CN111378586B

CN111378586B - 用于表达外源基因的毕赤酵母突变株

Info

Publication number: CN111378586B
Application number: CN201811619605.3A
Authority: CN
Inventors: 曹海生; 戴小军; 吴伟
Original assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Current assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Priority date: 2018-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: CN111378586A

Abstract

本发明提供保藏编号为CGMCC No.16668的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。本发明的菌株可用于构建表达外源基因的毕赤酵母菌，构建得到的毕赤酵母菌是有效的外源表达通用宿主，可高效表达各种蛋白，尤其是磷脂酶和脂肪酶。

Description

用于表达外源基因的毕赤酵母突变株

技术领域

本发明涉及用于表达外源基因的毕赤酵母突变株。

背景技术

巴斯德毕赤酵母表达系统是20世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统。由于它既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统所不具有的外源蛋白的翻译后修饰等特点，如糖基化、蛋白磷酸化等。同时它还避免了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷，所以该表达系统很快成为目前最优秀、应用最为广泛的外源基因表达系统之一。

Koichi Ogata等人于1969年首次发现了某些酵母可以利用甲醇为唯一碳源和能源生长(Ogata,et a1.1969)，此后，用甲醇利用型酵母生产单细胞蛋白作为动物饲料的潜力就引起了广泛关注。1987年，Cregg等人首次报道了用甲醇营养型酵母表达乙型肝炎表面抗原(HbsAg)，随后Philip Petroleum公司与Salk Institute Biotechnology/IndustrialAssociates(SIBIA)就开始了毕赤酵母表达系统的合作开发。SIBIA的研究人员分离了AOX基因的启动子和宿主菌株，构建了载体，并开发出了相应的毕赤酵母基因操作技术，结合Philip Petroleum公司生产单细胞蛋白的发酵工艺，实现了外源蛋白的高效表达。1993年，Philip Petroleum公司将毕赤酵母表达系统的专利卖给Research CorporationTechnologies(RCT)公司。

RCT公司的基础菌株GS115来自化学法诱变原始菌NRRL-Y 11430(ATCC 76273)，使之成为组氨酸营养缺陷型宿主(His-)，便于进行克隆筛选。GS115醇氧化酶基因AOX1完整，已经能够很好地利用甲醇表达大多数外源蛋白，但其本底AOX1依然会高效表达，因而某些基因的产量受到影响。后续毕赤酵母衍生菌株方向之一就是在GS115基础上将AOX1基因敲除，替换成酿酒酵母ARG4基因，得到KM71(his4 arg4 aox1Δ::ARG4)，其AOX2基因保持完整，因此甲醇利用率很低，在甲醇唯一碳源的培养下生长很慢。进一步敲除AOX2基因，得到了无法利用甲醇的宿主MC100-3(his4 arg4 aox1Δ::SARG4 aox2Δ::Phis4)。在GS115基础上改造的另一个方向是失活宿主蛋白酶。敲除毕赤酵母液泡蛋白酶B(Proteinase B，prb1)，得到SMD1165(his4 prb1)。或敲除液泡天冬氨酸蛋白酶(PEP4)得到SMD1168(his4pep4)，该蛋白酶用于激活其他液泡蛋白酶，包括羧肽酶Y(carboxypeptidase Y)和蛋白酶B。然后在SMD1168基础上进一步敲除液泡蛋白酶B(Proteinase B，prb1)，得到SMD1163(his4 pep4 prb1)。即PEP4蛋白酶比较关键，用于一些蛋白酶的活化，必要时可进一步敲除液泡蛋白酶prb1和羧肽酶。

发明内容

本发明改造毕赤酵母CICC32806，得到可以高效外源表达各种蛋白，尤其是磷脂酶、脂肪酶的毕赤酵母菌。

具体而言，本发明提供保藏编号为CGMCC No.16668的巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)菌株。

本发明提供一种基因工程化的毕赤酵母菌株，该菌株为经基因工程改造而含有外源基因或该外源基因的载体的保藏编号为CGMCC No.16668的巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)菌株。

在一个或多个实施方案中，所述菌株的基因组中整合了所述外源基因。

在一个或多个实施方案中，所述外源基因为工业、饲料或食品领域中用到的蛋白的编码序列。

在一个或多个实施方案中，所述外源基因为酶的编码序列。

在一个或多个实施方案中，所述酶选自以下酶中的至少一种：脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、植酸酶、酯酶、果胶酶、半乳糖苷酶和磷脂酶。

在一个或多个实施方案中，所述酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、7或9所示。

在一个或多个实施方案中，所述外源基因的序列如SEQ ID NO:1、6或8所示。

本发明还提供一种培养物，所述培养物含有本文任一实施方案所述的毕赤酵母菌株和任选的培养基。

在一个或多个实施方案中，所述培养基为种子培养基或发酵培养基。

在一个或多个实施方案中，所述培养基为YPD培养基或BMMY培养基。

本发明还提供一种酶制品，所述酶制品含有本发明任一实施方案所述的其外源基因为酶的编码序列的毕赤酵母菌的发酵液或发酵所得细胞的裂解液，或所述发酵液或裂解液的浓缩物。

本发明还提供本发明所述酶制品在酯交换中的应用，其中，该酶制品含有本发明任一实施方案所述的其外源基因为脂肪酶的编码序列的毕赤酵母菌的发酵液或发酵所得细胞的裂解液，或所述发酵液或裂解液的浓缩物。

本发明还提供本发明所述酶制品在油脂脱胶中的应用，其中，该酶制品含有本发明任一实施方案所述的其外源基因为磷脂酶(尤其是磷脂酶C)的编码序列的毕赤酵母菌的发酵液或发酵所得细胞的裂解液，或所述发酵液或裂解液的浓缩物。

本发明还提供保藏编号为CGMCC No.16668的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株在构建表达外源基因的菌株中的应用。

本发明还提供一种制备用于外源基因表达的毕赤酵母菌株的方法，所述方法包括：

(1)对毕赤酵母进行诱变，筛选获得尿嘧啶营养缺陷型突变子；

(2)敲除步骤(1)获得的尿嘧啶营养缺陷型突变子中的HIS4基因，筛选获得组氨酸缺陷型突变子；

(3)在步骤(2)获得的组氨酸缺陷型突变子中敲入外源基因，筛选获得表达该外源基因的突变子；

(4)对步骤(3)获得的突变子实施诱变，筛选获得步骤(3)中敲入的外源基因未发生突变、但相对而言该外源基因表达量较高或其表达产物活性较高的突变子；和

(5)对步骤(4)获得的突变子再次实施诱变，筛选获得步骤(3)中敲入的外源基因未发生突变、但相对而言该外源基因表达量较高或其表达产物活性较高的突变子；和

(6)敲除步骤(5)获得的突变子中步骤(3)敲入的选择基因及HIS4基因，筛选获得组氨酸缺陷型突变子；

从而制备用于外源基因表达的毕赤酵母菌株。

附图说明

图1：m314-SPLC表达PLC的PLC酶活对比图。

图2：m314-SPLC表达PLC的对比蛋白电泳图。

图3：mc1-1-SPLC表达PLC的酶活对比图。

图4：mc1-1-SPLC表达PLC的对比蛋白电泳图。

图5：mc1-1H表达PLC的酶活对比图。

图6：mc1-1H表达PLC的对比蛋白电泳图。

图7：mc1-1H表达RML的RML酶活对比图。

图8：mc1-1H表达RML的对比蛋白电泳图。

具体实施方式

应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

本发明通过对毕赤酵母进行诱变，然后筛选出营养缺陷型突变子，从而制备得到用于外源基因表达的毕赤酵母菌株。具体而言，本发明以购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(简称CICC)的CICC32806为初始菌株，经过紫外诱变后，筛选获得尿嘧啶营养缺陷型菌株U7。再通过基因敲除的方式，将U7菌株中的HIS4基因进行失活，获得了组氨酸营养缺陷型菌株7H3。然后在7H3中转入PLC编码序列，筛选获得重组毕赤酵母7H3-SPLC。本发明进一步对7H3-SPLC实施诱变，筛选得到突变子m314-SPLC。进一步对m314-SPLC实施诱变，筛选得到水解性能增强的突变子mc1-1-SPLC；然后敲除PLC基因和组氨酸脱氢酶基因(HIS4)，获得了mc1-1H菌株。

本发明中，诱变可以是物理诱变或化学诱变。物理诱变包括紫外诱变，如将毕赤酵母菌株置于紫外光下一段时间，例如60～120秒。化学诱变包括使毕赤酵母菌株与化学诱变剂如亚硝基胍接触一段时间，例如15～60分钟。

利用含有尿嘧啶和5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基，如含YNB(无氨基酵母氮源)的培养基培养诱变的菌株，可筛选获得尿嘧啶缺陷型菌株。例如，在某些实施方案中，可将诱变的菌株培养于含有YNB、甘油、琼脂糖、尿嘧啶和5-氟乳清酸的培养基上，25-33℃避光培养3-8天，然后挑出在该培养基中长出来的单菌落，转接到含YNB和尿嘧啶的培养基(如含有YNB、甘油、琼脂糖和尿嘧啶)上，挑取只能在此培养基上生长的菌株，即可获得尿嘧啶缺陷型菌株。这些培养基中，YNB的浓度可为10-20g/L，甘油含量可为0.5-2％，琼脂糖含量可为1-3％，尿嘧啶浓度可为30-100μg/mL；含有时，5-FOA浓度可为0.5-1.2mg/mL。

在某些实施方案中，本发明以保藏编号为CICC32806的毕赤酵母为初始菌株进行诱变。因此，在这些实施方案中，所述尿嘧啶缺陷型菌株是保藏编号为CICC32806的毕赤酵母经诱变和尿嘧啶营养缺陷型筛选后获得的菌株。

获得的尿嘧啶缺陷型菌株可经基因敲除法敲除其HIS4基因，并在含有组氨酸的培养基中进行筛选，筛选出能在含组氨酸的培养基中生长的菌株，即为组氨酸缺陷型菌株。通常，使转入了组氨酸敲除载体的尿嘧啶缺陷型菌株在含有组氨酸(如10-50微克/mL)的MDS筛选平板中培养，将获得的单菌落分别接种到含YNB的培养基和含YNB及组氨酸的培养基中，通过对比可找出在含组氨酸的培养中能生长但在不含组氨酸的培养基中不能生长的菌株，由此可筛选获得组氨酸缺陷型菌株。

在本发明的某些实施方案中，经诱变和组氨酸营养缺陷型筛选后获得的菌株，转入了表达PLC的表达载体，并筛选得到磷脂平板上培养时水解圈较大、且转入的用于表达PLC的核酸序列(如AOX启动子、信号肽、PLC基因、转录终止子等)未发生突变的突变子7H3-SPLC。也可转入其它外源基因，只要可基于该外源基因的表达或其表达的蛋白的活性能筛选出突变后活性增强的突变子即可。

在进一步的实施方案中，可对该突变子实施进一步的物理诱变，如紫外照射，筛选出磷脂平板培养中水解圈较大、且转入该用于表达PLC的核酸序列(如AOX启动子、信号肽、PLC基因、转录终止子等)未发生突变的突变子m314-SPLC。

进一步地，可对m314-SPLC实施诱变，如物理诱变，如紫外照射，筛选出磷脂平板培养中水解圈变大、且转入该用于表达PLC的核酸序列(如AOX启动子、信号肽、PLC基因、转录终止子等)未发生突变的突变子mc1-1-SPLC。

可利用常规的技术敲除该突变子mc1-1-SPLC中先前转入的外源基因，包括PLC基因和标记基因如His基因。例如，构建AOX-His基因片段，电转突变子mc1-1-SPLC，在含组氨酸的磷脂酶筛选平板上培养，挑选出没有水解圈的转化子，分别在不含组氨酸和含有组氨酸的平板上划线，选择表型正确(在含有组氨酸的平板上生长，而在不含组氨酸的平板上不生长)的转化子，可获得本发明的菌株mc1-1H。应理解的是，在构建此菌株过程中所获得的各种突变子，如前文所述的突变子也包括在本发明的保护范围之内。

本发明的菌株mc1-1H已于2018年10月31日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)，分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，保藏编号为CGMCC No.16668。

本发明的营养缺陷型毕赤酵母，尤其是菌株mc1-1H，可作为基础菌株，用做构建含有外源基因的宿主菌株。本文中，外源基因指从外部转入宿主菌株的基因，不论该基因是来自其它物种还是本身存在于该宿主基因组中。外源基因可以是编码任何感兴趣蛋白的基因。宿主菌株中，外源基因可以整合到宿主的基因组中，也可以含于载体中的形式存在于宿主内。

本文中，感兴趣蛋白包括但不限于工业、饲料或食品等领域中用到的各种蛋白，包括但不限于各种脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、植酸酶、酯酶、果胶酶、半乳糖苷酶和磷脂酶。尤其是，在某些实施方案中，可利用本文所述的组氨酸营养缺陷型毕赤酵母构建表达外源磷脂酶C的菌株。在某些实施方案中，所述磷脂酶C的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或7所示，优选地，其编码序列如SEQ ID NO:1或6所示。或者，在某些实施方案中，可用本发明的菌株表达其氨基酸序列与SEQ ID NO:2或7相比具有一个或多个(例如10个以内)氨基酸残基突变的磷脂酶C，包括氨基酸残基的取代、插入或缺失。在某些实施方案中，可利用本文所述的组氨酸营养缺陷型毕赤酵母构建表达外源脂肪酶的菌株。在某些实施方案中，所述脂肪酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，优选地，其编码序列如SEQ ID NO:8所示。或者，在某些实施方案中，可用本发明的菌株表达其氨基酸序列与SEQ ID NO:9相比具有一个或多个(例如10个以内)氨基酸残基突变的脂肪酶，包括氨基酸残基的取代、插入或缺失。

可利用本领域常规的用于在毕赤酵母中表达外源基因的骨架载体构建适用于本发明的表达载体，用于转化本文所述的组氨酸营养缺陷型毕赤酵母。这类骨架载体包括但不限于pPIC3、pPIC9、pPIC9k、pHIL-D1、pAO804、pAO815和pPSC3K等。典型的毕赤酵母表达载体包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的启动子和转录终止子(5'AOX1和AOXTT)，它们被多克隆位点(MCS)分开，外源基因可以在此插入。这类载体还可包含组氨醇脱氢酶基因(HIS4)选择标记及3'AOX1区。当将这类载体转化毕赤酵母时，载体的5'AOX1、AOXTT、3'AOX1以及HIS4能单独或一起与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同待表达的外源基因插入到受体菌染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。本领域研究者熟知的，AOX1启动子可被替代，包括但不限于诱导型、组成型启动子。

载体的构建方法为本领域所熟知。例如，PCR扩增获得目的基因后，对PCR产物以及骨架载体进行相应的限制性内切酶酶切，利用DNA连接酶将PCR产物的酶切片段与载体的酶切片段连接，将连接物转入大肠杆菌中，在合适的培养基中培养后，利用市售的质粒提取试剂盒提取获得用于转化本文所述组氨酸营养缺陷型毕赤酵母的质粒。

毕赤酵母的转化方法也为本领域所熟知。例如，用限制性内切酶酶切构建得到的表达载体，获得线性化的载体。然后，可按照标准的转化方法(Shixuan Wu&Geoffrey JLetchworth，2004)，电击转化毕赤酵母的感受态细胞，然后涂布到合适的平板(如MDS筛选平板)上培养数日。之后再挑取转化子至合适的平板上，根据其所表达的外源蛋白的生物学活性来挑选所需的重组菌株。例如，在某些实施方案中，所述外源蛋白是磷脂酶(如磷脂酶C)，则将在磷脂平板上培养转化子。通常，磷脂平板含有1～3％YNB、1～3％磷脂和1～3％琼脂。由于磷脂酶能水解磷脂，因此，可依据水解圈的大小确定转化子表达的磷脂酶的活性。挑取水解圈相对较大的转化子，即可获得性能优异的组氨酸营养缺陷型毕赤酵母。

因此，在某些实施方案中，本发明还包括包含待表达的外源基因的组氨酸营养缺陷型毕赤酵母。该组氨酸营养缺陷型毕赤酵母可含有整合到其基因组中的外源基因，或者可含有含该外源基因的表达载体。含有该外源基因的组氨酸营养缺陷型毕赤酵母能稳定地表达所述外源基因。在某些实施方案中，所述外源基因是磷脂酶或脂肪酶的编码序列。在某些实施方案中，所述外源基因是磷脂酶C或脂肪酶的编码序列。在某些实施方案中，所述组氨酸营养缺陷型毕赤酵母转入了利用pPIC9构建的含外源基因的表达载体。在某些实施方案中，利用pPIC9构建的含外源基因的表达载体含有SEQ ID NO:1、6或8所示的核苷酸序列。

可采用本领域常规的培养基和方法培养本文的组氨酸营养缺陷型毕赤酵母。例如，培养基可以是常规的BMGY培养基。可在28～32℃、180～300rpm条件下培养。诱导外源基因表达时，可在培养液中加入一定量的甲醇，用于诱导表达。诱导表达结束后，离心发酵液，过滤上清液，即可获得含有外源基因表达的目的蛋白的发酵液。可采用常规的方法进一步浓缩该发酵液。

在某些实施方案中，发酵时，上罐初始培养基可以是基础发酵培养基，其含有硫酸钙、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、硫酸铵、乳化硅油消泡剂和甘油，并添加有PTM，即五水硫酸铜、碘化钠、一水硫酸锰、二水钼酸钠、六水氯化钴、五水氯化锌、七水硫酸亚铁、硼酸、浓硫酸和生物素。基础发酵培养基中的成分浓度或含量为本领域所熟知。例如，硫酸钙的浓度可以是0.5～1.5g/L，磷酸二氢钾的浓度可以是30～40g/L，无水硫酸镁的浓度可以是10～13g/L，硫酸铵的浓度可以是6～12g/L，乳化硅油消泡剂的浓度可以是0.1～0.5ml/L，甘油的浓度可以是30～70g/L。PTM中，五水硫酸铜的浓度可以是5～6.5g/L，碘化钠的浓度可以是60～100mg/L，一水硫酸锰的浓度可以是2.0～4.0g/L，二水钼酸钠的浓度可以是0.2～0.4g/L，六水氯化钴的浓度可以是0.4～0.6g/L，五水氯化锌的浓度可以是18～22g/L，七水硫酸亚铁的浓度可以是60～70g/L，硼酸的浓度可以是0.01～0.03g/L，浓硫酸的浓度可以是19.0～19.5ml/L，生物素的浓度可以是0.3～0.5g/L。

菌体生长阶段流加甘油、PTM、消泡剂和氨水。当发酵至一定阶段时，例如菌体生长湿重达200～220g/L时，停止甘油补料并经过一段时间的饥饿期后，加入甲醇发酵。加入甲醇发酵诱导外源基因表达可根据需要，调控发酵过程的pH、温度、溶氧和甲醇流加速率等参数。本领域研究者熟知的，毕赤酵母还可以使用组成型启动子，如GAP启动子，TEF启动子等，使用相应的启动子并使用对应的发酵条件。

可对发酵液进行离心处理或板框过滤处理去除菌体，上清进行微滤、超滤处理，并使用缓冲液置换并浓缩。进一步的，可加入适当的保护剂待完全溶解后作为酶制剂置于4℃保存。

因此，本申请也提供一种酶制品，所述酶制品含有本文任一实施方案所述的含有编码酶的外源基因的毕赤酵母菌株的发酵液或发酵所得细胞的裂解液，或所述发酵液或裂解液的浓缩物。在某些优选的实施方案中，所述毕赤酵母菌株含有利用pPIC9构建得到的含所述酶的编码序列的表达载体。在某些实施方案中，酶制剂还可含有甘油和防腐剂。防腐剂可以是常规的防腐剂，如山梨酸钾。甘油和防腐剂的量可为本领域的常规用量。例如，可加入占该酶制品重量40-70％的甘油和0.1-0.8％的山梨酸钾。在某些实施方案中，所述酶制品含有磷脂酶C或脂肪酶。

本文所述的含磷脂酶C的酶制剂可用于油脂脱胶。脱胶可采用常规的方法实施，包括将待脱胶油脂与本文所述的含磷脂酶C的酶制剂接触的步骤。例如，取毛油加热至一定的温度(如50±5℃)，加入一定量的纯水和酶液，高速剪切(如10000r/min)，然后在一定温度下搅拌(如750r/min)，反应1～5小时。最后可将反应混合物升温至80－90℃并维持一段时间，将酶灭活，离心即可获得脱胶油。

因此，本申请还提供一种脱胶方法，该方法包括将待脱胶油脂与本文所述的含磷脂酶C的酶制剂接触的步骤；以及本文所述的含磷脂酶C的酶制剂在油脂脱胶中的应用。

在某些实施方案中，本申请还涉及本文所述的含有脂肪酶的酶制品在酯交换中的应用。例如，本文提供一种酯交换方法，所述方法包括将反应底物与本发明的含脂肪酶的酶制品接触的步骤。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非限制本发明的保护范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的方法和材料。

实施例1：尿嘧啶营养缺陷型毕赤酵母32806-U7菌株的获得

将10uL CICC-32806菌种接种至10mL的YPD(2％蛋白胨，1％酵母粉，1％甘油)培养基中，30℃，240rpm培养过夜，检测菌液OD600数值，吸取200OD培养液，室温4000rpm离心后去除上清，使用无菌水洗涤菌体2次，最后重悬菌液浓度至20OD/mL，取2mL菌液均匀分散在培养皿表层，置于超净工作台紫外灯下照射90s，取100μL涂布于YNB-Uracil-FOA(13.4g/LYNB，1％甘油，2％琼脂糖，50μg/mL尿嘧啶(Uracil)，0.75mg/mL5-氟乳清酸(5-FOA))固体培养基上，30℃避光培养(全过程在红光下操作，防止回复突变)7天。将上一步在YNB-Uracil-FOA固体培养基上长出来的单菌落转接到YNB固体培养基、YNB-Uracil固体培养基上，挑取只能在YNB-Uracil固体培养基上生长的菌株，获得尿嘧啶代谢缺陷型毕赤酵母32806-U7菌株。

实施例2：组氨酸缺陷型毕赤酵母32806-7H3菌株的获得

以CICC32806的基因组为模板，HIS-A-F/R扩增HIS-A片段，HIS-B-F/R扩增HIS-B片段，URA3-1F/2R扩增URA3片段，依次连接入pSP72质粒，从而构建好组氨酸敲除载体pHISA-URA3-HISB，引物序列如下：

HIS-A-F:5'CCGCTCGAGTCACCTCAGCCAGATCAAAGT 3'(SEQ ID NO:10)；

HIS-A-R:5'ACATGCATGCCTTTGGACAACTCTTTCTGCC 3'(SEQ ID NO:11)；

HIS-B-F:5'CGGGGTACCCCTGGTTGATAAAGTTGCAT 3'(SEQ ID NO:12)；

HIS-B-R:5'GGCGAGCTCAGGTGTCTTCAAAGCGACTC 3'(SEQ ID NO:13)；

URA3-1F:ACATGCATGCCTGCAGAAATGGGGAGATAACCACC(SEQ ID NO:14)；

URA3-2R:CGGGGTACCACTAGTGGTTTTCTGGGGGTATTTGCTG(SEQ ID NO:15)。

用XhoI和SacI线性化敲除载体，通过电击法转化入32806-U7中，涂布在含有组氨酸(20μg/mL)的MDS筛选平板，将长出来的单菌落，分别转接到YNB固体培养基、YNB-HIS固体培养基上。组氨酸营养缺陷型突变子不能在YNB固体培养基上生长，但是可以在YNB-HIS固体培养基上生长。将表型正确的菌株再次在YNB固体培养基、YNB-HIS固体培养基上进行单菌落划，挑取只能在YNB-HIS固体培养基上生长的单菌落菌株。最终获得组氨酸缺陷型毕赤酵母32806-7H3菌株。

实施例3：产磷脂酶菌株7H3-PLC的构建

经过密码子优化并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成的磷脂酶PLC核苷酸序列为：

ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTTGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTGGTCAGCTGAGGACAAGCATAAGGAAGGTGTGAATAGTCACTTATGGATCGTGAACCGTGCCATTGATATAATGTCTAGGAATACAACTCTGGTTAAGCAAGATAGAGTTGCTCAATTGAATGAATGGCGTACAGAGCTAGAGAATGGCATCTACGCTGCTGATTATGAAAACCCCTATTACGATAACAGTACCTTCGCTTCTCACTTTTACGATCCAGACAACGGAAAGACATATATCCCATTCGCCAAGCAAGCTAAGGAGACTGGAGCTAAGTACTTCAAGTTGGCTGGAGAGTCATACAAGAATAAAGACATGAAGCAGGCCTTCTTTTATCTTGGGTTGTCATTGCATTATTTGGGCGATGTCAACCAACCTATGCATGCCGCAAACTTTACGAACCTGTCCTATCCACAGGGTTTTCACTCCAAGTACGAGAACTTTGTCGATACTATTAAAGACAACTACAAAGTTACCGATGGGAACGGATATTGGAATTGGAAAGGCACCAACCCTGAAGAATGGATTCACGGTGCAGCAGTAGTTGCAAAACAGGACTACTCTGGAATTGTCAATGACAATACCAAAGATTGGTTTGTGAAAGCCGCAGTCTCCCAGGAATATGCAGATAAATGGAGAGCTGAAGTTACACCTATGACTGGTAAACGACTAATGGATGCCCAAAGAGTTACTGCTGGTTACATTCAATTATGGTTCGACACTTACGGTGACAGGTAA(SEQ ID NO:1)；

该PLC的氨基酸序列为：

MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAWSAEDKHKEGVNSHLWIVNRAIDIMSRNTTLVKQDRVAQLNEWRTELENGIYAADYENPYYDNSTFASHFYDPDNGKTYIPFAKQAKETGAKYFKLAGESYKNKDMKQAFFYLGLSLHYLGDVNQPMHAANFTNLSYPQGFHSKYENFVDTIKDNYKVTDGNGYWNWKGTNPEEWIHGAAVVAKQDYSGIVNDNTKDWFVKAAVSQEYADKWRAEVTPMTGKRLMDAQRVTAGYIQLWFDTYGDR(SEQ ID NO:2)。

使用引物PLC_F：TACGTATGGTCAGCTGAGGACAAGC(SEQ ID NO:3)及PLC_R：CCTAGGTTACCTGTCACCGTAAGTGTCGAAC(SEQ ID NO:4)，扩增PLC的成熟肽部分，PCR使用Takara公司PrimeSTAR HS(DRR010A)DNA聚合酶进行，反应体系为：水33μL，5×PrimeSTAR缓冲液10μL，dNTP混合物(各2.5mM)4μL，引物各1μL，质粒模板0.5μL，PrimeSTAR酶0.5μL。PCR反应程序为30个循环的98℃10秒，68℃1min。

PCR产物经Axygen公司PCR产物纯化试剂盒纯化(AP-PCR-50)，使用NEB公司SnaBI和AvrII限制性内切酶酶切，并再次经过Axygen公司PCR产物纯化试剂盒纯化。同时使用相同的限制性内切酶酶切pPIC9K质粒，酶切物同样进行纯化。使用Fermentas公司T4 DNA连接酶，按照产品说明，将PCR产物酶切片段和pPIC9k载体酶切片段进行连接，连接物热激法转入大肠杆菌DH5α中，在含氨苄的LB平板上过夜培养。次日挑取单克隆在LB液体培养基中培养，使用Axygen公司质粒提取试剂盒提取质粒并送交上海生工测序。

将测序正确的重组表达载体用Bgl II限制性内切酶酶切线性化后，按照毕赤酵母的标准转化方法(Shixuan Wu&Geoffrey J Letchworth,2004)，电击转化毕赤酵母32806-7H3、SMD1168感受态细胞，涂布到选择培养基MDS筛选平板，于28℃培养三天。挑取转化子至磷脂平板(1％YNB，2％磷脂，2％琼脂糖，1％甘油)上，30℃培养2天，挑取具有水解圈且磷脂酶基因为单拷贝的转化子，编号7H3-SPLC和SMD1168-SPLC重组菌株。

实施例4：紫外诱变法获得m314-SPLC菌株

挑取7H3-SPLC菌落至5mL YPD培养基中，于30℃，240rpm摇床震荡培养过夜，检测菌液OD600数值；吸取重量200OD的菌液，室温4000rpm离心后去除上清，使用无菌水洗涤细胞2次，最后重悬菌液浓度至20OD/mL，取2mL菌液均匀分散在培养皿表层，置于超净工作台紫外灯下照射90s，取100μL涂布于磷脂平板上，30℃培养箱避光培养(全过程在红光下操作，防止回复突变)4天。挑取水解圈变大的突变子，使用KOD-FX酶和毕赤酵母表达测序通用5’AOX及3’AOX引物，对该突变子菌落进行PCR扩增，按照该酶的使用说明进行PCR，PCR产物送上海生工进行测序，发现人为转入酵母中的核酸部分：AOX启动子、信号肽、PLC基因、转录终止子等都未发生突变，因此该突变子的改变为菌株自身的突变，命名为m314-SPLC。

实施例5：7H3-SPLC、m314-SPLC和SMD1168-SPLC摇瓶发酵

根据实施例2和实施例3可知，7H3-SPLC、m314-SPLC和SMD1168-SPLC三个菌中所含PLC基因的氨基酸序列完全一样且拷贝数均为单拷贝。接种这三个菌至50mL的BMGY培养基中，30℃、240rpm培养过夜，取200OD菌体离心收集。用无菌水重悬洗涤菌体2次，然后用BMMY培养基重悬菌体。向BMMY培养基中添加2％的甲醇，30℃、240rpm诱导表达。每隔12h向50mL培养基中补加0.5mL甲醇。诱导3天后，8000rpm、4℃离心发酵液，取发酵液上清进行酶活测定及蛋白电泳检测。

pNPPC法磷脂酶测定方法：

pNPPC法磷脂酶酶活单位的定义：在温度为37℃，pH值7.6的条件下，1min催化底物释放出1μmol磷酸胆碱的酶量为1个磷脂酶活力单位(U)。

反应缓冲液的配制：0.1M硼酸-硼酸钠缓冲液(pH7.6)，20mM pNPPC，1％Triton-X-100，1mM CaCl₂。

测定具体步骤：取两支干净的离心管，其中一个做样品管，一个做空白对照管。每个离心管中加入600μL反应缓冲液，样品管加入25μL的待测酶液，空白管不加，两管同时放在37℃恒温水浴锅中反应15min，立即加入500μL 0.5M的氢氧化钠溶液终止反应，空白管加入25μL待测酶液，405nm测定吸光度，用空白管校正零点。

酶活测定结果如图1所示。结果显示，m314-SPLC磷脂酶酶活比出发菌株7H3-SPLC提高了127％，比SMD1168-SPLC提高了152％。

聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：使用0.22μm滤膜过滤处理上清液，将等量上清液使用Milipore 10KDa超滤浓缩罐浓缩到相同体积后，取相同体积的浓缩酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

电泳结果如图2所示。结果显示，3个泳道都有明显的目标条带，位于35-40KDa条带之间。各泳道的目标蛋白含量与测定的磷脂酶活性高低一致。

因此，经过紫外诱变获得的m314-SPLC菌株的蛋白表达能力比诱变前提高了127％。

实施例6：紫外诱变法获得mc1-1-SPLC菌株

挑取m314-SPLC菌落至5mL YPD培养基中，于30℃，240rpm摇床震荡培养过夜，检测菌液OD600数值；吸取200OD的菌液，室温4000rpm离心后去除上清，使用无菌水洗涤细胞2次，最后重悬菌液浓度至20OD/mL，取2mL菌液均匀分散在培养皿表层，置于超净工作台紫外灯下照射90s，取100μL涂布于磷脂平板上，30℃培养箱避光培养(全过程在红光下操作，防止回复突变)4天。挑取水解圈变大的突变子，使用KOD-FX酶和毕赤酵母表达测序通用5’AOX及3’AOX引物，对该突变子菌落进行PCR扩增，按照该酶的使用说明进行PCR，PCR产物送上海生工进行测序，发现人为转入酵母中的核酸部分：AOX启动子、信号肽、PLC基因、转录终止子等都未发生突变，因此该突变子的改变为菌株自身的突变，命名为mc1-1-SPLC。

实施例7：m314-SPLC和mc1-1-SPLC摇瓶发酵

接种m314-SPLC和mc1-1-SPLC至50mL的BMGY培养基中，30℃，240rpm培养过夜，取300OD菌体离心收集。用无菌水重悬洗涤菌体2次，然后用BMMY培养基重悬菌体。向BMMY培养基中添加2％的甲醇，30℃，240rpm诱导表达。每隔12h向50mL培养基中补加0.5mL甲醇。诱导3d后，8000rpm、4℃离心发酵液，取发酵液上清进行酶活测定及蛋白电泳检测。

pNPPC法磷脂酶测定方法：

酶活测定结果如图3所示。结果显示，mc1-1-SPLC磷脂酶酶活比出发菌株m314-SPLC提高了53％。

电泳结果如图4所示。2个泳道都有明显的目标条带，位于35-40KDa条带之间。各泳道的目标蛋白含量与测定的磷脂酶活性高低一致。

总结，经过紫外诱变获得的mc1-1-SPLC菌株的蛋白表达能力比诱变前提高了53％。

实施例8：mc1-1-SPLC菌株中PLC基因和His基因的敲除

用于敲除PLC基因的核苷酸序列(AOX-His)：

CTCGAGATTCAGGTGAACCCACCTAACTATTTTTAACTGGGATCCAGTGAGCTCGCTGGGTGAAAGCCAACCATCTTTTGTTTCGGGGAACCGTGCTCGCCCCGTAAAGTTAATTTTTTTTTCCCGCGCAGCTTTAATCTTTCGGCAGAGAAGGCGTTTTCATCGTAGCGTGGGAACAGAATAATCAGTTCATGTGCTATACAGGCACATGGCAGCAGTCACTATTTTGCTTTTTAACCTTAAAGTCGTTCATCAATCATTAACTGACCAATCAGATTTTTTGCATTTGCCACTTATCTAAAAATACTTTTGTATCTCGCAGATACGTTCAGTGGTTTCCAGGACAACACCCAAAAAAAGGTATCAATGCCACTAGGCAGTCGGTTTTATTTTTGGTCACCCACGCAAAGAAGCACCCACCTCTTTTAGGTTTTAAGTTGTGGGAACAGTAACACCGCCTAGAGCTTCAGGAAAAACCAGTACCTGTGACCGCAATTCACCATGATGCAGAATGTTAATTTAAACGAGTGCCAAATCAAGATTTCAACAGACAAATCAATCGATCCATAGTTACCCATTCCAGCCTTTTCGTCGTCGAGCCTGCTTCATTCCTGCCTCAGGTGCATAACTTTGCATGAAAAGTCCAGATTAGGGCAGATTTTGAGTTTAAAATAGGAAATATAAACAAATATACCGCGAAAAAGGTTTGTTTATAGCTTTTCGCCTGGTGCCGTACGGTATAAATACATACTCTCCTCCCCCCCCTGGTTCTCTTTTTCTTTTGTTACTTACATTTTACCGTTCCGTCACTCGCTTCACTCAACAACAAAATAAACTAGTGGTACCGTCAGCCACCAAAGTAGTGAATAGACCATCGGGGCGGTCAGTAGTCAAAGACGCCAACAAAATTTCACTGACAGGGAACTTTTTGACATCTTCAGAAAGTTCGTATTCAGTAGTCAATTGCCGAGCATCAATAATGGGGATTATACCAGAAGCAACAGTGGAAGTCACATCTACCAACTTTGCGGTCTCAGAAAAAGCATAAACAGTTCTACTACCGCCATTAGTGAAACTTTTCAAATCGCCCAGTGGAGAAGAAAAAGGCACAGCGATACTAGCATTAGCGGGCAAGGATGCAACTTTATCAACCAGGGTCCTATAGATAACCCTAGCGCCTGGGATCATCCTTTGGACAACTCTTTCTGCCAAATCTAGGTCCAAAATCACTTCATTGATACCATTATTGTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAATTC(SEQ ID NO:5)。

PCR法扩增出AOX-His基因片段，电击转化mc1-1-SPLC菌株，涂布在含有组氨酸的磷脂酶筛选平板上。挑选出没有水解圈的转化子分别在不含组氨酸和含有组氨酸的平板上划线，选择表型正确(在含有组氨酸的平板上生长，而在不含组氨酸的平板上不生长)的转化子，命名为mc1-1H，该菌株已于2018年10月31日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)，分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)，保藏编号为CGMCC No.16668。

采用相同的方法敲除m314-SPLC菌株中的PLC基因和His基因，选择表型正确(在含有组氨酸的平板上生长，而在不含组氨酸的平板上不生长)的转化子，命名为m314H，该菌株已于2018年10月31日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)，分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，保藏编号为CGMCC No.16670。

实施例9：以PLC基因为报告基因评估mc1-1H菌株

通过PLC脂肪酶基因来评估mc1-1H菌株对其它蛋白表达水平的增强作用，所用PLC基因经过密码子优化并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，核苷酸序列：

ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTTGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTGGTCAGCTGAGGACAAGCATAAGGAAGGTGTGAATAGTCACTTATGGATCGTGAACCGTGCCATTGATATAATGTCTAGGAATACAACTCTGGTTAAGCAAGATAGAGTTGCTCAATTGAATGAATGGCGTACAGAGCTAGAGAATGGCATCTACGCTGCTGATTATGAAAACCCCTATTACGATAACAGTACCTTCGCTTCTCACTTTTACGATCCAGACAACGGAAAGACATATATCCCATTCGCCAAGCAAGCTAAGGAGACTGGAGCTAAGTACTTCAAGTTGGCTGGAGAGTCATACAAGAATAAAGACATGAAGCAGGCCTTCTTTTATCTTGGGTTGTCATTGCATTATTTGGGCGATGTCAACCAACCTATGCATGCCGCAAACTTTACGAACCTGTCCTATCCACAGGGTTTTCACTCCAAGTACGAGAACTTTGTCGATACTATTAAAGACAACTACAAAGTTACCGATGGGAACGGATATTGGAATTGGAAAGGCACCAACCCTGAAGAATGGATTCACGGTGCAGCAGTAGTTGCAAAACAGGACTACTCTGGAATTGTCAATGACAATACCAAAGATTGGTTTGTGAAAGCCGCAGTCTCCCAGGAATATGCAGATAAATGGAGAGCTGAAGTTACACCTATGACTGGTAAACGACTAATGGATGCCCAAAGAGTTACTGCTGGTTACATTCAATTATGGTTCGACACTTACGGTGACAGGTAA(SEQ ID NO:6)；

该PLC的氨基酸序列为：

MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAWSAEDKHKEGVNSHLWIVNRAIDIMSRNTTLVKQDRVAQLNEWRTELENGIYAADYENPYYDNSTFASHFYDPDNGKTYIPFAKQAKETGAKYFKLAGESYKNKDMKQAFFYLGLSLHYLGDVNQPMHAANFTNLSYPQGFHSKYENFVDTIKDNYKVTDGNGYWNWKGTNPEEWIHGAAVVAKQDYSGIVNDNTKDWFVKAAVSQEYADKWRAEVTPMTGKRLMDAQRVTAGYIQLWFDTYGDR(SEQ ID NO:7)。

根据合成的PLC基因序列设计引物，构建pPIC9K-PLC表达载体，经限制性内切酶BglII线性化后分别电击转化m314H和mc1-1H菌株，经脂肪酶平板筛选后选择具有水解圈且PLC基因为单拷贝的转化子，编号m314H-SPLC和mc1-1H-SPLC，将选择出来的转化子进行摇瓶发酵。发酵液经超滤浓缩后取用相同体积的浓缩酶液进行脂肪酶酶活测定和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

酶活测定结果如图5所示。结果显示，mc1-1H-SPLC表达的PLC磷脂酶酶活比m314H-SPLC提高了47％。

电泳结果如图6所示。2个泳道都有明显的目标条带，位于35-40KDa条带之间。各泳道的目标蛋白含量与测定的磷脂酶活性高低一致。

总结上述实施例的结果，以PLC为报告基因将菌株m314H通过紫外诱变获得的mc1-1H，用mc1-1H来表达PLC时，其蛋白表达能力比出发菌株m314H提高了53％，证明菌株mc1-1H异源表达蛋白的能力较出发菌株m314H显著提升，具有优良的特性。

实施例10：以RML为报告基因评估mc1-1H菌株

通过RML脂肪酶基因来评估mc1-1H菌株对其它蛋白表达水平的增强作用，所用RML基因经过密码子优化并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，核苷酸序列：

TCCATCGACGGAGGTATTAGAGCCGCTACTTCTCAGGAAATCAACGAACTTACTTACTATACAACTTTGTCAGCTAATTCTTACTGTAGAACTGTTATTCCTGGTGCTACTTGGGATTGCATACATTGTGACGCCACTGAAGATTTAAAGATAATTAAAACCTGGTCTACTTTGATTTACGACACTAACGCTATGGTTGCTAGAGGAGATTCCGAGAAGACTATTTATATCGTGTTTAGAGGTTCTTCATCTATTCGTAATTGGATCGCTGATTTGACATTCGTTCCAGTCTCTTACCCTCCAGTTTCTGGTACTAAGGTTCACAAAGGATTTCTTGATTCTTATGGTGAAGTTCAAAACGAGTTGGTTGCTACTGTCTTGGATCAGTTTAAACAATACCCATCTTATAAGGTTGCTGTCACTGGTCACTCTTTGGGAGGTGCTACTGCCTTGCTGTGTGCTTTAGGTTTATACCAGAGAGAGGAAGGATTGTCTTCAAGTAACCTATTCTTGTACACTCAAGGTCAGCCTAGAGTTGGAGATCCAGCATTTGCTAATTATGTGGTTTCTACTGGTATTCCATATAGACGTACTGTTAACGAAAGAGACATAGTACCACACTTGCCTCCAGCTGCCTTCGGATTTCTGCATGCCGGTGAAGAGTACTGGATCACAGATAATTCTCCTGAAACCGTTCAAGTGTGTACATCTGATTTAGAGACTTCCGACTGCTCTAACAGTATTGTTCCATTTACTTCAGTTCTTGATCATTTGTCTTATTTTGGAATTAACACCGGTTTGTGTACT(SEQ ID NO:8)

该RML氨基酸序列：

SIDGGIRAATSQEINELTYYTTLSANSYCRTVIPGATWDCIHCDATEDLKIIKTWSTLIYDTNAMVARGDSEKTIYIVFRGSSSIRNWIADLTFVPVSYPPVSGTKVHKGFLDSYGEVQNELVATVLDQFKQYPSYKVAVTGHSLGGATALLCALGLYQREEGLSSSNLFLYTQGQPRVGDPAFANYVVSTGIPYRRTVNERDIVPHLPPAAFGFLHAGEEYWITDNSPETVQVCTSDLETSDCSNSIVPFTSVLDHLSYFGINTGLCT(SEQ ID NO:9)。

根据合成的RML基因序列设计引物，构建pPIC9K-RML表达载体，经限制性内切酶BglII线性化后分别电击转化m314H和mc1-1H菌株，经脂肪酶平板筛选后选择具有水解圈且RML基因为单拷贝的转化子，编号m314H-SRML和mc1-1H-SRML，将选择出来的转化子进行摇瓶发酵。发酵液经超滤浓缩后取用相同体积的浓缩酶液进行脂肪酶酶活测定和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

酶活测定结果如图7所示。结果显示，mc1-1H-SRML表达的脂肪酶酶活比m314H-SRML提高了43％。

电泳结果如图8所示。2个泳道都有明显的目标条带，位于35KDa条带处。各泳道的目标蛋白含量与测定的脂肪酶活性高低一致。

总结上述实施例的结果，以RML为报告基因将菌株m314H通过紫外诱变获得的mc1-1H，用mc1-1H来表达RML时，其蛋白表达能力比出发菌株m314H提高了43％，证明菌株mc1-1H异源表达蛋白的能力较出发菌株m314H显著提升，具有优良的特性。

序列表

<110> 丰益（上海）生物技术研发中心有限公司

<120> 用于表达外源基因的毕赤酵母突变株

<130> 188437

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctcttgaga aaagagaggc tgaagcttgg tcagctgagg acaagcataa ggaaggtgtg 300

aatagtcact tatggatcgt gaaccgtgcc attgatataa tgtctaggaa tacaactctg 360

gttaagcaag atagagttgc tcaattgaat gaatggcgta cagagctaga gaatggcatc 420

tacgctgctg attatgaaaa cccctattac gataacagta ccttcgcttc tcacttttac 480

gatccagaca acggaaagac atatatccca ttcgccaagc aagctaagga gactggagct 540

aagtacttca agttggctgg agagtcatac aagaataaag acatgaagca ggccttcttt 600

tatcttgggt tgtcattgca ttatttgggc gatgtcaacc aacctatgca tgccgcaaac 660

tttacgaacc tgtcctatcc acagggtttt cactccaagt acgagaactt tgtcgatact 720

attaaagaca actacaaagt taccgatggg aacggatatt ggaattggaa aggcaccaac 780

cctgaagaat ggattcacgg tgcagcagta gttgcaaaac aggactactc tggaattgtc 840

aatgacaata ccaaagattg gtttgtgaaa gccgcagtct cccaggaata tgcagataaa 900

tggagagctg aagttacacc tatgactggt aaacgactaa tggatgccca aagagttact 960

gctggttaca ttcaattatg gttcgacact tacggtgaca ggtaa 1005

<210> 2

<211> 334

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp Ser Ala Glu Asp Lys His

85 90 95

Lys Glu Gly Val Asn Ser His Leu Trp Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp

100 105 110

Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Leu Val Lys Gln Asp Arg Val Ala Gln

115 120 125

Leu Asn Glu Trp Arg Thr Glu Leu Glu Asn Gly Ile Tyr Ala Ala Asp

130 135 140

Tyr Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asn Ser Thr Phe Ala Ser His Phe Tyr

145 150 155 160

Asp Pro Asp Asn Gly Lys Thr Tyr Ile Pro Phe Ala Lys Gln Ala Lys

165 170 175

Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Lys Leu Ala Gly Glu Ser Tyr Lys Asn

180 185 190

Lys Asp Met Lys Gln Ala Phe Phe Tyr Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr

195 200 205

Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met His Ala Ala Asn Phe Thr Asn Leu

210 215 220

Ser Tyr Pro Gln Gly Phe His Ser Lys Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr

225 230 235 240

Ile Lys Asp Asn Tyr Lys Val Thr Asp Gly Asn Gly Tyr Trp Asn Trp

245 250 255

Lys Gly Thr Asn Pro Glu Glu Trp Ile His Gly Ala Ala Val Val Ala

260 265 270

Lys Gln Asp Tyr Ser Gly Ile Val Asn Asp Asn Thr Lys Asp Trp Phe

275 280 285

Val Lys Ala Ala Val Ser Gln Glu Tyr Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu

290 295 300

Val Thr Pro Met Thr Gly Lys Arg Leu Met Asp Ala Gln Arg Val Thr

305 310 315 320

Ala Gly Tyr Ile Gln Leu Trp Phe Asp Thr Tyr Gly Asp Arg

325 330

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacgtatggt cagctgagga caagc 25

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctaggttac ctgtcaccgt aagtgtcgaa c 31

<210> 5

<211> 1817

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcgagattc aggtgaaccc acctaactat ttttaactgg gatccagtga gctcgctggg 60

tgaaagccaa ccatcttttg tttcggggaa ccgtgctcgc cccgtaaagt taattttttt 120

ttcccgcgca gctttaatct ttcggcagag aaggcgtttt catcgtagcg tgggaacaga 180

ataatcagtt catgtgctat acaggcacat ggcagcagtc actattttgc tttttaacct 240

taaagtcgtt catcaatcat taactgacca atcagatttt ttgcatttgc cacttatcta 300

aaaatacttt tgtatctcgc agatacgttc agtggtttcc aggacaacac ccaaaaaaag 360

gtatcaatgc cactaggcag tcggttttat ttttggtcac ccacgcaaag aagcacccac 420

ctcttttagg ttttaagttg tgggaacagt aacaccgcct agagcttcag gaaaaaccag 480

tacctgtgac cgcaattcac catgatgcag aatgttaatt taaacgagtg ccaaatcaag 540

atttcaacag acaaatcaat cgatccatag ttacccattc cagccttttc gtcgtcgagc 600

ctgcttcatt cctgcctcag gtgcataact ttgcatgaaa agtccagatt agggcagatt 660

ttgagtttaa aataggaaat ataaacaaat ataccgcgaa aaaggtttgt ttatagcttt 720

tcgcctggtg ccgtacggta taaatacata ctctcctccc ccccctggtt ctctttttct 780

tttgttactt acattttacc gttccgtcac tcgcttcact caacaacaaa ataaactagt 840

ggtaccgtca gccaccaaag tagtgaatag accatcgggg cggtcagtag tcaaagacgc 900

caacaaaatt tcactgacag ggaacttttt gacatcttca gaaagttcgt attcagtagt 960

caattgccga gcatcaataa tggggattat accagaagca acagtggaag tcacatctac 1020

caactttgcg gtctcagaaa aagcataaac agttctacta ccgccattag tgaaactttt 1080

caaatcgccc agtggagaag aaaaaggcac agcgatacta gcattagcgg gcaaggatgc 1140

aactttatca accagggtcc tatagataac cctagcgcct gggatcatcc tttggacaac 1200

tctttctgcc aaatctaggt ccaaaatcac ttcattgata ccattattgt acaacttgag 1260

caagttgtcg atcagctcct caaattggtc ctctgtaacg gatgactcaa cttgcacatt 1320

aacttgaagc tcagtcgatt gagtgaactt gatcaggttg tgcagctggt cagcagcata 1380

gggaaacacg gcttttccta ccaaactcaa ggaattatca aactctgcaa cacttgcgta 1440

tgcaggtagc aagggaaatg tcatacttga agtcggacag tgagtgtagt cttgagaaat 1500

tctgaagccg tatttttatt atcagtgagt cagtcatcag gagatcctct acgccggacg 1560

catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat 1620

caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg 1680

tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt 1740

ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa cctactactg ggctgcttcc taatgcagga 1800

gtcgcataag ggaattc 1817

<210> 6

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctcttgaga aaagagaggc tgaagcttgg tcagctgagg acaagcataa ggaaggtgtg 300

aatagtcact tatggatcgt gaaccgtgcc attgatataa tgtctaggaa tacaactctg 360

gttaagcaag atagagttgc tcaattgaat gaatggcgta cagagctaga gaatggcatc 420

tacgctgctg attatgaaaa cccctattac gataacagta ccttcgcttc tcacttttac 480

gatccagaca acggaaagac atatatccca ttcgccaagc aagctaagga gactggagct 540

aagtacttca agttggctgg agagtcatac aagaataaag acatgaagca ggccttcttt 600

tatcttgggt tgtcattgca ttatttgggc gatgtcaacc aacctatgca tgccgcaaac 660

tttacgaacc tgtcctatcc acagggtttt cactccaagt acgagaactt tgtcgatact 720

attaaagaca actacaaagt taccgatggg aacggatatt ggaattggaa aggcaccaac 780

cctgaagaat ggattcacgg tgcagcagta gttgcaaaac aggactactc tggaattgtc 840

aatgacaata ccaaagattg gtttgtgaaa gccgcagtct cccaggaata tgcagataaa 900

tggagagctg aagttacacc tatgactggt aaacgactaa tggatgccca aagagttact 960

gctggttaca ttcaattatg gttcgacact tacggtgaca ggtaa 1005

<210> 7

<211> 334

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp Ser Ala Glu Asp Lys His

85 90 95

Lys Glu Gly Val Asn Ser His Leu Trp Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp

100 105 110

Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Leu Val Lys Gln Asp Arg Val Ala Gln

115 120 125

Leu Asn Glu Trp Arg Thr Glu Leu Glu Asn Gly Ile Tyr Ala Ala Asp

130 135 140

Tyr Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asn Ser Thr Phe Ala Ser His Phe Tyr

145 150 155 160

Asp Pro Asp Asn Gly Lys Thr Tyr Ile Pro Phe Ala Lys Gln Ala Lys

165 170 175

Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Lys Leu Ala Gly Glu Ser Tyr Lys Asn

180 185 190

Lys Asp Met Lys Gln Ala Phe Phe Tyr Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr

195 200 205

Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met His Ala Ala Asn Phe Thr Asn Leu

210 215 220

Ser Tyr Pro Gln Gly Phe His Ser Lys Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr

225 230 235 240

Ile Lys Asp Asn Tyr Lys Val Thr Asp Gly Asn Gly Tyr Trp Asn Trp

245 250 255

Lys Gly Thr Asn Pro Glu Glu Trp Ile His Gly Ala Ala Val Val Ala

260 265 270

Lys Gln Asp Tyr Ser Gly Ile Val Asn Asp Asn Thr Lys Asp Trp Phe

275 280 285

Val Lys Ala Ala Val Ser Gln Glu Tyr Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu

290 295 300

Val Thr Pro Met Thr Gly Lys Arg Leu Met Asp Ala Gln Arg Val Thr

305 310 315 320

Ala Gly Tyr Ile Gln Leu Trp Phe Asp Thr Tyr Gly Asp Arg

325 330

<210> 8

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tccatcgacg gaggtattag agccgctact tctcaggaaa tcaacgaact tacttactat 60

acaactttgt cagctaattc ttactgtaga actgttattc ctggtgctac ttgggattgc 120

atacattgtg acgccactga agatttaaag ataattaaaa cctggtctac tttgatttac 180

gacactaacg ctatggttgc tagaggagat tccgagaaga ctatttatat cgtgtttaga 240

ggttcttcat ctattcgtaa ttggatcgct gatttgacat tcgttccagt ctcttaccct 300

ccagtttctg gtactaaggt tcacaaagga tttcttgatt cttatggtga agttcaaaac 360

gagttggttg ctactgtctt ggatcagttt aaacaatacc catcttataa ggttgctgtc 420

actggtcact ctttgggagg tgctactgcc ttgctgtgtg ctttaggttt ataccagaga 480

gaggaaggat tgtcttcaag taacctattc ttgtacactc aaggtcagcc tagagttgga 540

gatccagcat ttgctaatta tgtggtttct actggtattc catatagacg tactgttaac 600

gaaagagaca tagtaccaca cttgcctcca gctgccttcg gatttctgca tgccggtgaa 660

gagtactgga tcacagataa ttctcctgaa accgttcaag tgtgtacatc tgatttagag 720

acttccgact gctctaacag tattgttcca tttacttcag ttcttgatca tttgtcttat 780

tttggaatta acaccggttt gtgtact 807

<210> 9

<211> 269

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ser Ile Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn Glu

1 5 10 15

Leu Thr Tyr Tyr Thr Thr Leu Ser Ala Asn Ser Tyr Cys Arg Thr Val

20 25 30

Ile Pro Gly Ala Thr Trp Asp Cys Ile His Cys Asp Ala Thr Glu Asp

35 40 45

Leu Lys Ile Ile Lys Thr Trp Ser Thr Leu Ile Tyr Asp Thr Asn Ala

50 55 60

Met Val Ala Arg Gly Asp Ser Glu Lys Thr Ile Tyr Ile Val Phe Arg

65 70 75 80

Gly Ser Ser Ser Ile Arg Asn Trp Ile Ala Asp Leu Thr Phe Val Pro

85 90 95

Val Ser Tyr Pro Pro Val Ser Gly Thr Lys Val His Lys Gly Phe Leu

100 105 110

Asp Ser Tyr Gly Glu Val Gln Asn Glu Leu Val Ala Thr Val Leu Asp

115 120 125

Gln Phe Lys Gln Tyr Pro Ser Tyr Lys Val Ala Val Thr Gly His Ser

130 135 140

Leu Gly Gly Ala Thr Ala Leu Leu Cys Ala Leu Gly Leu Tyr Gln Arg

145 150 155 160

Glu Glu Gly Leu Ser Ser Ser Asn Leu Phe Leu Tyr Thr Gln Gly Gln

165 170 175

Pro Arg Val Gly Asp Pro Ala Phe Ala Asn Tyr Val Val Ser Thr Gly

180 185 190

Ile Pro Tyr Arg Arg Thr Val Asn Glu Arg Asp Ile Val Pro His Leu

195 200 205

Pro Pro Ala Ala Phe Gly Phe Leu His Ala Gly Glu Glu Tyr Trp Ile

210 215 220

Thr Asp Asn Ser Pro Glu Thr Val Gln Val Cys Thr Ser Asp Leu Glu

225 230 235 240

Thr Ser Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Val Leu Asp

245 250 255

His Leu Ser Tyr Phe Gly Ile Asn Thr Gly Leu Cys Thr

260 265

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccgctcgagt cacctcagcc agatcaaagt 30

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acatgcatgc ctttggacaa ctctttctgc c 31

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cggggtaccc ctggttgata aagttgcat 29

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggcgagctca ggtgtcttca aagcgactc 29

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acatgcatgc ctgcagaaat ggggagataa ccacc 35

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cggggtacca ctagtggttt tctgggggta tttgctg 37

Claims

1.保藏编号为CGMCC No. 16668的巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株。

2.一种基因工程改造的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述菌株为经基因工程改造的权利要求1所述的巴斯德毕赤酵母菌株，所述基因工程改造使得该毕赤酵母菌株含有外源基因或含该外源基因的载体。

3.如权利要求2所述的毕赤酵母菌株，其特征在于，该毕赤酵母菌株的基因组中整合了所述外源基因。

4.如权利要求2或3所述的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述外源基因为工业、饲料或食品领域中用到的蛋白的编码序列。

5.如权利要求2或3所述的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述外源基因为酶的编码序列。

6.如权利要求5所述的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述酶选自以下酶中的至少一种：脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、植酸酶、酯酶、果胶酶、半乳糖苷酶和磷脂酶。

7.如权利要求2所述的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述外源基因的序列如SEQ ID NO:1、6或8所示。

8.一种培养物，其特征在于，所述培养物含有权利要求1-7中任一项所述的毕赤酵母菌株。

9.如权利要求8所述的培养物，其特征在于，所述培养物还含有培养基。

10.如权利要求9所述的培养物，其特征在于，所述培养基为种子培养基或发酵培养基。

11.如权利要求9所述的培养物，其特征在于，所述培养基为YPD培养基或BMMY培养基。

12.权利要求1所述的巴斯德毕赤酵母菌株在构建表达外源基因的菌株中的应用。