CN106164260B

CN106164260B - 一种假丝酵母羰基还原酶及用于制备(r)-6-羟基-8-氯辛酸酯的方法

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Publication number: CN106164260B
Application number: CN201580002695.XA
Authority: CN
Inventors: 许建和; 张玉军; 郑高伟; 潘江
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2015-03-04
Filing date: 2015-03-04
Publication date: 2019-10-01
Anticipated expiration: 2035-03-04
Also published as: WO2016138641A1; US10294479B2; CN106164260A; US20180265875A1

Abstract

本发明公开了近平滑假丝酵母CGMCC 9630，该菌株表达的羰基还原酶及其编码基因和氨基酸序列，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用所述近平滑假丝酵母整细胞、其羰基还原酶或相应的重组转化体作为催化剂用于催化潜手性羰基化合物的不对称还原，特别是6‑羰基‑8‑卤代辛酸酯还原制备(R)‑α‑硫辛酸合成前体(R)‑6‑羟基‑8‑卤代辛酸酯。与不对称还原制备(R)‑6‑羟基‑8‑卤代辛酸酯的其他方法相比，本发明具有底物浓度高、反应条件温和、环境友好、产率高、产品光学纯度高等优势，因此在(R)‑α‑硫辛酸的工业化生产中具有很好的应用前景。

Description

一种假丝酵母羰基还原酶及用于制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种近平滑假丝酵母菌(Candidaparapsilosis)及其表达的羰基还原酶，该酶的编码基因和氨基酸序列，以及含有所述编码基因的重组表达载体和重组表达转化体，利用该羰基还原酶或重组表达转化体作为催化剂在不对称还原潜手性羰基化合物中的应用，例如还原6-羰基-8-氯辛酸酯以制备光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯。

背景技术

自Reed于1950年首次从猪肝中分离出α-硫辛酸(α-lipoic acid)以来，人们对该物质的生理活性研究持续深入。α-硫辛酸属于维生素类药物，是兼具脂溶性和水溶性的抗氧化剂，能够消除体内致病的自由基。有文献报道，α-硫辛酸可被用于放射性损害的治疗，或用于治疗肝功能障碍、亚急性坏死性脑病等。在我国，α-硫辛酸主要用于急性肝炎、肝硬变、脂肪肝等肝病的治疗。α-硫辛酸的生理活性仅限于右旋硫辛酸，即(R)-α-硫辛酸，而(S)-α-硫辛酸基本没有生理活性，但也没有其他副作用。市场上光学纯(R)-α-硫辛酸正逐渐取代外消旋硫辛酸。

现有的(R)-α-硫辛酸合成方法基本分为化学法和生物法。Elliott等通过手性辅助剂的诱导，进行了(R)-α-硫辛酸的不对称合成，总收率可达37％，但反应条件的苛刻和所用试剂的高成本限制了该方法在产业中的应用(Tetrahedron Letters，1985，26(21)：2535-2538)。Gopalan尝试用微生物酶催化生成(R)-α-硫辛酸，但总收率仅10％，可操作性不强(Journal of the Chemical Society，Perkin Trans.，1990，7：1897-1900)。近来研究得较多的合成方法之一是对映体拆分，它以手性拆分剂或酯酶/脂肪酶对外消旋硫辛酸或其前体进行拆分，进而转化生成(R)-α-硫辛酸，但因为过程中伴随着(S)-α-硫辛酸的生成，其理论最高产率只有50％。

另外，酶法还原制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯也逐渐受到关注，但现有的少量报道在产品得率和光学纯度方面尚不够理想。例如，Olbrich等用Geotrichum candidum整细胞催化6-羰基-8-氯辛酸酯不对称还原生成(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯，底物浓度为5g/L，反应24小时后得率仅62％，产物ee值为88％(US 7135328 B2)。Müller等利用来自Thermoanaerobium brokii的醇脱氢酶TbADH，催化2g/L的6-羰基-8-氯辛酸酯还原转化，生成产物(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯的光学纯度可达99.5％，但其转化率也仅85％，而且反应体系中还需要添加0.5mM辅酶和1mM二硫苏糖醇(DTT)(US 7157253B2)。Werner等利用来自Nocardia globulera的NgADH来制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯，底物浓度可达到44g/L，但并未公开其产物的ee值(WO 2007/028729 A1，2007)。Gupta等利用一种来自Metschnikowiazobellii的氧化还原酶，可将85g/L的底物6-羰基-8-氯辛酸酯转化为产物(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯，反应体系中需添加0.1mM的辅酶，反应24小时后的转化率仅为55％，尽管其产物ee值可达97％(WO 2005049816 A2)。总体来看，现存的生物催化剂及其工艺技术水平离产业化应用的要求还相距甚远。例如，已见报道的羰基还原酶普遍存在着催化活性低、底物耐受性差、反应时间长以及产物光学纯度不理想等问题。

可见，现有的(R)-α-硫辛酸合成方法存在各种不足，难以满足对光学纯(R)-α-硫辛酸不断增加的市场需求。因此，仍然需要进一步拓展(R)-α-硫辛酸的合成方法，来通过高效、低成本的方法来满足市场需求。

发明内容

针对现有技术中羰基还原酶的不足，发明人提供了一种近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)CGMCC 9630。该菌株所表达的羰基还原酶具有催化反应底物浓度高、反应条件温和、环境友好、产率高、产品光学纯度高等优点。

本发明公开了所述近平滑假丝酵母菌CGMCC 9630所表达的羰基还原酶CpKR、其编码基因、表达该羰基还原酶的重组载体和重组转化体，所述菌株或羰基还原酶在中的应用催化潜手性羰基化合物的不对称还原，以及制备手性仲醇特别是(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯的方法。本发明的羰基还原酶具有很高的催化活性、立体选择性及底物耐受性。

另一方面，发明人提供了一种新的羰基还原酶，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.2所示。制备本发明所述羰基还原酶CpKR的方法包括但不限于：1)可从近平滑假丝酵母CGMCC 9630的细胞中直接提取分离获得；2)也可按照本领域常规技术通过所述羰基还原酶编码基因的异源重组表达来获得。

另一方面，发明人提供了羰基还原酶的编码基因，含有所述基因的重组表达载体、重组表达转化体。发明人还提供了所述羰基还原酶的制备方法，所述方法包括培养本发明所述的近平滑假丝酵母菌或含有所述羰基还原酶基因的重组表达载体的宿主细胞的步骤。

相应地，本发明还提供了利用所述近平滑假丝酵母菌CGMCC 9630或相关重组表达载体的培养物或所得羰基还原酶在不对称还原潜手性羰基化合物中的应用，其中所述潜手性羰基化合物可选自如下通式：

其中R₁选自，-CH₂(CH₃)₂，，-2-Cl-C₆H₄和-(CH₂)₂C₆H₅；R₂为-CH₃或-CH₂CH₃；R₃为-CH₂Cl，-CH₂CH₃或-(CH₂)₂CH₃；R₄为-CH₃或-CH₂CH₃，具体地，所述潜手性羰基化合物为6-羰基-8-氯辛酸乙酯。

具体地，在潜手性羰基化合物是6-羰基-8-氯辛酸乙酯时，可以由此获得(R)-α-硫辛酸，下图是可用反应路线的示意图：

其中，式(I)为6-羰基-8-氯辛酸乙酯；式(II)为(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯；式(III)为(R)-6，8-二氯辛酸乙酯；式(IV)为(R)-α-硫辛酸。各步骤中，①为羰基还原酶，该反应需要在NADPH的存在下进行，在羰基底物被催化还原的同时NADPH被氧化生成相应的氧化型辅酶NADP⁺；②为SOCl₂；③为Na₂S+S。在一种实施方式中，本发明具体涉及在步骤①中以CGMCC 9630细胞或相关重组转化体的培养物来提供活性羰基还原酶，对6-羰基-8-氯辛酸乙酯进行不对称还原生成(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯，用于合成(R)-α-硫辛酸。

在前述应用中，潜手性羰基化合物的浓度可为1～1500mmol/L，所述羰基还原酶的用量可选为8.0～800U/mmol潜手性羰基化合物。反应中所需的NADPH可由作为催化剂的细胞培养物一同提供，可以额外添加，在适用时，所述辅酶NADPH的添加量可为0～10mmol/L。或者可以通过添加葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP⁺来间接提供NADPH，在适用时，所述葡萄糖脱氢酶的用量可为0～340U/mmol潜手性羰基化合物，所述葡萄糖的用量可为0～0.3g/mmol潜手性羰基化合物，所述辅酶NADP⁺的添加量可为0～1.0mmol/L。

在一种实施方式中，本发明通过上述路线对6-羰基-8-氯辛酸酯进行酶法还原，不对称生成单一构型的(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯，进而实现(R)-α-硫辛酸的合成。该方法相比于现有技术的方法，具有催化反应底物浓度高，反应条件温和、环境友好、产率高、产品光学纯度高等优点，其理论产率高达100％。

附图简要说明

图1为羰基还原酶CgKR催化合成(R)-6-羟基-8-氯辛酸乙酯的示意图。

图2为质粒pET28a-CpKR构建示意图。

发明详述

本发明公开了一种近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)CGMCC 9630。该菌株初始命名为ECU 6481，自华东理工大学奉贤校区土样中分离得到，并经分类实验和16SrDNA分析鉴定为近平滑假丝酵母菌。在以6-羰基-8-氯辛酸乙酯为底物，对本课题组保藏的菌株库进行的还原活性筛选中，发现该菌株的静息细胞可以催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯的不对称还原，生成(R)-6-羟基-8氯辛酸乙酯，且产物的ee值达到了97％。该菌株已于2014年9月1日专利保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC 9630。

发明人在筛选获得高活性、高立体选择性近平滑假丝酵母CGMCC 9630的基础上，结合本领域常规技术方法，以NCBI数据库中公开的来源于近平滑假丝酵母菌并被预测为羰基还原酶的相关序列为基础设计引物来进行分子克隆，并将克隆得到的片段在大肠杆菌中进行重组表达。用重组表达的羰基还原酶催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯的还原，来测定其催化活性以及所得还原产物的ee值，最终得到还原产物的ee值为97％，且酶促还原活性最高的羰基还原酶CpKR，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。在此基础上，通过对氨基酸序列SEQID No.2的一个或多个氨基酸残基在保持酶活性范围内进行替换，得到氨基酸序列如SEQID No.4和6所示的突变体。

本发明的羰基还原酶CpKR及其突变体可由SEQ ID No.1、3和5所示核酸序列编码。基于本申请所公开的羰基还原酶氨基酸序列，不难利用本领域常规技术制备本发明所述羰基还原酶(CpKR)的编码基因。包含所述编码基因的核酸分子包括但不限于：从生物体内提取天然存在的编码CpKR的核酸分子，或通过基因克隆技术对已有核酸片段进行基因工程操作制得的编码CpKR酶的核酸分子，或通过人工合成方法得到的编码所述CpKR酶的核酸分子。术语“核酸”和“核酸分子”在本文中可互换使用，指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。

技术人员都了解，由于密码子的简并性，编码所述羰基还原酶(氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2、4和6所示)的核酸分子不仅仅局限于SEQ ID No.1、3和5所示的核酸序列，还包括通过引入替换来提供一个核酸分子的同系物，只要该核酸分子编码如序列表SEQID No.2、4和6所示氨基酸序列的蛋白质即可。

编码本发明所述羰基还原酶的核酸分子的较佳来源有：以近平滑假丝酵母Candida parapsilosis CGMCC 9630的基因组DNA为模板，采用本领域常规技术方法(如聚合酶链反应PCR)，获得编码所述羰基还原酶的完整核酸分子。其中涉及的合成引物，优选的如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示：

正向引物SEQ ID No.7：CCGGAATTCATGACAGTATTTGTCTCAGGTGCA

反向引物SEQ ID No.8：CCGCTCGAGTTACTTGGCATCGAGAAGTTGTTT

其中，正向引物中以下划线标出EcoRI酶切位点，反向引物中以下划线标出XhoI酶切位点。

本发明还公开了一种包含所述羰基还原酶基因的重组表达载体。术语“表达载体”指设计成能供核酸序列插入并表达所插入核酸序列的载体、质粒或载剂。表达载体可提供转录和翻译调节序列，可用于提供诱导型或组成型表达，其中编码区操作性地置于转录起始区(例如，启动子或增强子)和转录与翻译终止区的转录控制下。所述表达载体可采用本领域的常规载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。所述重组表达载体可通过本领域常规技术方法，将编码所述羰基还原酶的核苷酸序列导入到各种表达载体中构建而成。本发明所述载体优选为质粒pET-28a。通过PCR扩增所得的核酸产物与表达载体pET-28a可以分别用适当的限制性内切酶如EcoRI和XhoI双酶切，形成互补的粘性末端，然后用连接酶如T4DNA连接酶连接，即可形成含有本发明所述羰基还原酶CpKR编码基因的重组表达载体，如pET28a-CpKR(质粒示意图见附图2)。

本发明还公开一种包含所述羰基还原酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体。所述重组表达转化体可以通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中来制得。本发明所述宿主细胞优选为本领域常见的宿主微生物，能满足所述重组表达载体稳定地自我复制以及所述羰基还原酶基因的有效表达即可。所述宿主细胞优选大肠杆菌，更优选地为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌DH 5α。本说明书中，术语“重组微生物”、“重组细胞”和“重组宿主细胞”在本文中互换使用，指遗传修饰成复制并表达或过量表达内源多核苷酸或表达非内源序列如载体所含序列的那些细胞，并包括此类细胞的子代。

本发明还公开了所述重组羰基还原酶的制备方法。通过培养上述重组表达转化体，可获得具有催化6-羰基-8-氯辛酸酯不对称还原活性的羰基还原酶CpKR。所用的培养基可选自本领域的常规培养基，例如，LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0)等。转化体的培养参照本领域常规操作即可。例如，在所含表达载体提供诱导型表达的实施方式中，所述重组表达转化体的培养条件可以为：37℃培养至OD₆₀₀达到0.6左右，随后加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖(IPTG)进行诱导，诱导剂浓度可选为0.05～1.0mmol/L(例如0.2mmol/L)，诱导温度可选为16～25℃(例如20℃)，诱导可持续12～24小时(例如16小时)。通过将本申请所述重组表达转化体于适当培养基中在适当条件下培养，并在需要时以适当试剂和条件进行诱导，就能够有效表达上述羰基还原酶。

本发明的不对称还原中，利用通过近平滑假丝酵母菌CGMCC 9630或相应重组转化体的培养获得菌体沉淀作为催化剂，所得菌体沉淀可选进行冷冻干燥，以便于长期存放供以后使用。使用菌体进行不对称还原的另一个优势在于，在提供催化剂以外，还提供了CpKR催化反应所需要的辅酶NADPH，从而无需添加价格昂贵的还原型辅酶，有助于降低反应的成本。

类似地，为了控制成本，反应体系中也可以加入氧化型辅酶NADP⁺，同时加入辅助性的葡萄糖脱氢酶以及廉价的辅底物葡萄糖，从而通过催化NADP⁺还原生成NADPH来提供CpKR反应所需要的NADPH。所述辅助性的葡萄糖脱氢酶可以直接以活性蛋白质的形式添加。所述辅助性的葡萄糖脱氢酶还可与CpKR由相同或不同的宿主细胞以重组表达产物的形式来提供，也就是说，CpKR与葡萄糖脱氢酶可以在两个宿主细胞中分别表达，也可以在同一个宿主细胞中在相同或不同的表达载体上共表达。两种酶的共表达可以简化酶的发酵生产步骤，简化反应体系，减少生物催化剂的用量，同时也可以提高辅酶NADP⁺还原再生的效率。因此，本发明还公开了共同表达所述羰基还原酶CpKR与葡萄糖脱氢酶的方法。所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列可如SEQ ID No.14所示，其可由SEQ ID No.13所示核苷酸序列编码。

在一种实施方式中，可以用两种宿主细胞分别表达所述羰基还原酶CpKR与葡萄糖脱氢酶，然后将培养所得到的细胞按需要以适当比例混合用于催化反应。在另一种实施方式中，可以在同一宿主细胞中用两个不同的载体分别表达所述羰基还原酶CpKR与葡萄糖脱氢酶，然后将培养所得到的细胞用于催化反应。在另一种实施方式中，可以将所述羰基还原酶CpKR与葡萄糖脱氢酶的编码序列插入同一表达载体内，并导入宿主细胞，然后将培养所得到的细胞用于催化反应。

可通过常规技术获得这些重组转化的宿主细胞。例如，将所述羰基还原酶CpKR与所述葡萄糖脱氢酶的编码核酸分别接入两个不同的表达质粒，并同时转入宿主细胞。或者，在采用单一表达载体的情况中，可以将所述羰基还原酶CpKR与所述葡萄糖脱氢酶的编码核酸以任意顺序串联接入所述表达质粒，再转入宿主细胞。所述葡萄糖脱氢酶可以是来源于Bacillus megaterium的BmGDH；所述表达质粒可选用pET28a；所述宿主细胞可选用大肠杆菌BL21(DE3)。

羰基还原酶可通过如下过程分离：相应的重组表达转化体细胞离心后用pH 7.0的100mM Tris-HCl缓冲液重悬，在冰水浴中超声破碎(例如，以400W功率工作4s，间歇6s处理99个循环)，然后离心沉淀细胞碎片(例如，4℃下12000rpm离心10分钟)，收集所得上清液即可作为重组羰基还原酶CpKR的粗酶液。重组表达产生的葡萄糖脱氢酶可根据文献报道的方法来分离和纯化，例如参见：Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology2011，38，633-641。

为了实现上述共表达，可以利用合适引物分别扩增获得所述羰基还原酶CpKR与葡萄糖脱氢酶的编码序列。例如，可以利用下述SEQ ID No.9和10为引物获得SEQ ID No.1所示羰基还原酶CpKR的编码序列，可以利用下述SEQ ID No.11和12为引物获得SEQ ID No.13所示葡萄糖脱氢酶的编码序列。

印KR-NdeI，SEQ ID No.9：GGAATTCCATATGACAGTATTTGTCTCAGGTGC

CpKR-EcoRI，SEQ ID No.10：CCGGAATTCTTACTTGGCATCGAGAAGTTGTTT

BmGDH-SalI，SEQ ID No.11：

ACGCGTCGACAAGGAGATATAATGTATAAAGATTTAGAAGG

BmGDH-XhoI，SEQ ID No.12：CCGCTCGAGTTATCCGCGTCCTGCTTGGAAT

上述序列中，分别以下划线表示各引物中的酶切位点。

所述羰基还原酶的活力可用如下方法测定：将含2mmol/L 6-羰基-8-氯辛酸乙酯和0.1mmol/L NADPH的1mL反应体系(100mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 7.0)预热至30℃，然后加入适量的羰基还原酶，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADPH的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值。

所述葡萄糖脱氢酶的活力可用如下方法测定：将含10mmol/L葡萄糖、1mmol/LNADP⁺的1mL反应体系(100mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH 7.0)预热至30℃，然后加入适量葡萄糖脱氢酶。30℃条件下，在分光光度计比色皿中保温反应，并原位检测340nm处NADPH吸光度的变化，记录1分钟内吸光度的变化值。

按上述方法测定所述羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的活力时，可用下式计算得到酶活力：

酶活力(U)＝EW×V×10³/(6220×1)

式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为ml；6220为NADPH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)；1为光程距离，单位为cm。对于羰基还原酶而言，1个活性单位对应于上述条件下每分钟氧化1μmol NADPH所需的酶量。对于葡萄糖脱氢酶而言，1个活性单位对应于上述条件下每分钟还原1μmol NADP⁺所需的酶量。

本发明还公开了所述羰基还原酶CpKR在催化还原潜手性羰基化合物生成光学纯手性仲醇中的应用方法。所述的应用包括以所述羰基还原酶或重组表达转化体作为催化剂，在pH 6.0～7.5(例如pH 7.0)的缓冲液中，加入待转化的潜手性羰基化合物、葡萄糖以及葡萄糖脱氢酶(在需要时)，经过适当时间的生物转化，即可生成光学纯的手性羟基化合物，例如，(R)-硫辛酸的合成前体(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯。

本发明中所用的缓冲液为本领域常规缓冲液。在一种实施方式中，所述缓冲液为pH 7.0的Tris-HCl缓冲液，其他可用缓冲液包括磷酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液，只要其能满足pH 6.0～7.5的缓冲范围即可。缓冲液的浓度范围可为10～200mM，优选为50～100mM。

提及化合物时，术语“化学纯”是指与不需要的杂质相比，化合物占总量的85％或更高(例如，90％、95％或更高)的纯化物。提及硫辛酸前体等手性化合物时，术语“光学纯”是指与不需要的(S)-对映异构体相比，(R)-对映异构体占全部异构体的百分比为96.5％或更高(例如，97％、97.5％、98％、98.5％、99％或更高)的纯化物。本发明中，光学纯度一般以术语“对映体过量”或符号“ee”表示，该术语是指混合物中一种对映体相对于另一种的过量，例如硫辛酸前体化合物中(R)型相对于(S)型的过量。除非另有说明，说明书中涉及纯度或ee值时，“＞99％”表示残余底物或某异构体含量低于检测下限而无法准确测定。本文中，ee值的分析可通过将乙酰化处理的产物经过进行气相色谱(例如，采用CP-Chirasil-DEXCB柱)来进行，示例性的气相色谱条件为：以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，柱温160℃。

术语“潜手性羰基化合物”是一类酮酯化合物，即主链上含有羰基取代基的酯类化合物，这类化合物本身不具有手性，而在酶促不对称还原后能生成具有手性的羟基酯。例如，所述潜手性羰基化合物可选自以下通式：

式中，

R₁选自、-CH₂(CH₃)₂、、-2-Cl-C₆H₄或-(CH₂)₂C₆H₅；

R₂为-CH₃或-CH₂CH₃；

R₃为-CH₂Cl，-CH₂CH₃或-(CH₂)₂CH₃；

R₄为-CH₃或-CH₂CH₃。

所述的不对称还原反应较佳地在适度振荡或搅拌条件下进行。反应温度可选20～30℃，底物浓度可选地为1～1500mmol/L，羰基还原酶用量可选地为8.0～800U酶/mmol底物；葡萄糖脱氢酶用量可选地为0～340U酶/mmol底物；葡萄糖用量可选地为0～0.3g/mmol底物；额外添加辅酶NADP⁺用量可选地为0～0.1mmol/L；额外添加辅酶NADPH的用量可选地为0～10mmol/L。反应中，间歇取样测定反应转化率，反应时间以转化率达到99％以上为准，一般为2～12小时。转化率可采用气相色谱法来分析，例如，利用-5Sil MS色谱柱，以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，柱温160℃来进行。

待不对称还原反应结束后，反应液用等量水不溶性有机溶剂，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醚、甲基叔丁基醚，进行萃取，重复萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂，即得光学纯手性产物的粗提物。粗提物通过常规方法如减压蒸馏等进一步纯化即可得高度化学纯和光学纯的产物。

本发明提供的近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CGMCC 9630菌株，以及由该菌株合成的羰基还原酶CpKR，可用于高效催化6-羰基-8-氯辛酸酯的不对称还原，生成光学纯(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯。利用该酶法催化技术，底物浓度达1.5mol/L(或330g/L)，转化率可超过99％，产物ee值高于97％。相对于其他(R)-α-硫辛酸合成前体的不对称还原制备方法，本发明具有产物浓度高和光学纯度高的优势，有利于实现(R)-α-硫辛酸的高效、低成本生产，具有工业化应用前景。

前述各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可用通过实验得到验证。以下实施例举例说明了本发明示例性的实施方式，来帮助本领域技术人员理解本申请的其它目标、特征、优点和各方面。应当理解，虽然表明了本申请的优选实施方式，但以下描述和具体实施例仅是为了说明而给出，而不对本发明的范围构成限制。本发明的范围根据所附权利要求书确定。

具体实施方式

除非另有说明，下列实施例中的具体实验按照本领域常规方法和条件进行，或遵照商品说明书。

下列实施例中的材料来源为：

近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)CGMCC 9630

表达质粒pET28a购自Novagen公司。

E.coli DH5a和E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

限制性内切酶EcoR I和Xho I均为Takara公司的市售产品。

实施例1近平滑假丝酵母CGMCC 9630的培养

近平滑假丝酵母CGMCC 9630接种入培养基(酵母膏3g/L，麦芽提取物3g/L，大豆蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L)中，30℃培养1天。培养液经8000rpm离心收集菌体。收集的菌体沉淀即刻使用，或4℃冰箱保存供3天内使用。

实施例2近平滑假丝酵母细胞催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯还原反应

取0.2g如实施例1所述的菌体沉淀，用2mL Tris-HCl缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)重悬，加入1mM的6-羰基-8-氯辛酸乙酯，置于恒温混匀仪上30℃、1000rpm反应12小时。用等量乙酸乙酯萃取后，无水硫酸钠干燥6小时以上。将产物乙酰化衍生后，通过气相色谱分析，测得其光学纯度为97％ee(R)。

实施例3羰基还原酶CpKR的基因克隆

根据羰基还原酶CpKR的开放阅读框，设计上、下游引物如下：

上游引物SEQ ID No.7：

CCGGAATTCATGACAGTATTTGTCTCAGGTGCA

下游引物SEQ ID No.8：

CCGCTCGAGTTACTTGGCATCGAGAAGTTGTTT

其中，上游引物下划线部分为EcoRI酶切位点，下游引物下划线部分为XhoI酶切位点。

以近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)CGMCC 9630的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 25μl，上游引物和下游引物(10ng/μl)各2.5μl，基因组DNA(100ng/μl)1μl和ddH₂O19μl。PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟后进行32次如下循环：94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟；最后72℃再延伸10分钟。PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化后，用DNA回收试剂盒回收目的片段。经过DNA测序，该序列中编码的开放阅读框全长1002bp，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

实施例4羰基还原酶重组表达质粒和重组表达转化体的制备

将实施例3中PCR扩增所得的羰基还原酶目的片段以及pET 28a空质粒同时用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切过夜，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化、DNA试剂盒回收。将回收的经酶切目的片段和空载体在T4DNA连接酶的作用下，于4℃连接12小时，得到重组质粒pET28a-CpKR。

将所得重组质粒转化至E.coli DH 5α，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基平板上，37℃培养8小时，对长出来的菌落进行菌落PCR验证，挑取菌落PCR扩增出长度约1000bp的目的条带的阳性克隆。经测序验证后，提取相应的质粒，进一步转化至E.coliBL21，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-CpKR。

实施例5羰基还原酶CpKR的诱导表达

将实施例4中所得的重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-CpKR，接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接种至装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，放入37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.7时，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L进行诱导，16℃诱导24小时后，将培养液以8000rpm转速离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤，得到静息细胞。将所得细胞用10ml的Tris-HCl缓冲液(100mM，pH 7.0)重悬，冰水浴中进行如下超声处理：400W功率，工作4s，间歇6s，进行99个循环，4℃下10000rpm离心10分钟，收集上清液，按前文所述方法进行活力测定。测得的酶活为81.3U/ml裂解液。

实施例6重组羰基还原酶突变体CpKR_G86E的制备

对实施例3所得的羰基还原酶CpKR全长基因序列(SEQ ID No.1)进行碱基突变，分别将还原酶基因编码序列的第257位的G突变为A，第258位的G突变为A，从而得到如SEQ IDNo.3所示的突变基因的碱基序列。所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.4，即羰基还原酶CpKR(SEQ ID No.2)第86位的Gly突变为Glu，该突变基因所编码的羰基还原酶命名为CpKR_G86E。如实施例4所述的方法制备含有该突变体基因DNA序列的重组表达质粒和重组表达转化体，按照实施例5的方法，培养并诱导表达后，取细胞超声处理后得到裂解液，测得酶活为122U/ml裂解液。

实施例7重组羰基还原酶双突变体CpKR_G86E/A163S的制备

对实施例3所得的羰基还原酶CpKR全长基因序列(SEQ ID No.1)进行碱基突变，将还原酶基因编码序列的第257、258位的两个G都突变为A，将第487、489位的G、T突变为T、G，从而得到如SEQ ID No.5所示的突变基因的碱基序列。其编码的氨基酸序列为SEQ IDNo.6，即羰基还原酶CpKR(SEQ ID No.2)第86、163位的Gly、Ala分别突变为Glu、Ser，该突变基因所编码的羰基还原酶命名为CpKR_G86E/A163S。如实施例4所述的方法制备含有该突变体基因DNA序列的重组表达质粒和重组表达转化体，按照实施例5的方法，培养并诱导表达后，取细胞超声处理后得到裂解液，测得酶活为181U/ml裂解液。

实施例8 CpKR催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯不对称还原

取0.1ml如实施例5的培养液，10000rpm离心5分钟，沉淀细胞重新悬浮入1ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)，加入0.01mmol的6-羰基-8-氯辛酸乙酯(即，浓度为10mM)以及终浓度至10mmol/L的NADPH，置于恒温混匀仪上30℃、1000rpm反应12小时。取样，用等体积乙酸乙酯萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥8小时，通过气相色谱分析，转化率为98.7％。将产物乙酰化衍生后，通过气相色谱分析，测得其光学纯度为97％ee(R)。

实施例9 CpKR催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯不对称还原

在2mL离心管中进行反应，1mL Tris-HCl缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中加有20mmol/L的底物6-羰基-8-氯辛酸乙酯，6g/L葡萄糖，1U葡萄糖脱氢酶和终浓度为1.0mM的NADP⁺，以53U酶/mmol底物的量加入如实施例5所述的重组表达CpKR的静息细胞。反应在振荡器上1000rpm，30℃下进行。转化10小时，测得底物转化率为99.2％，产物ee值为99.7％(R)。

实施例10重组还原酶CpKR_G86E不对称还原6-羰基-8-氯辛酸乙酯

在2mL离心管中进行反应，1mL Tris-HCl缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中加有20mmol/L的底物6-羰基-8-氯辛酸乙酯，6g/L葡萄糖和1U葡萄糖脱氢酶，以10U酶/mmol底物的量加入如实施例6所述的重组表达CpKR_G86E的静息细胞。反应在振荡器上1000rpm，30℃下进行。转化8小时，测得底物转化率为99.1％，产物ee值为97.3％(R)。

实施例11重组还原酶CpKR_c86E/A163S不对称还原6-羰基-8-氯辛酸乙酯

在2mL离心管中进行反应，1mL Tris-HCl缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中加有20mmol/L的底物6-羰基-8-氯辛酸乙酯，6g/L葡萄糖和1U葡萄糖脱氢酶，以8U酶/mmol底物的量加入如实施例7所述的重组表达CpKR_G86E/A163S的静息细胞。反应在振荡器上1000rpm，30℃下进行。转化10小时，测得底物转化率为99.5％，产物ee值为99.6％(R)。

实施例12羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶的基因串联共表达

按照常规的PCR扩增技术以及酶切连接手段，利用引物CpKR-Nde I和CpKR-EcoR I扩增得到SEQ ID No.6所示的羰基还原酶CpKR_G86E/A163S的基因；用Nde I/EcoR I双酶切目的基因及质粒pET 28a后，进行连接，转化入E.coli BL21(DE3)，并进行质粒pET28-CpKR_G86E/A163S的提取；利用引物BmGDH-Sal I和BmGDH-Xho I扩增SEQ ID No.14所示的葡萄糖脱氢酶BmGDH目的基因；Sal I/Xho I双酶切BmGDH及包含有CpKR片段的质粒pET28-CpKR_G86E/A163S后，进行连接，转化入E.coli BL21(DE3)，即得到包含有CpKR_G86E/A163S和BmGDH的所述重组表达转化体E.coli BL21(DE3)(pET28-CpKR_G86E/A163S-BmGDH)。

将E.coli BL21(DE3)(pET28-CpKR_G86E/A163S-BmGDH)接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接种至装有100m1LB培养基的500m1三角瓶中，37℃下180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.7时，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L进行诱导，16℃诱导24小时后，将培养液以8000rpm转速离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤，得到静息细胞。冷冻干燥，获得冻干的重组表达转化体(E.coli BL21/pET28a-CpKR_G86E/A163S-BmGDH)，测得其CpKR_G86E/A163S活力为8.0U/mg冻干细胞，BmGDH活力为3.4U/mg冻干细胞。

实施例13～19共表达整细胞催化的羰基不对称还原反应

在10mL的Tris-HCl缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中加入0.1g如实施例12所述重组表达转化体(E.coli BL21/pET28a-CpKR_G86E/A163S-BmGDH)的冻干细胞，加入相应的羰基化合物底物至终浓度100mmol/L，并加入葡萄糖至150mmol/L和NADP⁺至0.1mmol/L。反应液用磁力搅拌，在30℃下进行，流加1mol/L的碳酸钠溶液使pH控制在7.0。反应1小时后，终止反应，用等体积乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，测定底物转化率和还原产物的ee值。转化率与ee值的分析条件参考Adv Synth Catal 2012，354，1765-1772；ApplMicrobiol Biotechnol.2007，76，237-248。结果见表1：

表1 CpKR催化羰基还原反应的结果

实施例20冻干细胞催化还原100mmol/L 6-羰基-8-氯辛酸乙酯

在含100mmol/L底物6-羰基-8-氯辛酸乙酯(22g/L)和150mmol/L葡萄糖的10mL的Tris-HCl缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中，加入0.1g如实施例12所述重组表达转化体(E.coli BL21/pET28a-CpKR_G86E/A163S-BmGDH)的冻干细胞。磁力搅拌下于30℃进行反应，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的碳酸钠溶液使pH控制在7.0。反应3小时后，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。用气相色谱法测得：底物转化率为99.4％，产物ee值为99.8％(R)。

实施例21冻干细胞催化还原1.5mol/L 6-羰-8-氯辛酸乙酯

在含1.5mol/L底物6-羰-8-氯辛酸乙酯和2.25mol/L葡萄糖的10mL的Tris-HCl缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中，加入0.3g如实施例12所述重组表达转化体(E.coli BL21/pET28a-CpKR_G86E/A163S-BmGDH)的冻干细胞。反应在磁力搅拌下于30℃水浴中进行，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的碳酸钠溶液使pH控制在7.0。反应12小时后，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。用气相色谱法测定得：底物转化率为99.9％，产物ee值为99.8％。旋转蒸发除去溶剂，获得产品2.93g，分离收率为88％。

实施例22 1-L规模整细胞还原6-羰基-8-氯辛酸乙酯

在含1mol/L的底物6-羰基-8-氯辛酸乙酯和1.5mol/L葡萄糖的1L Tris-HCl缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中，加入10g如实施例6所述重组表达转化体(E.coli BL21/pET28a-CpKR_G86E/A163S-BmGDH)的冻干细胞。反应在30℃水浴下进行，机械搅拌，通过自动电位滴定仪控制流加1mol/L的碳酸钠溶液使pH控制在7.0。反应8小时后，测得转化率99.9％，产物ee值99.8％，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂，获得产品198g，分离收率为90％。测得产物比旋光度为：＝-21.0°(c 1.0，ethanol)。

对比实施例1

将本发明所述羰基还原酶印KR不对称还原6-羰基-8-氯辛酸乙酯的反应效果与文献报道的催化效果比较。下表2总结了反应系统和催化结果的比较。

表2 CpKR催化6-羰基-8-氯辛酸乙酯反应效果与文献报道水平的比较

具体地，Olbrich等用Geotrichum candidum整细胞催化6-羰基-8-氯辛酸甲酯不对称还原生成(R)-6-羟基-8-氯辛酸甲酯，将培养的Geotrichum candidum细胞悬浮于相同发酵液体积的含有5g/L葡萄糖的缓冲液中用于反应，底物浓度仅为5g/L，反应24小时后得率仅62％，并且产物ee值仅为88％(参见US 7135328 B2)。

Müller等利用来自Thermoanaerobium brokii的醇脱氢酶TbADH催化6-羰基-8-氯辛酸酯不对称还原生成(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯，使用甲酸脱氢酶进行辅酶再生，醇脱氢酶TbADH和甲酸脱氢酶的浓度均为4kU/L，底物浓度仅为2g/L，反应在37℃进行，生成产物(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯的光学纯度可达99.5％，但其转化率仅为85％，而且反应体系中还需要添加0.5mM辅酶和1mM二硫苏糖醇(DTT)(参见US 7157253 B2)。

Werner等利用来自Nocardia globulera的NgADH来制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯，底物浓度可达到44g/L，脱氢酶浓度为58U/mmol底物，在30℃反应24小时，底物转化率为95％，但并未公开其产物的ee值(参见WO 2007/028729 A1，2007)。

Gupta等利用一种来自Metschnikowia zobellii的氧化还原酶，在两相体系中催化反应，反应体系中加入25U/ml重组氧化还原酶MzCR，5U/ml的醇脱氢酶和0.1mM的NADP⁺，25℃下反应，可催化85g/L的底物6-羰基-8-氯辛酸酯转化为产物(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯，产物ee值为97％，反应24小时后的转化率仅为55％(参见WO 2005049816 A2)。

陈睿杰等用300g/L的Rhodococcus baikonurensis静息细胞和60kU/L葡萄糖脱氢酶粗酶液，在30℃，pH 6.0反应条件下，反应36h仅能催化浓度为300mM的6-羰基-8-氯辛酸乙酯转化，且产物ee值只有93％(参见CN103451124A)。

如本发明各实施例所示，特别是表2所总结，本发明的技术可催化的底物浓度(例如，330g/L)远远高于现有技术所报道的最高底物浓度(85g/L)，且转换率以及产物光学纯度也非常高。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求所限定的范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 一种假丝酵母羰基还原酶及用于制备(R)-6-羟基-8-氯辛酸酯的方法

<130>

<160> 14

<170> Patent In version 3.5

<210> 1

<211> 1002

<212> DNA

<213> 近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1002)

<400> 1

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<210> 2

<211> 333

<212> PRT

<213> 近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)

<400> 2

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1 5 10 15

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305 310 315 320

Ser Val Val Asp Ala Val Lys Gln Leu Leu Asp Ala Lys

325 330

<210> 3

<211> 1002

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 羰基还原酶突变基因

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1002)

<400> 3

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Met Thr Val Phe Val Ser Gly Ala Thr Gly Phe Ile Ala Gln His Val

1 5 10 15

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Glu Lys Ser Asp Glu Glu Leu Lys Lys Ala Asn Leu Lys Trp Asp Asn

290 295 300

gcc aaa act aaa aag ctt ttg ggt ttt gag ttt att cca ctt gaa aaa 960

Ala Lys Thr Lys Lys Leu Leu Gly Phe Glu Phe Ile Pro Leu Glu Lys

305 310 315 320

tcg gta gtt gac gca gtt aaa caa ctt ctc gat gcc aag taa 1002

Ser Val Val Asp Ala Val Lys Gln Leu Leu Asp Ala Lys

325 330

<210> 4

<211> 333

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 4

Met Thr Val Phe Val Ser Gly Ala Thr Gly Phe Ile Ala Gln His Val

1 5 10 15

Val Lys Glu Leu Leu Arg Gln Gly Phe Gln Val Ile Gly Ser Val Arg

20 25 30

Thr Lys Thr Lys Gly Asp Tyr Leu Ser Lys Leu Ile Ser Ser Lys Ser

35 40 45

Phe Ser Tyr Val Val Val Pro Asp Ile Ala Ser Lys Gly Ala Phe Asp

50 55 60

Gln Val Leu Gln Asp Asn Glu Asn Ile Glu Ser Phe Ile His Thr Ala

65 70 75 80

Ser Pro Val Asp Phe Glu Val Ser Asp Ile Gln Thr Gly Leu Leu Asp

85 90 95

Pro Ala Ile Glu Gly Thr Lys Asn Val Leu Glu Ala Ile Asp Lys Phe

100 105 110

Gly Ser Asn Val Lys Ser Ile Val Val Thr Ser Ser Thr Ser Ala Val

115 120 125

Arg Asp Ser Ser Gly Asn Arg Pro Ser Asn Ser Thr Leu Glu Glu Ser

130 135 140

Ala Trp Asn Glu Ile Thr Ile Glu Gln Gly Leu Lys Ser Thr Arg Leu

145 150 155 160

Gly Tyr Ala Ala Ala Lys Thr Phe Ala Glu Lys Glu Val Trp Lys Phe

165 170 175

Ala Asn Ala His Thr Gly Phe Asn Val Thr Thr Val Asn Pro Thr Phe

180 185 190

Val Phe Gly Pro Gln Ala Tyr Glu Val Lys His Lys Glu Lys Leu Asn

195 200 205

Glu Ser Ala Glu Ile Ile Asn Lys Val Leu Asn Leu Ser Pro Asp Asp

210 215 220

Ala Ile Pro Arg Leu Thr Gly Leu Tyr Ile Asp Val Arg Asp Val Ala

225 230 235 240

Lys Ala His Val Ala Ala Val Asn His Pro Asn Gln Phe Asn Gly Gln

245 250 255

Arg Leu Leu Leu Ile Asp Ser Ala Trp Thr Asn Glu Leu Leu Ala Val

260 265 270

Ile Ile Asn Lys His Phe Pro Asn Ala Asp Ile Pro Lys Gly Ser Ile

275 280 285

Glu Lys Ser Asp Glu Glu Leu Lys Lys Ala Asn Leu Lys Trp Asp Asn

290 295 300

Ala Lys Thr Lys Lys Leu Leu Gly Phe Glu Phe Ile Pro Leu Glu Lys

305 310 315 320

Ser Val Val Asp Ala Val Lys Gln Leu Leu Asp Ala Lys

325 330

<210> 5

<211> 1002

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 羰基还原酶突变基因

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1002)

<400> 5

atg aca gta ttt gtc tca ggt gca aca ggc ttc att gct cag cac gta 48

Met Thr Val Phe Val Ser Gly Ala Thr Gly Phe Ile Ala Gln His Val

1 5 10 15

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Val Lys Glu Leu Leu Arg Gln Gly Phe Gln Val Ile Gly Ser Val Arg

20 25 30

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Thr Lys Thr Lys Gly Asp Tyr Leu Ser Lys Leu Ile Ser Ser Lys Ser

35 40 45

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Phe Ser Tyr Val Val Val Pro Asp Ile Ala Ser Lys Gly Ala Phe Asp

50 55 60

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Gln Val Leu Gln Asp Asn Glu Asn Ile Glu Ser Phe Ile His Thr Ala

65 70 75 80

agt cca gtt gat ttc gaa gtt agt gat ata caa act ggt ctt ttg gat 288

Ser Pro Val Asp Phe Glu Val Ser Asp Ile Gln Thr Gly Leu Leu Asp

85 90 95

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Pro Ala Ile Glu Gly Thr Lys Asn Val Leu Glu Ala Ile Asp Lys Phe

100 105 110

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Gly Ser Asn Val Lys Ser Ile Val Val Thr Ser Ser Thr Ser Ala Val

115 120 125

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130 135 140

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Ala Trp Asn Glu Ile Thr Ile Glu Gln Gly Leu Lys Ser Thr Arg Leu

145 150 155 160

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165 170 175

gct aat gca cac acg ggt ttc aat gtg aca acc gtc aat cca act ttt 576

Ala Asn Ala His Thr Gly Phe Asn Val Thr Thr Val Asn Pro Thr Phe

180 185 190

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195 200 205

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Glu Ser Ala Glu Ile Ile Asn Lys Val Leu Asn Leu Ser Pro Asp Asp

210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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Ile Ile Asn Lys His Phe Pro Asn Ala Asp Ile Pro Lys Gly Ser Ile

275 280 285

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Glu Lys Ser Asp Glu Glu Leu Lys Lys Ala Asn Leu Lys Trp Asp Asn

290 295 300

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Ala Lys Thr Lys Lys Leu Leu Gly Phe Glu Phe Ile Pro Leu Glu Lys

305 310 315 320

tcg gta gtt gac gca gtt aaa caa ctt ctc gat gcc aag taa 1002

Ser Val Val Asp Ala Val Lys Gln Leu Leu Asp Ala Lys

325 330

<210> 6

<211> 333

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 6

Met Thr Val Phe Val Ser Gly Ala Thr Gly Phe Ile Ala Gln His Val

1 5 10 15

Val Lys Glu Leu Leu Arg Gln Gly Phe Gln Val Ile Gly Ser Val Arg

20 25 30

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35 40 45

Phe Ser Tyr Val Val Val Pro Asp Ile Ala Ser Lys Gly Ala Phe Asp

50 55 60

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65 70 75 80

Ser Pro Val Asp Phe Glu Val Ser Asp Ile Gln Thr Gly Leu Leu Asp

85 90 95

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100 105 110

Gly Ser Asn Val Lys Ser Ile Val Val Thr Ser Ser Thr Ser Ala Val

115 120 125

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130 135 140

Ala Trp Asn Glu Ile Thr Ile Glu Gln Gly Leu Lys Ser Thr Arg Leu

145 150 155 160

Gly Tyr Ser Ala Ala Lys Thr Phe Ala Glu Lys Glu Val Trp Lys Phe

165 170 175

Ala Asn Ala His Thr Gly Phe Asn Val Thr Thr Val Asn Pro Thr Phe

180 185 190

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195 200 205

Glu Ser Ala Glu Ile Ile Asn Lys Val Leu Asn Leu Ser Pro Asp Asp

210 215 220

Ala Ile Pro Arg Leu Thr Gly Leu Tyr Ile Asp Val Arg Asp Val Ala

225 230 235 240

Lys Ala His Val Ala Ala Val Asn His Pro Asn Gln Phe Asn Gly Gln

245 250 255

Arg Leu Leu Leu Ile Asp Ser Ala Trp Thr Asn Glu Leu Leu Ala Val

260 265 270

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275 280 285

Glu Lys Ser Asp Glu Glu Leu Lys Lys Ala Asn Leu Lys Trp Asp Asn

290 295 300

Ala Lys Thr Lys Lys Leu Leu Gly Phe Glu Phe Ile Pro Leu Glu Lys

305 310 315 320

Ser Val Val Asp Ala Val Lys Gln Leu Leu Asp Ala Lys

325 330

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

ccggaattca tgacagtatt tgtctcaggt gca

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

ccgctcgagt tacttggcat cgagaagttg ttt

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

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<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

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<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

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<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

ccgctcgagt tatccgcgtc ctgcttggaa t

<210> 13

<211> 786

<212> DNA

<213> 巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(786)

<400> 13

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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225 230 235 240

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Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe

245 250 255

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Gln Ala Gly Arg Gly

260

<210> 14

<211> 261

<212> PRT

<213> 巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）

<400> 14

Met Tyr Lys Asp Leu Glu Gly Lys Val Val Val Ile Thr Gly Ser Ser

1 5 10 15

Thr Gly Leu Gly Lys Ser Met Ala Ile Arg Phe Ala Thr Glu Lys Ala

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

Ser Lys Gly Gly Met Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

165 170 175

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn

180 185 190

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195 200 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile

210 215 220

Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Ser Glu Ala Ser Tyr Val Thr

225 230 235 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe

245 250 255

Gln Ala Gly Arg Gly

260

Claims

1.一种近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)，其保藏号为CGMCC No. 9630，所述近平滑假丝酵母菌能表达羰基还原酶，其中所述羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

2.一种羰基还原酶，其中所述羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2、4或6所示。

3.一种编码羰基还原酶的基因，其中所述基因是：

(1)如SEQ ID No.1、3或5所示的核苷酸序列；

(2)氨基酸序列如SEQ ID No.2、4或6所示的蛋白质的编码基因。

4.一种重组表达载体，其中所述载体包含如权利要求3所述的基因。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其中所述载体还包含葡萄糖脱氢酶的编码基因。

6.如权利要求5所述的重组表达载体，其中所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.14所示。

7.一种重组表达转化体，其中所述转化体包含如权利要求4-6中任一项所述的重组表达载体。

8.一种羰基还原酶的制备方法，其中所述方法包括培养如权利要求1所述的近平滑假丝酵母菌或如权利要求7所述的重组表达转化体的步骤。

9.如权利要求2所述的羰基还原酶或如权利要求8所述方法制得的羰基还原酶作为催化剂在不对称还原潜手性羰基化合物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其中所述潜手性羰基化合物的浓度为1～1500mmol/L。

11.如权利要求9所述的应用，其中所述羰基还原酶的用量为8.0～800U/mmol潜手性羰基化合物。

12.如权利要求9-11中任一项所述的应用，其中所述不对称还原反应中额外添加(1)NADPH或(2)葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP⁺，并且在有添加时，

所述辅酶NADPH的添加量为0～10mmol/L，

所述葡萄糖脱氢酶的用量为0～340U/mmol潜手性羰基化合物，

所述葡萄糖的用量为0～0.3g/mmol潜手性羰基化合物，

所述辅酶NADP⁺的添加量为0～1.0mmol/L。

13.如权利要求9-11中任一项所述的应用，其中所述潜手性羰基化合物选自如下通式：

其中R₁选自，-CH₂(CH₃)₂，-2-C1-C₆H₄和-(CH₂)₂C₆H₅；R₂为-CH₃或-CH₂CH₃；R₃为-CH₂C1，-CH₂CH₃或-(CH₂)₂CH₃；R₄为-CH₃或-CH₂CH₃。

14.如权利要求13所述的应用，其中所述潜手性羰基化合物为6-羰基-8-氯辛酸乙酯。