CN117247911B - 大肠杆菌dna连接酶突变体及其在毕赤酵母中表达纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种大肠杆菌DNA连接酶突变体及其在毕赤酵母中表达纯化方法。相对于野生型大肠杆菌连接酶,大肠杆菌DNA连接酶突变体的氨基酸序列在野生型大肠杆菌连接酶的T357位发生突变。本发明大肠杆菌DNA连接酶突变体的获取方法通过设计新的编码基因,利用毕赤酵母表达纯化方法,可以获得纯化步骤快且得率高的目标产物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种大肠杆菌DNA连接酶突变体及其在毕赤酵母中表达纯化方法。
背景技术
大肠杆菌DNA连接酶是一种以NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)为辅酶,催化双链DNA中5'磷酸和3'羟基之间形成磷酸二酯键,即催化双链DNA粘性末端连接或双链DNA中的缺刻修复的DNA连接酶,但其对平末端的底物DNA无明显连接活性。
目前市场上的大肠杆菌DNA连接酶基本采用原核大肠杆菌表达系统进行重组表达,大肠杆菌胞内表达需要进行菌体裂解,同时裂解后纯化还需要进行核酸酶的去除,操作流程复杂,成本较高,得率较低。
另外,采用常规序列通过毕赤酵母分泌表达,其表达产物没有活性。
发明内容
基于此,有必要提供一种大肠杆菌DNA连接酶突变体及其在毕赤酵母中表达纯化方法,可以获得活性产物,同时提升产物得率,降低成本。
本发明采用如下技术方案:
本发明提供一种大肠杆菌DNA连接酶突变体,相对于野生型大肠杆菌连接酶,其氨基酸序列在野生型大肠杆菌连接酶的T357位发生突变:T357V,序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供编码大肠杆菌DNA连接酶突变体的核酸(核酸序列如SEQ ID NO.2所示),包含所述核酸的表达载体,以及包含上述表达载体的毕赤酵母。
本发明提供大肠杆菌DNA连接酶突变体的毕赤酵母表达纯化方法包括如下步骤:构建包含如SEQ ID NO.2所示核酸序列的毕赤酵母菌株,挑选大肠杆菌DNA连接酶突变体表达量高的阳性克隆;对所述阳性克隆进行诱导培养,离心,获得发酵上清液;对所述发酵上清液进行纯化,获得大肠杆菌DNA连接酶突变体。
在其中一些实施例中,构建包含如SEQ ID NO.2所示核酸序列的毕赤酵母菌株的步骤为:获得含核酸序列如所示的E.coli DNA ligase-pPIC9K载体;转化到毕赤酵母菌株中。
在其中一些实施例中,所述诱导培养的工艺条件为:BMGY培养基培养,BMMY培养基诱导,30℃,1%甲醇诱导表达。
在其中一些实施例中,采用Ni柱亲和层析进行洗脱纯化。优选地,洗脱流程为平衡液平衡Ni柱,洗杂液进行洗杂,然后采用洗脱缓冲液进行洗脱。
在其中一些实施例中,所述平衡缓冲液的组成为:20mM Tris,100mM KCl,10mM咪唑,10%甘油,pH 7.5;所述洗杂缓冲液的组成为:20mM Tris,100mM KCl,50mM咪唑,10%甘油,pH 7.5;所述洗脱缓冲液的组成为:20mM Tris,100mM KCl,250mM咪唑,10%甘油,pH7.5。
在其中一些实施例中,大肠杆菌DNA连接酶突变体的得率≥0.1g/L,纯度≥90%。
与现有技术相比,本发明的核心优势在于:
本发明大肠杆菌DNA连接酶突变体具有活性,且能够在毕赤酵母表达系统中进行高量表达(摇瓶培养得率在0.1g/L以上,远高于原核大肠杆菌的表达量),无需超声破碎包涵体等工序,纯化成本低。
附图说明
图1为WT E.coli DNA ligase pPICZα-A和E.coli DNA ligasepPIC9K载体的构建图谱。
图2为野生及突变型载体构建PCR鉴定结果图;其中,泳道1为D2000Plus DNALadder(ABclonal,Cat:RM19004),分子量从上往下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp;泳道2为WT-pPIC9K鉴定结果;泳道3~5为Mut1-pPIC9K鉴定结果;泳道6-8为Mut2-pPIC9K鉴定结果;泳道9~11为Mut3-pPIC9K鉴定结果。
图3为pPICZα-A、pPIC9K载体线性化的鉴定结果图;其中,泳道1为1kb DNA Ladder(ABclonal,Cat:RM19005),分子量丛上往下依次为10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp;泳道2为WT-pPICZα-A切前,泳道3~5为WT-pPICZα-A Sac I切后;泳道6为Mut-pPIC9K切前,泳道7~9为Mut1、Mut2、Mut3-pPIC9K切后;泳道10为D2000Plus DNA Ladder(ABclonal,Cat:RM19004),分子量从上往下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
图4为WT-pPICZα-A GS115诱导3天的鉴定结果图;其中编号1-12#,分别代指克隆号1-12#甲醇诱导三天后的分泌上清样品电泳检测,MK指蛋白质Marker,分子量分别为116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa、18kDa、14kDa。
图5为Mut1-pPIC9K GS115诱导3天的鉴定结果图。其中编号1-12#,分别代指克隆号1-12#甲醇诱导三天后的分泌上清样品电泳检测,MK指蛋白质Marker,分子量分别为116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa、18kDa、14kDa。
图6为Mut2-pPIC9K GS115诱导3天的鉴定结果图。其中编号1-12#,分别代指克隆号1-12#甲醇诱导三天后的分泌上清样品电泳检测,MK指蛋白质Marker,分子量分别为116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa、18kDa、14kDa。
图7为Mut3-pPIC9K GS115诱导3天的鉴定结果图。其中编号1-12#,分别代指克隆号1-12#甲醇诱导三天后的分泌上清样品电泳检测,MK指蛋白质Marker,分子量分别为116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa、18kDa、14kDa。
图8为载体线性化回收后鉴定结果;其中泳道1、7为1kb DNA Ladder(ABclonal,Cat:RM19005),泳道2、3、4分别为Mut1-pPIC9K、Mu2-pPIC9K、Mu3-pPIC9K线性化回收结果,泳道5、6为WT-pPICZα-A线性化后回收结果。
图9为Mut3-pPIC9K-GS115诱导表达3-5天电泳结果图;其中1,16号泳道为蛋白质Marker,分子量分别为116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa、18kDa、14kDa(由于SDS-PAGE胶浓度较低,下方25kDa以下条带已迁移出去),泳道2-4为1#克隆诱导3-5天的分泌上清样品,5-7号泳道为2#克隆诱导3-5天的分泌上清样品,8-10号泳道为3#克隆诱导3-5天的分泌上清样品,11-13号泳道为6#克隆诱导3-5天的分泌上清样品,14、15、17号泳道为9#克隆诱导3-5天的分泌上清样品。
图10为Ni柱亲和纯化SDS-PAGE电泳结果;其中,泳道1为蛋白质Marker,分子量分别为116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa、18kDa、14kDa;泳道2为发酵上清样品,泳道3为挂柱后流穿样品,泳道4为洗杂缓冲液洗杂样品,泳道5-12为洗脱缓冲液洗脱样品,泳道13为基质检测。
图11为Mut1、Mut 2、Mut 3表达蛋白活性测试结果;其中,泳道1为1kb DNA Ladder(ABclonal,Cat:RM19005);泳道2、3为阴性对照,即将待测样品替换为储存缓冲液;泳道4、5为阳性对照,为原核大肠杆菌表达E.coli DNA Ligase,活性为10U/μL;泳道6为阴性对照2,即BMMY培养基空白对照;泳道7、8为突变体mut1活性测试结果;泳道9、10为突变体mut2活性测试结果;泳道11、12为突变体mut3活性测试结果;泳道13为突变体mut3未换液到储存Buffer活性测试结果。
具体实施方式
本发明的技术构思在于提供一种具有活性的大肠杆菌DNA连接酶突变体及利用毕赤酵母表达该大肠杆菌DNA连接酶突变体的方法。
其中,大肠杆菌DNA连接酶突变体Mut3的氨基酸序列为:
MESIEQQLTELRTTLRHHEYLYHVMDAPEIPDAEYDRLMRELRELETKHPELITPDSPTQRVGAAPLAAFSQIRHEVPMLSLDNVFDEESFLAFNKRVQDRLKNNEKVTWCCELKLDGLAVSILYENGVLVSAATRGDGTTGEDITSNVRTIRAIPLKLHGENIPARLEVRGEVFLPQAGFEKINEDARRTGGKVFANPRNAAAGSLRQLDPRITAKRPLTFFCYGVGVLEGGELPDTHLGRLLQFKKWGLPVSDRVTLCESAEEVLAFYHKVEEDRPTLGFDIDGVVIKVNSLAQQEQLGFVARAPRWAVAFKFPAQEQMTFVRDVEFQVGRTGAITPVARLEPVHVAGVLVSNAVLHNADEIERLGLRIGDKVVIRRAGDVIPQVVNVVLSERPEDTREVVFPTHCPVCGSDVERVEGEAVARCTGGLICGAQRKESLKHFVSRRAMDVDGMGDKIIDQLVEKEYVHTPADLFKLTAGKLTGLERMGPKSAQNVVNALEKAKETTFARFLYALGIREVGEATAAGLAAYFGTLEALEAASIEELQKVPDVGIVVASHVHNFFAEESNRNVISELLAEGVHWPAPIVINAEEIDSPFAGKTVVLTGSLSQMSRDDAKARLVELGAKVAGSVSKKTDLVIAGEAAGSKLAKAQELGIEVIDEAEMLRLLGS(SEQID NO.1)。
相对于野生型大肠杆菌DNA连接酶,其T357位发生突变:T357V。
编码大肠杆菌DNA连接酶突变体Mut3的核酸序列为:ATGGAATCAATCGAACAACAACTGACAGAACTGCGAACGACGCTTCGCCATCATGAATATCTTTATCATGTGATGGATGCGCCGGAAATTCCCGACGCTGAATACGACAGGCTGATGCGCGAACTGCGCGAGCTGGAAACCAAACATCCAGAACTGATTACGCCTGATTCGCCTACTCAACGTGTAGGCGCTGCGCCGCTGGCGGCTTTCAGCCAGATACGCCATGAAGTACCAATGCTGTCACTGGATAACGTTTTTGATGAAGAAAGCTTTCTTGCTTTCAACAAACGTGTGCAGGACCGTCTGAAAAACAACGAGAAAGTCACCTGGTGCTGTGAGCTGAAGCTGGATGGTCTTGCCGTCAGTATTCTGTATGAAAATGGCGTTTTAGTCAGTGCCGCGACCCGTGGCGATGGCACCACCGGGGAAGATATCACGTCTAATGTGCGTACTATTCGCGCCATTCCGCTGAAGCTGCACGGAGAGAATATCCCGGCGCGTCTGGAAGTGCGTGGTGAAGTGTTCCTGCCGCAGGCGGGGTTCGAAAAGATTAACGAAGATGCGCGACGCACGGGCGGGAAAGTGTTTGCTAACCCACGTAATGCGGCAGCTGGTTCACTGCGTCAGCTTGATCCGCGTATTACAGCGAAGCGACCGCTCACTTTTTTCTGCTATGGCGTTGGTGTTCTGGAAGGTGGCGAGCTGCCGGATACTCATCTTGGCCGTTTACTGCAATTTAAAAAGTGGGGGTTGCCGGTCAGCGATCGGGTAACGCTTTGTGAATCGGCGGAAGAAGTGCTGGCGTTCTATCACAAAGTGGAAGAAGACCGCCCGACGCTGGGCTTTGATATCGACGGCGTGGTGATTAAGGTCAACTCACTGGCACAGCAGGAGCAGCTTGGCTTTGTCGCGCGTGCCCCGCGCTGGGCGGTAGCGTTTAAATTCCCGGCGCAGGAGCAGATGACCTTTGTGCGTGACGTCGAGTTTCAGGTTGGGCGTACTGGCGCGATTACGCCTGTTGCGCGTCTGGAACCTGTCCATGTTGCAGGCGTGCTGGTGAGTAACGCAGTGTTACACAATGCGGATGAAATCGAACGTCTTGGTTTACGCATTGGCGATAAAGTGGTGATTCGCCGCGCTGGCGACGTGATCCCGCAGGTGGTTAACGTCGTGCTTTCTGAACGCCCGGAAGATACCCGTGAGGTTGTATTCCCGACGCATTGTCCGGTATGTGGTTCTGACGTTGAGCGTGTGGAAGGTGAAGCGGTTGCCCGCTGTACCGGTGGCCTGATTTGCGGTGCGCAGCGTAAAGAGTCGCTGAAACACTTTGTTTCCCGCCGTGCGATGGATGTTGACGGAATGGGCGACAAAATCATCGATCAGCTGGTTGAAAAAGAATATGTCCATACTCCGGCAGATCTGTTCAAACTCACCGCAGGCAAACTGACCGGACTGGAGCGTATGGGGCCAAAATCGGCACAAAACGTGGTTAACGCGCTGGAAAAAGCGAAAGAAACCACCTTTGCTCGCTTCCTCTATGCACTTGGCATCCGTGAAGTCGGCGAGGCCACCGCAGCAGGTCTGGCGGCATATTTCGGCACGCTGGAAGCGCTGGAAGCCGCTTCGATTGAAGAGCTGCAAAAGGTGCCTGATGTTGGCATTGTCGTTGCATCCCACGTTCACAACTTCTTTGCCGAAGAAAGCAACCGCAATGTCATCAGCGAGCTGTTGGCGGAAGGTGTTCACTGGCCTGCGCCGATCGTTATCAACGCGGAAGAGATTGACAGCCCGTTTGCTGGTAAAACCGTGGTGCTTACGGGCAGCTTAAGCCAGATGTCGCGTGATGACGCTAAAGCTCGACTGGTCGAACTGGGCGCGAAAGTCGCGGGCAGCGTGTCGAAGAAAACCGATCTGGTGATAGCGGGTGAAGCTGCAGGATCTAAACTGGCGAAGGCGCAGGAACTGGGCATTGAAGTCATCGACGAAGCGGAAATGCTGCGTTTGCTGGGTAGC(SEQ ID NO.2)。
该核酸序列的5’端引入有六聚组氨酸标签CATCACCATCACCATCAC,3’端引入TAA。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明,以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下各实施例,仅用于说明本发明,但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下,所获得的其他所有实施例,都属于本发明的保护范围。在本发明实施例中,若无特殊说明,所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品;在本发明实施例中,若未具体指明,所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
编码野生型大肠杆菌DNA连接酶的核酸序列:委托武汉金开瑞合成,并要求通过无缝克隆的方式完成克隆,构建在pPICZα-A载体EcoR I/Age I酶切位点之间,WT E.coli DNAligase pPICZα-A构建图谱构建图谱参见图1。本发明所采用的引物序列如下表:
实施例1突变型E.coli DNA ligase的基因克隆
将携带有野生型大肠杆菌DNA连接酶基因的WT E.coli DNA ligasepPICZα-A质粒(构建图谱见图1中的A图)做为模板,设计如表1所示的野生型上下游引物(WT)、突变位点引物(Mut1、Mut 2、Mut 3),通过PCR扩增,获得突变后的基因片段。
其中,PCR扩增体系:
片段1:
试剂名称 | 体积 |
上游引物E.coli-WT-F | 1μL |
下游引物E.coli-Mut1-R | 1μL |
模板(WT E.coli DNA ligase pPICZα-A) | 1μL |
酶Gloria Nova HS 2X Master Mix(ABclonal、RK20717) | 25μL |
无酶水 | 22μL |
片段2:
试剂名称 | 体积 |
上游引物E.coli-Mut1-F-2 | 1μL |
下游引物E.coli-WT-R | 1μL |
模板(WT E.coli DNA ligase pPICZα-A) | 1μL |
酶Gloria Nova HS 2X Master Mix(ABclonal、RK20717) | 25μL |
无酶水 | 22μL |
扩增程序:
再通过限制性内切酶EcoRI和Age I(ABclonal市售)对E.coli DNA ligase-pPIC9K载体(购自美国Invitrogen公司,构建图谱见图1中的B图)进行双酶切,然后突变后的目的片段通过上下游引物同源臂(E.coli-WT-F、E.coli-WT-R),将片段无缝连接到pPIC9K载体上。
同源连接体系:
连接条件:50℃,30min。连接完成后,热激转化到DH5α菌株中。37℃,静置过夜培养。
菌落PCR采用通用引物α-Factor、3AOX,鉴定产物条带大小,如图2的野生及突变型载体构建PCR鉴定结果所示。在2100bp左右,大小正确,正确条带则送测。测序正确后,构建出E.coli DNA ligase-pPIC9K载体。
构建好的E.coli DNA ligase-pPIC9K、pPICZα-A载体,通过质粒抽提后,分别使用Sal I和Sac I进行载体线性化(如图3所示),然后通过乙醇沉淀后,使用无菌水溶解至500ng/μL的浓度,通过0.7%琼脂糖凝胶鉴定回收DNA效果,结果见图8所示。取10μL溶解的质粒,转化到GS115菌株中,与感受态细胞充分混匀,转移至预冷的电转杯(0.1cm间隙)中,静置10min。
通过BIORAD165-2100 MicroPulse电转仪毕赤酵母电转程序,进行电击,电击完毕后,迅速向电转杯中加入1mL预冷的1×YPDS培养基,混匀后,转移到2ml无菌EP管中。30℃静置培养1h后。分别将菌体涂布于MD、Zeocin+YPD的固体培养基上,每100μL涂布一块平板,剩余菌液暂存4℃。然后放置在30℃静置培养48h。
挑取菌斑大的菌落,进行扩增培养:取10mL容量的24孔板,每个孔中加入4mL BMGY培养基,用无菌牙签挑取单菌落与新的平板上对点,pPIC9K载体的菌落从MD平板对点到YPD+G418平板上,pPICZα-A载体继续对点到博来霉素平板,同时对点后的牙签蘸在BMGY培养基中扩增培养,30℃,220rpm,培养48h。
各孔分别取1mL培养菌液离心,收集菌体,按照酵母基因组提取试剂盒(索莱宝,Cat:D1900-100T)要求,进行基因组抽提后,并通过特异性引物扩增,插入片段大小应该在2100bp附近。选择正确的菌落,挑选12个克隆,编号为1-12#。
各孔将剩余3mL BMGY培养菌体离心后,使用2mL BMMY培养基悬浮后,加入1%甲醇,继续在30℃、220rpm条件下培养,后续每隔24h向诱导表达培养基中补加终浓度1%的甲醇,诱导72h收菌,收获上清,进行SDS-PAGE电泳,电泳结果分别如图4至7所示。
实施例2毕赤酵母菌株诱导表达及纯化
挑选实施例1中Mut3表达量较高的1#、2#、3#、6#、9#克隆号,采用20mL BMGY培养基进行扩增培养,30℃,220rpm,培养48h,然后1500g离心收菌,将菌体采用10mL BMMY培养基重悬,随后加入1%甲醇,继续在30℃、220rpm条件下培养,后续每隔24h向诱导表达培养基中补加终浓度1%的甲醇,并从72h开始,96h、120h,分别取样,进行SDS-PAGE电泳检测,结果如图9所示,通过SDS-PAGE观察,3#、6#、9#整体表达量在第5天都较高,不同克隆间没有特别明显的差异。
将诱导结束后的离心小量表达上清,采用0.22μm滤膜过滤,采用Ni柱亲和层析(博格隆Ni Bestarose FF)进行洗脱纯化。纯化步骤如下:
将9#克隆,10mL上清离心收集,加入终浓度0.1mM AEBsf(购自阿拉丁),0.22um滤膜过滤,用已过滤平衡缓冲液,将上清体积稀释到30mL左右。取1mL Ni柱亲和层析与15mL层析柱管中,水洗10mL,采用平衡缓冲液,对Ni柱进行平衡,平衡10mL(柱体积)
随后开始上样,以蠕动泵15rpm/min转速(2.5mL/mL左右)将上清液与填料结合,收集流穿,上样结束后,采用洗杂缓冲液开始洗杂,洗杂体积15mL,随后开始用3mL体积洗脱缓冲液A分批洗脱,洗脱液用G250检测颜色,至颜色不蓝后停止洗脱,共收集6管蛋白(简称“洗脱1”),换洗脱缓冲液B开始洗脱,每管3mL,洗脱两管蛋白(简称“洗脱2”)。
名称 | 成分 |
平衡缓冲液 | 20mM Tris、100mM KCl、10mM咪唑、10%甘油pH 7.5 |
洗杂缓冲液 | 20mM Tris、100mM KCl、50mM咪唑、10%甘油pH 7.5 |
洗脱缓冲液A | 20mM Tris、100mM KCl、250mM咪唑、10%甘油pH 7.5 |
洗脱缓冲液B | 20mM Tris、100mM KCl、500mM咪唑、10%甘油pH 7.5 |
将上清、流穿、洗杂、洗脱1、洗脱2、基质分别取样后,进行SDS-PAGE纯化检测,电泳检测结果如图10所示。
由图10可以看出,目的蛋白基本在洗脱缓冲液A被洗脱,目的蛋白纯度>90%,将洗脱缓冲液A洗脱的蛋白合并后,换液到储存缓冲液(10mM Tris-HCl,50mM KCl,1mM DTT,0.1mM EDTA,50%glycerol,pH7.4@25℃)中,换液后体积为9.6mL。
然后通过Bradford蛋白检测试剂盒(购自ThermoFisher Cat:23236)检测换液后蛋白浓度,其测定流程见说明书。
最终测得蛋白突变体Mut3-9#克隆浓度为0.46mg/mL。初步换算,10mL培养上清纯化后总目标蛋白为4.4mg。考虑到洗杂和洗脱缓冲液B中导致的蛋白损失,预计其发酵上清的表达量在5mg/10mL以上,换算后为0.5g/L。
另外两个突变体蛋白的表达纯化流程同上,不在额外做重复描述。
另外,针对Mut 2-2#克隆发酵后,10mL培养上清纯化后总目标蛋白突变体mut 2为2.7mg;
针对Mut 1-3#克隆发酵后,10mL培养上清纯化后总目标蛋白突变体mut为3.5mg。
实施例3目的蛋白的活性测试
将实施例2制备的目的蛋白酶为样品,通过λDNA(Hind III酶切,具有5’粘性末端)测定酶的活性。
活性单位(U)指6μgλDNA(经HindIII酶切,具有5’粘性末端)在20μL体系的1XE.coli DNA Ligase Reaction Buffer中,16℃反应30min,连接50% DNA 片段所需的酶量。
测试原理,通过E.coli DNA Ligase催化双链DNA粘性末端连接或双链DNA中的缺刻修复的功能,修复经HindIII酶切后的λDNA,使其条带连接正常。
具体方法步骤为:
采用20μL连接体系:其中0.5μg/μLλDNA(Hind III酶切,具有5’粘性末端,NEB,Cat:N3012L)12μL,10*E.coli DNALigase Reaction Buffer 2μL,无酶无菌水5μL,表达纯化后的待测酶(分别为Mut1、Mut2、Mut3表达纯化后蛋白)样品1μL。于PCR仪中,16℃反应30min,然后65℃变性20min,进行0.7%琼脂糖凝胶电泳检测,观察连接情况,判定酶活。
结果如图11所示,大肠杆菌DNA连接酶突变体Mut 3具有活性效应,与阳性对照活性相当,野生型序列未显示出活性。
根据酶活测定结果发现:大肠杆菌DNA连接酶突变体Mut 3具有功能活性,且综合SDS-PAGE分析发现表达量较高。
在此有必要指出的是,以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明,并不是对本发明的技术方案的进一步的限制,本发明的方法仅为较佳的实施方案,并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种大肠杆菌DNA连接酶突变体,其特征在于,相对于野生型大肠杆菌连接酶,所述大肠杆菌DNA连接酶突变体氨基酸序列在野生型大肠杆菌连接酶的T357位发生突变:T357V,所述大肠杆菌DNA连接酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述大肠杆菌DNA连接酶突变体的核酸,其特征在于,核酸序列如SEQID NO.2所示。
3.包含权利要求2所述核酸的表达载体。
4.包含权利要求3所述表达载体的毕赤酵母。
5.权利要求1所述大肠杆菌DNA连接酶突变体的毕赤酵母表达纯化方法,其特征在于,包括如下步骤:
构建包含如SEQ ID NO.2所示核酸序列的毕赤酵母菌株,挑选大肠杆菌DNA连接酶突变体表达量高的阳性克隆;
对所述阳性克隆进行诱导培养,离心,获得发酵上清液;
对所述发酵上清液进行纯化,获得大肠杆菌DNA连接酶突变体。
6.根据权利要求5所述大肠杆菌DNA连接酶突变体的毕赤酵母表达纯化方法,其特征在于,所述诱导培养的工艺条件为:BMGY培养基培养,BMMY培养基诱导,30℃,1%甲醇诱导表达。
7.根据权利要求5所述大肠杆菌DNA连接酶突变体的毕赤酵母表达纯化方法,其特征在于,采用Ni柱亲和层析进行洗脱纯化。
8.根据权利要求7所述大肠杆菌DNA连接酶突变体的毕赤酵母表达纯化方法,其特征在于,洗脱流程为:平衡缓冲液稀释发酵上清,再采用平衡缓冲液平衡填料,洗杂缓冲液进行杂带去除,洗脱缓冲液进行目的蛋白洗脱。
9.根据权利要求8所述大肠杆菌DNA连接酶突变体的毕赤酵母表达纯化方法,其特征在于,
所述平衡缓冲液的组成为:20mM Tris,100mM KCl,10mM咪唑,10%甘油,pH 7.5;
所述洗杂缓冲液的组成为:20mM Tris,100mM KCl,50mM咪唑,10%甘油,pH 7.5;
所述洗脱缓冲液的组成为:20mM Tris,100mM KCl,250mM咪唑,10%甘油,pH 7.5。
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