CN113215028A

CN113215028A - 一种微生物菌组及其微生物菌剂和应用

Info

Publication number: CN113215028A
Application number: CN202110352921.4A
Authority: CN
Inventors: 沈家葆; 李华一
Original assignee: Guangdong Lihao Biological Agriculture Co ltd
Current assignee: Guangdong Lihao Biological Agriculture Co ltd
Priority date: 2021-03-30
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2041-03-30
Also published as: CN113215028B

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种微生物菌组及其微生物菌剂和应用。本发明的微生物菌组包括以下菌属：a)硝化细菌：所述硝化细菌包括黄色杆菌属、硝化杆菌属、亚硝化单胞菌属中的一种，和b)固氮菌：所述固氮菌包括克雷伯氏菌属、红螺菌属、固氮螺菌属、拜叶林克氏菌属中的一种。本发明的微生物菌组菌种之间搭配合理、有效，微生物菌组可长期存在根圈环境中，可以达到药效高、效力持久的效果，并且本发明微生物菌组的菌种相互促进、依存，使得固氮菌的固氮效果大幅提高，同时将无效氮变成有效氮，有效的促进了农作物的营养生长。

Description

一种微生物菌组及其微生物菌剂和应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种微生物菌组及其微生物菌剂和应用。

背景技术

据联合国世界粮食组织统计，全球有大于9亿人处于营养不良状态，食物安全成为当今全球化的世界面临的一大关键挑战。统计人员发现，抛开经济、政治、历史等人为因素，如果可以消除作物的理论产量和实际产量的差值，可以至少提高粮食产量45-70％。造成在实验管理条件下和生产管理条件下的差值主要在于两种管理模式下植物生长的土壤环境不尽相同。

植物的生长、发育、繁殖离不开土壤，土壤的主要组成是各种颗粒状矿物质、有机物质、水分、空气、微生物。随着土壤微生物组学和植物生物技术的蓬勃发展，研究者们开始意识到土壤中的微生物对植物抗逆性或植物同化能力起到决定性作用。随着这个认知逐渐成为主流，用作农业、园林、水保、环保方面的微生物菌剂成为一个炙手可热的研究和开发方向。近年来，大量研究表明，微生物菌剂作为化学和农药的替代物，可以在保证充分抑制植物病原体或帮助植物生长的同时，不对人体健康或环境安全造成可观的负面影响。事实上，早在100年前，来自于荷兰的微生物学家Martinus Beijerinck提出了微生物对农业生产的“可靠性与必然性”，自1950s以来，世界各地已经陆续开发和改良了各类微生物菌剂。

在正常的耕地植物根圈土壤中，每1g土壤中可含有1亿-100亿微生物，理论上，没有人为干预，例如改变土壤pH、含水量、活性成分，由于所有微生物处于生物进化的稳定策略(Evolutionarily Stable Strategy,ESS)下形成一个稳定的微生物圈/微生态平衡，微生物菌剂难以挤进土著菌群的生态空位，导致存活率定殖率低，即使存活也处于微生态圈/微生态平衡中的边缘生态位，难以发挥效力。为解决这个窘境，在现如今对于根圈环境的浅显认知下，采用以一个互相依赖、互惠共生的微生物组来作为微生物菌剂成为一个可行且必要的技术方向。

为达到植物根圈促生细菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR)的定殖、生效、传承，在前人的基础上，当代研究者们取得了大量值得钦佩和借鉴的研究结果和技术方案。例如，美国孟山都技术公司的D·T·布利斯等人在2014年11月26日开发的以成团泛菌(Pantoea agglomerans)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia metallica)、越南伯克霍尔德菌(Burkholderia vietnamiensis)为主要效益菌；以培养液(包括水、水溶液、石油馏出物等)和固态物质(包括泥炭、小麦、麸皮、蛭石、黏土、滑石、膨润土、硅藻土、漂白土、消毒土等)为载体；以液体菌剂、固态菌粉、种质资源包衣剂、底肥、追肥为最终产品；以对作物的种子浸种、浸根、根部浇灌、叶面喷施、雾化施肥等为操作手段的一系列技术。旨在改良土壤肥力、改善农田生态环境、提高作物同化养料能力、提高作物抗逆性、降低病虫害发生几率。例如美国巴斯夫公司的K·西弗斯等人在2014年3月14日开发的以枯草芽孢杆菌为主要效益菌，混合以唑菌胺酯等农药的微生物菌剂技术。旨在提高农药药效，增加农药利用率，降低农药利用量，增加对农田、鱼塘、地下水等环境的保护。例如BioConsortia，INC，Peter Wigley A Susan等人以自主分离的圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、稻皮假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)、恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)等150余种400余株菌株作为实验材料，开发出相互混合的多种微生物菌剂。旨在帮助植物生长，拮抗土壤致病菌。

虽然国内外研究者们对微生物菌剂相关技术进行了大量的开发和研究，但是目前还有几个技术性的难题尚未解决。第一、各种微生物菌剂有效菌种雷同，据不完全统计，截止2014年，在国内微生物菌剂开发公司中随机抽样，在其生产的68种取得农业部肥料登记的产品中，有49个产品的有效菌种都从属于芽孢杆菌属，无外乎此属中的四个种：巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、动胶菌样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌。有效菌种雷同带来的结果是微生物菌剂产品效果类似，所能解决的农业问题范围狭窄，容易伤害农业生产者对于微生物菌剂产品的信心。第二、各种微生物菌剂中包含的微生物种类单一，搭配不合理，在同一个微生物菌剂产品中，往往是同属不同种菌种的混合，亲源关系越接近的微生物，对养料的偏好性就越接近。造成微生物菌剂产品内部菌群对于养料的争夺，进而导致微生物菌剂产品内部菌群的互相拮抗。截止2014年，在国内微生物菌剂开发公司中随机抽样，在其生产的68种取得农业部肥料登记的产品中，25种是单一菌种的微生物菌剂，剩下的43种两种及两种以上的有效菌种混合培养的微生物菌剂产品中，有26种的混合菌种来源于同一属。这样做的结果导致菌种之间大概率存在拮抗，造成“1+1<2”的结果。第三、在微生物菌剂产品中，革兰氏阳性菌处于主流地位，但无数研究证实：能在根圈环境中定殖并发挥作用的菌种绝大多数都是革兰氏阴性菌。虽然革兰氏阳性菌的培养技术要求不严苛，易于培养出浓度极高的菌液，但革兰氏阳性菌种往往不能有效定殖在土壤中，更不必提能发挥效果。这类微生物菌剂往往药效时间短、药效弱。截止2014年，在国内微生物菌剂开发公司中随机抽样，在其生产的68种取得农业部肥料登记的产品中，51种产品的有效菌是革兰氏阳性菌。导致的结果是施用菌剂后效果差、持续时间短、受不良天气影响严重。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种微生物菌组及其微生物菌剂和应用，本发明的微生物菌组菌种之间搭配合理、有效，微生物菌组可长期存在根圈环境中，可以达到药效高、效力持久的效果，并且本发明微生物菌组的菌种相互促进、依存，使得固氮菌的固氮效果大幅提高，同时将无效氮变成有效氮，有效的促进了农作物的营养生长。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种微生物菌组，所述微生物菌组包括以下菌属：

a)硝化细菌：所述硝化细菌包括黄色杆菌属、硝化杆菌属、亚硝化单胞菌属中的一种，和

b)固氮菌：所述固氮菌包括克雷伯氏菌属、红螺菌属、固氮螺菌属、拜叶林克氏菌属中的一种。

本发明的微生物菌组包含多种有效菌种，菌种之间的相互关系紧密，硝化细菌在N源上对固氮菌的依赖，硝化细菌使用了固氮菌在固氮过程中的生成物，如NH⁴⁺，降低了生成物的浓度，促进了固氮菌的活性；这使得本发明的微生物菌剂施用后可以长久的以一整个生态循环的模式长久的存在于土壤中，可与土壤真菌交互。同时，本微生物菌组核心效益菌群为革兰氏阴性菌，和植物的互作关系紧密，施用本发明的微生物菌组后，可以长久的定殖与根圈环境中，具有药效持久和效力强劲的效果。

近年来，海量的研究和实验表明：在种类上，植物根际环境中绝大多数(>95％)稳定定殖的微生物种类为革兰氏阴性菌。但市面上大多产品与这项调查结果背道而驰，革兰氏阳性菌由于其不能定殖在根际环境中，进而影响到药效。致使药效持续时间短、效力弱。

本发明的微生物菌组将硝化细菌和固氮菌混合，可以增强固氮效率，增强菌组活性，可以长久的定殖与根圈环境中，更好的促进农作物营养生长。

作为本发明所述微生物菌组的优选实施方式，所述硝化细菌选自氧化胺黄色杆菌、巴氏梭菌、Nitrosomonas aestuarii、N.communis、N.cryotolerans、N.europaea、N.eutropha、N.halophila、N.marina、N.nitrosa、N.oligotropha、N.ureae中的一种，所述固氮菌选自巴西固氮螺菌、Azospirillum lipoferum、圆褐固氮菌、蜜糖草固氮螺菌、A.nigricans、A.vinelandii、A.paspali、A.salinestris、A.beijerinckii中的一种。

当采用上述菌相互组合构成不同组合的微生物菌组时，分别处理得到的农作物生长30天后干物质增量较高，说明当采用上述的微生物菌组可以提高农作物的生长。

作为本发明所述微生物菌组的优选实施方式，所述硝化细菌选自氧化胺黄色杆菌，所述固氮菌选自巴西固氮螺菌。

本发明采用氧化胺黄色杆菌和巴西固氮螺菌的组合对农作物具有促生作用，其发芽率、地上部分干物质增量、地下部分总量增量和总干物质增量菌较强。

第二方面，本发明提供了一种液体培养液，包括上述的微生物菌组，所述硝化细菌在液体培养液中的含量为10⁶～10¹¹CFU/mL，所述固氮菌在液体培养液中的含量为10⁶～10¹¹CFU/mL。

第三方面，本发明提供了一种固体培养基，包括上述的微生物菌组，所述硝化细菌在固体培养基中的含量为10⁴～10⁹CFU/g，所述固氮菌在固体培养基中的含量为10⁴～10⁹CFU/g。

第四方面，本发明提供了一种菌干粉，包括上述的微生物菌组，所述硝化细菌在菌干粉中的含量为10³～10¹²CFU/g，所述固氮菌在菌干粉中的含量为10³～10¹²CFU/g。

第五方面，本发明提供了一种促进农作物生长的微生物菌剂，包括上述的微生物菌组。

对于微生物来说，当某种微生物在行使固氮、固碳、分解腐殖质等功能的过程中，上游底物或下游生成物的种类、浓度、酸碱度变化后，其原有的功能轻则大打折扣，重则反应停滞。市面上大量微生物菌剂产品，在理论上有固氮、固碳、分解腐殖质等的作用。单一或盲目配比决定了这些产品在土壤中行使功能强度极差，因为缺乏合理配合的菌种，稳定上游反应底物浓度或消耗下游生成物。植物往往不能吸收或低效率的吸收这些菌的产物。

固氮菌在固氮过程中，会发生被固氮产物抑制固氮反应的现象。其原因是由于固氮生成的NH⁴⁺没有被及时消耗，这抑制了固氮酶的活性位点的活性。本微生物菌剂中的菌种相互促进、依存，可以在固氮菌生成固氮产物后，由其它的有效菌及时转化成可溶于土壤的形态，保证了固氮菌的固氮效率，同时氮的形态也更易被植物吸收，极大地增强了对农作物养分的补充。

更优选地，上述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将氧化胺黄色杆菌按照质量比为1:1000加入改良液体营养肉汁培养基，放置恒温震荡摇床中培养，设置摇床参数为28℃，150～200r/min，24～48h后，获得复活的氧化胺黄色杆菌种子液；

2)将巴西固氮螺菌按照质量比为1:1000加入改良液体固氮培养基，放置恒温震荡摇床中培养，设置摇床参数为28℃，150～200r/min，24～48h后，获得复活的巴西固氮螺菌种子液；

3)将氧化胺黄色杆菌种子液和巴西固氮螺菌种子液加入液体共培养基，放置恒温震荡摇床中培养，设置摇床参数为28℃，150r/min，24-48h后，获得氧化胺黄色杆菌和巴西固氮螺菌的共培养液；

4)取得共培养液后，以质量比为1.5:100加入装满发酵底物的无菌液态发酵罐中发酵，由下至上分多个气阀通入无菌空气。发酵罐无菌空气质量要求为：出口空气压强控制在0.2-0.35mPa(表压)，潮湿度60％-70％，发酵过程中无菌空气通量为1L/min，发酵罐温度在25-30℃，发酵罐内必要保持正压，发酵24-48h后，得到微生物菌剂。

更优选地，所述改良液体营养肉汁培养基包括以下重量的组分：甘露醇10.0g；蛋白胨10.0g；牛肉浸出物3.0g；NaCl 5.0g；水1.0L，pH值为7.0。

更优选地，所述改良液体固氮培养基包括以下重量的组分：蛋白胨1g；蔗糖10.0g；甘露醇10.0g；KH₂PO₄ 0.2g；K₂HPO₄ 0.8g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；CaSO₄·2H₂O 0.1g；FeCl₃微量；Na₂MoO₄·2H₂O微量；酵母提取物0.5g；水1.0L，pH值为7.2。

更优选地，所述液体共培养基包括以下重量的组分：甘露醇10.0g；蛋白胨10.0g；NaCl 3.0g；KH₂PO₄ 0.2g；K₂HPO₄ 0.8g；酵母粉3g；含蔗糖的MS培养基(不含琼脂)10.0g；蒸馏水1L，pH值为7.0。

作为本发明所述微生物菌剂的优选实施方式，所述微生物菌剂施用在土壤中，所述微生物菌剂的用量为每毫升土含有10⁴～10⁶个。

在本发明的技术方案中，微生物菌剂可以增加土壤的固氮量，显著增加农作物总生物量。

第六方面，本发明提供了一种农作物生长的种植方法，所述种植方法包括施用上述微生物菌剂的步骤。

作为本发明所述农作物生长的种植方法的优选实施方式，所述农作物包括花生、大豆、玉米、小麦、油菜、菜薹中至少一种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明提供了一种微生物菌组，菌种之间搭配有效、合理，微生物菌组可以长期存在于根圈环境中，稳定、高效地发挥效果；

2)本发明的微生物菌组相互促进、依存，固氮菌的固氮效果大幅提高，同时将无效氮变成有效氮，有效的促进了植物的营养生长；

3)本发明提供了一种微生物菌剂及农作物生长的种植方法，可以显著提高农作物的发芽率，提高农作物地上和地下的总生物量，帮助农作物生长。

附图说明

图1为硝化细菌的镜检图；

图2为固氮菌的镜检图；

图3为氧化胺黄色杆菌的镜检图；

图4为巴西固氮螺菌的镜检图；

图5为硝化细菌和固氮菌的共培养液的镜检图；

图6为氧化胺黄色杆菌和巴西固氮螺菌的共培养液的镜检图；

图7为不同组合的微生物菌组对农作物地上干物质增量的结果图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

在以下实施例和对比例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在以下实施例及对比例中，主要受试巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)、氧化胺黄色杆菌(Xanthobacter aminoxidans)在中国普通微生物菌种保藏管理中心购得，其编号分别为CGMCC1.10379和CGMCC1.3798。

其它受试菌种巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、Nitrosomonasaestuarii、N.communis、N.cryotolerans、N.europaea、N.eutropha、N.halophila、N.marina、N.nitrosa、N.oligotropha、N.ureae、

Azospirillum lipoferum、圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)、蜜糖草固氮螺菌(Azospirillum melinis)、A.nigricans、A.vinelandii、A.paspali、A.salinestris、A.beijerinckii分别来源于(来源+编号)：中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC1.2675、中国微生物菌种查询网bio-110700、中国微生物菌种查询网bio-105705、中国微生物菌种查询网bio-105704、中国微生物菌种查询网bio-84318、中国微生物菌种查询网bio-84364、全球生物资源中心ATCC51953、全球生物资源中心ATCC51952、中国微生物菌种查询网bio-105706、全球生物资源中心ATCC51950、全球生物资源中心ATCC25393、中国微生物菌种查询网bio-091106、中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC1.496、中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC1.5340、中国微生物菌种查询网bio-087002、中国微生物菌种查询网bio-05470、全球生物资源中心ATCC12837、中国微生物菌种查询网bio-05472、中国微生物菌种查询网bio-78472。

实施例1、微生物的单株培养

复苏后的单种菌菌液或菌落作为种子液加入相对应的培养液中，每100mL加种子液0.3mL。置于恒温振荡培养箱中培养，28℃，150-200转/分钟，发酵周期为24～48h，发酵液中活菌菌体浓度不低于10⁸个/mL。

硝化细菌和固氮菌镜检：取培养得到的硝化细菌菌液和固氮菌菌液，于超纯水中充分摇匀稀释，吸取0.3mL滴在载玻片上，将载玻片放入干燥箱中干燥，使用革兰氏染色法进行染色，在油镜下观察(参见图1和图2)。

氧化胺黄色杆菌和巴西固氮螺菌镜检：取培养得到的氧化胺黄色杆菌菌液和巴西固氮螺菌菌液，于超纯水中充分摇匀稀释，吸取0.3mL滴在载玻片上，将载玻片放入干燥箱中干燥，使用革兰氏染色法进行染色，在油镜下观察(参见图3和图4)。

实施例2、一种微生物菌组及微生物菌剂

一种微生物菌剂，包括微生物菌组，微生物菌组由硝化细菌和固氮菌构成。

一种微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将硝化细菌按照质量比为1:1000加入改良液体营养肉汁培养基，放置恒温震荡摇床中培养，设置摇床参数为28℃，150r/min，24-48h后，获得复活的硝化细菌种子液；

2)将固氮菌按照质量比为1:1000加入改良液体固氮培养基，放置恒温震荡摇床中培养，设置摇床参数为28℃，150r/min，24-48h后，获得复活的固氮菌种子液；

3)将硝化细菌种子液和固氮菌种子液加入液体共培养基，每100mL液体共培养基加0.25mL硝化细菌种子液和0.25mL固氮菌种子液，放置恒温震荡摇床中培养，设置摇床参数为28℃，150r/min，24-48h后，获得硝化细菌和固氮菌的共培养液，共培养液中总活菌菌体浓度不低于10⁹个/mL，硝化细菌和固氮菌的浓度不低于10⁶个/mL；

取培养得到的硝化细菌和固氮菌的共培养液，于超纯水中充分摇匀稀释，吸取0.3mL滴在载玻片上，将载玻片放入干燥箱中干燥，使用革兰氏染色法进行染色，在油镜下观察，其镜检如图5所示

改良液体营养肉汁培养基包括以下重量的组分：甘露醇10.0g；蛋白胨10.0g；牛肉浸出物3.0g；NaCl 5.0g；水1.0L，pH值为7.0。

改良液体固氮培养基包括以下重量的组分：蛋白胨1g；蔗糖10.0g；甘露醇10.0g；KH₂PO₄ 0.2g；K₂HPO₄ 0.8g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；CaSO₄·2H₂O 0.1g；FeCl₃微量；Na₂MoO₄·2H₂O微量；酵母提取物0.5g；水1.0L，pH值为7.2。

共培养基包括以下重量的组分：甘露醇10.0g；蛋白胨10.0g；NaCl 3.0g；KH₂PO₄0.2g；K₂HPO₄ 0.8g；酵母粉3g；含蔗糖的MS培养基(不含琼脂)10.0g；蒸馏水1L，pH值为7.0。

实施例3、一种微生物菌组及微生物菌剂

一种微生物菌剂，包括微生物菌组，微生物菌组由氧化胺黄色杆菌和巴西固氮螺菌构成。

一种微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将氧化胺黄色杆菌按照质量比为1:1000加入改良液体营养肉汁培养基，放置恒温震荡摇床中培养，设置摇床参数为28℃，150r/min，24-48h后，获得复活的氧化胺黄色杆菌种子液；

2)将巴西固氮螺菌按照质量比为1:1000加入改良液体固氮培养基，放置恒温震荡摇床中培养，设置摇床参数为28℃，150r/min，24-48h后，获得复活的巴西固氮螺菌种子液；

3)将氧化胺黄色杆菌种子液和巴西固氮螺菌种子液加入液体共培养基，每100mL液体共培养基加0.25mL氧化胺黄色杆菌种子液和0.25mL巴西固氮螺菌种子液，放置恒温震荡摇床中培养，设置摇床参数为28℃，150r/min，24-48h后，获得氧化胺黄色杆菌和巴西固氮螺菌的共培养液，共培养液中总活菌菌体浓度不低于10⁹个/mL，氧化胺黄色杆菌和巴西固氮螺菌的度不低于10⁶个/mL；

将培养得到的氧化胺黄色杆菌和巴西固氮螺菌的共培养液于超纯水中充分摇匀稀释，吸取0.3mL滴在载玻片上，将载玻片放入干燥箱中干燥，使用革兰氏染色法进行染色，在油镜下观察，其镜检如图6所示。

改良液体营养肉汁培养基、改良液体固氮培养基和共培养基的组分和含量如实施例2相同。

在其他实施例中，微生物菌组还可以由以下菌种构成：

a)氧化胺黄色杆菌、巴氏梭菌、Nitrosomonas aestuarii、N.communis、N.cryotolerans、N.europaea、N.eutropha、N.halophila、N.marina、N.nitrosa、N.oligotropha、N.ureae中的一种；和

b)巴西固氮螺菌、Azospirillum lipoferum、圆褐固氮菌、蜜糖草固氮螺菌、A.nigricans、A.vinelandii、A.paspali、A.salinestris、A.beijerinckii中的一种。

实施例4、一种农作物生长的种植方法

一种农作物生长的种植方法，包括以下步骤：

S1、浸种：使用上述的微生物菌剂按照质量比为1:100兑入水中得稀释100倍后的菌液，放置，将需要浸种的农作物种子加入米汤，摇匀，静置4h-12h，捞出阴干；

S2、拌种：将步骤S1中的农作物种子与稀释100倍后的菌液搅拌均匀，或用稀释后的菌液喷湿农作物种子，待农作物种子阴干后播种，得幼苗；

S3、喷施：使用上述的微生物菌剂按照质量比为1:50兑入水中得稀释50倍后的菌液，将稀释50倍后的菌液均匀喷施在幼苗的叶片上；

S4、蘸根：使用上述的微生物菌剂按照质量比为1:20兑入水中得稀释20倍后的菌液，幼苗移栽前将幼苗的根部浸入稀释20倍后的菌液中10min～20min；

S5、灌根：使用上述的微生物菌剂按照质量比为1:10兑入水中得稀释10倍后的菌液，将稀释10倍后的菌液浇灌于幼苗的根部。

实施例5、微生物菌组的功能及性质实验

1、微生物菌组的溶血反应

将制备好的微生物菌组接种于血琼脂平板上，37℃培养24h，观察发现无溶血圈产生，可用于制作农用微生物菌剂。血琼脂平板：蛋白胨10g，牛肉浸出粉10g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1L。pH7.5，高压灭菌冷却到60℃左右时加入无菌脱纤维绵羊血60mL，旋转充分倒平板。血琼脂层厚度5mm。

溶血反应结果：固氮菌、硝化细菌、固氮菌和硝化细菌的共培养液、巴西固氮螺菌、氧化胺黄色杆菌、巴西固氮螺菌和氧化胺黄色杆菌的共培养液均无溶血反应。

2、微生物菌组的固氮能力测定

实验组：实施例1制备的固氮菌发酵液、巴西固氮螺菌发酵液、硝化细菌发酵液、氧化胺黄色杆菌发酵液，实施例2制备的固氮菌和硝化细菌的共培养液、实施例3制备的巴西固氮螺菌和氧化胺黄色杆菌的共培养液；清水作为对照组。

微生物菌组及其组分的固氮能力测定：以乙炔还原法分别测定微生物组及其组分的固氮能力。具体实施步骤为：用规格为15mm^*150mm的试管中加入5mL的LB琼脂制成斜面培养基，以软橡胶塞封口培养，静至24h待长出菌苔后，抽出5mL空气，注射5mL乙炔，培养48h后吸取100μL试管内气体用气相色谱仪测乙烯生成量。菌体蛋白含量测定方法如下所述：用5mL生理盐水将试管斜面上的菌苔洗入离心管中，收集菌体，向菌体中加入3mL 0.5M的NaOH沸水煮沸5min，加入3mL 0.5M的HCl混合，离心后取上清1.0mL，加入5mL考马斯亮蓝溶液，在漩涡混合器上混合，显色3分钟，测定595nm处的吸光值A595，根据牛血清白蛋白标准曲线计算菌体蛋白含量。其结果见表1所示。

表1

实施例5、微生物菌组与土壤的互作关系

1、微生物菌组在根圈环境中的定殖情况

微生物菌组在植物根际环境中定殖的测定实验：在培养箱中盆栽作物，盆栽用土为腐殖土，来源于吉林省长白山。

实验用培养钵为21cm^*21cm，土壤理化性质为：干态下的平均粒径为223μm，湿态粒径为66.5μm，颗粒体积为4.64*10⁵cm³，干腐殖土的密度约为2.47g/cm³。有机质质量分数为29.13％，含固率为89.50％，种植植物为花生。将鲁豫花生以稀释25倍的实施例2或实施例3微生物菌组制成的微生物菌剂分别浸种，种入培养钵内，每盆4株种到培养钵内，每隔2周分别以稀释100倍的实施例2和实施例3微生物菌组制成的微生物菌剂进行叶面及根部喷施。2月后分离土壤根际环境中的细菌。采用平板计数法估测微生物菌组各组分的含量。结果见表2所示。

表2

菌种	含量(CFU/g)
		固氮菌	1.3*10<sup>6</sup>
硝化细菌	2.2*10<sup>5</sup>
		巴西固氮螺菌	7.2*10<sup>6</sup>
氧化胺黄色杆菌	6.8*10<sup>5</sup>

上述表2的数据可以说明，喷施实施例2和实施例3的微生物菌组后，实施例2或实施例3的微生物菌组可有效定殖在土壤中。

2、微生物组在根圈环境中的生存状况

微生物组在植物根际环境中定殖的测定实验：在培养箱中盆栽作物，盆栽用土为腐殖土，来源于吉林省长白山。实验用培养钵为21cm*21cm，土壤理化性质为：干态下的平均粒径为223μm，湿态粒径为66.5μm，颗粒体积为4.64*10⁵cm³，干腐殖土的密度约为2.47g/cm³。有机质质量分数为29.13％，含固率为89.50％，种植植物为花生。将鲁豫花生以稀释25倍的结果见表2所示制成的微生物菌剂浸种，种入培养钵内，每盆4株种到培养钵内。2月后分离土壤根际环境中的细菌。采用平板计数法估测微生物组各组分的含量。结果见表3所示。

表3

菌种	含量(CFU/g)
		固氮菌	4.1*10<sup>4</sup>
硝化细菌	1.1*10<sup>5</sup>
		巴西固氮螺菌	7.0*10<sup>3</sup>
氧化胺黄色杆菌	7.0*10<sup>3</sup>

上述表3的数据可以说明，喷施实施例2或实施例3的微生物菌组后，实施例2或实施例3的微生物菌组可长期在土壤中生存，可以达到药效高、效力持久的效果。

实施例6、微生物菌组对不同植物组织的影响

取受不同实验组条件下影响、人工环境下生长的花生、大豆、玉米、小麦、油菜、菜薹，对发芽率、30d茎长度、30d根长度、30d地上部分干物质重进行测量。其中实验组分为：施用实施例2的微生物菌组、施用实施例3的微生物菌组、施用硝化细菌、施用固氮菌、施用氧化胺黄色杆菌、施用巴西固氮螺菌，共六个实验组，对照组为清水对照。

管理方案为：实验组采用上述微生物菌浸种，以稀释25倍的菌剂28℃下浸泡种子1h，经催芽后种入培养钵中，每两周用稀释100倍的上述微生物菌制成的微生物菌剂浇灌一次同时对叶面进行喷施。对照组采用类似的管理模式，但菌剂用蒸馏水替代。结果见表4。

表4

从表4的数据可知，硝化细菌和固氮菌的组合对豆科作物、如花生、大豆，禾本科作物、如玉米、小麦，十字花科作物、如油菜、菜薹，具有促生作用。此结果具有很强的统计学意义。此结果说明氧化胺黄色杆菌(Xanthobacter aminoxidans)和巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)的组合对豆科作物、如花生、大豆，禾本科作物、如玉米、小麦，十字花科作物、如油菜、菜薹，具有促生作用。此结果具有很强的统计学意义。

实施例7、不同组合的微生物菌组对农作物生长的影响

1)硝化细菌和固氮菌对植物生长的影响

取在植物培养箱中生长7d的作物10株作为实验组，用稀释25倍的硝化细菌和固氮菌的共培养液灌根，隔2h后用稀释100倍的硝化细菌和固氮菌的共培养液进行叶面喷施；每14d后重复此操作，35d后采样测量地上部分干重。取同等生长时间同等长势的作物用清水做同等处理，为对照组。

受到硝化细菌和固氮菌的共培养液的影响，实验组相对于对照组地上干重在35d增加了25％。

2)受试菌种组合对植物生长的影响

其它受试硝化细菌包括：巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)、Nitrosomonasaestuarii、N.communis、N.cryotolerans、N.europaea、N.eutropha、N.halophila、N.marina、N.nitrosa、N.oligotropha、N.ureae，共11种。

其它受试固氮菌包括：Azospirillum lipoferum、圆褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)、蜜糖草固氮螺菌(Azospirillum melinis)、A.nigricans、A.vinelandii、A.paspali、A.salinestris、A.beijerinckii，共8种。

以上述硝化细菌和固氮菌的混合菌液培养方式培养的硝化细菌和固氮菌的组合共88种。

以上述88种组合微生物菌组，以稀释50倍浸种的方式处理作物，每一种微生物菌组处理的作物为一组实验组，共88组实验组，对照组为清水浸种。生长30d后测地上干物质增量。结果如图7所示。

从图7的内容可知，本发明的微生物菌组可以提高农作物地上干物质增量，通过菌种相互促进、依存，使得固氮菌的固氮效果大幅提高，同时将无效氮变成有效氮，有效的促进了农作物的营养生长。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种微生物菌组，其特征在于，所述微生物菌组包括以下菌属：

2.如权利要求1所述的微生物菌组，其特征在于，所述硝化细菌选自氧化胺黄色杆菌、巴氏梭菌、Nitrosomonas aestuarii、N.communis、N.cryotolerans、N.europaea、N.eutropha、N.halophila、N.marina、N.nitrosa、N.oligotropha、N.ureae中的一种，所述固氮菌选自巴西固氮螺菌、Azospirillum lipoferum、圆褐固氮菌、蜜糖草固氮螺菌、A.nigricans、A.vinelandii、A.paspali、A.salinestris、A.beijerinckii中的一种。

3.如权利要求2所述的微生物菌组，其特征在于，所述硝化细菌选自氧化胺黄色杆菌，所述固氮菌选自巴西固氮螺菌。

4.一种液体培养液，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的微生物菌组，所述硝化细菌在液体培养液中的含量为10⁶～10¹¹CFU/mL，所述固氮菌在液体培养液中的含量为10⁶～10¹¹CFU/mL。

5.一种固体培养基，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的微生物菌组，所述硝化细菌在固体培养基中的含量为10⁴～10⁹CFU/g，所述固氮菌在固体培养基中的含量为10⁴～10⁹CFU/g。

6.一种菌干粉，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的微生物菌组，所述硝化细菌在菌干粉中的含量为10³～10¹²CFU/g，所述固氮菌在菌干粉中的含量为10³～10¹²CFU/g。

7.一种促进农作物生长的微生物菌剂，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的微生物菌组。

8.如权利要求7所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将硝化细菌按照质量比为1:1000加入改良液体营养肉汁培养基，放置恒温震荡摇床中培养，获得复活的硝化细菌种子液；

2)将固氮菌按照质量比为1:1000加入改良液体固氮培养基，放置恒温震荡摇床中培养，获得复活的固氮菌种子液；

3)将硝化细菌种子液和固氮菌种子液加入液体共培养基，放置恒温震荡摇床中培养，获得硝化细菌和固氮菌的共培养液；

4)取得共培养液后，以质量比为1.5:100加入装满发酵底物的无菌液态发酵罐中发酵，得微生物菌剂；

所述改良液体营养肉汁培养基包括以下重量的组分：甘露醇10.0g；蛋白胨10.0g；牛肉浸出物3.0g；NaCl 5.0g；水1.0L，pH值为7.0；

所述改良液体固氮培养基包括以下重量的组分：蛋白胨1g；蔗糖10.0g；甘露醇10.0g；KH₂PO₄ 0.2g；K₂HPO₄ 0.8g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；CaSO₄·2H₂O 0.1g；FeCl₃微量；Na₂MoO₄·2H₂O微量；酵母提取物0.5g；水1.0L，pH值为7.2；

所述液体共培养基包括以下重量的组分：甘露醇10.0g；蛋白胨10.0g；NaCl 3.0g；KH₂PO₄ 0.2g；K₂HPO₄ 0.8g；酵母粉3g；含蔗糖的MS培养基10.0g；蒸馏水1L，pH值为7.0。

9.一种农作物生长的种植方法，其特征在于，所述种植方法包括施用权利要求7所述微生物菌剂的步骤。

10.如权利要求9所述的农作物生长的种植方法，其特征在于，所述农作物包括花生、大豆、玉米、小麦、油菜、菜薹中至少一种。