CN113073057A - 耐高温毕赤酵母菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及耐高温毕赤酵母菌株。具体地，本发明涉及突变的耐热巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）菌株，其在28‑34ºC，特别是34ºC的发酵温度下相对于未突变的菌株的外源蛋白生长速度和/或生产能力提高。本发明还涉及所述菌株的各种用途。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，更具体涉及突变的耐热巴斯德毕赤酵母菌株和用该菌株得到的重组菌株、生物催化剂等，以及用该菌株生产外源蛋白的方法。
背景技术
随着基因操作技术的日臻成熟，生物表达系统的出现很快地迎合了世界各地科学家的需求，逐渐成为解决工业、农业以及医疗卫生等领域问题的主要手段之一。生物表达系统中尤以巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）表达系统研究最为广泛，是20世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统。该系统相较其他表达系统，弥补了大肠杆菌表达系统不易表达复杂蛋白的限制以及植物、动物细胞表达系统周期长、操作繁琐、成本高的缺点，完善了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌效率低、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷，迅速成为各国科学工作者的研究宠儿。迄今为止，已有数百多种外源蛋白在此体系中成功表达，且数量在不断增加。
由于毕赤酵母在工业微生物发酵中应用广泛，控温能耗问题使得耐高温酵母的需要越来越迫切。毕赤酵母的最适生长温度为30 ºC，发酵诱导温度在28 ºC以下，所以在工业发酵过程中需要大量的冷却水来保证酵母的正常发酵生产。利用高温酵母菌进行发酵生产可以在较高温度条件下实现菌株的正常生长与蛋白表达，从而减少生产中由于降温而产生的能耗费用。且对于耐高温酵母菌株来说，它们具有生长速度快，生产效率高、不易污染杂菌等优点。它们所合成的酶与适温同类酵母菌株产生的酶相比，高温时具有更好的酶活性。因此围绕耐高温酵母菌株的选育已经成为研究的热点。目前，耐高温酵母菌株的选育方法主要集中在自然筛选和高温驯化，也有研究者才用分子生物学手段来改造酵母菌，使耐高温酵母菌株的研究取得了显著进展。ARTP（常压室温等离子诱变技术）作为一种操作简易的新型诱变技术已被证明能快速且有效地突变酵母菌和细菌等微生物。
但是，本领域仍然需要具有在较高温度下生长速度更快，具有更高生产效率的耐高温毕赤酵母。
发明内容
本研究采用ARTP诱变和高温驯化结合的方式解决了上述问题。本发明在实验室前期改造的毕赤酵母m316H（CGMCC No. 19221）的基础上，通过ARTP诱变的方法，得到了具有良好的耐高温性能的突变毕赤酵母菌株，该菌株能够高效地表达外源基因。
具体地，本发明涉及以下方面。
一方面，本发明涉及突变的耐热巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）菌株，其在28-34 ºC的发酵温度，特别是34 ºC下相对于未突变的菌株的生长速度提高和/或外源蛋白生产能力提高。
在一个具体实施方案中，本发明的耐热巴斯德毕赤酵母菌株具有CGMCC No.18764的保藏号。
本发明的耐热巴斯德毕赤酵母菌株在高温条件进行发酵，在发酵过程不需要加入冷却水来保证酵母的正常发酵生产，因此节约了能耗。在具体实施方案中，发酵温度可以是28-34 ºC。特别是，在34 ºC的高温下，本发明的耐热巴斯德毕赤酵母菌株相对于未突变的出发菌株的蛋白产量显著提高。具体地，其在相同条件下相对于未突变的对照菌株生产的蛋白量，可以提高10%至2倍，例如，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%，110%，120%，130%，140%，150%，160%，170%，180%，190%，特别是124%。
另一方面，本发明涉及重组巴斯德毕赤酵母菌株，其通过在上述突变的耐热巴斯德毕赤酵母菌株中引入编码外源蛋白的基因而获得。在一个实施方案中，所述外源蛋白是酶，例如甘油单-二酰酯脂肪酶MDGL。
另一方面，本发明涉及生产目标蛋白的方法，包括将编码所述目标蛋白的基因引入上述突变的耐热巴斯德毕赤酵母菌株，并且培养所述菌株以产生目标蛋白。或者，包括培养上述重组巴斯德毕赤酵母菌株以产生目标蛋白。在一个实施方案中，所述外源蛋白是酶，例如甘油单-二酰酯脂肪酶MDGL。
另一方面，本发明涉及生物催化剂，其包含上述突变的耐热巴斯德毕赤酵母菌株，其中引入了编码外源酶，例如甘油单-二酰酯脂肪酶MDGL的基因。
另一方面，本发明涉及上文所述菌株生产的外源蛋白。所述外源蛋白是酶，优选甘油单-二酰酯脂肪酶MDGL。
本发明还涉及重组微生物细胞，其中引入了源自上述突变的耐热巴斯德毕赤酵母菌株的菌内成分。在获得本发明的菌株后，可以通过常规技术分离其菌内成分，并且将所述成分引入其它微生物。引入所述成分的重组微生物细胞具有本发明所述菌株的优良性能。
具体地，本发明的突变毕赤酵母菌株能够用于表达外源蛋白。在获得了本发明的突变毕赤酵母菌株后，可以将常用的表达载体引入其中，用于表达外源蛋白。例如，表达载体中可以包含启动子和终止子，在启动子和终止子之间具有多克隆位点，可以插入编码外源蛋白的基因。许多商业载体都可以用于本发明的突变毕赤酵母菌株中进行外源蛋白的表达。例如，分泌表达载体主要有：pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1、pPICZα A、pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10、pGAPZ、pGAPZa、pPIC3.5K等。
在表达非酵母来源的外源蛋白时，某些物种的密码子可能在毕赤酵母中是稀有的密码子。因此，在引入表达载体时，可以先对编码外源蛋白的基因进行适合本发明的毕赤酵母的密码子优化，从而增加表达量。
本发明的毕赤酵母可以表达多种外源蛋白，包括药用蛋白、来自植物、动物和细菌的各种酶、膜受体蛋白、含辅基的蛋白以及可用于研究晶体结构的蛋白等。本发明的表达外源酶组分的毕赤酵母还可以以全细胞作为生物催化剂。
附图说明
图1显示本发明的1#菌株以及对照菌株GS115和m316H在发酵0-72小时后的生长情况(OD600)。
图2显示实施例3中各菌株在28ºC和34ºC下产生的酶活力的比较。
图3显示28 ºC（左）及34 ºC（右）条件下本发明的1#菌与出发菌表达MDGL的蛋白电泳图。
具体实施方式
本发明以m316H菌株（CGMCC No. 19221）为出发菌株，通过ARTP诱变，并经高温筛选，获得了一株能在34 ºC生长较快并且蛋白产量提高的突变菌株——毕赤酵母FY1H菌株。
发明人用MDGL基因对FY1H菌株进行摇瓶评估，发现在28 ºC条件下发酵，MDGL酶活与出发菌株m316H相当，较GS115提高了15%。经过诱变所得的宿主菌1#，升温发酵，产量比出发菌株提高了124%，比m1-1H提高了130%，比低温下的m1-1H产量提高12%。即，本发明提供了一株能高温条件下发酵产酶性能显著提高的毕赤酵母菌株。
该毕赤酵母可以在高温条件进行发酵，降低发酵过程中的能耗，且表达的外源蛋白具有酶活高、蛋白量高等优点。
实验材料
1)实验菌株和质粒
实验菌株：GS115(购于Invitrogen公司)、m316H（于2019年12月19号保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号CGMCC No. 19221，分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris））、FY1H（于2019年10月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号 CGMCC No. 18764，分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris））、mc1-1H（于2018年10月31号保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号 CGMCCNo. 16668，分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris））。
2)培养基和溶液
YPD培养基：2%蛋白胨，1%酵母粉，1%葡萄糖
MDS筛选平板：1.34% YNB，1M 山梨醇，1%甘油，2%琼脂
YPM平板：2%蛋白胨，1%酵母粉，4%甲醇，2%琼脂
BMMY培养基：1.34% YNB（含硫酸铵），2%蛋白胨，1%酵母粉，0.1M pH6.5柠檬酸钠缓冲体系，2%甲醇
罗丹明平板：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34% YNB，2%琼脂糖，1%甘油，1%甘二酯，1%聚乙二醇。
3）序列与引物
委托上海生工合成具有以下核苷酸序列的proteaseA基因：
CGAGTTTCTCCGTATCTAATCTTTCTCGCTCCCCGTACGTTAAGAATGAAATTTCTACTTCCATTATAGAAAATAGTGTATCACTGCCAGCATCTTTTACTCACAAGCAATTAAACAAAGTAACAATGGTCTCTAAGCAATTGGAATCACCACAGGGGACCTTTATCACGTTGAATCTAGTTGAAAATTCAGTGTCCAAGTTCGGTGCAGTACACATACCACAAGGAAAAACCCCATTTGTTGTTGGTAGAGATTCATCTTGTGACTGGTTGATCAAAGAAGAAAGAATTTCCAAAATACACTGCATGATTGCCAAAAAAAGGCATCCTACTGCTAATCCTTCCATATTTGAGTCACCTGCTTTAGGGCTGGAAGATATTTGGTTACTAGATTTTAGTACAAACTCTTGCTTTGTCAATGACATTAAAATAGGCAAGAATCGCAAAACTCAAATATTTCATGGAGATGAGATATGCTTGTTCAAAGATGCCCAGAAAAAAGAGCAACTCGTTTATAGGGTTCATATTGATGATGGAACAGGCCTTTTCCAGGGAGGTGAAAGAACCCAAGCCAATTCTGATGACATTCTGGATATTGATGAGGTTGATGAAAAGTTAAGAGAACTATTGACAAGAGCCTCAAGGAAACGGCATATCACCCCTGCATTGGAAACTCCTGATAAACGTGTAAAAAGAGCTTATTTGAACAGTATTACTGATAACTCTTGATGGACCTTAAAGATGTATAATAGTAGACAGAATTCATAATGGTGAGATTAGGTAATCGTCCGGAATAGGAATAGTGGTTTGGGGCGATTAATCGCACCTGCCTTATATGGTAAGTACCTTGACCGATAAGGTGGCAACTATTTAGAACAAAGCAAGCCACCTTTCTTTATCTGTAACTCTGTCGAAGCAAGCATCTTTACTAGAGAACATCTAAACCATTTTACATTCTAGAGTTCCATTTCTCAATTACTGATAATCAATTTAAAGATGATATTTGACGGTACTACGATGTCAATTGCCATTGGTTTGCTCTCTACTCTAGGTATTGGTGCTGAAGCCAAAGTTCATTCTGCTAAGATACACAAGCATCCAGTCTCAGAAACTTTAAAAGAGGCCAATTTTGGGCAGTATGTCTCTGCTCTGGAACATAAATATGTTTCTCTGTTCAACGAACAAAATGCTTTGTCCAAGTCGAATTTTATGTCTCAGCAAGATGGTTTTGCCGTTGAAGCTTCGCATGATGCTCCACTTACAAACTATCTTAACGCTCAGTATTTTACTGAGGTATCATTAGGTACCCCTCCACAATCGTTCAAGGTGATTCTTGACACAGGATCCTCCAATTTATGGGTTCCTAGCAAAGATTGTGGATCATTAGCTTGCTTCTTGCATGCTAAGTATGACCATGATGAGTCTTCTACTTATAAGAAGAATGGTAGTAGCTTTGAAATTAGGTATGGATCCGGTTCCATGGAAGGGTATGTTTCTCAGGATGTGTTGCAAATTGGGGATTTGACCATTCCCAAAGTTGATTTTGCTGAGGCCACATCGGAGCCGGGGTTGGCCTTCGCTTTTGGCAAATTTGACGGAATTTTGGGGCTTGCTTATGATTCAATATCAGTAAATAAGATTGTTCCTCCAATTTACAAGGCTTTGGAATTAGATCTCCTTGACGAACCAAAATTTGCCTTCTACTTGGGGGATACGGACAAAGATGAATCCGATGGCGGTTTGGCCACATTTGGTGGTGTGGACAAATCTAAGTATGAAGGAAAGATCACCTGGTTGCCTGTCAGAAGAAAGGCTTACTGGGAGGTCTCTTTTGATGGTGTAGGTTTGGGATCCGAATATGCTGAATTGCAAAAAACTGGTGCAGCCATCGACACTGGAACCTCATTGATTGCTTTGCCCAGTGGCCTAGCTGAAATTCTCAATGCAGAAATTGGTGCTACCAAGGGTTGGTCTGGTCAATACGCTGTGGACTGTGACACTAGAGACTCTTTGCCAGACTTAACTTTAACCTTCGCCGGTTACAACTTTACCATTACTCCATATGACTATACTTTGGAGGTTTCTGGGTCATGTATTAGTGCTTTCACCCCCATGGCTTTCCTGAACCAATAGGTCCTTTGGCAATCATTGGTGACTCGTTCTTGAGAAAATATTACTCAGTTTATGACCTAGGCAAAGATGCAGTAGGTTTAGCCAAGTCTATTTAGGCAAGAATAAAAGTTGCTCAGCTGAACTTATTTGGTTACTTATCAGGTAGTGAAGATGTAGAGAATATATGTTTAGGTATTTTTTTTTAGTTTTTCTCCTATAACTCATCTTCAGTACGTGATTGCTTGTCAGCTACCTTGACAGGGGCGCATAAGTGATATCGTGTACTGCTCAATCAAGATTTGCCTGCTCCATTGATAAGGGTATAAGAGACCCACCTGCTCCTCTTTAAAATTCTCTCTTAACTGTTGTGAAAATCATCTTCGAAGCAAATTCGAGTTTAAATCTATGCGGTTGGTAACTAAAGGTATGTCATGGTGGTATATAGTTTTTCATTTTACCTTTTACTAATCAGTTTTACAGAAGAGGAACGTCTTTCTCAAGATCGAAATAGGACTAAATACTGGAGACGATGGGGTCCTTATTTGGGTGAAAGGCAGTGGGCTACAGTAAGGGAAGACTATTCCGATGATGGAGATGCTTGGTCTGCTTTTCCTTTTGAGCAATCTCATTTGAGAACTTATCGCTGGGGAGAGGATGGACTAGCTGGAGTCTCAGACAATCATCAACTAATTTGTTTCTCAATGGCACTGTGGAATGAGAATGATGATATTTTGAAGGAGCGATTATTTGGGGTCACTGGAGAGGCTGCAAATCATGGAGAGGATGTTAAGGAGCTTTATTATTATCTTGATAATACACCTTCTCACTCTTATATGAAATACTTTACAAATATCCACAATCGAAATTTCCTTACGAAGAATTGATTTCAGAGAACCGTAAACGTTCCAGATTAGAAAGAGAGTACGAGATTACTGACTCTGAAGTACTGAAGGATAACAGATATTTTGATGTGATCTTTGAAATGGCAAAGGACGATGAAGATGAGAATGAACTTTACTTTAGAATTACCGCTTACAACCGAGGTCCCACCCCTGCCCCTTTACATGTCGCTCCACAGGTAACCTTTAGAAATACCTGGTCCTGGGGTATAGATGAGGA（SEQ ID NO:1）。
委托上海生工合成具有以下核苷酸序列的MDGL基因：
GATGTCTCCACTTCCGAACTGGACCAGTTCGAGTTCTGGGTTCAATACGCAGCCGCCTCTTACTACGAGGCTGATTACACCGCACAGGTTGGTGATAAGCTGTCCTGCTCTAAGGGTAACTGCCCAGAAGTTGAAGCAACCGGTGCAACTGTGTCTTACGACTTCTCCGATTCCACGATCACTGACACCGCAGGTTACATCGCAGTTGATCACACCAACTCCGCAGTGGTACTGGCATTCCGTGGTTCTTACTCCGTACGTAACTGGGTTGCTGATGCTACTTTCGTCCATACCAACCCAGGTCTGTGTGATGGTTGTCTGGCTGAGCTGGGTTTCTGGTCTTCCTGGAAGCTGGTTCGTGATGATATTATCAAAGAACTGAAAGAAGTGGTGGCACAGAACCCAAACTATGAACTGGTGGTCGTGGGCCACTCCCTGGGTGCTGCTGTGGCTACTCTGGCTGCTACCGACCTGCGTGGTAAAGGTTATCCATCTGCTAAACTGTACGCTTACGCTTCCCCTCGTGTTGGCAACGCAGCCCTGGCCAAATATATCACCGCCCAGGGCAACAACTTCCGTTTCACCCACACCAATGACCCAGTACCTAAACTGCCACTGCTGTCTATGGGCTATGTACATGTTTCTCCTGAATATTGGATCACCTCTCCTAACAACGCCACTGTTTCTACCTCTGACATCAAAGTCATTGACGGCGACGTATCTTTTGACGGCAATACCGGCACGGGCCTGCCTCTGCTGACGGACTTTGAAGCCCACATTTGGTACTTTGTACAGGTTGACGCCGGCAAAGGTCCTGGCCTGCCATTCAAACGTGTTTAA（SEQ ID NO:4）。
引物pepF：CGAGTTTCTCCGTATCTAAT(SEQ ID NO:2)
引物pepR：TCCTCATCTATACCCCAGG(SEQ ID NO:3)
引物MDGL_F：GAATTCATGAGATTTCCTTCAAT（SEQ ID NO:5）
引物MDGL_R：GCGGCCGCTTAACACGTTTG（SEQ ID NO:6）。
实施例1：m316H菌株ARTP突变菌的获得
菌株m316H天然地失活了蛋白酶A基因，首先补偿该基因缺陷。委托上海生工合成毕赤酵母蛋白酶A基因，包含启动子区域及终止子区域，其序列如SEQ ID NO:1所示。
使用引物pepF：CGAGTTTCTCCGTATCTAAT(SEQ ID NO:2)和pepR：TCCTCATCTATACCCCAGG(SEQ ID NO:3)，以上述合成物(SEQ ID NO:1)为模板扩增。PCR使用Takara公司PrimeSTAR HS（DRR010A）DNA聚合酶进行，反应体系为：水33 μL，5×PrimeSTAR缓冲液10 μL，dNTP混合物（各2.5 mM）4 μL，引物各1 μL，质粒模板0.5 μL，PrimeSTAR酶0.5μL。PCR反应程序为30个循环的98 ºC 10秒，68 ºC 1.5 min。PCR产物经Axygen公司PCR产物纯化试剂盒（AP-PCR-50）纯化，然后按照毕赤酵母的标准转化方法(Shixuan Wu &Geoffrey J Letchworth, 2004)，电击转化m314H。电转物涂布到选择培养基MDS筛选平板（1.34% YNB，1M 山梨醇，1%甘油，2%琼脂），于30 ºC培养三天。使用引物pepF和pepR，使用KOD-FX酶（购于日本TOYOBO公司）按照使用说明进行菌落PCR挑选，获得pep4补偿阳性的菌m316H。经基因组测序，pep4回补有3个拷贝，2个位于基因组原pep4位置，另一个拷贝错误插入BQ9382_C2-3700基因编码区域，导致该基因失活。同样的方法对m1-1H菌株（2018年10月31号保藏于CGMCC，保藏号 CGMCC No. 16668）进行相同操作，所得菌pep4均在原位回补，拷贝数4。
将菌种m316H菌株接种至50 mL YPD（2%蛋白胨，1%酵母粉，1%葡萄糖）培养基中，30°C培养过夜，稀释菌液浓度至OD600 = 1.0。吸取500 μL菌液与10%甘油1:1混合；吸取10 μL混合后的菌株至铁片上；分别于ARTP仪器中处理0 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s。混合后稀释100倍后取100 μL涂布在YPM（2%蛋白胨，1%酵母粉，4%甲醇，2%琼脂）平板上，置于40 °C培养箱中培养4 d，挑选菌落较大的菌株。
在液体培养基中发酵复测。分别接种各毕赤酵母突变菌株在10 mL YPD培养基中培养过夜，得到各菌种子液。向BMMY（1.34% YNB（含硫酸铵），2%蛋白胨，1%酵母粉，0.1MpH6.5柠檬酸钠缓冲体系，2%甲醇）中接种上述菌种至初始OD=0.5，34℃，240 rpm摇床培养并监控OD情况。多个突变体表现出优于出发菌株以及商品菌株GS115（购于Invitrogen公司）的生长性能。见图1。
实施例2：各突变株的比较
将干酪青霉来源的单/二甘酯脂肪酶MDGL基因进行适合毕赤酵母表达的密码子优化。优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
使用引物MDGL_F：GAATTCATGAGATTTCCTTCAAT（SEQ ID NO:5）及MDGL_R：GCGGCCGCTTAACACGTTTG（SEQ ID NO:6），扩增MDGL的成熟肽部分。PCR使用Takara公司PrimeSTAR HS（DRR010A）DNA聚合酶进行，反应体系为：水33 μL，5×PrimeSTAR缓冲液10 μL，dNTP混合物（各2.5 mM）4 μL，引物各1 μL，质粒模板0.5 μL，PrimeSTAR酶0.5 μL。PCR反应程序为30个循环的98 ºC 10秒，68 ºC 1 min。PCR产物经Axygen公司PCR产物纯化试剂盒（AP-PCR-50）纯化。使用NEB公司EcoRI和NotI限制性内切酶酶切，并再次经过Axygen公司PCR产物纯化试剂盒纯化。同时使用相同的限制性内切酶酶切pPIC 9K质粒，酶切物同样进行纯化。使用Fermentas公司T4 DNA连接酶，按照产品说明，将PCR产物酶切片段和pPIC9K载体酶切片段进行连接，连接物热激法转入大肠杆菌DH5α中，在含氨苄的LB平板上过夜培养。次日挑取单克隆在LB液体培养基中培养，使用Axygen公司质粒提取试剂盒提取质粒并送交上海生工测序。
将测序正确的重组表达载体用SalI限制性内切酶酶切线性化后，按照毕赤酵母的标准转化方法(Shixuan Wu & Geoffrey J Letchworth, 2004)，电击转化实施例1所得突变酵母菌株的感受态细胞，以及m316H、m1-1H、GS115三个对照菌株。电转物涂布到选择培养基MDS筛选平板（1.34% YNB，1M 山梨醇，1%甘油，2%琼脂糖），于30 ºC培养三天。挑取转化子至罗丹明平板（1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34% YNB，2%琼脂糖，1%甘油，1%甘二酯，1%聚乙二醇）上，30 ºC培养过夜，挑取具有水解圈较大的转化子。
实施例3：发酵比较
接种实施例2所得各转化子至50 mL的BMGY培养基（1.34% YNB（含硫酸铵），2%蛋白胨，1%酵母粉，0.1M pH6.5柠檬酸钠缓冲体系，1%甘油）中，28 ºC，240 rpm培养过夜，取300 OD菌体离心收集。用无菌水重悬洗涤菌体2次，然后用BMMY培养基重悬菌体。向BMMY培养基中添加2%的甲醇，分别在28 ºC、34 ºC，240 rpm诱导表达。每隔12 h向50 mL培养基中补加0.5mL甲醇。诱导3 d后，4000 rpm、4 ºC离心发酵液，取发酵液上清进行酶活测定及蛋白电泳检测。
pNPP法脂肪酶测定方法：
pNPP法脂肪酶酶活单位的定义：在温度37 ºC，pH 4.8的条件下，1 min催化底物释放出1 μmol对硝基苯酚（pNP）的酶量为1个脂肪酶活力单位（U）。
反应缓冲液的配制：
反应液（Buffer1）：0.05 M 乙酸-乙酸钠，0.4% PVA，0.1% 阿拉伯胶，pH 4.8
终止液（Buffer2）：0.2M Tris-Hcl，5% TritonX-100，pH 8.5
底物pNPP溶液（3 mg/L）：称取棕榈酸对硝基苯脂（pNPP）0.030 g，加入 10 mL异丙醇42ºC搅拌溶解，4 ºC保存。
测定具体步骤：取两支干净的离心管，其中一个做样品管，一个做空白对照管。每个离心管中加入400 μL反应缓冲液，样品管加入25 μL的待测酶液，空白管不加，两管同时放在37 ºC恒温水浴锅中反应10 min，立即加入400 μL无水乙醇终止反应，空白管加入25 μL待测酶液，405 nm测定吸光度，用空白管校正零点，检测各反应体系405 nm光吸收值的增量。测定结果如图2所示。
结果显示，在28 ºC条件下发酵，1#菌的酶活较出发菌株m316H略有提高。4#、14#以及GS115跟m316H的表现相当。它们都显著优于m1-1H。提高发酵温度到34 ºC，1#、4#、14#、17#的表达效果都比m316H有了显著的提高，1#菌最显著，提高了124%，较商品菌株GS115提高了15%。表明1#菌株在出发菌株基础上，有了显著的提高。而且，即使34 ºC下表达量比28ºC要低，1#菌在34 ºC下的表达依然优于m1-1H在28 ºC下的产量。经过诱变所得的宿主菌1#，升温发酵，产量比出发菌株提高了124%，比m1-1H提高了130%，比低温下的m1-1H产量提高12%。
对上述两个条件下的1#菌发酵物进行SDS-PAGE电泳比较：
聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：取40 μL发酵上清液与10 μL 5 X SDS loading buffer（250 mM Tris-HCL（pH=6.8），10% SDS（十二烷基硫酸钠），0.5% BPB（溴酚蓝），50%甘油，5%β-巯基乙醇）混匀后放沸水中加热5 min，取10 μL样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。电泳结果如图3所示。
2个样品都有明显的目标条带，位于40-55 KDa条带之间。各泳道的目标蛋白含量与测定的MDGL活性高低一致。1#菌的目标蛋白量都超过了m316H出发菌。
将1#菌株于2019年10月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号 CGMCC No. 18764，分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）。
序列表
<110> 丰益（上海）生物技术研发中心有限公司
<120> 耐高温毕赤酵母菌株
<130> CPCH1962747N
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3230
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 毕赤酵母蛋白酶A基因
<400> 1
cgagtttctc cgtatctaat ctttctcgct ccccgtacgt taagaatgaa atttctactt 60
ccattataga aaatagtgta tcactgccag catcttttac tcacaagcaa ttaaacaaag 120
taacaatggt ctctaagcaa ttggaatcac cacaggggac ctttatcacg ttgaatctag 180
ttgaaaattc agtgtccaag ttcggtgcag tacacatacc acaaggaaaa accccatttg 240
ttgttggtag agattcatct tgtgactggt tgatcaaaga agaaagaatt tccaaaatac 300
actgcatgat tgccaaaaaa aggcatccta ctgctaatcc ttccatattt gagtcacctg 360
ctttagggct ggaagatatt tggttactag attttagtac aaactcttgc tttgtcaatg 420
acattaaaat aggcaagaat cgcaaaactc aaatatttca tggagatgag atatgcttgt 480
tcaaagatgc ccagaaaaaa gagcaactcg tttatagggt tcatattgat gatggaacag 540
gccttttcca gggaggtgaa agaacccaag ccaattctga tgacattctg gatattgatg 600
aggttgatga aaagttaaga gaactattga caagagcctc aaggaaacgg catatcaccc 660
ctgcattgga aactcctgat aaacgtgtaa aaagagctta tttgaacagt attactgata 720
actcttgatg gaccttaaag atgtataata gtagacagaa ttcataatgg tgagattagg 780
taatcgtccg gaataggaat agtggtttgg ggcgattaat cgcacctgcc ttatatggta 840
agtaccttga ccgataaggt ggcaactatt tagaacaaag caagccacct ttctttatct 900
gtaactctgt cgaagcaagc atctttacta gagaacatct aaaccatttt acattctaga 960
gttccatttc tcaattactg ataatcaatt taaagatgat atttgacggt actacgatgt 1020
caattgccat tggtttgctc tctactctag gtattggtgc tgaagccaaa gttcattctg 1080
ctaagataca caagcatcca gtctcagaaa ctttaaaaga ggccaatttt gggcagtatg 1140
tctctgctct ggaacataaa tatgtttctc tgttcaacga acaaaatgct ttgtccaagt 1200
cgaattttat gtctcagcaa gatggttttg ccgttgaagc ttcgcatgat gctccactta 1260
caaactatct taacgctcag tattttactg aggtatcatt aggtacccct ccacaatcgt 1320
tcaaggtgat tcttgacaca ggatcctcca atttatgggt tcctagcaaa gattgtggat 1380
cattagcttg cttcttgcat gctaagtatg accatgatga gtcttctact tataagaaga 1440
atggtagtag ctttgaaatt aggtatggat ccggttccat ggaagggtat gtttctcagg 1500
atgtgttgca aattggggat ttgaccattc ccaaagttga ttttgctgag gccacatcgg 1560
agccggggtt ggccttcgct tttggcaaat ttgacggaat tttggggctt gcttatgatt 1620
caatatcagt aaataagatt gttcctccaa tttacaaggc tttggaatta gatctccttg 1680
acgaaccaaa atttgccttc tacttggggg atacggacaa agatgaatcc gatggcggtt 1740
tggccacatt tggtggtgtg gacaaatcta agtatgaagg aaagatcacc tggttgcctg 1800
tcagaagaaa ggcttactgg gaggtctctt ttgatggtgt aggtttggga tccgaatatg 1860
ctgaattgca aaaaactggt gcagccatcg acactggaac ctcattgatt gctttgccca 1920
gtggcctagc tgaaattctc aatgcagaaa ttggtgctac caagggttgg tctggtcaat 1980
acgctgtgga ctgtgacact agagactctt tgccagactt aactttaacc ttcgccggtt 2040
acaactttac cattactcca tatgactata ctttggaggt ttctgggtca tgtattagtg 2100
ctttcacccc catggctttc ctgaaccaat aggtcctttg gcaatcattg gtgactcgtt 2160
cttgagaaaa tattactcag tttatgacct aggcaaagat gcagtaggtt tagccaagtc 2220
tatttaggca agaataaaag ttgctcagct gaacttattt ggttacttat caggtagtga 2280
agatgtagag aatatatgtt taggtatttt tttttagttt ttctcctata actcatcttc 2340
agtacgtgat tgcttgtcag ctaccttgac aggggcgcat aagtgatatc gtgtactgct 2400
caatcaagat ttgcctgctc cattgataag ggtataagag acccacctgc tcctctttaa 2460
aattctctct taactgttgt gaaaatcatc ttcgaagcaa attcgagttt aaatctatgc 2520
ggttggtaac taaaggtatg tcatggtggt atatagtttt tcattttacc ttttactaat 2580
cagttttaca gaagaggaac gtctttctca agatcgaaat aggactaaat actggagacg 2640
atggggtcct tatttgggtg aaaggcagtg ggctacagta agggaagact attccgatga 2700
tggagatgct tggtctgctt ttccttttga gcaatctcat ttgagaactt atcgctgggg 2760
agaggatgga ctagctggag tctcagacaa tcatcaacta atttgtttct caatggcact 2820
gtggaatgag aatgatgata ttttgaagga gcgattattt ggggtcactg gagaggctgc 2880
aaatcatgga gaggatgtta aggagcttta ttattatctt gataatacac cttctcactc 2940
ttatatgaaa tactttacaa atatccacaa tcgaaatttc cttacgaaga attgatttca 3000
gagaaccgta aacgttccag attagaaaga gagtacgaga ttactgactc tgaagtactg 3060
aaggataaca gatattttga tgtgatcttt gaaatggcaa aggacgatga agatgagaat 3120
gaactttact ttagaattac cgcttacaac cgaggtccca cccctgcccc tttacatgtc 3180
gctccacagg taacctttag aaatacctgg tcctggggta tagatgagga 3230
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物pepF
<400> 2
cgagtttctc cgtatctaat 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物pepR
<400> 3
tcctcatcta taccccagg 19
<210> 4
<211> 1107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优化的MDGL基因
<400> 4
atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctcttgaga aaagagaggc tgaagctgat gtctccactt ccgaactgga ccagttcgag 300
ttctgggttc aatacgcagc cgcctcttac tacgaggctg attacaccgc acaggttggt 360
gataagctgt cctgctctaa gggtaactgc ccagaagttg aagcaaccgg tgcaactgtg 420
tcttacgact tctccgattc cacgatcact gacaccgcag gttacatcgc agttgatcac 480
accaactccg cagtggtact ggcattccgt ggttcttact ccgtacgtaa ctgggttgct 540
gatgctactt tcgtccatac caacccaggt ctgtgtgatg gttgtctggc tgagctgggt 600
ttctggtctt cctggaagct ggttcgtgat gatattatca aagaactgaa agaagtggtg 660
gcacagaacc caaactatga actggtggtc gtgggccact ccctgggtgc tgctgtggct 720
actctggctg ctaccgacct gcgtggtaaa ggttatccat ctgctaaact gtacgcttac 780
gcttcccctc gtgttggcaa cgcagccctg gccaaatata tcaccgccca gggcaacaac 840
ttccgtttca cccacaccaa tgacccagta cctaaactgc cactgctgtc tatgggctat 900
gtacatgttt ctcctgaata ttggatcacc tctcctaaca acgccactgt ttctacctct 960
gacatcaaag tcattgacgg cgacgtatct tttgacggca ataccggcac gggcctgcct 1020
ctgctgacgg actttgaagc ccacatttgg tactttgtac aggttgacgc cggcaaaggt 1080
cctggcctgc cattcaaacg tgtttaa 1107
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物MDGL_F
<400> 5
gaattcatga gatttccttc aat 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物MDGL_R
<400> 6
gcggccgctt aacacgtttg 20
Claims (10)
1.突变的耐热巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris）菌株，其在28-34 ºC，特别是34 ºC的发酵温度下相对于未突变的菌株生长速度和/或外源蛋白生产能力提高。
2.权利要求1的耐热巴斯德毕赤酵母菌株，其保藏号为CGMCC No.18764。
3.重组巴斯德毕赤酵母菌株，其通过在权利要求1或2的菌株中引入编码外源蛋白的基因而获得。
4.权利要求3的重组巴斯德毕赤酵母菌株，其中所述外源蛋白是酶，优选甘油单-二酰酯脂肪酶MDGL。
5.生产目标蛋白的方法，包括将编码所述目标蛋白的基因引入权利要求1或2的菌株，并且培养所述菌株以产生目标蛋白，或者培养权利要求3或4的重组巴斯德毕赤酵母菌株以产生目标蛋白。
6.权利要求5的方法，其中所述目标蛋白是酶，优选甘油单-二酰酯脂肪酶MDGL。
7.生物催化剂，其包含权利要求1或2的重组巴斯德毕赤酵母菌株，所述菌株中引入了编码酶，优选甘油单-二酰酯脂肪酶MDGL的基因。
8.由权利要求1-4的任一项的菌株生产的外源蛋白。
9.权利要求8的方法，其中所述外源蛋白是酶，优选甘油单-二酰酯脂肪酶MDGL。
10.重组微生物细胞，其中引入了源自权利要求1或2的菌株的菌内成分。
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