CN113684161B

CN113684161B - 改造的肠杆菌属细菌及其生产2,3-二羟基异戊酸的应用

Info

Publication number: CN113684161B
Application number: CN202010421493.1A
Authority: CN
Inventors: 郝健; 杨洋; 史吉平
Original assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Current assignee: Shanghai Advanced Research Institute of CAS
Priority date: 2020-05-18
Filing date: 2020-05-18
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2040-05-18
Also published as: CN113684161A

Abstract

本发明公开了改造的肠杆菌属细菌及其生产2,3‑二羟基异戊酸的应用。该改造的肠杆菌属细菌为乙酰乳酸脱羧酶失活的肠杆菌属细菌，或者乙酰乳酸脱羧酶和二羟酸脱水酶同时失活的肠杆菌属细菌。以葡萄糖等原料为碳源，利用改造的肠杆菌属细菌进行发酵培养，菌体将培养基中的碳源转化成生成2,3‑二羟基异戊酸。本生产菌株并未引用外源基因，具有稳定的遗传性及旺盛的生长力，产物终浓度高，原料范围广，发酵生产成本低。

Description

改造的肠杆菌属细菌及其生产2,3-二羟基异戊酸的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及改造的肠杆菌属细菌及其生产2,3-二羟基异戊酸的应用。

背景技术

肠杆菌属细菌(Enterobacter spp)是一类在自然界广泛分布的微生物，属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae family)，包括阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacea)，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)和霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)等。这个菌属的细菌具有生长旺盛、能利用多种碳源进行生长等特点。目前肠杆菌属细菌用于乙偶姻、2,3-丁二醇、双乙酰和乙醇等生产菌株，具有底物转化率高和产物终浓度高等优点。

阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)为革兰氏阴性菌，具有鞭毛。阴沟肠杆菌可以生产鞣酸酶，用于制革厂废水降解，食品和制药工业等方面(Process Biochemistry,2019,77:37-47)。发酵阴沟肠杆菌得到的富硒胞外多糖具有明显的保护和抗糖尿病作用(Int J Biol Macromol,2012,50(2):348-352)。阴沟肠杆菌可以生产用于采油过程的表面活性剂(Colloids Surf B Biointerfaces,2013,105:223-229)。阴沟肠杆菌还可以用于恢复或净化受重金属污染的部位，如镉(J Environ Manage,2018,215:143-152)、金和碲(Front Microbiol,2018,9:3118)等。

阴沟肠杆菌可以利用多种底物如葡萄糖(Sci Rep,2015,5:9033)、木糖(MetabEng,2015,28:19-27)、木质纤维素(Metab Eng,2015,28:19-27)、甘油(Fuel,2019,250:292-305)等为碳源进行生长代谢，生产大宗化合物。阴沟肠杆菌以木薯粉(PLoS One,2012,7(7):e40442)、葡萄糖和木糖(Metab Eng,2015,28:19-27)为底物可以产生2,3-丁二醇。有学者利用阴沟肠杆菌为底盘生物生产双乙酰、乙偶姻(Biotechnology andBioengineering,1978,XX:1895-1901)等化合物。

产气肠杆菌是发酵氢生产中研究最广泛的模型菌株之一(BioresourceTechnology,2011,102(18):8344-8349)。据报道，过表达氢促进蛋白的产气肠杆菌以葡萄糖为底物时可以产生2.55mol/mol的氢气(International Journal of Hydrogen Energy,2011,36:6609-6615)。此外，产气肠杆菌可以利用低成本的木质纤维素发酵生产鼠李糖脂和聚羟基链烷酸酯(Bioresource technology,2020,296:122321)；利用废旧生物柴油等发酵生产乙醇(Industrial Crops&Products,2019,138:111451)。

霍氏肠杆菌可以利用葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、麦芽糖、鼠李糖、蔗糖等作为碳源产酸(Journal of clinical microbiology,1989,27(9):2046)。霍氏肠杆菌可以采用糖蜜、玉米浆和无机氮磷激活剂作为采油功能微生物提高原油采集率。抗炎药双氯芬酸在低浓度下对非靶标生物具有有害影响，霍氏肠杆菌可以代谢消除82％双氯芬酸(CurrentMicrobiology,2017,74(3):381–388)。霍氏肠杆菌可以分解叶黄素产生香味物质(Biotechnology Letters,2017,39(7):1019–1024)。

2,3-二羟基异戊酸是生物体内缬氨酸及亮氨酸的合成前体。2,3-二羟基异戊酸也是生物体内合成泛酸的一个中间代谢产物。近几年利用氨基酸合成途径合成支链醇是国际上一个重要发展方向，支链醇是一类新型的生物能源。2,3-二羟基异戊酸是生物合成异丁醇和3-甲基-1-丁醇的中间代谢产物(Nature,2008，451：86–89)。其中二羟酸脱水酶(2,3-二羟酸水解酶，EC 4.2.1.9)催化2,3-二羟基异戊酸和2,3-二羟基-3-甲基丁酸酯脱水生成2-酮异戊酸和2-酮-3-甲基丁酸酯，已经从细菌、真核和古菌生物中鉴定了多种二羟酸脱水酶(Journal of Biotechnology，2015，211:31-41)。

发明内容

本发明的目的是，提供改造的肠杆菌属细菌及其生产2,3-二羟基异戊酸的方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

改造的肠杆菌属细菌，该改造的肠杆菌属细菌为乙酰乳酸脱羧酶失活的肠杆菌属细菌，或者为二羟酸脱水酶和乙酰乳酸脱羧酶同时失活的肠杆菌属细菌。

所述乙酰乳酸脱羧酶失活的肠杆菌属细菌通过失活乙酰乳酸脱羧酶基因获得。所述乙酰乳酸脱羧酶和二羟酸脱水酶同时失活的肠杆菌属细菌通过失活乙酰乳酸脱羧酶基因和二羟酸脱水酶基因获得。

所述二羟酸脱水酶是指催化2,3-二羟基异戊酸生成α-酮异戊酸的酶，其编码基因名称为ilvD。其在Enterobacter cloacae subsp.cloacae ATCC 13047基因组(GenBank:CP001918.1；NC_014121.1)中的基因阅读框如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列Genebank编号为(ADF64533.1)。所述乙酰乳酸脱羧酶是指催化乙酰乳酸脱羧生成乙偶姻的酶，其编码基因名称为budA或alsA。其在Enterobacter cloacae subsp.cloacae ATCC 13047基因组中的基因阅读框如SEQ ID NO.2所示；其氨基酸序列Genebank编号为(ADF62663.1)。

本发明还提供了所述改造的肠杆菌属细菌在生产2,3-二羟基异戊酸中的应用。

本发明还提供了所述改造的肠杆菌属细菌生产2,3-二羟基异戊酸的方法，该方法为：将改造的肠杆菌属细菌接种到培养基中，进行发酵培养。

优选地，所述发酵培养基的组成包括：碳源10-200g/L，氮源1-50g/L，无机盐0-10g/L。

所述碳源选自能代谢转化成丙酮酸的化合物，具体包括葡萄糖、甘油、木糖、生物质水解液、以及它们的混合物。

所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐。

所述无机盐选自钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。

优选地，所述发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度25-45℃，发酵过程中供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在5.5-8.5之间。

进一步优选地，所述发酵条件为：将菌株接种到发酵培养基，发酵温度30-40℃，发酵过程中微量供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在6.5-7.5之间。

优选地，所述的改造的肠杆菌属细菌生产2,3-二羟基异戊酸的方法还包括：发酵过程中待碳源消耗至1-20g/L时流加碳源进行补料发酵。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明通过失活乙酰乳酸脱羧酶或者同时失活二羟酸脱水酶和乙酰乳酸脱羧酶对肠杆菌属细菌进行改造，改造后的肠杆菌属细菌利用碳源进行发酵培养时，碳源转化形成2,3-二羟基异戊酸，并在发酵液中积累。本发明提供的方法，生产菌株中未引入外源基因，菌株遗传稳定性高，产物终浓度高，原料范围广。本发明提供的方法，生产的2,3-二羟基异戊酸是生物体中缬氨酸、亮氨酸和泛酸合成的中间代谢产物。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

实施例1

利用基因重组方法构建肠杆菌属细菌乙酰乳酸脱羧酶活性失活菌株。

阴沟肠杆菌SARI菌株(Microbial Cell Factories,2020,19(1):89)该菌株是一株用于生产乙偶姻、2,3-丁二醇、双乙酰、乙醇的菌株。

1)利用PCR扩增阴沟肠杆菌SARI菌株乙酰乳酸脱羧酶基因的两侧长同源臂序列。

根据Enterobacter cloacae subsp.cloacae ATCC 13047(GenBank:CP001918.1；NC_014121.1)基因组信息，设计乙酰乳酸脱羧酶基因两条同源臂PCR引物，前端同源臂上游引物budA-F-s：CCCGGGGATCCTCTAGAGATCTGGGTGC AGAAGCGCTG(SEQ ID NO.3所示)，前端同源臂下游引物budA-F-a：GCTCCAGCCTACAGCTTTATTTACTCCCGTCTGACTATTAA(SEQ ID NO.4所示)。后端同源臂上游引物budA-B-s：GAATTGATGGCCGAGTCACAACCC(SEQ ID NO.5所示)，后端同源臂下游引物budA-B-a：CATGCCTGCAGGTCGACGATTCAGCACCGCCACGCCTG(SEQ ID NO.6所示)

通过上述引物，以阴沟肠杆菌SARI基因组DNA为模板，经PCR扩增，获得乙酰乳酸脱羧酶基因的两侧长同源臂片段。

2)利用PCR扩增链霉素抗性基因序列。

以质粒pIJ778为模板，设计链霉素抗性基因上游引物budA-frt-s：ATAAAGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQ ID NO.7所示)，链霉素抗性基因下游引物budA-frt-a：TGTGACTCGGCCATCAATTCCGGGGATCCGTCGA(SEQ ID NO.8所示)。

利用引物budA-frt-s和budA-frt-a，以质粒pIJ778为模板扩增出长约1.4Kb的DNA片段A。该片段的两端分别具有与budA序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ778质粒的链霉素抗性基因aadA。

3)以pMD18-T为模板，设计载体上游引物pMD18-T-s：ATCGTCGACCTGCAGGCA(SEQ IDNO.9所示)，载体下游引物pMD18-T-a：ATCTCTAGAGGATCCCCGGGT(SEQ ID NO.10所示)。

通过上述引物以pMD18-T为模板进行PCR扩增，可以得到线性化的pMD18-T片段。

4)利用步骤1、步骤2和步骤3克隆到的四条基因序列，制备两侧连有长同源臂中间连接抗性盒的DNA片段。

本步骤中的操作，采用在体外使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒，获得pMD18T-budA质粒上重组失活的budA基因，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与budA基因同源的序列，中间连接抗性盒。

具体步骤如下：

a.将步骤1、步骤2和步骤3克隆到的四条基因序列，通过ClonExpress Ultra OneStep Cloning Kit试剂盒进行多片段重组反应，构建出pMD18T-ΔbudA质粒。

b.利用引物budA-F-s和budA-B-a以pMD18T-ΔbudA质粒为模板进行PCR扩增，获得2.8Kb的DNA片段B。

5)利用转化将制备的DNA片段B转入到阴沟肠杆菌SARI中，DNA片段B与染色体上的乙酰乳酸脱羧酶基因相邻的序列进行同源重组，筛选获得菌株染色体乙酰乳酸脱羧酶重组失活的菌株，具体步骤如下：

将pSC-red质粒转化到阴沟肠杆菌SARI中，将转化有pSC-red质粒的阴沟肠杆菌SARI命名为阴沟肠杆菌SARI-pSC-red菌株，线性DNA片段B电击转化阴沟肠杆菌SARI-pSC-red感受态细胞。利用链霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为EcΔbudA，该菌株的乙酰乳酸脱羧酶基因通过同源重组而失活。

6)霍氏肠杆菌乙酰乳酸脱羧酶基因失活菌株构建。

霍氏肠杆菌S6是一株从植物根际中分离获得的菌株。利用转化将制备的DNA片段B转入到霍氏肠杆菌S6中，DNA片段B与染色体上的乙酰乳酸脱羧酶基因相邻的序列进行同源重组，筛选获得菌株染色体乙酰乳酸脱羧酶重组失活的菌株，操作过程与5)相同，筛选获得的菌株命名为EhΔbudA，该菌株的乙酰乳酸脱羧酶基因通过同源重组而失活。

7)产气肠杆菌乙酰乳酸脱羧酶基因失活菌株构建。

产气肠杆菌S2是一株从土壤分离获得的菌株。利用转化将制备的DNA片段B转入到产气肠杆菌S2中，DNA片段B与染色体上的乙酰乳酸脱羧酶基因相邻的序列进行同源重组，筛选获得菌株染色体乙酰乳酸脱羧酶重组失活的菌株，操作过程与5)相同，筛选获得的菌株命名为EaΔbudA，该菌株的乙酰乳酸脱羧酶基因通过同源重组而失活。

实施例2

利用基因重组方法构建二羟酸脱水酶基因失活的肠杆菌属菌株，来实现二羟酸脱水酶活性的失活。

1)利用PCR扩增阴沟肠杆菌SARI菌株二羟酸脱水酶基因的两侧长同源臂序列。

根据Enterobacter cloacae subsp.cloacae ATCC 13047(GenBank:CP001918.1；NC_014121.1)基因组信息，设计二羟酸脱水酶基因两条同源臂PCR引物，前端同源臂上游引物ilvD-F-s：GCTCCAGCCTACATGCTTTATTTACTCCCGTCTGACTA(SEQ ID NO.11所示)，前端同源臂下游引物ilvD-F-a：CCCGGGGATCCTCTAGAGATCTGGGTGCAGAAGCGCTG(SEQ ID NO.12所示)。后端同源臂上游引物ilvD-B-s：CATGCCTGCAGGTCGACGATTCAGCACCGCCACGCCTG(SEQ IDNO.13所示)，前端同源臂下游引物ilvD-B-a：ACGGATCCCCGGAATATGATGGCCGAGTCACAACC(SEQID NO.14所示)。

2)利用PCR扩增安普霉素抗性基因序列。

以质粒pIJ773为模板，设计链霉素抗性基因上游引物ilvD-frt-s：TAAAGCATGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQ ID NO.15所示)，链霉素抗性基因下游引物ilvD-frt-a：ATCATATTCCGGGGATCCGTCGA(SEQ ID NO.16所示)。

利用引物ilvD-frt-s和budA-frt-a，以质粒pIJ773为模板扩增出长约1.3Kb的DNA片段C。该片段的两端分别具有与ilvD序列同源的同源臂，中间包含了来源于pIJ773质粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。

3)以pMD18-T为模板，设计载体上游引物pMD18-T-s，载体下游引物pMD18-T-a。

通过上述引物以pMD18-T为模板进行PCR扩增，可以得到线性化的pMD18-T基因片段。

本步骤中的操作，采用在体外使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit试剂盒，获得pMD18T-ilvD质粒上重组失活的ilvD基因，利用该质粒作为模板通过PCR扩增具有长的同源臂的DNA片段，该片段两侧连有与ilvD基因同源的序列，中间连接抗性盒。

具体步骤如下：

a.将步骤1、步骤2和步骤3克隆到的四条基因序列，通过ClonExpress Ultra OneStep Cloning Kit试剂盒进行多片段重组反应，构建出pMD18T-ΔilvD质粒。

b.利用引物ilvD-F-s和ilvD-B-a，以pMD18T-ΔilvD质粒为模板进行PCR扩增，获得2.7Kb的DNA片段D。

5)利用转化将制备的DNA片段D转入到阴沟肠杆菌SARI中，DNA片段D与染色体上的二羟酸脱水酶基因相邻的序列进行同源重组，筛选获得菌株染色体二羟酸脱水酶重组失活的菌株，命名为EcΔilvD，该菌株的二羟酸脱水酶基因通过同源重组而失活。

6)霍氏肠杆菌二羟酸脱水酶基因失活菌株构建。

利用转化将制备的DNA片段D转入到霍氏肠杆菌SD中，DNA片段D与染色体上的二羟酸脱水酶基因相邻的序列进行同源重组，筛选获得菌株染色体二羟酸脱水酶重组失活的菌株，命名为EhΔilvD，该菌株的二羟酸脱水酶基因通过同源重组而失活。

7)产气肠杆菌二羟酸脱水酶酶基因失活菌株构建。

利用转化将制备的DNA片段B转入到产气肠杆菌S2中，DNA片段D与染色体上的二羟酸脱水酶基因相邻的序列进行同源重组，筛选获得菌株染色体二羟酸脱水酶重组失活的菌株，命名为EaΔilvD，该菌株的二羟酸脱水酶基因通过同源重组而失活。

实施例3

利用基因重组方法构建二羟酸脱水酶基因和乙酰乳酸脱羧酶基因同时失活的肠杆菌属细菌，来实现二羟酸脱水酶和乙酰乳酸脱羧酶活性同时失活。

1)将DNA片段D转入到EcΔbudA中，DNA片段D与染色体上的二羟酸脱水酶基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体二羟酸脱水酶重组失活的菌株，具体步骤如下：

线性DNA片段D电击转化已经含有pSC-red质粒的EcΔbudA感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为EcΔilvDΔbudA，该菌株的乙酰乳酸合成酶基因和二羟酸脱水酶基因通过同源重组而同时失活。

2)将DNA片段D转入到菌EhΔbudA中，DNA片段D与染色体上的二羟酸脱水酶基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体二羟酸脱水酶重组失活的菌株，具体步骤如下：

线性DNA片段D电击转化已经含有pSC-red质粒的EhΔbudA感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为EhΔilvDΔbudA，该菌株的乙酰乳酸合成酶基因和二羟酸脱水酶基因通过同源重组而同时失活。

3)将DNA片段D转入到菌EaΔbudA中，DNA片段D与染色体上的二羟酸脱水酶基因进行同源重组，筛选获得菌株染色体二羟酸脱水酶重组失活的菌株，具体步骤如下：

线性DNA片段D电击转化已经含有pSC-red质粒的EaΔbudA感受态细胞。利用安普霉素筛选抗性菌株，筛选获得的抗性菌株命名为EaΔilvDΔbudA，该菌株的乙酰乳酸合成酶基因和二羟酸脱水酶基因通过同源重组而同时失活。

实施例4

将实施例1-3中获得的菌株进行摇瓶批次发酵实验。

将出发菌株阴沟肠杆菌SARI和实施例1-3中获得的改造的菌株接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml发酵培养基，摇瓶柜转速100转每分钟，恒温30℃进行发酵培养。

培养基组分为：葡萄糖10g/L，酵母膏1g/L，碳酸钙0.5g每瓶。

培养24小时，测定发酵液中组分。采用液相色谱法测定，利用HPX-87H色谱柱对发酵液组分进行分离，利用视差和紫外检测器检测。流动相0.025mol/L硫酸水溶液，流速0.8ml/min，柱温箱65℃。2,3-二羟基异戊酸和2,3-二羟基异戊酸盐在本发明中不作区分，都以2,3-二羟基异戊酸计。各菌株发酵结果如表1-表3所示。

表1，阴沟肠杆菌及改造菌株摇瓶发酵实验结果

菌株	乙偶姻(g/L)	2,3-二羟基异戊酸(g/L)	2,3-丁二醇(g/L)
				阴沟肠杆菌SARI	0.57	0.00	1.96
EcΔbudA	0.22	2.03	0.28
				EcΔilvD	0.72	0.00	1.73
EcΔilvDΔbudA	0.25	3.84	0.32

表2，霍氏肠杆菌及改造菌株摇瓶发酵实验结果

菌株	乙偶姻(g/L)	2,3-二羟基异戊酸(g/L)	2,3-丁二醇(g/L)
				霍氏肠杆菌S6	1.63	0.00	0.79
EhΔbudA	0.32	2.83	0.34
				EhΔilvD	1.47	0.00	0.55
EhΔilvDΔbudA	0.22	3.03	0.37

表3，产气肠杆菌及改造菌株摇瓶发酵实验结果

菌株	乙偶姻(g/L)	2,3-二羟基异戊酸(g/L)	2,3-丁二醇(g/L)
				产气肠杆菌S2	0.76	0.00	1.58
EaΔbudA	0.27	2.47	0.24
				EaΔilvD	0.65	0.00	1.46
EaΔilvDΔbudA	0.17	3.79	0.39

根据表1-3的数据可知：野生型肠杆菌属细菌利用葡萄糖发酵不生产2,3-二羟基异戊酸，其主要代谢产物是乙偶姻和2,3-丁二醇。二羟酸脱水酶活性消除的菌株利用葡萄糖培养不能合成2,3-二羟基异戊酸。乙酰乳酸脱羧酶活性消除的菌株利用葡萄糖培养可以合成2,3-二羟基异戊酸同时合成少量2，3-丁二醇和乙偶姻。二羟酸脱水酶活性和乙酰乳酸脱羧酶活性同时消除的菌株利用葡萄糖培养合成少量乙偶姻和2,3-丁二醇，同时合成2,3-二羟基异戊酸能力提高。

实施例5

将实施例3中获得的菌株进行5L发酵罐发酵实验。

将实施例3中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温30℃进行种子培养。

种子培养基组分为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L。

发酵培养基组成为：甘油100g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L,硫酸铵5g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.4g/L。

种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量3L/分钟，搅拌转速300转/分，发酵温度25℃，利用氢氧化钠溶液使发酵液的pH值稳定在5.5，发酵48小时结束，采用实施例4方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表4所示。

表4，改造的肠杆菌属细菌发酵罐发酵结果

菌株	乙偶姻(g/L)	2,3-二羟基异戊酸(g/L)	2,3-丁二醇(g/L)
				EcΔilvDΔbudA	3.46	31.82	4.31
EhΔilvDΔbudA	3.21	29.75	4.43
				EaΔilvDΔbudA	4.59	27.91	5.63

从表4的数据结果可以看出：实验菌株均能利用甘油为碳源合成2,3-二羟基异戊酸。

实施例6

将实施例3中获得的菌株进行5L发酵罐发酵实验。

将实施例3中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。

发酵培养基组成为：葡萄糖200g/L，玉米浆50g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.4g/L。

种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量2L/分钟，搅拌转速300转/分，发酵温度45℃，利用氢氧化钾溶液使发酵液的pH值稳定在8.5，发酵96小时结束，采用实施例4方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表5所示。

表5，改造的肠杆菌属细菌发酵罐发酵结果

菌株	乙偶姻(g/L)	2,3-二羟基异戊酸(g/L)	2,3-丁二醇(g/L)
				EcΔilvDΔbudA	5.92	61.68	8.82
EhΔilvDΔbudA	5.84	57.93	9.14
				EaΔilvDΔbudA	7.53	55.23	10.38

实施例7

将实施例3中获得的菌株进行5L发酵罐发酵实验。

发酵培养基组成为：葡萄糖100g/L，木糖30g/L，玉米浆30g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.6g/L。

种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量1L/分钟，搅拌转速200转/分，发酵温度30℃，利用氨水保持发酵液的pH值稳定在6.5，发酵48小时结束，采用实施例4方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表6所示。

表6，改造的肠杆菌属细菌发酵罐发酵结果

菌株	乙偶姻(g/L)	2,3-二羟基异戊酸(g/L)	2,3-丁二醇(g/L)
				EcΔilvDΔbudA	4.01	35.29	5.21
EhΔilvDΔbudA	3.82	31.79	5.17
				EaΔilvDΔbudA	4.29	29.52	5.49

从表6的数据结果可以看出：优选发酵条件下实验菌株均合成高水平的2,3-二羟基异戊酸。

实施例11

将实施例6中获得的菌株进行5L发酵罐发酵实验。

将实施例6中获得的改造的菌株接种分别接种到250ml锥形瓶中，其中装有50ml种子培养基，摇瓶柜转速200转每分钟，恒温35℃进行种子培养。

发酵培养基组成为：木糖100g/L，玉米浆30g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.6g/L。

种子培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量1L/分钟，搅拌转速200转/分，发酵温度40℃，利用氨水保持使发酵液的pH值稳定在7.5，发酵48小时结束，采用实施例4方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表7所示。

表7，改造的肠杆菌属细菌发酵罐发酵结果

菌株	乙偶姻(g/L)	2,3-二羟基异戊酸(g/L)	2,3-丁二醇(g/L)
				EcΔilvDΔbudA	4.38	33.62	4.91
EhΔilvDΔbudA	4.20	29.48	4.93
				EaΔilvDΔbudA	4.85	27.45	5.51

实施例12

将将实施例6中获得的菌株进行流加发酵罐发酵实验。

发酵培养基组成为：葡萄糖50g/L，玉米浆30g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.6g/L。

培养12小时，接种到5L发酵罐中，内装3L发酵培养基，保持发酵过程通风量1L/分钟，搅拌转速200转/分，发酵温度37℃，利用氢氧化钠稳定发酵液pH 7.0，待发酵液中葡萄糖浓度降低到1-20g/L时，补加150g的葡萄糖溶液，发酵36小时结束，采用实施例4方法测定发酵液中组分。各菌株发酵结果如表8所示。

表8，改造的肠杆菌属细菌发酵罐发酵结果

菌株	乙偶姻(g/L)	2,3-二羟基异戊酸(g/L)	2,3-丁二醇(g/L)
				EcΔilvDΔbudA	3.74	34.26	4.28
EhΔilvDΔbudA	3.37	32.37	4.83
				EaΔilvDΔbudA	3.61	29.77	5.04

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 改造的肠杆菌属细菌及其生产2,3-二羟基异戊酸的应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1851

<212> DNA

<213> 阴沟肠杆菌 ATCC 13047(Enterobacter cloacae subsp. cloacae ATCC 13047)

<400> 1

ttagccccca agtttcgatt tatcgcgtac cgcgcctttg tctgcactgg tcgcaaggct 60

cgcgtaagcg cgcagggcga aggagacttc acgctggcgg tccttcggcg tccaggcttt 120

atcgccgcgc gcttcctgtg cttcacgacg agccgcgatc tcttgatcgc tcagcttgag 180

ctggatcccg cgattcggaa tgtcgatttc aatcaggtca ccgtcttcga tgatcgcaat 240

gttgccgccg ctcgctgctt ccggtgatac gtggccgatg gagaggccgg acgtaccgcc 300

cgagaaacgt ccgtcggtga tcaacgcaca ggctttaccg aggcccatcg atttcaggaa 360

ggtggttggg tagagcatct cctgcatgcc tggaccgcct ttcggccctt cgtaacggat 420

gaccaccacg tcgccttcca caactttgcc gcccaggatg gcgtctaccg cctcgtcctg 480

gctttcgtac actttggccg ggccggtgaa tttgaggatg ctgtcatcca cgcccgcggt 540

ttttacgata cagccgtttt ccgcaaagtt gccgtacagc acggccagac cgccgtcttt 600

actgtaggcg tgctccagcg aacggatgca gccttcggcg cggtcatcat ccagggtgtc 660

ccagcgacaa tcctgagaga aggcctgcgt ggtacgaata ccggccggac ccgcgcggaa 720

catgtttttc accgcctcat cctgagtcag catcacgtca tatttatcca gcgtctgcgg 780

caacgtcaga ccgagaacgt tcttcacatc gcggttcagc agcccggcgc gatccagctc 840

gccaagaata ccgatgacgc cacccgcacg gtgtacgtct tccatgtggt atttctgggt 900

gcttggcgcg actttacaca gttgcggcac tttgcgggac agcttatcga tatcgctcat 960

ggtgaagtcg atttccgctt cctgcgccgc agccagcagg tgcaaaacgg tgttagtaga 1020

accgcccatg gcgatatcca gcgtcatggc attttcgaac gccgccttgc tggcgatgtt 1080

acgcggcagc gcgctggcat cgtcctgctc gtagtaacgt ttggtcagtt caacaatgcg 1140

cttaccggcg ttgaggaaca gcgctttacg gtcagcgtgc gtcgccagaa gcgaaccgtt 1200

acccggctga gagaggccca gtgcttcggt cagacagttc atggagttgg cggtgaacat 1260

cccggaacag gagccgcagg ttgggcacgc ggagcgttcc acctggttgc tctgctcgtc 1320

agacactttt ggatccgcgc cctggatcat cgcatcgacc aggtcgagct tgatgatttt 1380

gtcagaaagc ttggtcttgc ccgcttccat aggaccaccg gagacgaaaa ttaccggaat 1440

gttcagacgc agggaagcca tcagcatccc cggggtgatt ttgtcgcagt tggagataca 1500

gaccatggca tccgcacagt gagcgttaac catgtattcc accgagtcgg caatcagctc 1560

gcgcgacggc agtgaataga gcataccccc gtgccccatc gcgataccgt catccaccgc 1620

aatggtgttg aattctttcg ccacaccgcc cgcagcttca atttgctcag caaccagttt 1680

gccgagatcg cgcaggtgca catggcccgg cacaaactgg gtgaaggagt tcaccacggc 1740

gatgataggt ttaccgaaat cagcgtcggt catcccggtg gcgcgccaca gtgcgcgggc 1800

acccgccatg ttacggccgt gggtggtggt ggcggaacga tacttaggca t 1851

<210> 2

<211> 678

<212> DNA

<400> 2

ttagttttcg acggaacgga tcgctgcatc aaggttgctg gggtgaaggt tggcctgtaa 60

aaacgcgctg tcggcgggca ggtcaatcat tagcttgtgt atttcgccaa aggtgagcac 120

gccgctctcc agctggtaat ccagcagatg tcccccgccc tgacggtcgt cggtaatgaa 180

atgttcgtga tagccggcca cgttgatgcc ctgcatatgc tgcggcgtgc ggaacccaac 240

cagcacccct tcacgctggt taaagcggaa caccggctgg tcgtccagca cgtcggtcat 300

cgcgcggtat ggcggcgtct gacgcggtac ggtacgggtg tgggcgtggc ggaagttgcc 360

gtcgatgcgc agcgcgcaga acaggttatc cgagggaatt tgctggtcga tcacgtcgtg 420

gatctgctga cggctgaccg gcgcatcaaa ggttttgcgg tactgcggct ggaaccaggt 480

catcaccgcg aacggcgttt tctgctctgg cttcgcggcg cgtgcgctgc cgtcggcgcg 540

cagctggtac acctggctgc tgaaggcaat catttcgccg tccagctcgt tgaaggtgcc 600

cagaccaaaa tcaccatgtg ccagcagatc ggcgatggtg gtgtcccctt cgtagacacc 660

gcttagcagg gcgctcat 678

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccggggatc ctctagagat ctgggtgcag aagcgctg 38

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctccagcct acagctttat ttactcccgt ctgactatta a 41

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaattgatgg ccgagtcaca accc 24

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catgcctgca ggtcgacgat tcagcaccgc cacgcctg 38

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ataaagctgt aggctggagc tgcttcg 27

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgtgactcgg ccatcaattc cggggatccg tcga 34

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atcgtcgacc tgcaggca 18

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atctctagag gatccccggg t 21

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gctccagcct acatgcttta tttactcccg tctgacta 38

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cccggggatc ctctagagat ctgggtgcag aagcgctg 38

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

catgcctgca ggtcgacgat tcagcaccgc cacgcctg 38

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acggatcccc ggaatatgat ggccgagtca caacc 35

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

taaagcatgt aggctggagc tgcttcg 27

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atcatattcc ggggatccgt cga 23

Claims

1.改造的肠杆菌属细菌，其特征在于：所述改造的肠杆菌属细菌为乙酰乳酸脱羧酶和二羟酸脱水酶同时失活的肠杆菌属细菌。

2.改造的肠杆菌属细菌生产2,3-二羟基异戊酸的方法，该方法为：将权利要求1所述的改造的肠杆菌属细菌接种到含有碳源的培养基中，进行发酵培养，菌体将培养基中的碳源转化成2,3-二羟基异戊酸。

3.如权利要求2所述的改造的肠杆菌属细菌生产2,3-二羟基异戊酸的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：发酵温度为25-45℃，发酵过程中供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在5.5-8.5之间。

4.如权利要求2所述的改造的肠杆菌属细菌生产2,3-二羟基异戊酸的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：发酵温度为30-40℃，发酵过程中微量供氧，保持发酵过程中发酵液的pH值在6.5-7.5之间。

5.如权利要求2-4任一项所述的改造的肠杆菌属细菌生产2,3-二羟基异戊酸的方法，其特征在于：发酵过程中待碳源消耗至1-20g/L时流加碳源进行补料发酵。

6.如权利要求2-4任一项所述的改造的肠杆菌属细菌生产2,3-二羟基异戊酸的方法，其特征在于，所述培养基的组成包括：碳源10 -200 g/L，氮源1-50 g/L，无机盐0-10g/L。

7.如权利要求6所述的改造的肠杆菌属细菌生产2,3-二羟基异戊酸的方法，其特征在于：所述碳源选自葡萄糖、甘油、木糖、生物质水解液中的一种或多种；所述氮源选自玉米浆、酵母提取物、蛋白胨、豆饼粉、尿素、氨、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐；当所述培养基含有无机盐时，所述无机盐选自钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐。

8.权利要求1所述改造的肠杆菌属细菌在生产2,3-二羟基异戊酸中的应用。