TWI535847B - 異丙醇生產細菌及利用此細菌之異丙醇生產方法 - Google Patents

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Description

異丙醇生產細菌及利用此細菌之異丙醇生產方法
本發明係與異丙醇生產細菌及使用此細菌之異丙醇生產方法有關。
由植物來源原料製造之異丙醇，因能夠經脫水步驟而轉換成丙烯，故有希望當做碳中和的丙烯之原料。依京都議定書，對於全體已開發國家賦予在2008年至2012年間之二氧化碳排放量應比1990年之排放量減少5%之義務，現在碳中和的丙烯因其汎用性而在地球環境上極為重要。
能夠同化植物來源原料生產異丙醇之菌既已存在自然界(參照如中國專利申請公開第CN1043956A及日本特開昭61-67493號公報)。但已知其異丙醇生產性低，且副產丁醇或乙醇等醇類。由於丁醇或乙醇與水之共沸點與異丙醇與水之共沸點相近，故難以簡單蒸餾等方法分離丁醇或乙醇與異丙醇。為此，由丁醇或乙醇與異丙醇共同存在之既存菌之醱酵液回收異丙醇時，須考慮實施附加精餾塔等設備之蒸餾，而此部分預想會使精製步驟複雜化。
中國專利申請公開第CN1043956A記載，在添加玉米與糖蜜之培養液中培養Clostridium Butanoiacetonicus G.V後，將所得培養液進行蒸餾、再蒸餾、分餾，以製造丁醇、乙醇、丙酮、異丙醇之方法。但在本文獻之實施例中，完全未記載培養液中之丁醇、乙醇、丙酮及異丙醇之產量，亦未記載最終由分餾應得之各成分量。因此，由本文獻無法確認實際生產了異丙醇、丁醇、乙醇、丙酮。
日本特開昭61-67493號公報記載，在培養梭菌屬(Clostridium)細菌所得培養液中丁醇之生產量較異丙醇多，並伴生少量之乙醇及丙酮。依據該文獻記載，由所得培養液獲取異丙醇之方法，係將培養液過濾、蒸餾數次、濃縮、鹽析分離獲得油狀成分後，再將所得油狀成分以具有分餾塔之裝置進行分餾之方法為其一般性之分離精製方法。
另一方面，已知將來自梭菌屬細菌Clostridium Acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)之乙醯乙酸脫羧酶、輔酶A轉移酶及硫解酶之基因導入大腸菌，並培養此得到之重組大腸菌時，能夠生產丙酮(參照如Lourdes L Bermejo et al.;Applied and Environmental Microbiology,Vol.64,No.3,p.1079-1085,1998.)。
如上所述，既存之異丙醇生產細菌之異丙醇生產性低，再加上在培養液中副產顯著量之丁醇或乙醇等醇類，故由培養液中回收異丙醇困難，工業性生產異丙醇有問題。
本發明係鑑於上述情形而進行，以提供副產醇類少，為分離副產醇類毋須特別步驟，而能夠生產更為精製異丙醇之細菌為目的；並提供使用此細菌之異丙醇生產方法及異丙醇生產裝置為另一目的。
本發明之第1個形態為提供一種被賦予乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性，能夠由植物來源原料產生異丙醇之異丙醇生產細菌。
於本發明之第1個形態，上述乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性，分別以導入擇自於編碼為梭菌屬(Clostridium)細菌、有芽胞桿菌屬(Bacillus)細菌及大腸菌屬(Escherichia)細菌所構成群中至少1種細菌來源之各酵素的基因而獲得較好。
本發明之第2個形態為提供一種包含使用上述異丙醇生產細菌由植物來源原料生產異丙醇之異丙醇生產方法。
於本發明之第2個形態，較佳為包括以下步驟：在含有上述異丙醇生產細菌與植物來源原料之混合物中以供給氣體狀態下培養該異丙醇生產細菌之培養步驟，及回收由上述培養所產生異丙醇之回收步驟。
本發明之第3個形態為提供一種異丙醇生產裝置，此裝置具備：(1)培養部，容納含有上述異丙醇生產細菌與由植物原料來源之混合物；(2)氣體供給部，與上述培養部連接同時其開口位置在上述培養部所容納之混合物中，以供給氣體於上述混合物中；(3)捕集部，容納捕集異丙醇之捕集液；(4)連接部，連接上述培養部與上述捕集部，同時能夠使蒸散於上述培養部中之異丙醇向上述捕集部移動。
本發明之異丙醇生產細菌，係被賦予乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性，能夠由植物來源原料產生異丙醇。
本發明之異丙醇生產方法，包含使用上述異丙醇生產細菌由植物來源原料生產異丙醇。
本發明之異丙醇生產裝置，具備：(1)培養部，容納含有上述異丙醇生產細菌與植物來源原料之混合物；(2)氣體供給部，與上述培養部連接同時其開口位置在上述培養部所容納之混合物中，以供給氣體於上述混合物中；(3)捕集部，容納捕集異丙醇之捕集液；(4)連接部，連接上述培養部與上述捕集部，同時能夠使蒸散於上述培養部中之異丙醇向上述捕集部移動。
又，於本說明書中表示數值範圍時，記載於其前後之數值分別表示當做包含最小值及最大值之範圍，除非另有說明。
又，於本說明書中，所謂「步驟」意指本步驟所期望之作用達成之階段，如有多數階段在時間上同時進行之情形，而與其他步驟無法明確區分時，亦包含於本說明書中步驟之概念。
於本說明書中，「vvm」表示在1分鐘內進行幾倍液容量之通氣，例如，對於10公升培養液進行2vvm通氣，即意指進行每分鐘20公升之通氣。
以下說明本發明。
「異丙醇生產細菌」
本發明之異丙醇生產細菌，係被賦予乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性，能夠由植物來源原料產生異丙醇之異丙醇生產細菌。
本發明之異丙醇生產細菌，係被賦予乙醯乙酸脫羧酶、異丙醇脫氫酶、輔酶A轉移酶及硫解酶的4種所有異丙醇產生酵素。本案發明人等發現使用本異丙醇生產細菌生產異丙醇時，不會副產丁醇或乙醇等醇類。依此，與先前之異丙醇生產微生物比較時能夠使異丙醇之回收特別簡便。
於本發明，植物來源原料為可由植物獲得之碳源，只要細菌能夠進行代謝而轉換為異丙醇則無特別限定。於本發明，乃指根、莖、幹、枝、葉、花、種子等器官，含此等之植物體，此等植物之分解產物；再者，由植物體、植物器官、或此等之分解產物所得碳源中，微生物在培養時能夠當做碳源利用者，亦包含於植物來源原料。
此種植物來源原料所包含碳源，其一般性者如澱粉、葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖等醣類，及富含此等成分之草木質分解產物或纖維素水解物等。再者，植物油來源之甘油或脂肪酸亦可當做本發明之碳源。
本發明之植物來源原料，可適合使用穀物等農作物、玉米、米、小麥、黃豆、甘蔗、甜菜、棉等，其當做原料之使用形態，如未加工品、搾汁、粉碎物等並無特別限定。又，僅以上述碳源之形態使用亦可。
本發明之異丙醇生產細菌，只要具有能夠由植物來源原料產生異丙醇之能力即可，例如以培養將植物來源原料同化，在一定時間後分泌異丙醇於培養液中之細菌。
本發明之異丙醇生產細菌，被賦予乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性等4種酵素活性。
於本發明，所謂活性之「賦予」，除由寄主細菌之菌體外導入編碼為酵素之基因於菌體內以外，尚包含增強寄主細菌在基因組具有之酵素基因之啟動子活性或以其他啟動子取代原啟動子以增強酵素基因之表現。
本發明之乙醯乙酸脫羧酶，依國際生物化學聯盟會(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素編號4.1.1.4，為能夠催化乙醯乙酸產生丙酮之反應之酵素總稱。
此種可舉例如來自Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)、Clostridium beijerinckii(拜氏梭菌)等梭菌(Clostridium)屬細菌及Bacillus polymyxa(黏桿菌)等有芽胞桿菌(Bacillus)屬細菌。
導入於本發明之寄主細菌之乙醯乙酸脫羧酶之基因，可利用由上述各來源生物所取得具有編碼為乙醯乙酸脫羧酶之基因之鹼基序列之DNA、或根據此習知鹼基序列合成之合成DNA序列。其較適合者可舉如來自梭菌屬細菌或有芽胞桿菌屬細菌，例如具有來自Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)、Bacillus polymyxa(黏桿菌)之基因鹼基序列之DNA。並以具有來自Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)之基因鹼基序列之DNA特別適合。
本發明之異丙醇脫氫酶，依國際生物化學聯盟會(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素編號1.1.1.80，為能夠催化丙酮產生異丙醇之反應之酵素之總稱。
此種可舉例如來自Clostridium beijerinckii(拜氏梭菌)等梭菌屬細菌。
導入於本發明之寄主細菌之異丙醇脫氫酶之基因，可利用由上述各來源生物所取得具有編碼為異丙醇脫氫酶之基因鹼基序列之DNA、或根據此習知鹼基序列合成之合成DNA序列。其較適合者可舉如來自梭菌屬細菌，例如具有來自Clostridium beijerinckii(拜氏梭菌)之基因鹼基序列之DNA。
本發明之輔酶A轉移酶，依國際生物化學聯盟會(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素編號2.8.3.8，為能夠催化乙醯乙醯輔酶A產生乙醯乙酸之反應之酵素之總稱。
此種可舉例如來自Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)、Clostridium beijerinckii(拜氏梭菌)等梭菌屬細菌，Roseburia intestinalis等Roseburia屬細菌，Faecalibacterium prausnitzii等Faecalibacterium屬細菌，糞球菌(Coprococcus)屬細菌，Trypanosoma brucei(布氏錐蟲)等錐蟲(Trypanosome)，及Escherichia coli(大腸桿菌)等大腸菌屬細菌。
導入於本發明之寄主細菌之輔酶A轉移酶之基因，可利用由上述各來源生物所取得具有編碼為輔酶A轉移酶之基因鹼基序列之DNA、或根據此習知鹼基序列合成之合成DNA序列。其較適合者可舉如來自Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)等梭菌屬細菌、Roseburia intestinalis等Roseburia屬細菌、Faecalibacterium prausnitzii等Faecalibacterium屬細菌、糞球菌(Coprococcus)屬細菌、Trypanosoma brucei(布氏錐蟲)等錐蟲、及Escherichia coli(大腸桿菌)等大腸菌屬細菌之基因鹼基序列之DNA。並以來自梭菌屬細菌或大腸菌屬細菌更適合，而以具有來自Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)或Escherichia coli(大腸桿菌)之基因鹼基序列之DNA特別適合。
本發明之硫解酶，依國際生物化學聯盟會(I.U.B.)酵素委員會報告分類為酵素編號2.3.1.9，為能夠催化乙醯輔酶A產生乙醯乙醯輔酶A之反應之酵素之總稱。
此種可舉例如來自Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)、Clostridium beijerinckii(拜氏梭菌)等梭菌屬細菌，Escherichia coli(大腸桿菌)等大腸菌屬細菌，Halobacterium sp.(親鹽桿菌)種細菌，Zoogloea ramigera(膠團桿菌)等膠菌屬細菌，Rhizobium sp.(根瘤菌種)等根瘤菌屬細菌、Bradyrhizobium japonica(日本慢生型根瘤菌)等慢生型根瘤菌屬細菌、Caulobacter crescentus(新月柄桿菌)等柄桿菌屬細菌、Streptomyces collinus等鏈黴菌屬細菌Enterococcus faecalis(糞腸球菌)等腸球菌屬細菌、Candida tropicalis(熱帶念珠菌)等酵母念珠菌屬、Helianthus annuus(向日葵)等菊科向日葵屬、Gallus gallus(雞)等雉科雞屬、Rattus norvegicus(溝鼠)等鼠科鼠屬、Sus scrofa(歐洲野豬)等山豬科豬屬、Bos taurus(歐洲牛)等之牛科牛屬。
導入於本發明之寄主細菌之硫解酶之基因，可利用由上述各來源生物所取得具有編碼為硫解酶之基因鹼基序列之DNA、或根據此習知鹼基序列合成之合成DNA序列。其較適合者可舉如來自Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)及Clostridium beijerinckii(拜氏梭菌)等梭菌屬細菌、Escherichia coli(大腸桿菌)等大腸菌屬細菌、Halobacterium sp.(親鹽桿菌)種細菌、Zoogloea ramiger(膠團桿菌)等膠菌屬細菌、Rhizobium sp.(根瘤菌種)等根瘤菌屬細菌、Bradyrhizobium japonica(日本慢生型根瘤菌)等慢生型根瘤菌屬細菌、Caulobacter crescentus(新月柄桿菌)等柄桿菌屬細菌、Streptomyces collinus等鏈黴菌屬細菌、Enterococcus faecalis(糞腸球菌)等腸球菌屬細菌、Candida tropicalis(熱帶念珠菌)等酵母念珠菌屬、Helianthus annuus(向日葵)等菊科向日葵屬、Gallus gallus(雞)等雉科雞屬、Rattus norvegicus(溝鼠)等鼠科鼠屬、Sus scrofa(歐洲野豬)等山豬科豬屬、Bos taurus(歐洲牛)等之牛科牛屬之基因鹼基序列之DNA。並以來自梭菌屬細菌或大腸菌屬細菌更適合，而以具有來自Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)或Escherichia coli(大腸桿菌)之基因鹼基序列之DNA特別適合。
由酵素活性之觀點，上述4種酵素分別以來自梭菌屬細菌、有芽胞桿菌屬細菌及大腸菌屬細菌所構成群中選取至少1種細菌較好，其中，乙醯乙酸脫羧酶及異丙醇脫氫酶來自梭菌屬細菌、而輔酶A轉移酶及硫解酶來自大腸菌屬細菌之情形，及此等4種酵素均來自梭菌屬細菌之情形更好。
由酵素活性之觀點，有關本發明之4種酵素分別以來自Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)、Clostridium beijerinckii(拜氏梭菌)或Escherichia coli(大腸桿菌)中之任1種較好，並以乙醯乙酸脫羧酶為來自Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)之酵素、輔酶A轉移酶及硫解酶各別為來自Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)或Escherichia coli(大腸桿菌)之酵素、異丙醇脫氫酶為來自Clostridium beijerinckii(拜氏梭菌)之酵素更好；上述4種酵素由酵素活性之觀點，以乙醯乙酸脫羧酶活性來自Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)、異丙醇脫氫酶活性來自Clostridium beijerinckii(拜氏梭菌)、輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性來自Escherichia coli(大腸桿菌)最好。
在本發明，此等酵素活性係由菌體外導入菌體內，或強化寄主細菌基因組保有之酵素基因之啟動子活性或以其他啟動子取代原啟動子以使酵素之基因之強表現而獲得。
酵素活性之導入，例如利用基因重組技術，將此等4種酵素之基因由寄主細菌之菌體外導入菌體內以實施。此時，被導入之酵素基因與寄主細胞同種或異種均可。由菌體外導入基因於菌體內時所須基因組DNA之調製、DNA之切斷與連接、轉形作用(transformation)、PCR(聚合酶連鎖反應)、當做引子(primer)所使用寡核苷酸之設計與合成等方法，均可應用本業者習知之一般方法進行。此等方法記載於Sambrook,J.,et al.;“Molecular Cloning A Laboratory Manual,Second Edition”,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等。
為增強啟動子活性或使酵素之基因強表現所使用之啟動子，只要能夠在大腸菌等寄主中表現則使用任一啟動子均可。例如使用trp啟動子、lac啟動子、PL 啟動子、PR 啟動子等來自大腸菌或噬菌體之啟動子。又如tac啟動子等被人為設計改變之啟動子亦可使用。又如本發明之實施例所記載之3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH、Glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase)啟動子、谷胺酸脫羧酶(gadA、Glutamate decarboxylase)啟動子、絲胺酸羥甲基轉移酶(glyA、Serine hydroxymethyl transferase)啟動子亦可使用。此等啟動子可依所使用酵素之來源及種類而適當選擇。
例如為強化來自Escherichia coli(大腸桿菌)之硫解酶或輔酶A轉移酶之活性時，只要能夠在大腸菌等寄主中表現則使用任一啟動子均可，但可由trp啟動子、lac啟動子、PL 啟動子、PR 啟動子、tac啟動子、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)啟動子、谷胺酸脫羧酶(gadA)啟動子、絲胺酸羥甲基轉移酶(glyA)啟動子等構成群中適當選擇1種以上。又，trp啟動子、lac啟動子、PL 啟動子、PR 啟動子、tac啟動子、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)啟動子、谷胺酸脫羧酶(gadA)啟動子、絲胺酸羥甲基轉移酶(glyA)啟動子等啟動子，可取代來自Escherichia coli(大腸桿菌)之硫解酶或輔酶A轉移酶之啟動子而使用。
此等啟動子，以可使對象酵素之基因能夠表現之方式，依一般方法導入寄主細胞即可，例如與成為對象之酵素之基因一起連結至相同之載體(vector)後，與酵素基因同時導入寄主細胞即可。
於本發明，寄主細胞乃指為導入乙醯乙酸脫羧酶、異丙醇脫氫酶、輔酶A轉移酶及硫解酶等4種酵素之基因而使用之對象原核生物，或為促進啟動子活性或取代啟動子而使用之對象原核生物。此等可舉例如大腸菌(Escherichia)屬細菌、有芽胞桿菌(Bacillus)屬細菌、棒狀桿菌(Corynebacterium)屬細菌等，尤其以便利性高，工業性使用而實際成果豊富之Escherichia coli(大腸桿菌)適合使用。
「異丙醇之生產方法」
本發明之異丙醇生產方法，包含使用上述本發明之異丙醇生產細菌，由植物來源原料生產異丙醇。
依此，能夠不副產其他醇類而以高純度生產異丙醇。因此，依據本發明，不需要分離副產醇類之複雜步驟，能夠簡便且有效生產異丙醇。
該生產方法包含：在含有異丙醇生產細菌及植物來源原料之混合物中培養異丙醇生產細菌以同化植物來源原料，並在一定時間後將分泌於培養液中之異丙醇使用蒸餾、薄膜分離、萃取等習知技術進行精製之方法。
在異丙醇生產方法中之混合物，只要以一般使用於培養細菌類之基本培養基為主體即可，並依異丙醇生產細菌種類，只要一般使用之培養基則任一種培養基均可使用。
此種基本培養基只要含有碳源、氮源、無機離子及因應必要之其他微量成分則無特別限制。碳源可適當使用葡萄糖、果糖、糖蜜等糖類，反丁烯二酸、檸檬酸、琥珀酸等有機酸，甲醇、乙醇、甘油等醇類，及其他。
氮源可適當使用有機銨鹽、無機銨鹽、硝酸態氮、氨氣、氨水、蛋白質水解物等有機及無機氮源，及其他。無機離子可使用鎂離子、磷酸離子、鉀離子、鐵離子、錳離子、及其他適當使用。
有機微量成分可適當使用維生素、胺基酸等及含有此等之酵母菌萃取物，蛋白腖(peptone)、聚蛋白腖(polypeptone)、玉米浸漬液(corn steep liquor)、酪蛋白水解物，及其他。
聚蛋白腖(polypeptone)係將蛋白質以酵素或酸水解而得，如依日本製藥股份公司製品聚蛋白腖批號LotO586A之分析值時，雖有產生僅少許胺基氮(amino nitrogen)之例，但其氮源可謂全部來自蛋白質。聚蛋白腖成分如以其總質量而言，可舉例如總氮量12.5質量%～14.5質量%、胺基氮5.0質量%～6.5質量%、灼燒殘留物4.0質量%～7.0質量%、乾燥損失3.5質量%～5.5質量%。聚蛋白腖在培養基中通常以0.02～2%(w/w)範圍使用，並以0.1～1%(w/w)範圍使用較好。
玉米浸漬液係將含有玉米浸漬步驟溶出之可溶性成分與乳酸醱酵產生成分之浸漬液進行濃縮所得，依Microbiol. Mol. Biol. Rev.,Dec 1948;Vol. 12:pp297-311.，玉米浸漬液成分如以其總質量而言，可舉例如水分45質量%～55質量%、總氮量2.7質量%～4.5質量%、胺基氮1.0質量%～1.8質量%、揮發性氮0.15質量%～0.40質量%、還原糖0.1質量%～11.0質量%、乳酸5質量%～15質量%、灰分9質量%～10質量%、揮發性酸類0.1質量%～0.3質量%、二氧化硫0.009質量%～0.015質量%。依上述成分，就揮發性氮而言，在水中可能產生銨離子之含氮化合物最多可能含有0.40%(w/w)，且就算此全部為銨離子，但含有玉米浸漬液2%之培養基中之銨離子含量亦僅0.008%。玉米浸漬液在培養基中通常以0.1～20%(w/w)範圍使用，並以0.5～7%(w/w)範圍使用較好。
酵母菌萃取物已知由胺基酸及其聚合物、核酸、維生素、有機酸、無機鹽組成，如依BD(Becton,Dickinson and Company)公司之酵母菌萃取物分析數值(Catalog＃211929、211931、211930)，其無機鹽記載由鈣、鎂、鉀、鈉、氯化物、硫酸、磷酸組成，但無記載能夠產生銨離子之化合物。酵母菌萃取物成分如以其總質量而言，可舉例如總氮量11.4質量%、胺基氮6.9質量%、灰分13.1質量%、乾燥損失1.0質量%、氯化鈉0.2質量%、無機鹽總量10.5質量%。
混合物中之植物來源原料量依其種類及混合物中所含異丙醇生產細菌之活性及數量而異，但通常設定起始糖濃度(換算葡萄糖)為混合物總質量之20質量%以下，且由細菌耐糖性之觀點以起始糖濃度為15質量%以下較好。至於其他各成分，以添加微生物培養基之通常添加量即可，並無特別限制。
由提升異丙醇生產性之觀點，對於含有異丙醇生產細菌及植物來源原料之混合物，以再添加含氮化合物較好。「再添加」意指混合物所含在水中可能產生銨離子之含氮化合物含量較一般培養基之含量為高。依此，異丙醇生產細菌可在含有較通常培養條件更高濃度之胺基酸以外含氮化合物之培養基中培養。添加胺基酸以外含氮化合物於培養基中之時期，在培養開始前或在培養中均可。
在水中可能產生銨離子之含氮化合物，如硫酸銨、硝酸銨等含銨鹽之無機及有機化合物、氨氣、氨水等。在水中可能產生銨離子之含氮化合物在細菌用一般性培養基M9之含量為0.02%(w/w)，在其他一般性培養基MS之含量為0.02%(w/w)，但在本發明，為增加異丙醇生產量，其含量可較此等量多。於本發明，由提升異丙醇生產性之觀點，在水中可能產生銨離子之含氮化合物之添加量，若以氮原子質量合計，以添加混合物開始培養時培養基總質量之0.04%～10.6%(w/w)量進行培養較好。並以0.04%～5.30%(w/w)更好，0.04%～4.24%(w/w)最好。此時，液体1mL容量可換算為1g重量。
又，通常添加於微生物培養基之其他添加成分，如抗生素等，以添加通常之使用量即可。又，為抑制反應時之發泡，以適量添加消泡劑較好。
使用於本發明之培養基，如以水性介質為基本之液體培養基，或以洋菜等固體為基本之固體培養基，但如考慮提供工業性生產則以液體培養基較好。構成液體培養基之水性介質可使用蒸餾水、緩衝液等通常所使用之水性介質。
於本發明之培養，其培養條件並無特別限制，例如在需氧(aerobic)條件下，在pH4～9、較好pH6～8，溫度20℃～50℃、較好25℃～42℃範圍內，適當控制pH與溫度進行培養。
在培養液中蓄積之異丙醇之回收方法並無特別限制，例如可採用以離心分離等由培養液除去菌體後，再以蒸餾、薄膜分離等通常分離方法分離異丙醇之方法。
又，本發明之異丙醇生產方法，在為生產異丙醇進行培養步驟前，可包含將所使用異丙醇生產細菌調整為適當菌數或活性狀態之預培養(pre-culture)步驟。預培養步驟可因應異丙醇生產細菌種類而以通常所使用之培養條件進行培養。
本發明之異丙醇生產方法，包含在供給氣體於上述含有異丙醇生產細菌及植物來源原料之混合物中之狀態下培養該異丙醇生產細菌之培養步驟，及由混合物分離回收因上述培養所生產異丙醇之回收步驟。
依該方法，在供給氣體於混合物中之狀態下培養異丙醇生產細菌(通氣培養)。由於此通氣培養，所生產之異丙醇在釋放於混合物中之同時由混合物蒸散，結果所產生之異丙醇能夠容易由混合物(培養基)分離。又，由於以連續性分離所產生之異丙醇，故能夠抑制混合物中異丙醇濃度之上升。因此，毋須特別考慮異丙醇生產細菌對異丙醇之耐受性。
在培養步驟，供給混合物中之氣體，只要為含氧氣體即可，可使用氧氣或空氣，或此等之任一方與鈍性氣體之混合氣體。此等氣體以預先除菌較好。
上述鈍性氣體可使用氮氣(N2 )及稀有氣體(如氬(Ar)、氦(He)、氖(Ne)、氪(Kr)、或氙(Xe))，由操作之觀點，其中以氮氣(N2 )或氬(Ar)氣較好，氮氣(N2 )更好。
使用混合氣體時，只要不損害培養對象細菌之生理活性則任何混合比例均可，但為適當抑制異丙醇生產細菌活性使能夠長期處理，惰性氣體之混合比例以混合氣體總質量之10%～90%較好。
又，為確保混合物中之通氣，可將陶瓷體等多孔體投入特定之混合物中。
上述混合物中之氣體通氣量雖無特別限制，但僅以空氣當作氣體使用時，一般為0.02vvm～2.0vvm(vvm=通氣容量(mL)/液體容量(mL)/時間(分鐘))，而由抑制對細菌物理性損害之觀點，以0.1vvm～1.5vvm進行較好。
又，培養步驟以攪拌混合物全體狀態下進行較好。由此，異丙醇生產細菌及植物來源原料之混合能夠良好進行，同時能夠使供給混合物中之氣體以良好效率普及混合物全體。
培養步驟，能夠由開始培養至混合物中之植物來源原料被消耗為止，或至異丙醇生產細菌喪失活性為止繼續進行。至於培養步驟期間，因混合物中異丙醇生產細菌之數量與活性、及植物來源原料量而異，一般以1小時以上、較好4小時以上即可。另一方面，將植物來源原料或異丙醇生產細菌進行再投入之結果，培養期間能夠無限制繼續，但由處理效率之觀點，一般為5日以下，並以55小時以下較好。
在回收步驟，將培養步驟所產生並由混合物分離之異丙醇回收。至於回收方法，只要能夠收集以通常培養由混合物蒸散之氣體狀或飛沫狀異丙醇即可。該方法如收集到一般所使用之密閉容器等收集構件等，但由能夠僅回收高純度異丙醇之觀點，以包含捕集異丙醇為目的之捕集液，及使由混合物分離之異丙醇與捕集液進行接觸者較好。
以捕集異丙醇為目的之捕集液如水或有機溶劑。當作捕集液之有機溶劑，只要異丙醇能夠容易溶解，且捕集異丙醇後之捕集液在含水或不含水狀態蒸餾時具有能夠容易與異丙醇分離之沸點則無特別限制。此種有機溶劑可舉例如甲苯、二甲基甲醯胺、二甲亞碸等。當作捕集液之有機溶劑，可適當與水混合使用。
捕集液以水較好。由於推測與異丙醇共同產生之揮發性夾雜物較異丙醇更難溶於水，故異丙醇能夠從夾雜物以良好效率分離回收。
異丙醇與捕集液之接觸，以足夠異丙醇溶解於捕集液之時間進行即可。異丙醇溶解於捕集液時，若是水或上述有機溶劑則不需要長時間，通常以2小時程度即足夠。
為促進異丙醇溶解於捕集液，由混合物分離之氣體狀或飛沫狀異丙醇，以直接注入捕集液中較好。由於注入而產生氣泡，能夠促進異丙醇溶解於捕集液之速度。
於本發明之異丙醇生產方法，為再提高回收效率，包含將由混合物分離之異丙醇在與捕集液接觸前進行液化之液化步驟較好。
異丙醇之液化方法，只要能夠將氣體化或飛沫化狀態之異丙醇進行液化之方法即可，例如能夠使異丙醇之相改變之充分程度之冷卻。此種冷卻方法如使用空氣冷卻或使用冷卻水或冷卻醇類之方法。
又，由混合物分離之異丙醇，亦可使用吸附劑回收。此種吸附劑可使用通常為吸附液體或氣體目的所使用之沸石或矽膠等多孔體。
依照本發明之異丙醇生產方法，異丙醇可以由溶解於捕集液或混合物之方式回收。回收之異丙醇可以使用高性能液相層析法(HPLC)等通常之檢測方法確認。回收之異丙醇可以因應需要再進行精製。至於精製方法，可舉如蒸餾等。
回收之異丙醇如為水溶液狀態時，本發明之異丙醇生產方法除回收步驟外，可再包含脫水步驟。異丙醇之脫水可依常法進行。
圖1為可能應用於本發明之異丙醇生產方法之生產裝置10之一實施例之概念圖。玆參照圖1說明本發明之異丙醇生產方法。
生產裝置10具備培養槽12及捕集槽40，且培養槽12與捕集槽40以連結管30連結。培養槽12及捕集槽40能夠密閉而使槽內氣體不外洩。
培養槽12中裝有含異丙醇生產細菌B與植物來源原料M之混合物14。混合物14之量以裝填培養槽12容量之約半量即可，並可因應培養槽12之容量及生產裝置10之規模而適當調整。培養槽12由通常使用微生物以生產工業性物質所使用之物質構成即可，並無特別限制。又，本發明之生產裝置10能夠在常溫常壓下進行處理即可，但因應需要具備加熱裝置或加壓裝置使能夠加熱加壓亦可。
培養槽12與注入管16連結，注入管16用於從裝置外部注入氣體。注入管16之一端與安裝於生產裝置10外部之通氣裝置(未示於圖中)連接。注入管16之另一端則開口於培養槽12內之底部周邊。裝入培養槽12之混合物14之容量可預先調整，使混合物14之液面較高於注入管16之開口部。
又，培養槽12具備攪拌裝置20，該攪拌裝置則具備安裝於培養槽12外部之馬達部22及與馬達部22連結之攪拌部24。攪拌部24採用螺旋漿等形狀，安裝於培養槽12之底部周邊。
馬達部22與驅動控制裝置(未示於圖中)連接，控制驅動馬達部22使攪拌部24以設定之轉速旋轉。攪拌部24之轉速並無特別限制，但一般為100rpm～1000rpm，並以200rpm～800rpm較好。
捕集槽40內部裝有當作捕集液之阱液42。捕集槽40上部安裝排出管44，使捕集槽40中之氣體排出捕集槽40外。
連結管30之一端開口於培養槽12上部，能夠將充滿培養槽12中之氣體引導至培養槽12外。又，連結管30之另一端延伸並開口在捕集槽40底部周邊，而裝入捕集槽40之捕集液液面可預先調整，使較高於連結管30之開口部。
又，連結管30亦可積極地具冷卻器以主動冷卻連結管30內部。依此，能夠使氣體通過連結管30時主動將氣體液化。
其次，說明本發明之生產裝置10之作用。
將含有異丙醇生產細菌B與植物來源原料M之混合物14注入本發明之生產裝置10之培養槽12中，使混合物14之液面充分高於注入管16末端之位置。開啟攪拌裝置20之馬達部22之電源，以設定之轉速旋轉攪拌部24。又，培養槽12亦可預先裝入設定量培養基並調整適當溫度後，再添加混合物14至設定之合計量。
將設定量混合物14裝入培養槽12中，開啟通氣裝置(未示於圖中)之電源以注入氣體於培養槽12。依此，氣體注入培養槽12內之混合物14中，開始通氣培養。
開始通氣培養時，在混合物14中異丙醇生產細菌B將植物來源原料M同化開始生產異丙醇。所生產之異丙醇由菌體釋出於混合物14中，其一部分溶解於混合物，而大部分則由混合物蒸散。依此，異丙醇由混合物分離。由混合物分離之異丙醇，在培養槽12上部以通氣培養之排氣形式進入連結管30，並向捕集槽40移動。
通過連結管30時，排氣中之異丙醇之一部分被冷卻而液化。向捕集槽40移動之排氣中之異丙醇，由於捕集槽40底部開口之連結管30的另一端進入捕集槽40並注入阱液42中。此時阱液42因注入排氣而產生氣泡。此時異丙醇溶解於阱液42。另一方面，與異丙醇共同由培養槽12移動至捕集槽40之排氣中之揮發性夾雜物，因難溶於阱液42故由阱液42釋出，通過開口於捕集槽40上部之排出管44，以最終排氣之形式排出捕集槽40外。
在培養槽12中產生之異丙醇量，以採樣機器(未示於圖中)進行採樣並確認，如發現異丙醇之生產終止或減低時，或經過設定時間時，即完成處理。
由於完成處理後之阱液42溶解高濃度異丙醇，故可當作高濃度異丙醇溶液進行回收。又，回收此阱液42後，因應需要再單離精製異丙醇亦可。又，由於培養槽12之混合物14中亦有一部分異丙醇溶解，故可因應需要回收混合物14，再單離精製異丙醇。
如此使用本發明之生產裝置10之結果，使用異丙醇生產細菌所生產之異丙醇，能夠容易在常溫常壓(如25℃、101,325Pa)下進行分離回收。因此，不需要設置複雜的分離步驟或精製步驟，能夠使生產裝置簡化。
玆說明圖1之元件符號。10為本發明之生產裝置(異丙醇生產裝置)、12為培養槽(培養部)、14為混合物、16為注入管(氣體供給部)、20為攪拌裝置(攪拌部)、30為連結管(連結部)、40為捕集槽(捕集部)、42為阱液(捕集液)、44為排出管。
又，安裝於本實施方式之生產裝置10之培養槽12、捕集槽40、連結管30等之各種零件、構件之形狀，只要不損害初期作用，均可適當改變。
又，本實施方式之生產裝置10可設置能夠將混合物14或異丙醇生產細菌連續性投入培養槽12之投入部或排出部。依此，能夠進行異丙醇之連續性生產。
如上所述，於本發明，因副產之醇類少，故不需要副產醇類之分離步驟而能夠生產精製之異丙醇。
又，於本發明之較適合實施形態，能夠以連續性且簡便的生產更精製之異丙醇。
[實施例]
以下記載本發明之實施例，但本發明不受此等實施例之限制。又，記載中之「%」為質量%，除非另有說明。
[實施例1] ＜構建來自梭菌屬細菌之異丙醇產生酵素基因群之表現載體及構建該表現載體之轉形體＞
梭菌屬細菌之4種異丙醇產生酵素之胺基酸序列與基因之鹼基序列已有報告。亦即硫解酶記載於GenBank登錄號碼AE001437之基因組序列之互補股3005963～3007364。又，輔酶A轉移酶記載於GenBank登錄號碼X72831，乙醯乙酸脫羧酶記載於GenBank登錄號碼M55392，異丙醇脫氫酶記載於GenBank登錄號碼AF157307。再者，要表現此等4種基因所必須之啟動子之鹼基序列，可使用存在於上述硫解酶鹼基序列中之硫解酶啟動子的序列。
為取得硫解酶啟動子與硫解酶之基因，使用Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)ATCC824之基因組DNA當做模板，依照TTT GAA TTC CAT GAT TTT AAG GGG GTT AGC ATA TGC A(序列編號1)及TTT GGT ACC CTA GCA CTT TTC TAG CAA TAT TGC TGT TCC(序列編號2)，以PCR法放大，將所得DNA片段以限制酶EcoR I及Kpn I切斷，獲得約1.5kbp、含有編碼為硫解酶啟動子之DNA序列之硫解酶基因片段。
又，為取得輔酶A轉移酶之基因，使用Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)ATCC824之基因組DNA當做模板、依照TTT GGT ACC CAA CCT TAA ACC TTC ATA TTT CAA CTA CTT(序列編號3)及TTT GGA TCC CTA AAC AGC CAT GGG TCT AAG TTC(序列編號4)以PCR法放大，並將所得DNA片段以限制酶KpnI及BamHI切斷，獲得約1.4kbp之輔酶A轉移酶基因片段。
為取得乙醯乙酸脫羧酶之基因與終止子(terminator)序列，使用Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)ATCC824之基因組DNA當做模板、依照TTT GGA TCC AGC TAA ACA TTA TTA AAT TTA GGA AGG TG(序列編號5)及TTT GTC GAC CCA ATG AAC TTA GAC CCA TGG CTG(序列編號6)以PCR法放大，將所得DNA片段以限制酶BamHI及SalI切斷，獲得約880bp、含有編碼為終止基因DNA序列之乙醯乙酸脫羧酶基因片段。
又，Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)ATCC824可由細胞、微生物、基因銀行之American Type Culture Collection(ATCC、美國菌種保存中心)取得。
再者，為取得異丙醇脫氫酶之基因，使用Clostridium beijerinckii(拜氏梭菌)NRRLB-593之基因組DNA當做模板，依照TTT GGT ACC GCG AAA TAG CGA TGA ACA GGC AG(序列編號7)及TTT GGT ACC GCA GAT TTT GCT ACT CTT GGA GC(序列編號8)以PCR法放大，並將所得DNA片段以限制酶KpnI切斷，獲得約1.4kbp之異丙醇脫氫酶基因片段。
又，Clostridium beijerinckii(拜氏梭菌)NRRLB-593可由細胞、微生物銀行之VTT(Technical Research Centre of Finland)取得。
將上述4種DNA片段與以限制酶EcoRI及SalI切斷質體pUC19所得片段混合，並使用連接酶進行連接後，用以轉形Escherichia coli(大腸桿菌)DH5α菌株勝任細胞(日本東洋紡織股份公司製、DNA-903)，獲得能夠在含安比西林100μg/mL、並表面塗布40mg/mL X-gal與20%IPTG各40μL之LB Broth,Miller培養液(Difco 244620)洋菜平板上生育之轉形體。將培養所得菌落，以含安比西林100μg/mL之LB液體培養基在37℃培養1夜，再由所得菌體回收質體pIPA。
以此質體pIPA轉形Escherichia coli(大腸桿菌)B菌株(ATCC 11303)勝任細胞，在含安比西林100μg/mL之LB Broth,Miller培養液洋菜平板上以37℃培養1夜，得異丙醇產生酵素基因群表現載體之轉形體pIPA/B菌株。
又，Escherichia coli(大腸桿菌)B菌株(ATCC 11303)可由細胞、微生物、基因銀行之American Type Culture Collection取得。
[實施例2] ＜以Escherichia coli(大腸桿菌)pIPA/B菌株、Escherichia coli(大腸桿菌)B野生菌株生產異丙醇＞
將實施例1所得Escherichia coli(大腸桿菌)pIPA/B菌株接種於容量14mL塑膠管(FALCON公司製品、2057)中含安比西林0.1g/L及葡萄糖2g/L之LB Broth,Miller培養液5mL，在培養溫度37℃以120rpm振盪培養進行預培養。又，以不含安比西林外其他均相同之上述培養組成及培養條件振盪培養Escherichia coli(大腸桿菌)B野生菌株。將各預培養液全量移入容量300mL錐形瓶中含安比西林0.1g/L及葡萄糖20g/L之LB Broth,Miller培養液60mL，在培養溫度37℃以攪拌速度120rpm進行培養。在開始培養48小時後取菌體培養液樣品，以離心分離去除菌體，以HPLC依常法測定培養液上清液中異丙醇、丁醇、乙醇、及丙酮之蓄積量。結果示如表1。確認E. coli pIPA/B菌株在培養48小時後確認蓄積2.1g/L異丙醇。此時並無蓄積丁醇及乙醇。
[實施例3] ＜使用1L培養槽以E. coli pIPA/B菌株生產異丙醇(1)＞
本實施例使用圖1所示生產裝置10進行處理。培養槽12使用1L容量，捕集槽40使用500mL容量。培養槽12、捕集槽40、注入管16、連結管30、排出管44均為玻璃製。捕集槽40中注入水(阱水)400mL當做阱液42。
將實施例1所得E. coli pIPA/B菌株接種於試管中含安比西林0.1g/L及葡萄糖2g/L之LB Broth,Miller培養液4mL，在培養溫度37℃以120rpm攪拌培養進行預培養18小時。將此預培養液全量接種於容量1L培養槽中含安比西林0.1g/L、葡萄糖20g/L、ADEKA NOL 1滴之LB Broth,Miller培養液500mL進行培養。培養以攪拌速度500rpm、培養溫度37℃進行，並使用12.5%氨水控制培養液pH為7.0。又，開始培養25小時後添加0.5g/mL濃度葡萄糖20mL。在開始培養48小時後取菌體培養液樣品，以離心分離去除菌體，以HPLC依常法測定培養液上清液中異丙醇、丁醇、乙醇、及丙酮之蓄積量。結果示如表2。E. coli pIPA/B菌株在培養48小時後確認蓄積3.0g/L異丙醇。此時並無蓄積丁醇及乙醇。又，表2中之各測定值為培養後之培養液與阱水(400mL)中之合計值。
[實施例4] ＜構建來自E. coli硫解酶基因、來自E. coli之輔酶A轉移酶基因、來自Clostridium(梭菌)屬細菌之乙醯乙酸脫羧酶基因、來自Clostridium(梭菌)屬細菌之異丙醇脫氫酶基因之表現載體及構建該表現載體之轉形體＞
E. coli硫解酶及E. coli輔酶A轉移酶之胺基酸序列與基因之鹼基序列已有報告。亦即硫解酶之基因記載於GenBank登錄號碼U00096之E. coli MG1655菌株之2324131～2325315基因組序列。又，輔酶A轉移酶之基因記載於上述E. coli MG1655菌株之基因組序列2321469～2322781。將此等與實施例1記載之來自Clostridium(梭菌)屬細菌之乙醯乙酸脫羧酶之基因、異丙醇脫氫酶之基因共同表現時能夠生產異丙醇。為表現上述基因群所必要之啟動子之鹼基序列，可使用記載於GenBank登錄號碼X02662鹼基序列資料397～440、來自E. coli之3-磷酸甘油醛脫氫酶(以下簡寫為GAPDH)之啟動子序列。
為取得GAPDH啟動子序列，使用E. coli MG1655菌株之基因組DNA當做模板，依照CGA GCT ACA TAT GCA ATG ATT GAC ACG ATT CCG(序列編號9)及CGC GCG CAT GCT ATT TGT TAG TGA ATA AAA GG(序列編號10)以PCR法放大，將所得DNA片段以限制酶Nde I及Sph I切斷，得約110bp、相當於GAPDH啟動子之DNA片段。將上得DNA片段與以限制酶Nde I及Sph I切斷質體pBR322(GenBank登錄號碼J01749)所得片段混合，並使用連接酶進行連接後，用以轉形E. coli DH5α菌株勝任細胞(日本東洋紡織股份公司製、DNA-903)，獲得能夠在含安比西林50μg/mL之LB洋菜平板上生育之轉形體。將培養所得菌落，以含安比西林50μg/mL之LB液體培養基在37℃培養1夜，再由所得菌體回收質體pBRgapP。
為取得異丙醇脫氫酶之基因，使用Clostridium beijerinckii(拜氏梭菌)NRRL B-593之基因組DNA當做模板、依照AAT ATG CAT GCT GGT GGA ACA TAT GAA AGG TTT TGC AAT GCT AGG(序列編號11)及GCG GAT CCG GTA CCT TAT AAT ATA ACT ACT GCT TTA ATT AAG TC(序列編號12)以PCR法放大，並將所得DNA片段以限制酶SphI及Bam HI切斷，得約1.1kbp之異丙醇脫氫酶基因片段。將上得DNA片段與預先製成之以限制酶SphI及Bam HI切斷質體pBRgapP所得片段混合，並使用連接酶進行連接後，用以轉形E. coli DH5α菌株勝任細胞(日本東洋紡織股份公司製、DNA-903)，獲得能夠在含安比西林50μg/mL之LB洋菜平板上生育之轉形體。將培養所得菌落，以含安比西林50μg/mL之LB液體培養基在37℃培養1夜，再由所得菌體回收質體pGAP-IPAdh。
為取得來自E. coli之硫解酶之基因，使用Escherichia coli MG1655菌株之基因組DNA當做模板，依照ATG GAT CCG CTG GTG GAA CAT ATG AAA AAT TGT GTC ATC GTC AG(序列編號13)及GCA GAA GCT TGT CTA GAT TAA TTC AAC CGT TCA ATC ACC ATC(序列編號14)以PCR法放大，並將所得DNA片段以限制酶Bam HI及Hind III切斷，得約1.2kbp之硫解酶基因片段。將上得DNA片段與預先製成之以限制酶Bam HI及Hind III切斷質體pGAP-IPAdh所得片段混合，並使用連接酶進行連接後，用以轉形E. coli DH5α菌株勝任細胞(日本東洋紡織股份公司製、DNA-903)，獲得能夠在含安比西林50μg/mL之LB洋菜平板上生育之轉形體。將培養所得菌落，以含安比西林50μg/mL之LB液體培養基在37℃培養1夜，再由所得菌體回收質體pGAP-IPAdh-atoB。
為取得來自E. coli之輔酶A轉移酶之基因，使用E. coli MG1655菌株之基因組DNA當做模板，依照GCT CTA GAG CTG GTG GAA CAT ATG AAA ACA AAA TTG ATG ACA TTA CAA GAC(序列編號15)及TAG CAA GCT TCT ACT CGA GTT ATT TGC TCT CCT GTG AAA CG(序列編號16)以PCR法放大，並將所得DNA片段以限制酶Xba I及Hind III切斷，得約600bp之輔酶A轉移酶α次單元片段。將上得DNA片段與預先製成之以限制酶Xba I及Hind III切斷質體pGAP-IPAdh-atoB所得片段混合，並使用連接酶進行連接後，用以轉形E. coli DH5α菌株勝任細胞(日本東洋紡織股份公司製、DNA-903)，獲得能夠在含安比西林50μg/mL之LB洋菜平板上生育之轉形體。將培養所得菌落，以含安比西林50μg/mL之LB液體培養基在37℃培養1夜，再由所得菌體回收質體pGAP-IPAdh-atoB-atoD。
再使用E. coli MG1655菌株之基因組DNA當做模板，依照AAG TCT CGA GCT GGT GGA ACA TAT GGA TGC GAA ACA ACG TAT TG(序列編號17)及GGC CAA GCT TCA TAA ATC ACC CCG TTG C(序列編號18)以PCR法放大，並將所得DNA片段以限制酶Xho I及Hind III切斷，得約600bp之輔酶A轉移酶β次單元片段。將上得DNA片段與預先製成之以限制酶Xho I及Hind III切斷質體pGAP-IPAdh-atoB-atoD所得片段混合，並使用連接酶進行連接後，用以轉形E. coli DH5α菌株勝任細胞(日本東洋紡織股份公司製、DNA-903)，獲得能夠在含安比西林50μg/mL之LB洋菜平板上生育之轉形體。將培養所得菌落，以含安比西林50μg/mL之LB液體培養基在37℃培養1夜，再由所得菌體回收質體pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA。
為取得乙醯乙酸脫羧酶之基因，使用Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)ATCC824菌株之基因組DNA當做模板，依照CAG GTA CCG CTG GTG GAA CAT ATG TTA AAG GAT GAA GTA ATT AAA CAA ATT AGC(序列編號19)及GCG GAT CCT TAC TTA AGA TAA TCA TAT ATA ACT TCA GC(序列編號20)以PCR法放大，並將所得DNA片段以限制酶Kpn I及BamH I切斷，得約700bp之乙醯乙酸脫羧酶基因片段。將上得DNA片段與預先製成之以限制酶Kpn I及BamH I切斷質體pGAP-IPAdh-atoB-atoD-atoA所得片段混合，並使用連接酶進行連接後，用以轉形E. coli DH5α菌株勝任細胞(日本東洋紡織股份公司製、DNA-903)，獲得能夠在含安比西林50μg/mL之LB洋菜平板上生育之轉形體。將培養所得菌落，以含安比西林50μg/mL之LB液體培養基在37℃培養1夜，再由所得菌體回收質體pGAP-Iaaa。
以此質體pGAP-Iaaa轉形E. coli B菌株(ATCC 11303)勝任細胞，在含安比西林50μg/mL之LB Broth,Miller培養液洋菜平板上以37℃培養1夜，得E. coli pGAP-Iaaa/B菌株。
又，E. coli MG1655菌株、Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)ATCC824菌株、E. coli B菌株均可由細胞、微生物、基因銀行之American Type Culture Collection取得。
[實施例5] ＜使用1L培養槽以E. coli pGAP-Iaaa/B菌株生產異丙醇(1)＞
與實施例3相同，探討使用1L培養槽生產異丙醇。但，預培養使用裝入錐形瓶之含安比西林0.1g/L之LB Broth,Miller培養液25mL，接種實施例4所得E. coli pGAP-Iaaa/B菌株，在培養溫度35℃以120rpm進行攪拌培養16小時。將此預培養液全量接種於容量1L培養槽中含葡萄糖50g/L、ADEKA NOL 1滴之LB Broth,Miller培養液475mL進行培養。培養以攪拌速度500rpm、培養溫度35℃進行，並使用24wt/wt%氫氧化鈉溶液控制培養液pH為7.0。在開始培養24小時後取菌體培養液樣品，以離心分離去除菌體，用HPLC依常法測定培養液上清液中異丙醇、丁醇、乙醇之蓄積量。結果，在培養24小時後確認蓄積5.5g/L異丙醇。此時並無蓄積丁醇及乙醇。又，48小時後之異丙醇蓄積量為5.0g/L。又，測定值為培養後之培養液與阱水(改為500mL)中之合計值。
[實施例6] ＜使用1L培養槽以E. coli pGAP-Iaaa/B菌株生產異丙醇(2)＞
與實施例5相同，探討使用1L培養槽生產異丙醇。但，於1L培養槽進行培養時使用表3所示組成之培養基475mL。此時來自硫安之氮原子之質量%為培養開始時之培養基總質量之0.04質量%。又，以10g/L/時間之流速添加50wt/wt%葡萄糖水溶液。結果，在培養24小時後確認蓄積7.4g/L異丙醇。此時並無蓄積丁醇及乙醇。又，48小時後之異丙醇蓄積量為6.2g/L。又，測定值為培養後之培養液與阱水(500mL)中之合計值。
[實施例7] ＜使用1L培養槽以E. coli pGAP-Iaaa/B菌株生產異丙醇(3)＞
與實施例6相同，探討使用1L培養槽生產異丙醇。但，於1L培養槽進行培養時，在培養開始30小時後追加0.2質量%(2g/L)之(NH4 )2 SO4 。在本實施例，來自硫安之氮原子之質量%為培養開始時之培養基總質量之0.08質量%。結果，在培養24小時後確認蓄積7.2g/L異丙醇。此時並無蓄積丁醇及乙醇。又，48小時後之異丙醇蓄積量為13.4g/L。又，測定值為培養後之培養液與阱水(500mL)中之合計值。可知添加適當量之氮源硫酸銨時能夠提升生產性。
[實施例8] ＜使用1L培養槽以E. coli pGAP-Iaaa/B菌株生產異丙醇(4)＞
與實施例6相同，探討使用1L培養槽生產異丙醇。但，於1L培養槽進行培養時，將培養基組成中之(NH4 )2 SO4 量設定為0.4質量%(4g/L)。在本實施例，來自硫安之氮原子之質量%為培養開始時之培養基總質量之0.08質量%。結果，在培養24小時後確認蓄積11.6g/L異丙醇。又，測定值為培養後之培養液與阱水(500mL)中之合計值。可知添加適當量之氮源硫酸銨時能夠提升生產速度。
[實施例9] ＜使用1L培養槽以E. coli pGAP-Iaaa/B菌株生產異丙醇(5)＞
與實施例6相同，探討使用1L培養槽生產異丙醇。但，於1L培養槽進行培養時，將培養基組成中之(NH4 )2 SO4 量設定為0.5質量%(5g/L)。在本實施例，來自硫安之氮原子之質量%為培養開始時之培養基總質量之0.11質量%。結果，在培養24小時後確認蓄積11.2g/L異丙醇。又，55小時後之異丙醇蓄積量為21.3g/L。又，測定值為培養後之培養液與阱水(500mL)中之合計值。
[實施例10] ＜使用1L培養槽以E. coli pGAP-Iaaa/B菌株生產異丙醇(6)＞
與實施例6相同，探討使用1L培養槽生產異丙醇。但，pH調節劑使用12.5質量%氨水。結果，在培養24小時後確認蓄積13.3g/L異丙醇。又，55小時後之異丙醇蓄積量為28.4g/L。培養55小時為止所添加12.5質量%氨水之質量為69.0g，在本實施例，來自氨水之氮原子之質量%合計為培養開始時之培養基總質量之0.73質量%。又，測定值為培養後之培養液與阱水(500mL)中之合計值。
[實施例11] ＜使用1L培養槽以E. coli pGAP-Iaaa/B菌株生產異丙醇(7)＞
與實施例6相同，探討使用1L培養槽生產異丙醇。但，於1L培養槽進行培養時，將培養基組成中之聚蛋白腖2g/L以玉米浸漬液(日本食品化工製)20g/L替代，並將(NH4 )2 SO4 之量設定為5g/L。結果，在培養24小時後確認蓄積10.9g/L異丙醇。又，55小時後之異丙醇蓄積量為17.8g/L。在本實施例，來自硫安之氮原子之質量%為培養開始時之培養基總質量之0.11質量%。又，測定值為培養後之培養液與阱水(500mL)中之合計值。可知能夠利用廣泛成分當做培養基營養源。
[實施例12] ＜使用1L培養槽以E. coli pIPA/B菌株生產異丙醇(2)＞
與實施例3相同條件，探討使用1L培養槽以pIPA/B菌株生產異丙醇。但，於培養開始時添加0.5%(5g/L)(NH4 )2 SO4 。在本實施例，來自硫安之氮原子之質量%為培養開始時之培養基總質量之0.11質量%。結果，在培養48小時後確認蓄積4.5g/L異丙醇。
[實施例13] ＜以蒸餾法由培養液回收異丙醇＞
依據實施例3之方法培養pIPA/B菌株，得培養液180g當做提供蒸餾之培養液。此稱為培養液A。將178.6g之培養液A裝入容量200mL茄形燒瓶，在攪拌狀態下以油浴加熱，依常法進行簡單蒸餾。培養液A各行程之塔頂溫度與液量示如表4。蒸餾前之培養液、蒸餾分得之液體、及殘餘液體中之異丙醇、丁醇及乙醇含量用HPLC依常法進行測定。結果示如表5。在本實施例，以塔頂溫度99.1～99.5℃，能夠由培養pIPA/B菌株之培養液回收幾乎全部所含之異丙醇。此時，在分餾所得液體中未檢測出丁醇及乙醇。
[比較例1]
模仿日本特開昭61-67493號公報記載之Clostridium. sp. 172CY-02菌株之培養液組成，配製LB Broth,Miller培養液中添加正丁醇9.9g/L、乙醇0.6g/L、異丙醇7.2g/L之培養液180g，並將此當做比較培養液B。取177.9g之比較培養液B裝入容量200mL茄形燒瓶，在攪拌狀態下以油浴加熱，依常法進行簡單蒸餾。比較培養液B各行程之塔頂溫度與液量示如表4。蒸餾前之培養液、蒸餾分得之液體、及殘餘液體中之異丙醇、丁醇及乙醇含量用HPLC依常法進行測定。結果示如表5。在比較培養液B，3種混合之醇類成分中特別以異丙醇與丁醇表現相同之分餾行動，故無法僅分離回收異丙醇。
由實施例13與比較例1之結果，可知本發明之培養液因不含異丙醇以外之副產醇類，故能夠容易回收異丙醇。因此，以簡單蒸餾等簡易精製步驟能夠由本發明之培養液回收異丙醇。
另一方面，得知在既有菌之培養液，異丙醇與副產醇類之分離困難，無法容易回收異丙醇。由既有菌之培養液回收異丙醇時，必需附加精餾塔等設備之蒸餾，因而可預期使精製步驟複雜化。
由上所述，本發明之異丙醇生產細菌在由植物來源原料生產異丙醇之實用化上與先前技術比較時可謂特別優異。
[實施例14]＜實驗例＞
本實施例使用圖1所示生產裝置10進行處理。培養槽12使用1L容量，捕集槽40使用500mL容量者。培養槽12、捕集槽40、注入管16、連結管30、排出管44均為玻璃製。捕集槽40中注入水(阱水)400mL當做阱液42。
將10g/L異丙醇水溶液500mL當做處理液注入培養槽12。以攪拌速度500rpm、處理溫度37℃進行處理。
其次，由注入管16將空氣以0.5L/min(1vvm)速度注入異丙醇水溶液，開始進行處理。將培養槽12之排氣排入捕集槽40中之阱液42使產生氣泡。至於捕集槽40之排氣則排出於裝置系統外之空氣中。處理開始經0、2、4、8、24小時後分別採樣培養槽12中之處理液及捕集槽40中之阱液42，以HPLC測定樣品中之異丙醇蓄積量。又，HPLC測定使用日本信和化工公司製ULTRON PS-80H(8.0mm ID、300mm L)，以洗提液使用0.1% HClO4 、流速1.0mL/min、管柱溫度50℃，檢測器使用差示折射率檢測器(RI)進行測定。結果示如表6。
如表6所示，培養槽12中之異丙醇濃度隨時間之經過而減少，而阱液42中之異丙醇濃度則徐徐增加。在經過24小時之時間點，得知培養槽中之異丙醇有70%由培養槽向阱液移動。又，此時之異丙醇總量為10.1g，故物質均衡(material balance)亦大約一致。
由上可知，將培養槽12中之通氣培養之排氣排入捕集槽40中之阱液42使產生氣泡之結果，能夠由處理液分離處理液中之異丙醇而溶解於阱液42。
[實施例15] ＜異丙醇之生產＞
在本實施例，使用與實施例3所使用之同一生產裝置10以生產異丙醇。又，捕集槽40中注入水(阱水)400mL當做阱液42。
預培養使用ψ19mm×長175mm試管，裝入含安比西林0.1g/L及葡萄糖2g/L之LB Broth,Miller培養液4mL，並接種實施例1所得pIPA/B菌株，在培養溫度37℃以120rpm進行振盪培養18小時。
將此預培養液4mL接種於培養槽12中含安比西林0.1g/L、葡萄糖20g/L、ADEKA NOL 1滴之LB Broth,Miller培養液500mL，開始進行培養。培養以攪拌速度500rpm、培養溫度37℃進行，並使用12.5%氨水調整培養液pH為7.0。
其次，由注入管16將空氣以0.5L/min(1vvm)速度注入培養液中，開始進行通氣培養。培養槽12之排氣則排入捕集槽40中之阱液42使產生氣泡。
在培養開始經23小時後添加0.5g/L葡萄糖溶液20mL於培養槽中。
＜檢測樣品中之異丙醇＞
在培養開始經0、7、23、30、47及52小時後，分別採樣培養槽12中之處理後培養液及捕集槽40中之處理後阱液42。採樣之培養液以離心分離去除菌體等固態物。
培養液及阱水樣品中之異丙醇蓄積量，分別以HPLC測定。結果示如表7。
又，以HPLC測定培養開始經47小時後之培養液及阱水時檢測之峰部號碼、Rt時間(Retention time、保持時間)、及化合物名稱，分別示如表8(培養液)、表9(阱水)。
又，於表8及表9，「IPA」表示異丙醇。又，於表8，「不明」表示推測因異丙醇之通氣培養所產生之夾雜物。
如表7～表9所示，可確認使用異丙醇生產細菌所生產之異丙醇，因通氣培養而蓄積於培養液及阱水。
又，關於在培養開始經47小時之培養液，確認除葡萄糖與醋酸以外，推測有夾雜物之11個峰部，但此時之阱水除相當於異丙醇峰部以外無其他峰部。因此得知，依據本發明之生產方法，將培養槽12之排氣排入阱液42使產生氣泡之結果，能夠容易分離夾雜物與異丙醇。
由上所述，自培養開始至異丙醇回收，能夠以簡單操作及良好效率回收異丙醇。再者，得知使用水於異丙醇回收，可得無夾雜物之異丙醇水溶液。因此，本發明可謂在以培養微生物生產異丙醇之實用化上，能夠構建生產步驟中精製步驟負擔少之劃時代的方法。
[比較例2] ＜構建硫解酶基因缺失質體pIPA及構建該質體之轉形體＞
由實施例1記載之質體pIPA製作剔除硫解酶基因之質體pIPAΔthio。
為了由質體pIPA分離硫解酶啟動子，使用pIPA為模板，依照TTT GAA TTC CAT GAT TTT AAG GGG GTT AGC ATA TGC A(序列編號21)及TTT TCT AGA TCT AAC TAA CCT CCT AAA TTT TGA TAC GGG(序列編號22)以PCR法放大，將所得DNA片段以限制酶EcoR I及Kpn I切斷，得約240bp之硫解酶啟動子片段。
再者，為了由質體pIPA分離異丙醇脫氫酶基因，使用pIPA為模板，依照TTT CTC GAG GCA GAT TTT GCT ACT CTT GGA GC(序列編號23)及TTT GGT ACC GCA GAT TTT GCT ACT CTT GGA GC(序列編號24)以PCR法放大，將所得DNA片段以限制酶EcoR I及Xba I切斷，得約1.4Kbp之異丙醇脫氫酶基因片段。
將上述2個DNA片段與質體pIPA以限制酶EcoR I及Kpn I切斷所得4.9Kbp片段混合，並用連接酶連接後用以轉形E. coli DH5α菌株勝任細胞(日本東洋紡織股份公司製、DNA-903)，獲得能夠在含安比西林100μg/mL之LB洋菜平板上生育之轉形體。將培養所得菌落，以含安比西林100μg/mL之LB液體培養基在37℃培養1夜，再由所得菌體回收質體pIPAΔthio。依常法測定此pIPAΔthio之鹼基序列，確認為硫解酶啟動子及異丙醇脫氫酶之基因之DNA序列無誤。
以此質體pIPAΔthio轉形E. coli B菌株(ATCC11303)勝任細胞，以含安比西林100μg/mL之LB Broth,Miller培養液洋菜平板上在37℃培養1夜，得pIPAΔthio/B菌株轉形體。
＜使用1L培養槽以E. coli pIPAΔthio/B菌株生產異丙醇＞
與實施例3相同，探討使用1L培養槽生產異丙醇。預培養使用裝入試管之含安比西林0.1g/L及葡萄糖2g/L之LB Broth,Miller培養液4mL，接種E. coli pIPAΔthio/B菌株，在培養溫度37℃以120rpm進行攪拌培養18小時。將此預培養液全量接種於容量1L培養槽中含葡萄糖20g/L、ADEKA NOL 1滴之LB Broth,Miller培養液500mL進行培養。培養以攪拌速度500rpm、培養溫度37℃進行，並使用12.5%氨水溶液控制培養液pH為7.0。又，自開始培養至第72小時添加0.5g/mL濃度之葡萄糖20mL。由開始培養定時採取菌體培養液樣品，以離心分離去除菌體後，用HPLC依常法測定培養液上清液中之異丙醇蓄積量。結果示如表10。又，表10中之異丙醇量為培養後之培養液與阱水中之合計值。
E. coli pIPAΔthio/B菌株雖有導入乙醯乙酸脫羧酶、異丙醇脫氫酶及輔酶A轉移酶等之各基因，但因未導入硫解酶之基因，故該酵素活性係天生來自該菌株本身。但於E. coli pIPAΔthio/B菌株，雖在培養72小時後亦無蓄積異丙醇。
[比較例3] ＜構建硫解酶基因及輔酶A轉移酶缺失質體pIPA及構建該質體之轉形體＞
由實施例1記載之質體pIPA製作剔除硫解酶之基因及輔酶A轉移酶之基因之質體pIPAΔthioΔctfAB。
質體pIPAΔthio以限制酶Kpn I及BamH I切斷，並使用DNA Blunting Kit(日本Takara-Bio股份公司製)將DNA末端平滑化後連接，用以轉形E. coli DH5α菌株勝任細胞(日本東洋紡織股份公司製、DNA-903)，獲得能夠在含安比西林100μg/mL之LB洋菜平板上生育之轉形體。將培養所得菌落，以含安比西林100μg/mL之LB液體培養基在37℃培養1夜，再由所得菌體回收質體pIPAΔthioΔctfAB。
以此質體pIPAΔthioΔctfAB轉形E. coliB菌株(ATCC11303)勝任細胞，以含安比西林100μg/mL之LB Broth,Miller培養液(Difco244620)洋菜平板上在37℃培養1夜，得pIPAΔthioΔctfAB/B菌株轉形體。
＜使用1L培養槽以E. coli pIPAΔthioΔctfAB/B菌株生產異丙醇＞
與實施例3相同，使用1L培養槽進行異丙醇之生產試驗。預培養使用裝入試管之含安比西林0.1g/L及葡萄糖2g/L之LB Broth,Miller培養液4mL，接種E. coli pIPAΔthioΔctfAB/B菌株，在培養溫度37℃以120rpm進行攪拌培養18小時。將此預培養液全量接種於容量1L培養槽中含葡萄糖20g/L、ADEKA NOL 1滴之LB Broth,Miller培養液500mL進行培養。培養以攪拌速度500rpm、培養溫度37℃進行，並使用12.5%氨水溶液控制培養液pH為7.0。又，自開始培養至第72小時添加0.5g/mL濃度之葡萄糖20mL。
由開始培養經時採取菌體培養液樣品，以離心分離去除菌體後，以HPLC常法測定培養液上清液中之異丙醇蓄積量。結果示如表11。又，表11中之異丙醇量為培養後之培養液與阱水中之合計值。
E. coli pIPAΔthioΔctfAB/B菌株雖有導入乙醯乙酸脫羧酶及異丙醇脫氫酶之基因，但因未導入硫解酶之基因及輔酶A轉移酶之基因，故此等酵素之活性係天生來自該菌株本身。但於E. coli pIPAΔthioΔctfAB/B菌株，雖培養72小時後亦無蓄積異丙醇。
由實施例1、2、3及比較例2、3之結果，可知本發明得到之大腸桿菌，不僅須賦予乙醯乙酸脫羧酶活性及異丙醇脫氫酶活性，同時亦須賦予被大腸桿菌基因組本來存在之硫解酶基因及輔酶A轉移酶基因所編碼之此等酵素之活性，否則不能生產異丙醇。
[實施例16] ＜構建使用glyA啟動子之來自E. coli硫解酶基因、來自E. coli之輔酶A轉移酶基因、來自Clostridium(梭菌)屬細菌之乙醯乙酸脫羧酶基因、來自Clostridium(梭菌)屬細菌之異丙醇脫氫酶基因之表現載體及構建該表現載體之轉形體＞
實施例4之GAPDH(Glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase、3-磷酸甘油醛脫氫酶)啟動子以來自E. coli之絲胺酸羥甲基轉移酶(Serine hydroxymethyl transferase、glyA)啟動子代替使用。
E. coli之絲胺酸羥甲基轉移酶之胺基酸序列與基因鹼基序列已有報告。亦即絲胺酸羥甲基轉移酶之基因記載於GenBank登錄號碼V00283。使用此啟動子，能夠使生產異丙醇所必須之基因群表現。
為取得glyA啟動子，使用E. coli MG1655菌株之基因組DNA當做模板、依照TCG ACC GGC TCC AGT TCG(序列編號25)及CTG TCG CAT GCT GAC TCA GCT AAC AAT AAA ATT TTT GG(序列編號26)以PCR法放大，將所得DNA片段以限制酶Sph I切斷，得約850bp、相當於glyA啟動子之DNA片段。將上得DNA片段與質體pBR322(GenBank登錄號碼J01749)以限制酶Nde I處理後，用T4DNA聚合酶處理使末端平滑化，再與以限制酶Sph I切斷所得片段混合，並使用連接酶進行連接後，用以轉形E. coli DH5α菌株勝任細胞(日本東洋紡織股份公司製、DNA-903)，獲得能夠在含安比西林50μg/mL之LB洋菜平板上生育之轉形體。將培養所得菌落，以含安比西林50μg/mL之LB液體培養基在37℃培養1夜，再由所得菌體回收質體pBRglyP。
其次，與實施例4相同，依序導入編碼為硫解酶、輔酶A轉移酶、異丙醇脫氫酶及乙醯乙酸脫羧酶之各基因，並回收質體pGly-Iaaa。
以此質體pGly-Iaaa轉形E. coli B菌株(ATCC 11303)勝任細胞，在含安比西林50μg/mL之LB Broth,Miller培養液洋菜平板上以37℃培養1夜，得E. coli pGly-Iaaa/B菌株。
[實施例17] ＜構建使用gadA啟動子之來自E. coli之硫解酶基因、來自E. coli之輔酶A轉移酶基因、來自梭菌屬細菌之乙醯乙酸脫羧酶基因、來自梭菌屬細菌之異丙醇脫氫酶基因之表現載體及構建該表現載體之轉形體＞
實施例4之GAPDH啟動子以來自E. coli之谷胺酸脫羧酶A(gadA)啟動子代替使用。
E. coli之絲胺酸羥甲基轉移酶A之胺基酸序列與基因鹼基序列已有報告。亦即絲胺酸羥甲基轉移酶之基因記載於GenBank登錄號碼M84024。使用此啟動子，能夠使生產異丙醇所必須之基因群表現。
為取得gadA啟動子，使用E. coli MG1655菌株之基因組DNA當做模板，依照CGA CTC GCA TAT GTC GTT TTT CTG CTT AGG(序列編號27)及CAG TCG CAT GCT TCG AAC TCC TTA AAT TTA TTT GAA GGC(序列編號28)以PCR法放大，將所得DNA片段以限制酶Nde I及Sph I切斷，得約130bp、相當於gadA啟動子之DNA片段。將上得DNA片段與質體pBR322(GenBank登錄號碼J01749)以限制酶Nde I及Sph I切斷所得片段混合，並使用連接酶進行連接後，用以轉形E. coli DH5α菌株勝任細胞(日本東洋紡織股份公司製、DNA-903)，獲得能夠在含安比西林50μg/mL之LB洋菜平板上生育之轉形體。將培養所得菌落，以含安比西林50μg/mL之LB液體培養基在37℃培養1夜，再由所得菌體回收質體pBRgadP。
其次，與實施例4相同，依序導入編碼為硫解酶、輔酶A轉移酶、異丙醇脫氫酶及乙醯乙酸脫羧酶之各基因，並回收質體pGad-Iaaa。
以此質體pGad-Iaaa轉形E. coli B菌株(ATCC 11303)勝任細胞，在含安比西林50μg/mL之LB Broth,Miller培養液洋菜平板上以37℃培養1夜，得E. coli pGad-Iaaa/B菌株。
[實施例18] ＜使用1L培養槽以E. coli pGly-Iaaa/B菌株及pGad-Iaaa/B菌株生產異丙醇＞
與實施例5相同，探討使用1L培養槽以E. coli pGly-Iaaa/B菌株及pGad-Iaaa/B菌株生產異丙醇。結果，在培養24小時後確認pGly-Iaaa/B菌株能夠蓄積3.1g/L異丙醇，而pGad-Iaaa/B菌株則能夠蓄積2.6g/L異丙醇。又，測定值為培養後之培養液與阱水(500mL)中之合計值。
[實施例19] ＜以1vvm或2vvm通氣量培養pGAP-Iaaa/B菌株時之異丙醇生產性＞
在本實施例，使用與實施例5相同之2台生產裝置10，但捕集槽之容量與實施例5不同。各捕集槽40之容量為2000mL，其中注入水(阱水)2000mL當做阱液42。
預培養使用裝入錐形瓶之含安比西林0.1g/L之LB Broth,Miller培養液25mL，接種實施例4所得E. coli pGAP-Iaaa/B菌株，在培養溫度35℃以120rpm進行攪拌培養16小時。將此預培養液全量接種於容量1L培養槽中含葡萄糖50g/L、ADEKA NOL 1滴之LB Broth,Miller培養液475mL進行培養。培養以攪拌速度500rpm、培養溫度35℃進行，並使用NaOH調整培養液pH為7.0。
其次，在第1台生產裝置10，由注入管16注入空氣於培養液中並使通氣量為1vvm開始進行通氣培養。在第2台生產裝置10則使用2支注入管16，將空氣與氮氣分別以1vvm注入培養液中，使總通氣量為2vvm開始進行通氣培養。至於由培養槽12之排氣則排入捕集槽40中之阱液42使產生氣泡。
結果，在培養24小時後確認通氣量1vvm能夠蓄積5.5g/L異丙醇，而2vvm則能夠蓄積3.3g/L異丙醇。又，測定值為培養後之培養液與阱水中之合計值。阱水中之異丙醇量係將水中異丙醇濃度4倍後換算成相當之培養液量而計算。
[實施例20] ＜以1vvm或0.75vvm通氣量培養pIPA/B菌株時之異丙醇生產性＞
與實施例3相同，探討pIPA/B菌株之培養。但，葡萄糖為40g/L，pH調整劑使用氨水。又，各捕集槽40之容量為500mL，其中注入水(阱水)500mL當做阱液42。氣體使用空氣，通氣量設定為1vvm或0.75vvm。結果，在培養54小時後確認通氣量1vvm能夠蓄積2.8g/L異丙醇，而0.75vvm能夠蓄積2.8g/L異丙醇。又，測定值為培養後之培養液與阱水中之合計值。
由實施例19與實施例20之結果，本案發明人等發現有適合於異丙醇生產之通氣量存在。亦即發現，注入培養槽之總通氣量以0.75vvm～1vvm較2vvm更適合異丙醇之生產。
如上所述，依據本發明之實施形態，副產之醇類少，不需要副產醇類之分離步驟而僅進行簡單精製，即能夠簡便且良好效率生產更精製之異丙醇。
依據本發明製得之異丙醇，可利用於各種用途，例如適合使用於當做丙烯之製造原料。
日本專利申請第2007-181571號所開示之全部以參考納入本說明書。
本說明書記載之所有文獻、專利申請及技術規格，與各個文獻、專利申請案及技術規格以具體且各別記載時同樣，當做參考文獻納入本說明書。
10．．．生產裝置
12．．．培養槽
14．．．混合物
16．．．注入管
20．．．攪拌裝置
22．．．馬達部
24．．．攪拌部
30．．．連結管
40．．．捕集槽
42．．．阱液(捕集液)
44．．．排出管
B．．．異丙醇生產細菌
M．．．植物來源原料
圖1為表示本發明之異丙醇生產裝置之一實施方式之概略概念圖。
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20．．．攪拌裝置
22．．．馬達部
24．．．攪拌部
30．．．連結管
40．．．捕集槽
42．．．阱液(捕集液)
44．．．排出管
B．．．異丙醇生產細菌
M．．．植物來源原料

Claims (22)

  1. 一種異丙醇生產細菌，能夠由植物來源原料生產異丙醇，其特徵為將硫解酶啟動子、3-磷酸甘油醛去氫酶(GAPDH)啟動子、谷胺酸脫羧酶(gadA)啟動子或絲胺酸羥甲基轉移酶(glyA)啟動子與編碼為Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)來源之酵素之乙醯乙酸脫羧酶基因、編碼為Clostridium beijerinckii(拜氏梭菌)來源之酵素之異丙醇脫氫酶基因、編碼為Escherichia coli(大腸桿菌)來源之各酵素之輔酶A轉移酶基因及硫解酶基因連結，而使該乙醯乙酸脫羧酶基因、該異丙醇脫氫酶基因、該輔酶A轉移酶基因及該硫解酶基因能表現；該細菌為大腸桿菌(E.coli)。
  2. 一種異丙醇生產細菌，能夠由植物來源原料生產異丙醇，其特徵為將硫解酶啟動子、3-磷酸甘油醛去氫酶(GAPDH)啟動子、谷胺酸脫羧酶(gadA)啟動子或絲胺酸羥甲基轉移酶(glyA)啟動子與編碼為Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)來源之酵素之乙醯乙酸脫羧酶基因、編碼為Clostridium beijerinckii(拜氏梭菌)來源之酵素之異丙醇脫氫酶基因、編碼為Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)來源之各酵素之輔酶A轉移酶基因及硫解酶基因連結，而使該乙醯乙酸脫羧酶基因、該異丙醇脫氫酶基因、該輔酶A轉移酶基因及該硫解酶基因能表現；該細菌為大腸桿菌(E.coli)。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之異丙醇生產細菌，其中，乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性係使用硫解酶啟動子強化。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之異丙醇生產細菌，其中，乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性係使用3-磷酸甘油醛去氫酶(GAPDH)啟動子強化。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之異丙醇生產細菌，其中，乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性係使用谷胺酸脫羧酶(gadA)啟動子強化。
  6. 如申請專利範圍第1或2項之異丙醇生產細菌，其中，乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性係使用絲胺酸羥甲基轉移酶(glyA)啟動子強化。
  7. 如申請專利範圍第1或2項之異丙醇生產細菌，其中，乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性，分別以導入擇自於編碼為梭菌屬細菌、有芽胞桿菌屬細菌及大腸菌屬細菌所構成群中至少1種細菌來源之各酵素之基因而獲得。
  8. 如申請專利範圍第1或2項之異丙醇生產細菌，其中，乙醯乙酸脫羧酶活性及異丙醇脫氫酶活性，係導入編碼為梭菌屬細菌來源之各酵素之基因而獲得；而輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性，係導入編碼為大腸菌屬細菌來源之各酵素基因而獲得。
  9. 如申請專利範圍第1或2項之異丙醇生產細菌，其中，乙醯乙酸脫羧酶活性係導入編碼為Clostridium acetobutylicum(丙酮丁醇梭菌)來源之酵素基因而獲得，異丙醇脫氫酶活性係導入編碼為Clostridium beijerinckii(拜氏梭菌)來源之酵素之基因而獲得；而輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性，係導入編碼為E.coli來源之各酵素之基因而獲得。
  10. 如申請專利範圍第1或2項之異丙醇生產細菌，其中，乙醯乙酸脫羧酶活性、異丙醇脫氫酶活性、輔酶A轉移酶活性及硫解酶活性，分別係導入編碼為梭菌屬細菌來源之各酵素基因而獲得。
  11. 一種異丙醇生產方法，其特徵為包含使用如申請專利範圍第1或2項之異丙醇生產細菌由植物來源原料生產異丙醇。
  12. 如申請專利範圍第11項之異丙醇生產方法，其中，在含有該異丙醇生產細菌及植物來源原料之混合物中再添加含氮化合物。
  13. 如申請專利範圍第11項之異丙醇生產方法，其中，在含有該異丙醇生產細菌及植物來源原料之混合物中添加在水中能夠產生銨離子之含氮化合物，其添加量以氮原子合計質量%計算為培養 開始時混合物中培養基總質量之0.04%~10.6%(w/w)。
  14. 如申請專利範圍第11項之異丙醇生產方法，其中，包括在含有該異丙醇生產細菌與植物來源原料之混合物中以供給氣體狀態下培養該異丙醇生產細菌之培養步驟，及回收由該培養所產生異丙醇之回收步驟。
  15. 如申請專利範圍第14項之異丙醇生產方法，其中，該氣體為含氧氣體。
  16. 如申請專利範圍第14項之異丙醇生產方法，其中，該氣體之供給量為0.02vvm~2.0vvm。
  17. 如申請專利範圍第14項之異丙醇生產方法，其中，該氣體之供給量為0.1vvm~1.5vvm。
  18. 如申請專利範圍第14項之異丙醇生產方法，其中，該回收步驟包含使該培養步驟所得由培養物蒸散之異丙醇與為捕集異丙醇之捕集液接觸。
  19. 如申請專利範圍第14項之異丙醇生產方法，其中，該回收步驟包含使該蒸散之異丙醇液化後與該捕集液接觸。
  20. 如申請專利範圍第11項之異丙醇生產方法，其使用具備以下構件的異丙醇生產裝置進行：培養部，容納含有如申請專利範圍第1至10項之異丙醇生產細菌與植物來源原料之混合物；氣體供給部，與該培養部連接同時其開口位置在該培養部所容納之混合物中，以供給氣體於該混合物中；捕集部，容納捕集異丙醇之捕集液；連接部，連接該培養部與該捕集部，同時能夠使蒸散於該培養部中之異丙醇向該捕集部移動。
  21. 如申請專利範圍第20項之異丙醇生產方法，其中，該連接部為將蒸散在該培養部中之異丙醇液化後供給該捕集部之液化部。
  22. 如申請專利範圍第20項之異丙醇生產方法，其中，該培養部更具備能夠將容納在該培養部中之該混合物進行攪拌之攪拌 部。
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