氮法测定培养液中的总氮含量。

经过综合测定后，选择出相关功能最强的两株菌，分别编号为YZX4 和YX7。因篇幅限制，其余菌的测试结果未放在文中。所述菌YZX4和 YX7的各指标的测定结果如表1～2所示，盐浓度以NaCl含量表示；表中的“-”指该菌株不具备该项功能或没有相关活性。

表1菌株YZX4在不同盐浓度下的相关性能展示

表2菌株YX7在不同盐浓度下的相关性能展示

4、菌株的生理生化鉴定和分子鉴定：

(1)将筛选得到的目标功能菌株YZX4和YX7进行一系列生理生化鉴定。其中，YZX4为革兰氏阴性菌，YX7为革兰氏阳性菌；YZX4的菌落形态如图1所示，YX7的菌落形态如图2所示；YZX4的电镜扫描图如图 3所示，YX7的电镜扫描图如图4所示；YZX4的生长曲线图如图5所示， YX7的生长曲线图如图6所示。

(2)分别提取各目标菌株的DNA，进行16SrDNA的扩增和测序。

利用引物27F和1492R进行扩增16SrDNA，引物序列如下：

27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；

1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。

PCR扩增条件为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s， 72℃延伸90s，30个循环；72℃最终延伸10min。

对PCR扩增产物进行测序，YZX4的测序结果如SEQ ID NO 1所示；YX7的测序结果如SEQ ID NO 2所示。

据此确认并将其分别命名为油菜假单胞菌YZX4和枯草芽孢杆菌 YX7。此2株菌株已于2018年07月30日，在微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center)保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院 3号。菌种名称：油菜假单胞菌YZX4(Pseudomonas brassicacearum)，保藏编号为CGMCC No.16170；菌种名称：枯草芽孢杆菌YX7(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCCNo.16171。

实施例二：筛选的菌株的耐盐碱能力展示

1、制备种子液：将实施例一筛选得到的菌株YZX4和YX7分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中进行活化：30℃恒温培养箱内培养8h。挑取一接种环已活化的功能菌株YZX4和YX7至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃、180r/min下培养至菌株对数期(通过生长曲线和OD值确定)，得到种子液。

2、耐盐能力测试：分别取一接种环的YZX4和YX7菌体(种子液)，分别接种到含有0、20、50、70、100、120、150、200g/L NaCl的牛肉膏蛋白胨液体培养基(pH＝7.2)中，以不接菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基作为空白对照，30℃，180r/min摇床培养2d。测定培养液在600nm 处的吸光值(OD₆₀₀)。

耐碱能力测试：取一接种环菌体分别接种到pH为7、8、9、9.5、 10、11的含20g/LNaCl牛肉膏蛋白胨培养基中，以不接菌的牛肉膏蛋白胨培养基作为空白对照，30℃，180r/min培养2d后，测定培养液在 600nm处的吸光值(OD₆₀₀)。

3、耐盐结果如图7所示，耐碱结果如图8所示。结果显示：菌株 YZX4的NaCl耐受范围为0～70g/L，最适生长的盐浓度为20g/L；在20g/L NaCl浓度下，碱性pH的耐受范围为7～9，最适生长的碱性pH为9。菌株YX7的NaCl耐受范围为0～200g/L，最适生长的盐浓度为20g/L；在20g/L NaCl浓度下，碱性pH的耐受范围为7～9，最适生长的碱性pH 为8。该结果说明菌株YZX4和YX7具有较广泛的耐盐能力，且在20g/L 盐浓度下具有一定的耐碱能力。

实施例三：改良剂中脱盐剂的筛选

1、配制30g/L的NaCl溶液，测定其pH值和pNa值，测定结果为 pH值为5.77，pNa值为0.79。取50ml上述溶液，分别与1.6g脱盐剂均匀混合，置于30℃，160r/min的恒温摇床中，24h后测定每瓶溶液的 pH值和pNa值。本实验选择的脱盐剂分别为D001型树脂、AB500型树脂、D113型树脂以及沸石粉，每种脱盐剂三个重复。

2、测定结果如表3所示。

表3不同脱盐剂测定结果展示

脱盐剂种类	处理后的pH	处理后的pNa
			D001	1.34±0.02	2.02±0.07
D113	2.28±0.03	1.31±0.03
			AB500	1.87±0.01	1.50±0.02
沸石粉	6.06±0.03	0.93±0.01

结果表明：经D001处理后的NaCl溶液pH值由初始的5.77降为1.34 ±0.02，pNa值由初始的0.79增加至2.02±0.07，效果最佳，因此选择D001型树脂作为本发明中改良剂中的脱盐剂。

实施例四：改良剂的制备和效果展示

1、制备微生物菌剂：将实施例一筛选得到的菌株YZX4和YX7分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中进行活化，30℃恒温培养箱内培养 8h。挑取一接种环已活化的功能菌株YZX4和YX7至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃、180r/min下培养至菌株对数期(通过生长曲线和 OD值确定)得到种子液。将种子液以20％(V/V)的接种量接入牛肉膏液体培养基中，在28℃下，0.5(V/V·min^-1)的通气量(无菌空气)， 100r/min的搅拌速度，培养12h得到菌发酵液。将各发酵液(菌体浓度为10⁹CFU/mL)按照1:1的体积比均匀混合，即得微生物菌剂。

2、制备生物炭：

(1)将农作物秸秆在600℃下进行厌氧碳化处理，制得生物炭。厌氧碳化是指高温、完全隔绝氧气条件下，有机物不发生燃烧，直接碳化的过程。

(2)碱改性：用2mol/L的NaOH溶液浸泡24h处理上述生物炭，去掉孔道中的硅类物质，处理后的样品用去离子水洗涤，直至pH值不再变化。

(3)酸改性：用2mol/L的HCl溶液浸泡经碱改性后的生物炭24h，去掉生物炭孔道中的无机盐离子，处理后的样品用去离子水洗涤，直至 pH值不再变化，以达到扩大生物炭孔道和增加比表面积的目的。

(4)活化处理：将经酸改性后的生物炭放入1mol/L的H₃PO₄溶液中浸泡处理24h，用于活化生物炭表面基团，同时起到携带营养元素磷、氮和缓冲/改良碱障碍型土壤的作用。

3、获取有机肥：有机肥可以直接使用各类自制或自然获得的肥料，如发酵后的人畜粪便、使用菜籽/棉籽等榨油后获得的饼肥、腐植酸等，也可以使用市购的有机肥，本实施例中使用市购有机肥来自内蒙古润田生物科技有限公司的羊粪有机肥。

4、将所述5～10份微生物菌剂、10～20份生物炭、70～80份有机肥和5～10份脱盐剂(D001)充分混匀，即得所需的改良剂。按所述方法制备18组改良剂，各组的具体制备方法如表4所示，表中份数指各组分的重量份数；表中微生物组成处的特定微生物指微生物菌剂中只含有特定微生物，菌浓度依然为10⁹CFU/mL，所述市购油菜假单胞菌、市购枯草芽孢杆菌均购自上海抚生实业有限公司；所述生物炭处理方式中，“未改性”指厌氧碳化后未经任何改性直接获得的生物炭，“碱改性”指只进行了碱改性，“酸改性”指只进行了酸改性，“进行全部改性”指进行了制备生物炭步骤中的全部改性和活性处理。

表4各组改良剂的具体制备方法展示

5、制备混有改良剂的模拟盐碱土，制备方法为：筛选成都双流当地土壤，去除杂质，过100目筛。将1kg土壤与16g改良剂混匀、装入试验盆中，再配制80g/L的NaCl溶液，按75ml/盆的量喷洒入试验盆中，再补充喷洒125ml水，以备播种。初始含盐量为0.6％。

浇水后，在每个盆中挖取5个3cm深的坑穴，每个坑穴内种一颗燕麦种子，各燕麦种子的品种和发育时间相同、外观相似、重量差异不显著。另设一组空白对照组：除将16g改良剂替换为等量模拟盐碱土外，其余处理完全相同。各组随机排列。2个月后全部收获并测定株高、根长、鲜重和干重(105℃杀青30min，75℃烘干至恒重)，将各组数据分别与空白对照组进行对比，得到增长率；并再次测定此时模拟盐碱土的含盐量。结果如表5所示。

表5各组改良剂的效果展示

实施例五：盐碱地改良方法效果展示

1、使用改良方法(1)进行改良。所述种子选择玉米种子，所述改良剂的用量为800kg/亩，种植至玉米外壳变黄即进行收获。

盐碱地改良结果为：改良前，盐碱地中含盐量为：3％，初始pH为10；改良后，盐碱地中含盐量为：0.8％，pH为9。

2、使用改良方法(2)进行改良。种苗选择甘薯，甘薯出苗后进行定植，定植后在甘薯苗根系周围挖一个3cm深的坑穴，将改良剂撒入坑穴中再进行掩埋，所述改良剂的用量为600kg/亩。

盐碱地改良结果为：改良前，盐碱地中含盐量为：3％，初始pH为 10；改良后，盐碱地中含盐量为：1.0％，pH为9。

3、使用改良方法(3)进行改良，具体包括如下步骤：

1)将营养土与待改良盐碱地的土壤按土壤干重比为1:1混匀，获得第一育苗土。其中，所述营养土由2份泥炭、1份珍珠岩、1份蛭石组成(质量份数)。所述待改良盐碱地的土壤中，初始可溶性总盐为3％，初始pH为9～10。

将所述第一育苗土放于育苗盆中，再选取耐盐性较强的盐生植物：盐角草和盐地碱蓬的种子，播种于育苗盘中。待盐角草和盐地碱蓬长至苗高8～12cm时，采用交叉栽培的方式移栽至所待改良盐碱地中(初始可溶性总盐为6.2％)。所述改良盐碱地中预先施入所述改良剂作为底肥，施入量为150kg/亩。所述交叉栽培，具体指：在一行以条播的方式移栽盐角草幼苗，再在与其垂直的一行以条播的方式移栽盐地碱蓬幼苗，以此类推，覆盖所需治理的盐碱土的所有区域。所述盐角草的种植密度为 3000株/亩,所述盐地碱蓬的种植密度为2500株/亩。当移栽的盐生植物生长量达到最大时，结束当季种植，收集距离根部3～5cm以上部位，对其进行晾晒制成牧草饲料。每种一季后进行翻土，并重新施入等量改良剂，再种下一季。采用上述方法治理改良3季后，测定被改良盐碱地的可溶性总盐为0.4～0.6％、pH值为8.5～9.0，完成重度盐碱地向中度盐碱地的转化。

2)将营养土与已改良3季的盐碱土按照土壤干重比为1:1均匀混合，获得第二育苗土。选取具有耐盐特性的披碱草和大麦草的种子，播种于装有第二育苗土的育苗盘中。提前向待改良的盐碱地中施用不含脱盐剂的改良剂做底肥，施入量为140kg/亩，并深翻旋耕土地。待披碱草和大麦草苗高为8～12cm时，采用交叉栽培的方式将各草苗移栽至所需改良的盐碱地中。所述披碱草的种植密度为3500株/亩，所述大麦草苗的种植密度为2500株/亩。当移栽的耐盐植物生长量达到最大时，结束当季种植，收集距离根部3～5cm以上部位，对其进行晾晒制成牧草饲料。每种一季后进行翻土，并重新施入不含脱盐剂的改良剂，再种下一季。采用上述方法治理改良3季后，测定被改良的土壤的可溶性总盐为 0.2～0.4％、pH值为7.5～8.0，完成中度盐碱地向轻度盐碱地的转化。

3)向已改良6季后的盐碱地中预先施入不含脱盐剂的改良剂，施入量为140kg/亩，选取具有耐盐特性的披碱草种子和玉米种子，以交叉栽培的形式播种至所需改良的盐碱地中。当披碱草生长量达到最大时，收集距离根部3～5cm以上部位，对其进行晾晒制成牧草饲料；待玉米成熟后(外壳长至黄色)，收集玉米果实，并收割秸秆作为饲料。收割完成后，结束当季种植，每种一季后进行翻土，重新施入等量不含脱盐剂的改良剂，再种下一季。采用上述方法治理改良2季后，测定被改良的土壤的可溶性总盐为0.1～0.2％、pH值为7.5～8.0，完成轻度盐碱地向农耕地的转化。

4)向已改良8季后的盐碱地中预先施入不含脱盐剂的改良剂做底肥，施入量为130kg/亩，并深翻旋耕土地。将玉米种子以条播的方式进行播种，待玉米成熟后，收集玉米果实，收割秸秆进行作为饲料再利用。每种一季后进行翻土，并重新施入不含脱盐剂的改良剂，再种下一季。采用上述方法治理改良2季，测定被改良的土壤中的可溶性总盐在0.1％以下，pH值在7.3以下。至此，将盐碱土壤彻底转化为农耕土地，恢复农业生产。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种盐碱地复合改良剂及其施用方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1439

<212> DNA

<213> 油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)

<400> 1

gggcatgggg gcagctacca tgcagtcgag cggtagagag gtgcttgcac ctcttgagag 60

cggcggacgg gtgagtaaag cctaggaatc tgcctggtag tgggggataa cgctcggaaa 120

cggacgctaa taccgcatac gtcctacggg agaaagcagg ggaccttcgg gccttgcgct 180

atcagatgag cctaggtcgg attagctagt tggtgaggta atggctcacc aaggcgacga 240

tccgtaactg gtctgagagg atgatcagtc acactggaac tgagacacgg tccagactcc 300

tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg 360

cgtgtgtgaa gaaggtcttc ggattgtaaa gcactttaag ttgggaggaa gggcattaac 420

ctaatacgtt agtgttttga cgttaccgac agaataagca ccggctaact ctgtgccagc 480

agccgcggta atacagaggg tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt 540

aggtggttcg ttaagttgga tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact gcattcaaaa 600

ctgtcgagct agagtatggt agagggtggt ggaatttcct gtgtagcggt gaaatgcgta 660

gatataggaa ggaacaccag tggcgaaggc gaccacctgg actgatactg acactgaggt 720

gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt 780

caactagccg ttgggagcct tgagctctta gtggcgcagc taacgcatta agttgaccgc 840

ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg 900

tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggcctt gacatccaat 960

gaactttcca gagatggatt ggtgccttcg ggaacattga gacaggtgct gcatggctgt 1020

cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt 1080

agttaccagc acgtaatggt gggcactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1140

gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacggcctgg gctacacacg tgctacaatg 1200

gtcggtacag agggttgcca agccgcgagg tggagctaat cccacaaaac cgatcgtagt 1260

ccggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgcgaatcag 1320

aatgtcgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg 1380

ggttgcacca gaagtagcta gtctaacctt cgggggacgg taccacgtgt atccgtgcg 1439

<210> 2

<211> 1453

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Pseudomonas brassicacearum)

<400> 2

gtggaatgcg ggtgctatac atgcagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt 60

tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 120

gaaaccgggg ctaataccgg atgcttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc 180

ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240

accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360

cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa 420

gaacaagtac cgttcgaata gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 540

cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 600

agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag 660

cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta 720

actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtgtccgcc ccttagtgct gcagctaacg 840

cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 900

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960

gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag 1020

gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080

gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1140

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acgtgctaca atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa 1260

atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt 1320

aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380

caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag ccagccgccg 1440

aagtgacaga aga 1453

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于：于2018年07月30日保藏至微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.16171。

2.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于：16Sr DNA序列如SEQ ID NO 2所示。

3.一种土壤改良剂，其特征在于：所述土壤改良剂的组分包括微生物菌剂、有机肥、生物炭，所述微生物菌剂中的微生物包括权利要求1或2中所述的枯草芽孢杆菌。

4.根据权利要求3所述的土壤改良剂，其特征在于：所述土壤改良剂的组分包括微生物菌剂、有机肥、生物炭、脱盐剂。

5.根据权利要求3所述的土壤改良剂，其特征在于：所述土壤改良剂的组分包括微生物菌剂5～10份、有机肥70～80份、生物炭10～20份、脱盐剂5～10份。

6.根据权利要求3所述的土壤改良剂，其特征在于：所述微生物菌剂中，所述微生物由所述枯草芽孢杆菌和油菜假单胞菌按活菌量为1:1组成。

7.根据权利要求3所述的土壤改良剂，其特征在于：所述生物炭的制备方法为：秸秆经厌氧碳化后，再依次经过碱处理、酸处理及磷酸活化后获得。

8.权利要求3～7任意一项所述的土壤改良剂在改良盐碱地中的应用，其特征在于：所述应用在播种时进行，方法为：将所述土壤改良剂与种子混合均匀后，撒入已翻耕待种植的盐碱地中，所述土壤改良剂的用量为500～1000kg/亩。

9.权利要求3～7任意一项所述的土壤改良剂在改良盐碱地中的应用，其特征在于：所述应用在种苗时进行，方法为：移植或定植种苗后，在种苗根系周围挖一个3～5cm深的坑穴，将土壤改良剂撒入坑穴中再进行掩埋，所述土壤改良剂的用量为500～1000kg/亩。

10.权利要求3～7任意一项所述的土壤改良剂在改良盐碱地中的应用，其特征在于：所述应用至少包括四个阶段，每个阶段至少种植一季植物，每季中土壤改良剂的用量至少为120kg/亩。