CN114703233B - 一种提高梭菌发酵产氢效率的方法及其应用 - Google Patents

一种提高梭菌发酵产氢效率的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高梭菌发酵产氢效率的方法及其应用。本发明通过将梭菌接种于暗发酵培养基，在顶空为氮气的环境中进行避光发酵，得到氢气。本发明所提供的方法可以显著提高梭菌发酵产氢底物转化率并降低发酵产氢成本，且操作简便，易于实现大规模的工业应用。

Description

一种提高梭菌发酵产氢效率的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物发酵领域，特别涉及一种提高梭菌发酵产氢效率的方法及其应用。
背景技术
氢气是一种高能量密度，环境友好的能源，在未来氢气有望成为化石能源的替代品。目前氢气的主要来源于电解盐溶液、化石能源的裂解等方式，能量消耗大，碳排放高且不可持续。
相较于传统的产氢方式，微生物暗发酵产氢具有反应条件温和，无需光照、碳排放较低、原料为糖类物质，获取简单等优点。微生物暗发酵产氢是一种可持续的、环境友好的制氢方式。在未来有望成为一种主流的产氢方式。
但目前微生物发酵产氢的瓶颈是产氢成本较高。底物发酵转化率较低是其中一个重要原因，如梭菌等严格厌氧菌利用葡萄糖为底物产氢的理论转化率为4 mol H2/ mol葡萄糖，但实际转化率一般为1.5-2.0 mol H2/ mol葡萄糖，距离实际应用还有较大差距。此外，目前微生物的高浓度发酵培养需要大量的有机氮源，而大量有机氮源的添加会增加氢气生产的成本，制约其实际应用。如何在提高产氢底物转化率的同时降低氢气生产的成本是微生物发酵产氢目前面临的关键问题。
梭菌是一种具有固氮能力的暗发酵产氢微生物，广泛分布于各种环境中。梭菌可以利用固氮酶将氮气转化为有机氮，用于生长和增殖。但是目前尚未有关于梭菌在固氮条件下产氢的相关研究，利用梭菌的固氮能力可以降低培养基的氮源成本，但是能否提高底物转化率仍是未知的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提高梭菌发酵产氢效率的方法。
本发明的另一目的在于提供上述提高梭菌发酵产氢效率的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种提高梭菌发酵产氢效率的方法，包括如下步骤：将梭菌接种于暗发酵培养基，在顶空为氮气的环境中进行避光发酵，得到氢气。
所述的梭菌优选为巴氏梭菌DSM 525和梭菌BY-1中的至少一种。
所述的梭菌在接种于暗发酵培养基前优选通过如下步骤制备得到：将梭菌接种于种子培养基中，富集培养，得到梭菌种子液。
所述的种子培养基的组成优选如下：谷氨酸钠0.9～1.1 g/L，NaCl 4～6 g/L，K2HPO4 1.8～2.2 g/L，KH2PO4 0.4～0.6 g/L，微量元素浓缩液 9～11 mL/L，葡萄糖4 g/L，pH=6.8～7.2；更优选如下：谷氨酸钠1 g/L，NaCl 5 g/L，K2HPO4 2 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，微量元素浓缩液 10 mL/L，葡萄糖4 g/L，pH=7。
所述的富集培养的条件优选如下：在厌氧条件下于35～40℃避光静置培养；更优选为在厌氧条件下于37℃避光静置培养。
所述的厌氧条件是将装有种子培养基的容器的顶空气体置换为氮气得到。
所述的富集培养的培养时间优选为10～14 h；更优选为12 h。
所述的暗发酵培养基为无氮源、底物为葡萄糖的培养基；其组成优选如下：NaCl 4～6 g/L，K2HPO4 1～3 g/L，KH2PO4 0.4～0.6 g/L，微量元素浓缩液 9～11 mL/L，葡萄糖3～5 g/L，pH=6.5～7.5；更优选如下：NaCl 5 g/L，K2HPO4 2 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，微量元素浓缩液 10 mL/L，葡萄糖4 g/L，pH=7。
微量元素浓缩液的组成如下：NaCl 6 g/L，CaCl2·2H2O 0.2 g/L，MgCl2·6H2O 2g/L，FeCl2·4H2O 40 mg/L，ZnCl2 1mg/L，MnCl2·4H2O 1 mg/L，CuCl2·2H2O 0.6 mg/L，Na2MoO4 1 mg/L，AlCl3 1 mg/L，CoCl3·6H2O 4 mg/L，硼酸饱和溶液 20 μL，浓度为12 mol/L的浓盐酸 20 μL，生物素0.04 mg/L，叶酸 0.04 mg/L，维生素B6 0.2 mg/L，核黄素0.1 mg/L，维生素B1 0.1 mg/L，烟酸 0.1 mg/L，维生素B12 0.1 mg/L，对氨苯甲酸 0.1 mg/L，泛酸0.1 mg/L。
所述的接种的量为暗发酵培养基体积2～4%；更优选为暗发酵培养基体积3%。
所述的环境是在将梭菌接种于暗发酵培养基后用氮气除氧得到。
所述的避光发酵的温度优选为35～40℃；更优选为37℃。
所述的避光发酵的时间优选为24 h以上；更优选为24～72 h。
上述提高梭菌发酵产氢效率的方法在氢气制备中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果
（1）本发明所提供的方法，可以高效提高梭菌发酵产氢底物转化率，有推广潜质；
（2）由于本发明所使用的培养基无需有机氮源，有利于降低发酵产氢的成本；
（3）本发明所提供的方法具有操作简便、实用性强的特点，有利于大规模的工业应用。
附图说明
图1是在含不同浓度氯化铵氮源的培养基中巴氏梭菌DSM525发酵产氢量（a）、生物量（b）和最终底物氢气转化率（c）的结果图。
图2是在含不同浓度氯化铵氮源的培养基中梭菌BY-1发酵产氢量（a）、生物量（b）和最终底物氢气转化率（c）的结果图。
图3是在含不同浓度谷氨酸钠氮源的培养基中巴氏梭菌DSM525发酵产氢量（a）、生物量（b）和最终底物氢气转化率（c）的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
（1）以巴氏梭菌（Clostridium pasteurianum）DSM 525（购置于德国微生物菌种保藏中心DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）为菌种，按5%（v/v）种子培养基的接种量将DSM 525接种于种子培养基，富集培养12 h获得梭菌种子液，培养体系为20 mL培养液/120 mL西林瓶，顶空气体置换为氮气，培养条件为37℃避光静置培养。
种子培养基，其配方如下：
谷氨酸钠1 g/L，NaCl 5 g/L，K2HPO4 2 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，微量元素浓缩液 10mL/L，葡萄糖4 g/L，pH=7。
微量元素浓缩液（1L）成分如下：
NaCl 6 g/L，CaCl2·2H2O 0.2 g/L，MgCl2·6H2O 2 g/L，FeCl2·4H2O 40 mg/L，ZnCl2 1mg/L，MnCl2·4H2O 1 mg/L，CuCl2·2H2O 0.6 mg/L，Na2MoO4 1 mg/L，AlCl3 1 mg/L，CoCl3·6H2O 4 mg/L，硼酸饱和溶液 20 μL，浓盐酸（12 mol/L） 20 μL，生物素0.04 mg/L，叶酸 0.04 mg/L，维生素B6 0.2 mg/L，核黄素0.1 mg/L，维生素B1 0.1 mg/L，烟酸 0.1 mg/L，维生素B12 0.1 mg/L，对氨苯甲酸 0.1 mg/L，泛酸 0.1 mg/L。
（2）将梭菌种子液按3%培养基体积比接种到梭菌暗发酵培养基，添加不同终浓度的氯化铵NH4Cl（0、3、7 mmol/L）。培养体系为20 mL培养液/120 mL西林瓶，顶空气体置换为氮气，培养条件为37℃避光静置培养。
暗发酵培养基，其配方如下：
NaCl 5 g/L，K2HPO4 2 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，微量元素浓缩液 10 mL/L，葡萄糖4g/L，pH=7。
微量元素浓缩液（1L）成分如下：NaCl 6 g/L，CaCl2·2H2O 0.2 g/L，MgCl2·6H2O2 g/L，FeCl2·4H2O 40 mg/L，ZnCl2 1mg/L，MnCl2·4H2O 1 mg/L，CuCl2·2H2O 0.6 mg/L，Na2MoO4 1 mg/L，AlCl3 1 mg/L，CoCl3·6H2O 4 mg/L，硼酸饱和溶液 20 μL，浓盐酸（12mol/L） 20 μL，生物素0.04 mg/L，叶酸 0.04 mg/L，维生素B6 0.2 mg/L，核黄素0.1 mg/L，维生素B1 0.1 mg/L，烟酸 0.1 mg/L，维生素B12 0.1 mg/L，对氨苯甲酸 0.1 mg/L，泛酸 0.1mg/L。
（3）通过测定培养液OD600反应梭菌生物量，通过气相色谱测定梭菌产氢量。
气相色谱分析方法：从西林瓶中取0.2 mL气体，利用气相色谱仪（安捷伦7820）对H2浓度进行测定。气相色谱仪以N2为载气，流速为10 mL·min-1，TCD检测器、进样口和柱温箱各温度设置分别为: 150℃、80℃和80℃。
产氢量计算方法：根据理想气体状态方程PV=nRT（P：气体分压；V：气体体积；n：气体物质的量；R：普适气体常数；T：气体温度），将气相色谱测定的数据换算成氢气摩尔质量。
（4）结果如图1所示：培养3天后，0、3、7 mmol/L氯化铵实验组氢气产量分别为43.74、36.46、37.93 mmol/L；培养液最大OD600分别为：0.94、1.33、1.38。培养基初始葡萄糖含量为20 mmol/L，所以0、3、7 mmol/L谷氨酸钠实验组底物氢气转化率为2.19、1.82、1.89mol H2/ mol葡萄糖。相比于3、7 mmol/L氯化铵实验组，巴氏梭菌DSM525在无氮源培养基中生长时底物氢气转化率分别提升19.97%、15.32%；最大生物量分别降低41.49%、46.81%。这一结果说明固氮生长条件能够提升巴氏梭菌DSM525的产氢量。
由于微生物的固氮作用需要消耗巨大的能量，梭菌固氮生长时，相比于非固氮条件，需要消耗更多的能量进行固氮作用，理论上产氢量应该更低，而梭菌固氮生长时产氢量出现了增加，这是通过现有技术无法预知的结果。进一步分析发现，梭菌固氮生长时的最大生物量出现了明显的下降，且生物量下降的幅度大于产氢量提升的幅度。由于微生物生物量的累积也是需要消耗大量的能量，那么梭菌在固氮条件下所降低的生物量则可能不仅填补了固氮作用所消耗的能量，还使得更多的能量转化为氢气。
实施例2：
（1）以梭菌（Clostridium sp.）BY-1（保藏编号为GDMCC No：62309，于2022年3月22日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心）为菌种，按5%（v/v）种子培养基的接种量将BY-1接种于种子培养基，富集培养12 h获得梭菌种子液，培养体系为20 mL培养液/120 mL西林瓶，顶空气体置换为氮气，培养条件为37℃避光静置培养。种子培养基配方同上。
（2）将梭菌种子液按3%培养基体积比接种到梭菌暗发酵培养基（暗发酵培养基成分同上），添加不同终浓度的NH4Cl（0、3、7 mmol/L）。培养体系为20 mL培养液/120 mL西林瓶，顶空气体置换为氮气，培养条件为37℃避光静置培养。
（3）梭菌生物量及产氢量的测定方法同上，结果如图2所示：培养3天后，0、3、7mmol/L氯化铵实验组氢气产量分别为33.37、27.22、28.8 mmol/L；培养液最大OD600分别为：0.93、1.29、1.34。培养基初始葡萄糖含量为20 mmol/L，所以0、3、7 mmol/L氯化铵实验组底物氢气转化率为1.67、1.36、1.44 mol H2/ mol葡萄糖。相比于3、7 mmol/L氯化铵实验组，梭菌BY-1固氮产氢时底物氢气转化率分别提升22.62%、15.86%；最大生物量分别降低38.71%、44.08%。结合实施例1，这一结果说明固氮生长条件能够提升梭菌的产氢量在不同梭菌之间存在普遍性，而梭菌固氮生长条件可以降低梭菌的生物量也在不同梭菌之间存在普遍性。
实施例3：
（1）以巴氏梭菌（Clostridium pasteurianum）DSM 525（购置于德国微生物菌种保藏中心DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）为菌种，按5%（v/v）种子培养基的接种量将DSM 525接种于种子培养基，富集培养12 h获得梭菌种子液，培养体系为20 mL培养液/120 mL西林瓶，顶空气体置换为氮气，培养条件为37℃避光静置培养。种子培养基成分同上。
（2）将梭菌种子液按3%培养基体积比接种到梭菌暗发酵培养基（暗发酵培养基成分同上），添加不同终浓度的谷氨酸钠（0、3、7 mmol/L）。培养体系为20 mL培养液/120 mL西林瓶，顶空气体置换为氮气，培养条件为37℃避光静置培养。
（3）梭菌生物量及产氢量的测定方法同上，结果如图3所示：培养3天后，0、3、7mmol/L谷氨酸钠实验组氢气产量分别为44.15、37.56、38.13 mmol/L；培养液最大OD600分别为：0.99、1.29、1.29。培养基初始葡萄糖含量为20 mmol/L，所以0、3、7 mmol/L谷氨酸钠实验组底物氢气转化率为2.21、1.88、1.91 mol H2/ mol葡萄糖。相比于3、7 mmol/L谷氨酸钠实验组，巴氏梭菌DSM525固氮产氢时底物氢气转化率分别提升17.55%、15.71%；最大生物量分别降低29.85%、30.21%。结合实施例1，这一结果说明固氮生长条件能够提升梭菌的产氢量在不同氮源成分下具有普遍性。而梭菌在固氮生长条件下，生物量的降低也在不同氮源成分下具有普遍性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种提高梭菌发酵产氢效率的方法，其特征在于包括如下步骤：将梭菌接种于暗发酵培养基，在顶空为氮气的环境中进行避光发酵，得到氢气；
所述的暗发酵培养基为无氮源、底物为葡萄糖的培养基；
所述的梭菌为巴氏梭菌DSM 525和梭菌BY-1中的至少一种；
所述的暗发酵培养基的组成如下：NaCl 4～6g/L，K2HPO4 1～3g/L，KH2PO4 0.4～0.6g/L，微量元素浓缩液 9～11 mL/L，葡萄糖3～5 g/L，pH=7；
微量元素浓缩液的组成如下：NaCl 6 g/L，CaCl2·2H2O 0.2 g/L，MgCl2·6H2O 2 g/L，FeCl2·4H2O 40 mg/L，ZnCl2 1mg/L，MnCl2·4H2O 1 mg/L，CuCl2·2H2O 0.6 mg/L，Na2MoO41 mg/L，AlCl3 1 mg/L，CoCl3·6H2O 4 mg/L，硼酸饱和溶液 20 μL，浓度为12 mol/L的浓盐酸20 μL，生物素0.04 mg/L，叶酸 0.04 mg/L，维生素B6 0.2 mg/L，核黄素0.1 mg/L，维生素B1 0.1 mg/L，烟酸 0.1 mg/L，维生素B12 0.1 mg/L，对氨苯甲酸 0.1 mg/L，泛酸 0.1 mg/L；
所述的接种的量为暗发酵培养基体积3%；
所述的避光发酵的温度为37℃；
所述的避光发酵的时间为48～72h；
所述的梭菌BY-1的保藏编号为GDMCC No：62309，于2022年3月22日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心。
2.根据权利要求1所述的提高梭菌发酵产氢效率的方法，其特征在于：所述的梭菌在接种于暗发酵培养基前通过如下步骤制备得到：将梭菌接种于种子培养基中，富集培养，得到梭菌种子液。
3.根据权利要求2所述的提高梭菌发酵产氢效率的方法，其特征在于：
所述的种子培养基的组成如下：谷氨酸钠0.9～1.1 g/L，NaCl 4～6 g/L，K2HPO4 1.8～2.2 g/L，KH2PO4 0.4～0.6 g/L，微量元素浓缩液 9～11 mL/L，葡萄糖4 g/L，pH=6.8～7.2；
所述的富集培养的条件如下：在厌氧条件下于35～40℃避光静置培养；
所述的富集培养的培养时间为10～14 h。
4.根据权利要求3所述的提高梭菌发酵产氢效率的方法，其特征在于：
所述的厌氧条件是将装有种子培养基的容器的顶空气体置换为氮气得到；
所述的富集培养的培养时间为12 h。
5.权利要求1～4任一项所述的提高梭菌发酵产氢效率的方法在氢气制备中的应用。
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