CN117247911A - 大肠杆菌dna连接酶突变体及其在毕赤酵母中表达纯化方法 - Google Patents

大肠杆菌dna连接酶突变体及其在毕赤酵母中表达纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种大肠杆菌DNA连接酶突变体及其在毕赤酵母中表达纯化方法。相对于野生型大肠杆菌连接酶，大肠杆菌DNA连接酶突变体的氨基酸序列在野生型大肠杆菌连接酶的T357位发生突变。本发明大肠杆菌DNA连接酶突变体的获取方法通过设计新的编码基因，利用毕赤酵母表达纯化方法，可以获得纯化步骤快且得率高的目标产物。

Description

大肠杆菌DNA连接酶突变体及其在毕赤酵母中表达纯化方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌DNA连接酶突变体及其在毕赤酵母中表达纯化方法。
背景技术
大肠杆菌DNA连接酶是一种以NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)为辅酶，催化双链DNA中5'磷酸和3'羟基之间形成磷酸二酯键，即催化双链DNA粘性末端连接或双链DNA中的缺刻修复的DNA连接酶，但其对平末端的底物DNA无明显连接活性。
目前市场上的大肠杆菌DNA连接酶基本采用原核大肠杆菌表达系统进行重组表达，大肠杆菌胞内表达需要进行菌体裂解，同时裂解后纯化还需要进行核酸酶的去除，操作流程复杂，成本较高，得率较低。
另外，采用常规序列通过毕赤酵母分泌表达，其表达产物没有活性。
发明内容
基于此，有必要提供一种大肠杆菌DNA连接酶突变体及其在毕赤酵母中表达纯化方法，可以获得活性产物，同时提升产物得率，降低成本。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种大肠杆菌DNA连接酶突变体，相对于野生型大肠杆菌连接酶，其氨基酸序列在野生型大肠杆菌连接酶的T357位发生突变：T357V，序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供编码大肠杆菌DNA连接酶突变体的核酸(核酸序列如SEQ ID NO.2所示)，包含所述核酸的表达载体，以及包含上述表达载体的毕赤酵母。
本发明提供大肠杆菌DNA连接酶突变体的毕赤酵母表达纯化方法包括如下步骤：构建包含如SEQ ID NO.2所示核酸序列的毕赤酵母菌株，挑选大肠杆菌DNA连接酶突变体表达量高的阳性克隆；对所述阳性克隆进行诱导培养，离心，获得发酵上清液；对所述发酵上清液进行纯化，获得大肠杆菌DNA连接酶突变体。
在其中一些实施例中，构建包含如SEQ ID NO.2所示核酸序列的毕赤酵母菌株的步骤为：获得含核酸序列如所示的E.coli DNA ligase-pPIC9K载体；转化到毕赤酵母菌株中。
在其中一些实施例中，所述诱导培养的工艺条件为：BMGY培养基培养，BMMY培养基诱导，30℃，1％甲醇诱导表达。
在其中一些实施例中，采用Ni柱亲和层析进行洗脱纯化。优选地，洗脱流程为平衡液平衡Ni柱，洗杂液进行洗杂，然后采用洗脱缓冲液进行洗脱。
在其中一些实施例中，所述平衡缓冲液的组成为：20mM Tris，100mM KCl，10mM咪唑，10％甘油，pH 7.5；所述洗杂缓冲液的组成为：20mM Tris，100mM KCl，50mM咪唑，10％甘油，pH 7.5；所述洗脱缓冲液的组成为：20mM Tris，100mM KCl，250mM咪唑，10％甘油，pH7.5。
在其中一些实施例中，大肠杆菌DNA连接酶突变体的得率≥0.1g/L，纯度≥90％。
与现有技术相比，本发明的核心优势在于：
本发明大肠杆菌DNA连接酶突变体具有活性，且能够在毕赤酵母表达系统中进行高量表达(摇瓶培养得率在0.1g/L以上，远高于原核大肠杆菌的表达量)，无需超声破碎包涵体等工序，纯化成本低。
附图说明
图1为WT E.coli DNA ligase pPICZα-A和E.coli DNA ligasepPIC9K载体的构建图谱。
图2为野生及突变型载体构建PCR鉴定结果图；其中，泳道1为D2000Plus DNALadder(ABclonal，Cat:RM19004)，分子量从上往下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道2为WT-pPIC9K鉴定结果；泳道3～5为Mut1-pPIC9K鉴定结果；泳道6-8为Mut2-pPIC9K鉴定结果；泳道9～11为Mut3-pPIC9K鉴定结果。
图3为pPICZα-A、pPIC9K载体线性化的鉴定结果图；其中，泳道1为1kb DNA Ladder(ABclonal，Cat:RM19005)，分子量丛上往下依次为10000bp、8000bp、7000bp、6000bp、5000bp、4000bp、3000bp、2000bp、1000bp；泳道2为WT-pPICZα-A切前，泳道3～5为WT-pPICZα-A Sac I切后；泳道6为Mut-pPIC9K切前，泳道7～9为Mut1、Mut2、Mut3-pPIC9K切后；泳道10为D2000Plus DNA Ladder(ABclonal，Cat:RM19004)，分子量从上往下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
图4为WT-pPICZα-A GS115诱导3天的鉴定结果图；其中编号1-12#，分别代指克隆号1-12#甲醇诱导三天后的分泌上清样品电泳检测，MK指蛋白质Marker，分子量分别为116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa、18kDa、14kDa。
图5为Mut1-pPIC9K GS115诱导3天的鉴定结果图。其中编号1-12#，分别代指克隆号1-12#甲醇诱导三天后的分泌上清样品电泳检测，MK指蛋白质Marker，分子量分别为116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa、18kDa、14kDa。
图6为Mut2-pPIC9K GS115诱导3天的鉴定结果图。其中编号1-12#，分别代指克隆号1-12#甲醇诱导三天后的分泌上清样品电泳检测，MK指蛋白质Marker，分子量分别为116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa、18kDa、14kDa。
图7为Mut3-pPIC9K GS115诱导3天的鉴定结果图。其中编号1-12#，分别代指克隆号1-12#甲醇诱导三天后的分泌上清样品电泳检测，MK指蛋白质Marker，分子量分别为116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa、18kDa、14kDa。
图8为载体线性化回收后鉴定结果；其中泳道1、7为1kb DNA Ladder(ABclonal,Cat:RM19005)，泳道2、3、4分别为Mut1-pPIC9K、Mu2-pPIC9K、Mu3-pPIC9K线性化回收结果，泳道5、6为WT-pPICZα-A线性化后回收结果。
图9为Mut3-pPIC9K-GS115诱导表达3-5天电泳结果图；其中1，16号泳道为蛋白质Marker，分子量分别为116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa、18kDa、14kDa(由于SDS-PAGE胶浓度较低，下方25kDa以下条带已迁移出去)，泳道2-4为1#克隆诱导3-5天的分泌上清样品，5-7号泳道为2#克隆诱导3-5天的分泌上清样品，8-10号泳道为3#克隆诱导3-5天的分泌上清样品，11-13号泳道为6#克隆诱导3-5天的分泌上清样品，14、15、17号泳道为9#克隆诱导3-5天的分泌上清样品。
图10为Ni柱亲和纯化SDS-PAGE电泳结果；其中，泳道1为蛋白质Marker，分子量分别为116kDa、66kDa、45kDa、35kDa、25kDa、18kDa、14kDa；泳道2为发酵上清样品，泳道3为挂柱后流穿样品，泳道4为洗杂缓冲液洗杂样品，泳道5-12为洗脱缓冲液洗脱样品，泳道13为基质检测。
图11为Mut1、Mut 2、Mut 3表达蛋白活性测试结果；其中，泳道1为1kb DNA Ladder(ABclonal,Cat:RM19005)；泳道2、3为阴性对照，即将待测样品替换为储存缓冲液；泳道4、5为阳性对照，为原核大肠杆菌表达E.coli DNALigase，活性为10U/μL；泳道6为阴性对照2，即BMMY培养基空白对照；泳道7、8为突变体mut1活性测试结果；泳道9、10为突变体mut2活性测试结果；泳道11、12为突变体mut3活性测试结果；泳道13为突变体mut3未换液到储存Buffer活性测试结果。
具体实施方式
本发明的技术构思在于提供一种具有活性的大肠杆菌DNA连接酶突变体及利用毕赤酵母表达该大肠杆菌DNA连接酶突变体的方法。
其中，大肠杆菌DNA连接酶突变体Mut3的氨基酸序列为：
MESIEQQLTELRTTLRHHEYLYHVMDAPEIPDAEYDRLMRELRELETKHPELITPDSPTQRVGAAPLAAFSQIRHEVPMLSLDNVFDEESFLAFNKRVQDRLKNNEKVTWCCELKLDGLAVSILYENGVLVSAATRGDGTTGEDITSNVRTIRAIPLKLHGENIPARLEVRGEVFLPQAGFEKINEDARRTGGKVFANPRNAAAGSLRQLDPRITAKRPLTFFCYGVGVLEGGELPDTHLGRLLQFKKWGLPVSDRVTLCESAEEVLAFYHKVEEDRPTLGFDIDGVVIKVNSLAQQEQLGFVARAPRWAVAFKFPAQEQMTFVRDVEFQVGRTGAITPVARLEPVHVAGVLVSNAVLHNADEIERLGLRIGDKVVIRRAGDVIPQVVNVVLSERPEDTREVVFPTHCPVCGSDVERVEGEAVARCTGGLICGAQRKESLKHFVSRRAMDVDGMGDKIIDQLVEKEYVHTPADLFKLTAGKLTGLERMGPKSAQNVVNALEKAKETTFARFLYALGIREVGEATAAGLAAYFGTLEALEAASIEELQKVPDVGIVVASHVHNFFAEESNRNVISELLAEGVHWPAPIVINAEEIDSPFAGKTVVLTGSLSQMSRDDAKARLVELGAKVAGSVSKKTDLVIAGEAAGSKLAKAQELGIEVIDEAEMLRLLGS(SEQID NO.1)。
相对于野生型大肠杆菌DNA连接酶，其T357位发生突变：T357V。
编码大肠杆菌DNA连接酶突变体Mut3的核酸序列为：ATGGAATCAATCGAACAACAACTGACAGAACTGCGAACGACGCTTCGCCATCATGAATATCTTTATCATGTGATGGATGCGCCGGAAATTCCCGACGCTGAATACGACAGGCTGATGCGCGAACTGCGCGAGCTGGAAACCAAACATCCAGAACTGATTACGCCTGATTCGCCTACTCAACGTGTAGGCGCTGCGCCGCTGGCGGCTTTCAGCCAGATACGCCATGAAGTACCAATGCTGTCACTGGATAACGTTTTTGATGAAGAAAGCTTTCTTGCTTTCAACAAACGTGTGCAGGACCGTCTGAAAAACAACGAGAAAGTCACCTGGTGCTGT
GAGCTGAAGCTGGATGGTCTTGCCGTCAGTATTCTGTATGAAAATGGCG
TTTTAGTCAGTGCCGCGACCCGTGGCGATGGCACCACCGGGGAAGATA
TCACGTCTAATGTGCGTACTATTCGCGCCATTCCGCTGAAGCTGCACGG
AGAGAATATCCCGGCGCGTCTGGAAGTGCGTGGTGAAGTGTTCCTGCC
GCAGGCGGGGTTCGAAAAGATTAACGAAGATGCGCGACGCACGGGCG
GGAAAGTGTTTGCTAACCCACGTAATGCGGCAGCTGGTTCACTGCGTC
AGCTTGATCCGCGTATTACAGCGAAGCGACCGCTCACTTTTTTCTGCTA
TGGCGTTGGTGTTCTGGAAGGTGGCGAGCTGCCGGATACTCATCTTGG
CCGTTTACTGCAATTTAAAAAGTGGGGGTTGCCGGTCAGCGATCGGGT
AACGCTTTGTGAATCGGCGGAAGAAGTGCTGGCGTTCTATCACAAAGT
GGAAGAAGACCGCCCGACGCTGGGCTTTGATATCGACGGCGTGGTGAT
TAAGGTCAACTCACTGGCACAGCAGGAGCAGCTTGGCTTTGTCGCGCG
TGCCCCGCGCTGGGCGGTAGCGTTTAAATTCCCGGCGCAGGAGCAGAT
GACCTTTGTGCGTGACGTCGAGTTTCAGGTTGGGCGTACTGGCGCGAT
TACGCCTGTTGCGCGTCTGGAACCTGTCCATGTTGCAGGCGTGCTGGT
GAGTAACGCAGTGTTACACAATGCGGATGAAATCGAACGTCTTGGTTT
ACGCATTGGCGATAAAGTGGTGATTCGCCGCGCTGGCGACGTGATCCC
GCAGGTGGTTAACGTCGTGCTTTCTGAACGCCCGGAAGATACCCGTGA
GGTTGTATTCCCGACGCATTGTCCGGTATGTGGTTCTGACGTTGAGCGT
GTGGAAGGTGAAGCGGTTGCCCGCTGTACCGGTGGCCTGATTTGCGGT
GCGCAGCGTAAAGAGTCGCTGAAACACTTTGTTTCCCGCCGTGCGATG
GATGTTGACGGAATGGGCGACAAAATCATCGATCAGCTGGTTGAAAAA
GAATATGTCCATACTCCGGCAGATCTGTTCAAACTCACCGCAGGCAAA
CTGACCGGACTGGAGCGTATGGGGCCAAAATCGGCACAAAACGTGGTT
AACGCGCTGGAAAAAGCGAAAGAAACCACCTTTGCTCGCTTCCTCTAT
GCACTTGGCATCCGTGAAGTCGGCGAGGCCACCGCAGCAGGTCTGGC
GGCATATTTCGGCACGCTGGAAGCGCTGGAAGCCGCTTCGATTGAAGA
GCTGCAAAAGGTGCCTGATGTTGGCATTGTCGTTGCATCCCACGTTCAC
AACTTCTTTGCCGAAGAAAGCAACCGCAATGTCATCAGCGAGCTGTTG
GCGGAAGGTGTTCACTGGCCTGCGCCGATCGTTATCAACGCGGAAGAG
ATTGACAGCCCGTTTGCTGGTAAAACCGTGGTGCTTACGGGCAGCTTA
AGCCAGATGTCGCGTGATGACGCTAAAGCTCGACTGGTCGAACTGGGC
GCGAAAGTCGCGGGCAGCGTGTCGAAGAAAACCGATCTGGTGATAGC
GGGTGAAGCTGCAGGATCTAAACTGGCGAAGGCGCAGGAACTGGGCATTGAAGTCATCGACGAAGCGGAAATGCTGCGTTTGCTGGGTAGC(SEQ ID NO.2)。
该核酸序列的5’端引入有六聚组氨酸标签CATCACCATCACCATCAC，3’端引入TAA。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
编码野生型大肠杆菌DNA连接酶的核酸序列：委托武汉金开瑞合成，并要求通过无缝克隆的方式完成克隆，构建在pPICZα-A载体EcoR I/Age I酶切位点之间，WT E.coli DNAligase pPICZα-A构建图谱构建图谱参见图1。本发明所采用的引物序列如下表：
实施例1突变型E.coli DNA ligase的基因克隆
将携带有野生型大肠杆菌DNA连接酶基因的WT E.coli DNA ligasepPICZα-A质粒(构建图谱见图1中的A图)做为模板，设计如表1所示的野生型上下游引物(WT)、突变位点引物(Mut1、Mut 2、Mut 3)，通过PCR扩增，获得突变后的基因片段。
其中,PCR扩增体系:
片段1：
试剂名称 体积
上游引物E.coli-WT-F 1μL
下游引物E.coli-Mut1-R 1μL
模板(WT E.coli DNA ligase pPICZα-A) 1μL
酶Gloria Nova HS 2X Master Mix(ABclonal、RK20717) 25μL
无酶水 22μL
片段2：
试剂名称 体积
上游引物E.coli-Mut1-F-2 1μL
下游引物E.coli-WT-R 1μL
模板(WT E.coli DNA ligase pPICZα-A) 1μL
酶Gloria Nova HS 2X Master Mix(ABclonal、RK20717) 25μL
无酶水 22μL
扩增程序：
再通过限制性内切酶EcoRI和Age I(ABclonal市售)对E.coli DNA ligase-pPIC9K载体(购自美国Invitrogen公司，构建图谱见图1中的B图)进行双酶切，然后突变后的目的片段通过上下游引物同源臂(E.coli-WT-F、E.coli-WT-R)，将片段无缝连接到pPIC9K载体上。
同源连接体系：
连接条件：50℃，30min。连接完成后，热激转化到DH5α菌株中。37℃，静置过夜培养。
菌落PCR采用通用引物α-Factor、3AOX，鉴定产物条带大小，如图2的野生及突变型载体构建PCR鉴定结果所示。在2100bp左右，大小正确，正确条带则送测。测序正确后，构建出E.coli DNA ligase-pPIC9K载体。
构建好的E.coli DNA ligase-pPIC9K、pPICZα-A载体，通过质粒抽提后，分别使用Sal I和Sac I进行载体线性化(如图3所示)，然后通过乙醇沉淀后，使用无菌水溶解至500ng/μL的浓度，通过0.7％琼脂糖凝胶鉴定回收DNA效果，结果见图8所示。取10μL溶解的质粒，转化到GS115菌株中，与感受态细胞充分混匀，转移至预冷的电转杯(0.1cm间隙)中，静置10min。
通过BIORAD165-2100 MicroPulse电转仪毕赤酵母电转程序，进行电击，电击完毕后，迅速向电转杯中加入1mL预冷的1×YPDS培养基，混匀后，转移到2ml无菌EP管中。30℃静置培养1h后。分别将菌体涂布于MD、Zeocin+YPD的固体培养基上，每100μL涂布一块平板，剩余菌液暂存4℃。然后放置在30℃静置培养48h。
挑取菌斑大的菌落，进行扩增培养：取10mL容量的24孔板，每个孔中加入4mL BMGY培养基，用无菌牙签挑取单菌落与新的平板上对点，pPIC9K载体的菌落从MD平板对点到YPD+G418平板上，pPICZα-A载体继续对点到博来霉素平板，同时对点后的牙签蘸在BMGY培养基中扩增培养，30℃，220rpm，培养48h。
各孔分别取1mL培养菌液离心，收集菌体，按照酵母基因组提取试剂盒(索莱宝，Cat:D1900-100T)要求，进行基因组抽提后，并通过特异性引物扩增，插入片段大小应该在2100bp附近。选择正确的菌落，挑选12个克隆，编号为1-12#。
各孔将剩余3mL BMGY培养菌体离心后，使用2mL BMMY培养基悬浮后，加入1％甲醇，继续在30℃、220rpm条件下培养，后续每隔24h向诱导表达培养基中补加终浓度1％的甲醇，诱导72h收菌，收获上清，进行SDS-PAGE电泳，电泳结果分别如图4至7所示。
实施例2毕赤酵母菌株诱导表达及纯化
挑选实施例1中Mut3表达量较高的1#、2#、3#、6#、9#克隆号，采用20mL BMGY培养基进行扩增培养，30℃，220rpm，培养48h，然后1500g离心收菌，将菌体采用10mL BMMY培养基重悬，随后加入1％甲醇，继续在30℃、220rpm条件下培养，后续每隔24h向诱导表达培养基中补加终浓度1％的甲醇，并从72h开始，96h、120h，分别取样，进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图9所示，通过SDS-PAGE观察，3#、6#、9#整体表达量在第5天都较高，不同克隆间没有特别明显的差异。
将诱导结束后的离心小量表达上清，采用0.22μm滤膜过滤，采用Ni柱亲和层析(博格隆Ni Bestarose FF)进行洗脱纯化。纯化步骤如下:
将9#克隆，10mL上清离心收集，加入终浓度0.1mM AEBsf(购自阿拉丁)，0.22um滤膜过滤，用已过滤平衡缓冲液，将上清体积稀释到30mL左右。取1mL Ni柱亲和层析与15mL层析柱管中，水洗10mL，采用平衡缓冲液，对Ni柱进行平衡，平衡10mL(柱体积)
随后开始上样，以蠕动泵15rpm/min转速(2.5mL/mL左右)将上清液与填料结合，收集流穿，上样结束后，采用洗杂缓冲液开始洗杂，洗杂体积15mL，随后开始用3mL体积洗脱缓冲液A分批洗脱，洗脱液用G250检测颜色，至颜色不蓝后停止洗脱，共收集6管蛋白(简称“洗脱1”)，换洗脱缓冲液B开始洗脱，每管3mL，洗脱两管蛋白(简称“洗脱2”)。
名称 成份及浓度
平衡缓冲液 20mM Tris、100mM KCl、10mM咪唑、10％甘油pH 7.5
洗杂缓冲液 20mM Tris、100mM KCl、50mM咪唑、10％甘油pH 7.5
洗脱缓冲液A 20mM Tris、100mM KCl、250mM咪唑、10％甘油pH 7.5
洗脱缓冲液B 20mM Tris、100mM KCl、500mM咪唑、10％甘油pH 7.5
将上清、流穿、洗杂、洗脱1、洗脱2、基质分别取样后，进行SDS-PAGE纯化检测，电泳检测结果如图10所示。
由图10可以看出，目的蛋白基本在洗脱缓冲液A被洗脱，目的蛋白纯度>90％，将洗脱缓冲液A洗脱的蛋白合并后，换液到储存缓冲液(10mM Tris-HCl，50mM KCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，50％glycerol，pH7.4@25℃)中，换液后体积为9.6mL。
然后通过Bradford蛋白检测试剂盒(购自ThermoFisher Cat：23236)检测换液后蛋白浓度，其测定流程见说明书。
最终测得蛋白突变体Mut3-9#克隆浓度为0.46mg/mL。初步换算，10mL培养上清纯化后总目标蛋白为4.4mg。考虑到洗杂和洗脱缓冲液B中导致的蛋白损失，预计其发酵上清的表达量在5mg/10mL以上，换算后为0.5g/L。
另外两个突变体蛋白的表达纯化流程同上，不在额外做重复描述。
另外，针对Mut 2-2#克隆发酵后，10mL培养上清纯化后总目标蛋白突变体mut 2为2.7mg；
针对Mut 1-3#克隆发酵后，10mL培养上清纯化后总目标蛋白突变体mut为3.5mg。
实施例3目的蛋白的活性测试
将实施例2制备的目的蛋白酶为样品，通过λDNA(Hind III酶切，具有5’粘性末端)测定酶的活性。
活性单位(U)指6μgλDNA(经HindIII酶切，具有5’粘性末端)在20μL体系的1XE.coli DNA Ligase Reaction Buffer中，16℃反应30min，连接50％ DNA 片段所需的酶量。
测试原理，通过E.coli DNA Ligase催化双链DNA粘性末端连接或双链DNA中的缺刻修复的功能，修复经HindIII酶切后的λDNA，使其条带连接正常。
具体方法步骤为：
采用20μL连接体系：其中0.5μg/μLλDNA(Hind III酶切，具有5’粘性末端，NEB,Cat:N3012L)12μL，10*E.coli DNA Ligase Reaction Buffer 2μL，无酶无菌水5μL，表达纯化后的待测酶(分别为Mut1、Mut2、Mut3表达纯化后蛋白)样品1μL。于PCR仪中，16℃反应30min，然后65℃变性20min，进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，观察连接情况，判定酶活。
结果如图11所示，大肠杆菌DNA连接酶突变体Mut 3具有活性效应，与阳性对照活性相当，野生型序列未显示出活性。
根据酶活测定结果发现：大肠杆菌DNA连接酶突变体Mut 3具有功能活性，且综合SDS-PAGE分析发现表达量较高。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种大肠杆菌DNA连接酶突变体，其特征在于，相对于野生型大肠杆菌连接酶，其氨基酸序列在野生型大肠杆菌连接酶的T357位发生突变：T357V，序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述大肠杆菌DNA连接酶突变体的核酸，其特征在于，核酸序列如SEQID NO.2所示。
3.包含权利要求2所述核酸的表达载体。
4.包含权利要求3所述表达载体的毕赤酵母。
5.权利要求1所述大肠杆菌DNA连接酶突变体的毕赤酵母表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
构建包含如SEQ ID NO.2所示核酸序列的毕赤酵母菌株，挑选大肠杆菌DNA连接酶突变体表达量高的阳性克隆；
对所述阳性克隆进行诱导培养，离心，获得发酵上清液；
对所述发酵上清液进行纯化，获得大肠杆菌DNA连接酶突变体。
6.根据权利要求5所述大肠杆菌DNA连接酶突变体的毕赤酵母表达纯化方法，其特征在于，所述诱导培养的工艺条件为：BMGY培养基培养，BMMY培养基诱导，30℃，1％甲醇诱导表达。
7.根据权利要求5所述大肠杆菌DNA连接酶突变体的毕赤酵母表达纯化方法，其特征在于，采用Ni柱亲和层析进行洗脱纯化。
8.根据权利要求7所述大肠杆菌DNA连接酶突变体的毕赤酵母表达纯化方法，其特征在于，洗脱流程为：平衡缓冲液稀释发酵上清，再采用平衡缓冲液平衡填料，洗杂缓冲液进行杂带去除，洗脱缓冲液进行目的蛋白洗脱。
9.根据权利要求8所述大肠杆菌DNA连接酶突变体的毕赤酵母表达纯化方法，其特征在于，
所述平衡缓冲液的组成为：20mM Tris，100mM KCl，10mM咪唑，10％甘油，pH 7.5；
所述洗杂缓冲液的组成为：20mM Tris，100mM KCl，50mM咪唑，10％甘油，pH 7.5；
所述洗脱缓冲液的组成为：20mM Tris，100mM KCl，250mM咪唑，10％甘油，pH 7.5。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000026381A2 (en) * 1998-10-30 2000-05-11 Cornell Research Foundation, Inc. High fidelity thermostable ligase and uses thereof
US20180265875A1 (en) * 2015-03-04 2018-09-20 East China University Of Science And Technology Candida carbonyl reductase and method for preparing (r)-lipoic acid precursor
CN111479923A (zh) * 2017-12-19 2020-07-31 葛兰素史克知识产权开发有限公司 用于生产寡核苷酸的新型方法
US10837009B1 (en) * 2017-12-22 2020-11-17 New England Biolabs, Inc. DNA ligase variants
CN114934026A (zh) * 2022-03-21 2022-08-23 武汉爱博泰克生物科技有限公司 具有增加的连接效率的t4 dna连接酶变体
WO2022183542A1 (zh) * 2021-03-05 2022-09-09 华熙生物科技股份有限公司 一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法
US20230037794A1 (en) * 2019-12-23 2023-02-09 The Broad Institute, Inc. Programmable dna nuclease-associated ligase and methods of use thereof
US20230212550A1 (en) * 2021-12-02 2023-07-06 Abclonal Science, Inc. T4 DNA Ligase Variants with Increased Ligation Efficiency

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000026381A2 (en) * 1998-10-30 2000-05-11 Cornell Research Foundation, Inc. High fidelity thermostable ligase and uses thereof
US20180265875A1 (en) * 2015-03-04 2018-09-20 East China University Of Science And Technology Candida carbonyl reductase and method for preparing (r)-lipoic acid precursor
CN111479923A (zh) * 2017-12-19 2020-07-31 葛兰素史克知识产权开发有限公司 用于生产寡核苷酸的新型方法
US10837009B1 (en) * 2017-12-22 2020-11-17 New England Biolabs, Inc. DNA ligase variants
US20230037794A1 (en) * 2019-12-23 2023-02-09 The Broad Institute, Inc. Programmable dna nuclease-associated ligase and methods of use thereof
WO2022183542A1 (zh) * 2021-03-05 2022-09-09 华熙生物科技股份有限公司 一种高效表达透明质酸水解酶的基因及其表达方法
US20230212550A1 (en) * 2021-12-02 2023-07-06 Abclonal Science, Inc. T4 DNA Ligase Variants with Increased Ligation Efficiency
CN114934026A (zh) * 2022-03-21 2022-08-23 武汉爱博泰克生物科技有限公司 具有增加的连接效率的t4 dna连接酶变体

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GELLERT M等: "DNA ligase mutants of Escherichia coli", 《PROC NATL ACAD SCI U S A》, vol. 67, no. 3, 30 November 1970 (1970-11-30), pages 1580 - 1587 *
JISHAN LI等: "Simultaneous identification of point mutations viaDNA ligase-mediated gold nanoparticle assembly", 《ANALYST》, vol. 7, no. 11, 1 January 2008 (2008-01-01), pages 939 - 945 *
LEIMBACH A.等: "DNA ligase", 《EMBL》, 3 May 2023 (2023-05-03), pages 0 *
PAULING C等: "Properties of a DNA ligase mutant of Escherichia coli: introduction of strand breaks in DNA", 《J GEN MICROBIOL》, vol. 94, no. 2, 30 June 1976 (1976-06-30), pages 297 - 304 *
TASKEEN, S.等: "scherichia coli strain 4A_CSF1O9 chromosome", 《GENBANK》, 24 April 2023 (2023-04-24), pages 123272 *
刘晓宇等: "游离型质粒在毕赤酵母中表达人溶菌酶的研究", 《食品与发酵工业》, vol. 47, no. 22, 29 April 2021 (2021-04-29), pages 70 - 75 *
陈少欣等: "毕赤酵母甲酸脱氢酶在大肠杆菌中的高表达及纯化", 《微生物学通报》, vol. 34, no. 01, 27 February 2007 (2007-02-27), pages 15 - 18 *
陈波宏: "重组T4 DNA连接酶的发酵及纯化工艺研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》, no. 2021, 15 May 2021 (2021-05-15), pages 006 - 113 *

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