CN1259167A - 农杆菌介导的霉菌特别是属于曲霉菌属的霉菌的转化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及农杆菌介导的霉菌包括真菌子囊菌、担子菌、半知菌、鞭毛菌和接合菌亚部的霉菌种的转化。实施例证明了泡盛曲霉(原生质体和分生孢子)、构巢曲霉、黑曲霉、盘长孢状刺盘孢、豌豆腐皮镰孢、粗糙脉孢菌、雷西木霉、糙皮侧耳和二孢蘑菇(均为分生孢子)、以及禾本科镰孢(分生孢子和重新水化的ATCC冻干物)的转化。尤其在泡盛曲霉中,转化频率远高于传统的霉菌转化技术。还进一步发现,不仅一个可表达的基因能被导入这些霉菌,甚至这种基因的多个拷贝也可以,而且,如同用泡盛曲霉所举的例子,这种基因可被定向至诸如染色体的pyrG位点中。这些多拷贝可以是一种编码一种所需的、同源或异源的蛋白的基因。

Description

农杆菌介导的霉菌特别是属于曲霉菌属的霉菌的转化
本发明涉及霉菌特别是属于曲霉属的霉菌的转化。
                 发明背景和现有技术
(1)微生物的一般转化技术
在重组DNA技术中，细菌和酵母的转化技术已经得到了很好的建立，但霉菌的转化频率相对较低。
例如，在大肠杆菌的遗传转化中，使用一种化学转化方法常规能获得约5×108转化子/ug载体DNA的转化频率。大约3.5％的活细胞被转化(Hanahan；J.Mol.Biol.166(1983)557-580)。最近，已经报道了在高电压电转化后获得了更高的转化频率---109至1010转化子/ug载体DNA(Dower et al.；Nucleic Acids Research 16(1988)6127-6145)。对于其他细菌来说，较低的转化频率已经有了介绍(例如，Chassy and Flickinger；FEMS Microbiology Letters44(1987)173-177；Miller et al.；Proc.Natl.Acad.Sci.usa85(1988)856-860)。对于酵母来说，已经获得了高至每ug载体DNA 1×107转化子的转化频率(Meilhoc et al.；Bio/Technology8(1990)223-227和Gietz et al.；Yeast 11(1995)355-360)。
对于霉菌来说，转化频率为以下各不相同的数值：
-对于二孢蘑菇来说，仅为0.1-0.5转化子/ug载体DNA(VanRhee et al.；Mol Gen Genet 250(1996)252-258)，
-对于禾本科镰孢A3/5来说，为5转化子/ug载体DNA(Royeret al.，Bio/Technology 13(1995)1479-1483)，
-对于泡盛曲霉来说，为约12转化子/ug载体DNA(Ward et al.，Experimental Mycology 13(1989)289-293)，以及
-对于构巢曲霉来说，为20-300转化子/ug载体DNA(Yelton etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)1470-1474)，
-对于粗糙脉孢菌来说，为大约104转化子/ug载体DNA(Volmerand Yanofsky；Prooc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)4869-4873)。
为对关于霉菌转化的文章进行回顾，参考以下文献：
-“真菌的转化”，作者John R.S.，发表于MicrobiologicalReviews(Mar.1989)148-170，它概述了真菌即酵母和霉菌的可能的转化方法。
-“丝状真菌的遗传工程”，作者Timberlake，W.E.and Marshall，M.A.，发表于Science 244(1989)1313-1317。
-“转化”，作者David B.Finkelstein(“丝状真菌的生物技术，技术和产品”(1992)的第6章，113-156，Finkelstein和Ball编辑)。
从此文献可明显看出，已经建立了数种转化技术来转化数目不断增加的丝状真菌。多数转化方法使用原生质体。原生质体可使用Novozyme 234R从菌丝培养物或发芽的分生孢子制备，Novozyme 234R为来自雷西木霉的一种多酶制备物。原生质体的DNA转化由电转化或一种CaCl2和聚乙二醇(PEG)的混合物介导。一些替代方法能避免制备原生质的需要，从而使过程变得更快速和简单。使用一种乙酸锂和PEG的组合、颗粒轰击(Lorito et al.；Curr.Genet.24(1993)349-356 and Herzog et al.，Appl.  Microbiol.Biotechnol.45(1996)333-337)还有电转化(Ozeki et al.；Biosci.Biotech.Biochem.58(1994)2224-2227)可转化完整的细胞。
考虑到与细菌和酵母的转化频率相比，霉菌的转化频率相对较低，因此存在这样一种需要，即在霉菌中得到较高的转化频率。
(2)使用农杆菌的植物转化
另一种为植物发展的转化技术以根癌农杆菌的使用为基础，农杆菌是一种革兰氏阴性土壤细菌，它在被感染的双子叶植物的受伤位置导致冠瘿瘤。在诱导肿瘤的过程中，农杆菌粘附于植物细胞，然后将它的肿瘤诱导(Ti)质粒的一部分---转移性DNA或T-DNA转移到细胞中，并整合到植物的核基因组中。T-DNA的两翼为24碱基对的不完全同向重复。这种同向重复也被称为“边界重复”或“边界”或“T-DNA边界”或“边界序列”或它们的组合。T-DNA含有一组基因。这些基因的一个亚组---onc基因的表达能导致植物激素的产生，而植物激素诱导植物细胞增生并形成一种肿瘤。转移的过程依赖于一组由Ti质粒编码的毒性基因的诱导。当VirA感受到来自受伤植物的诱导化合物如乙酰丁香酮(AS)时，转移系统被激活。通过转录激活因子VirG，剩余的vir位点被激活，并且通过一种virD1/D2编码的位点特异性内切酶在边界重复上产生一个缺口，产生一条线型的单链DNA---T链。VirD2蛋白继续与5’末端共价吸附。T-链被单链的接合蛋白VirE包被，所得到的复合物转移到植物细胞中。虽然T-DNA复合物从细菌运输到植物细胞的机制还不十分清楚，但据信T-DNA复合物通过一种由virB操纵子编码的蛋白组成的跨膜结构离开农杆菌细胞。根癌农杆菌转化的全面回顾见Hooykaas和Schilperoort(PlantMolecular Biology 19(1992)15-38)和Hooykaas和Beijersbergen(Annu.Rev.Phytopathol.32(1994)157-179)。根癌农杆菌将其T-DNA转移至植物细胞并稳定地整合到核基因组中的能力使这种有机体被广泛用于将基因转移进植物和植物细胞。为使植物在根癌农杆菌转化后再生，在T区域中onc基因被删除从而产生无臂或非致癌T-DNA。两种类型的载体系统被发展来用于植物转化。第一种是一种双体系统，在这种系统中，新基因被克隆到一种含有一种人工T-DNA的质粒的T-DNA边界之间。这种质粒被随后导入一种携带了Ti质粒的农杆菌菌株中，其中Ti质粒具有完整的vir区域，但缺少T区域(Hoekema et al.；Nature 303(1983)179-180和Bevan；Nucl.Acids Res.12(1984)8711-8721)。第二种是一种共整合系统，在这种系统中，新基因通过同源重组被导入一个带有完整的vir区的Ti质粒上已经存在的人工T-DNA中(Zambryski et al.；EMBO J.2(1983)2143-2150)。
已经有大量的植物种类用这样的系统进行了转化。这包括许多农业上重要的双子叶植物种类如马铃薯、西红柿、大豆、向日葵、甜菜和棉花(综述见Gasser and Fraley；Science 244(1989)1293-1299)。虽然单子叶植物的农杆菌转化在长时间内看来是不可能的，但目前已有几种种类例如玉米(Ishida et al.；Nature-Biotechnology 14(1996)745-750)和水稻(Aldemita and Hodges；Planta 199(1996)612-617)已使用农杆菌进行了转化。这种方法能广泛用于植物转化的一个原因是它的高转化频率。例如在使用烟草原生质体的共培养实验中，大约25％的微愈伤组织(由农杆菌共培养后的原生质体再生(平均20％))被转化(Depicker et al.；Mol.Gen.Genet.201(1985)477-484和Van den Elzen et al.；PlantMolecular Biology 5(1985)149-154)。这意味着高达5％的细胞被转化。而且，这种方法与其他使用裸DNA的植物转化方法相比更简单。它可用于完整的植物组织如叶片、茎、根和块茎以及原生质体。此外，该方法的优点还有，只有含有要整合的外源DNA的T-DNA整合到植物基因组中。载体在细菌中复制和选择所需的载体DNA序列并不从细菌转移到植物细胞中。因此，它是一种相对干净的转化方法。
另一种农杆菌种类---发根农杆菌拥有一种相似的天然基因转移系统。
(3)使用农杆菌的微生物转化
除了许多有关使用根癌农杆菌的植物转化的出版物外，最近发表了一些有关使用根癌农杆菌对微生物进行转化的研究结果。Beijersbergen等(Science 256(1992)1324-1327)证明，根癌农杆菌的毒性系统能在农杆菌之间介导接合转移，这仅涉及相同种的不同株的转化。
Bundock等(EMBO J.15(1995)3206-3214)报道了使用这种土壤细菌对酵母进行的成功转化。这个结果随后被Piers等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(1996)1613-1618)证实。两个小组都使用来自酿酒酵母的DNA序列如酵母2u起始区(Bundock et al.；EMBO J.15(1995)3206-3214)或酵母端粒序列和ARS1复制起始区(Pieers et al；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(1996)1613-1618)来使T-DNA在酵母中稳定。最近，Risseeuw等(Mol.Cell.Biol.16(1996)5924-5932)和Bundock & Hooykass(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(1996)15272-15275)报道了T-DNA在酿酒酵母中整合机制的结果。
这些出版物提供的数据显示，使用根癌农杆菌的微生物转化的效率比植物转化低得多。如上面所提到的，在植物中高达5％的细胞被转化，而对酵母来说，报道的转化细胞/受体细胞的比例要小得多，即3×10-3(Pieers et all；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(1996)1613-1618)和3.3×10-6(EMBO J.15(1995)3206-3214)。
此外，微生物的根癌农杆菌转化的效率被证明比传统的微生物转化技术低。通常裸DNA转移的转化频率用每ug载体DNA的转化子数目来描述，而根癌农杆菌转化的转化频率通常用可获得的转化细胞的数目相对于受体细胞的数目来表示。在一个以前的关于酵母常规转化的出版物中(Gietz et al.；Yeast 11，(1995)355-360)，转化子/ug载体DNA数据和每受体细胞的转化细胞数据均给出，这就给出了两种计算转化频率的方法之间的联系。Gietz et al.证明，使用其LiAc/SS-DNA/PEG方法在反应中最多能转化4％的酵母细胞，即高达4×10-2的转化频率。从图1A和本公开的相关说明可以计算出，这个4％相当于8×105转化子/ug载体DNA。对于酵母的根癌农杆菌转化来说，报道的最大转化频率是3×10-3(Pieers et all；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(1996)1613-1618)和3.3×10-6(EMBO J.15(1995)3206-3214)，这分别比Gietz等报道的用裸DNA获得的最大酵母转化频率(4％)低10倍和10000倍。因此根据这个证据，根癌农杆菌似乎不是微生物转化的一个另外的有前途的工具，因为用根癌农杆菌获得的转化频率远比用酵母的传统转化方法获得的要低。
                    发明简述
本发明基于使用农杆菌来转化霉菌的思路。尽管上面刚刚指出了用仅一种酵母即酿酒酵母获得较低的转化频率，本发明的发明者们决定研究根癌农杆菌介导的霉菌泡盛曲霉的转化。后者是用于酶、蛋白和代谢物生产的一种重要霉菌，但它有一个缺点，即如上面给出的数据所示(见Ward等)，传统的真菌转化技术相对效率较低。
令人惊奇的是，使用根癌农杆菌的植物转化技术被发现能成功地用于霉菌泡盛曲霉。经过一些实验后，获得了超过每107受体细胞7000转化子的转化频率，这是用传统转化技术获得的转化频率的约400倍(见下面的实施例1)。接着，这种技术也被成功地用于多种霉菌，包括黑曲霉、构巢曲霉、豌豆腐皮镰孢(CBS 230.34)、禾本科镰孢(ATCC 20334)、雷西木霉(CBS 383.78)、盘长孢状刺盘孢(CBS862.70)、粗糙脉孢菌(CBS 195.57)、糙皮侧耳(菌株Somycel 3015，购自“Proefstation voor de Champignoncultuur”)和二孢蘑菇(商业菌株Horst U1，也购自“Proefstation voor deChampignoncultuur”)。如下表1所示，这些霉菌属于不同的分类学背景。下表2给出了属于真菌门每个部的属和种的大致数目。鞭毛菌亚部包括壶菌纲和卵菌纲。如实施例11的介绍，二孢蘑菇菌株Horst U1以前不能直接转化。因此本发明首次提供了这种商业上非常重要的Horst U1菌株的直接转化。
因此在更广泛的意义上，本发明涉及霉菌即丝状真菌的转化。下面给出的例子代表组成约95％霉菌种类的真菌门的三个主要亚部(见表2)。
                               表1
                 包含农杆菌转化的种的真菌界的分布
  部 亚部     纲   目     科     种
粘菌门真菌门 鞭毛菌接合菌子囊菌担子菌半知菌 子囊菌纲同担子菌纲半知菌纲 曲霉目球壳目伞菌目HyphomycetesCoelomycetes 曲霉科粪壳菌科黑伞菌科白蘑科Melanconiaceae 构巢曲霉粗糙脉孢菌二孢蘑菇糙皮侧耳黑曲霉泡盛曲霉腐皮镰孢禾本科镰孢雷西木霉盘长孢状刺盘孢
参考文献：-Ainsworth，Sparrow和Sussman；The Fungi，Vol.IV A+B(1973)
-Gams，Van der Aa，Van der Plaats-Niterink，Samson和Stalpers；CBS Course of Mycology，3rd版(1987)
        表2真菌门各部中属和中的大致数目(O’Donnell和Peterson在书“丝状真菌的生物技术，技术和产品”(1992)第2章7-33页发表，Finkelstein和Ball编辑)
    部   属的数目和百分比     种的数目和百分比
  鞭毛菌接合菌子囊菌担子菌半知菌     190145272011041680     (3.2)(2.5)(46.4)(18.9)28.8)   1170765286501600017000     (1.8)(1.2)(45.0)(25.2)26.8)
对盘长孢状刺盘孢来说，本发明的方法比发表的用裸DNA转移的频率高大约5至10倍(见实施例5)。其他几种测试霉菌如禾本科镰孢(见实施例7)、粗糙脉孢菌(见实施例8)、雷西木霉(见实施例9)和糙皮侧耳(见实施例10)在用农杆菌转化后能获得与最适裸DNA转移方法相似的转化频率。霉菌构巢曲霉、黑曲霉和腐皮镰孢在用农杆菌转化后获得比裸DNA转移低的频率。对于曲霉属的菌种来说，这可能是转化子选择困难引起的(见实施例3和4)。应当注意，其他霉菌的转化并没有进行优化。根据在植物中用农杆菌转化的经验，转化频率可进一步提高。
这些霉菌很多在工业、农业和基础生物学研究中非常重要。例如泡盛曲霉、黑曲霉、雷西木霉和禾本科镰孢对于同源和异源蛋白的大量制备来说已显示是有吸引力的宿主(Van den Hondel et al.；Bennet和Lasure编辑的“More Gene Manipulations in Fungi”一书中的“Heterologous gene expression in filamentousfungi”(Chapter 18)(1991)397-428；Verdoes et al.；Appl.Microbiol.Biotechnol 43(1995)195-205；Royer et al.；Bio/Technology 13(1995)1479-1483)。它们具有将主要数量的蛋白分泌到培养基中的能力，大规模发酵一般已很好地建立，并且它们具有GRAS(一般被认为是安全的)地位，这使得我们能在食品和食品加工工业中使用这些菌株。而且霉菌禾本科镰孢A3/5---QuornR真菌蛋白真菌也已在英国作为一种商业化的人食物来源使用了超过10年(Royer et al.；Bio/Technology 13(1995)1479-1483)。霉菌腐皮镰孢和盘长孢状刺盘孢是真菌病原体(Marek et al.；CurrGenet 15(1989)421-428；Hwang et al.；The Plant Cell 7(1995)183-193)。构巢曲霉和粗糙脉孢菌对于遗传机制、生化途径和细胞生理的基础研究来说都是重要的有机体(Vollmer和Yanofsky；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)4869-4873；“真菌：50年”(1994)Martinelli和Kinghorn编辑)。蘑菇糙皮侧耳和二孢蘑菇可以食用并在商业上很重要。使用根据本发明的一种方法进行的成功转化在实施例10和11中介绍。
进一步的发现表明，不仅一种可表达的基因可被导入这些霉菌，而且甚至多拷贝的这种基因也可被定向到诸如染色体pyrG位点。这种多拷贝可以是一种编码一种所需的、同源或异源蛋白的基因。本发明的这种实施方案在实施例12中说明。
                    附图简述
图1显示质粒pUR5750的构建。
在构建说明图中所用缩写的说明：
RB＝T-DNA右边，
Pnos＝胭脂碱合成酶基因的启动子序列，
nptII＝来自Tn5的新霉素磷酸转移酶II基因的编码区，
Tocs＝章鱼碱合成酶基因的终止序列，
TrtpC＝来自构巢曲霉trpC基因的终止序列，
hph＝来自大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶基因的编码区，
Pgpd＝构巢曲霉gpd基因的启动子序列，
LB＝T-DNA左边。
图2显示质粒pUR5751的构建。
在构建说明图中所用缩写的说明：
AMA1＝来自构巢曲霉的质粒复制子AMA1。
图3显示8个独立的泡盛曲霉转化子(nr.1-8)的Southern印迹的放射性自显影。基因组DNA用BglII或HindIII(泳道1)消化或不消化(泳道2)。M代表1kb分子量标准(BRL)，杂交带代表1.6kb分子量标准片段。N(上面的泳道)是一个未转化的霉菌组织的阴性对照样品。
图4显示9个独立的霉菌转化子的Southern印迹的放射性自显影。编号1和2是黑曲霉转化子，编号5和6是雷西木霉转化子，编号7和8是禾本科镰孢转化子，编号9和10是粗糙脉孢菌转化子，编号11是一个盘长孢状刺盘孢转化子。泳道3、4和12不含DNA。基因组DNA用HindIII(上面的泳道)或BglII(下面的泳道)消化。P(上面的泳道)表示阳性对照，它是泡盛曲霉转化子7(见图3)未被消化的DNA，N(下面的泳道)是未转化霉菌的阴性样品对照。M代表1kb DNA分子量标准(BRL)，杂交带表示0.5和1.6kb的分子量标准片段。
图5显示4个独立的二孢蘑菇转化子的Southern印迹的放射性自显影(编号1-4)。基因组DNA用BglII消化(见lB-4B)或不消化(见1U-4U)。M代表1kb的DNA分子量标准(BRL)。
图6显示将多拷贝的基因定向整合到霉菌泡盛曲霉中的方法的实验设计。
A.野生型pyrG基因在图的上部显示。基因的编码区用浅灰色的盒指示。
B.在下面，显示目标位点，该位点含有剩余的泡盛曲霉菌株AWCSCE的无功能的pyrG基因的5’部分和染色体上pyrG位置的3’翼端序列。该菌株是由一种野生型的泡盛曲霉通过删除pyrG基因的3’部分制备的。该菌株也被用于其他的转化工作，在这些工作中，一个位于剩余的pyrG基因的5’部分下游的I-SceI位点被用于其他目的。“SalI-I-SceI-HindIII”指一个含有18bp的I-SceI内切酶识别位点(5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’＝SEQ ID NO 1)并在两翼有SalI和HindIII位点的合成DNA接头。I-SceI是一种来自酿酒酵母的切点稀有的限制性内切酶。
C.导入菌株AWCSCE的片段含有一个与染色体上目标位点剩余的的pyrG基因5’部分部分同源的无功能的pyrG基因3’部分、包含编码所需蛋白的结构基因的一个或多个基因拷贝(用深灰色的盒1、2和n表示)、以及一个来自pyrG位点并与紧接着目标位点的I-SceI位点的下游存在的序列同源的额外序列。此片段存在于一种根癌农杆菌载体上的T-DNA两边之间，该载体被导入一种在其DNA上含有一个vir区域的根癌农杆菌菌株中。
D.同源重组后，完整的pyrG基因被恢复，多基因拷贝被同时整合到pyrG位点，这在图的下部显示。
图7显示质粒pUR5710、pUR5711和pUR5712的构建。在构建说明图中所用的缩写的说明：
amp＝氨苄青霉素抗性基因，
pyrG＝来自泡盛曲霉的pyrG基因，’pyrG或pyrG’表示基因分别在5’或3’末端剪短。
图8显示质粒pUR5713(图8A)和pUR5714(图8B)的构建。在构建图中所用的缩写的说明：
pBS-SK＝pBluescriptR-SK
图9显示质粒pUR5716和pUR5718的构建。构建说明图中缩写的说明：
cos＝cos位点
图10显示质粒pUR5729的构建。构建说明图中所用缩写的说明：
Pex1A＝泡盛曲霉1、4-β-内木聚糖酶A基因的启动子序列，
cut＝豌豆腐皮镰孢角质酶基因的编码区(cDNA的合成拷贝)，
Tex1A＝泡盛曲霉1、4-β-内木聚糖酶A基因的终止序列。
图11显示粘粒pUR5725的构建。
图12显示质粒pUR5756的构建。
在图11-12中，“cut”或“cu”用来表示角质酶表达盒。
                      发明详述
本发明提供一种制备转化的霉菌的方法，其特征为：
(1)一种DNA片段，它含有至少一个要被导入一种霉菌的可表达基因，将该DNA片段首先克隆到一种根癌农杆菌的载体上的T-DNA两边之间；
(2)将在T-DNA两边之间含有该DNA片段的载体导入一种在其DNA中含有一个vir区域的根癌农杆菌菌株；
(3)通过加入一种vir诱导化合物使含有所说DNA片段的T-DNA从所说的根癌农杆菌中释放，并将根癌农杆菌菌株与需要转化的霉菌一起温育。并
(4)根据导入DNA或其表达产物的特征将转化的霉菌从未转化的霉菌中选择出来，并
可任选培养转化霉菌。
转化霉菌的选择可通过使用一种选择标记来进行。例如，这种选择标记是一种自然发生的、野生型霉菌菌株的特征，而需要转化的霉菌菌株是其一种突变菌株，缺少所说的选择标记，例如存在于野生型泡盛曲霉中的乳清苷-5’-磷酸脱羧酶基因pyrG基因。合适的选择标记包括抗生素抗性标记、使用在该霉菌菌株中不经常使用的代谢产物的基因、以及产生一种容易分析的产物的基因。
有时导入该霉菌的DNA可用做选择标记。例如，当导入DNA表达时，它可产生一种在非转化霉菌中不产生的产物，但更容易或较不容易检测。或存在或缺少该DNA可使用PCR技术来确定。
霉菌优选属于真菌门的真菌部，更优选属于以下真菌亚部之一---子囊菌，包括构巢曲霉和粗糙脉孢菌；担子菌，包括烟管菌属、Coprinus、草盖菌属，以及二孢蘑菇、Flammulina velutipes(Enokitake)、埃杜香菇(Shiitake)、Phanerochatechrysosporium、群交裂褶菌、Tricholoma matsutake和糙皮侧耳；半知菌，包括白僵菌属和绿僵菌属(适用于作为昆虫的生物控制试剂)、支顶孢属和青霉属(适用于生产抗生素)以及黑曲霉、泡盛曲霉、腐皮镰孢、禾本科镰孢、雷西木霉和盘长孢状刺盘孢；鞭毛菌，包含Oomycetes，包括绵霉属(适用于生产药物活性蛋白)、疫霉属、腐霉属和单轴霉属，以及壳菌纲，包括根生壳菌属和根囊壳菌属；以及接合菌，包括毛霉属和根霉属。
在本发明的一个优选实施例中提供了一种方法，其中DNA片段含有一种所需基因的多个拷贝。另外，DNA片段可含有几种基因的至少一个拷贝，或它可含有一种融合基因的一个或多个拷贝。
根据本发明的另一个优选实施方案，DNA片段被整合到真菌基因组的一个选择的位点。这种选择位点的一个例子是真菌基因组的pyrG位点(它在黑曲霉中被称为pyrA位点，在粗糙脉孢菌中被称为pyr4位点)。这能够产生一种转化霉菌，在转化霉菌中不含任何不需要的细菌DNA序列，包括T-DNA边界。
这样本发明提供一种不含任何不需要的细菌DNA序列包括T-DNA边界的转化霉菌，这种转化霉菌可通过根据本发明的农杆菌介导的转化获得。这种转化霉菌可用于通过培养一种转化霉菌来生产一种所需蛋白的过程。
根据本发明的另一个实施方案，提供了另一种方法，其中DNA片段随机整合到霉菌基因组中，并通过农杆菌介导的转化获得一种转化霉菌，该DNA含有一个或多个T-DNA边界序列的部分，并提供一种通过培养这种转化霉菌来生产一种所需蛋白的过程。
优选使用超毒性的根癌农杆菌菌株，因为它们能获得较高的转化频率。这种细菌、它们的用法以及制备这种菌株的载体在文献中已有介绍，有关植物转化见Jin等，(J.Bacteriology 169(1987)4417-4425 & Molecular Microbiology 7(1993)555-562)、Raineri等(BIO/TECHNOLOGY 8(January 1990)33-38)和Ishida等(NatureBiotechnology 14(1996)745-750)，有关酵母转化见Piers等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(1996)1613-1618)。
转化可使用一种二元系统或共整合，按照与上面在使用农杆菌转化植物的部分(2)中讨论的已知的植物转化的类似方式进行。
所有类型的霉菌组织包括原生质体、分生孢子、芽生孢子、菌丝体和沉淀都可以使用。原生质体、分生孢子和再水化的冷冻干燥培养物在下面举例说明。
霉菌的农杆菌介导转化的优点包括：
-它是一种“食品级”的方法，可产生一种不含细菌抗生素标记或其他细菌序列如复制起始区域残余的霉菌菌株。
-可导入较大部分的DNA，与可导入大约40kb DNA的旧式裸DNA霉菌转化方法相比，农杆菌介导的植物转化可将至少150kb的外源DNA导入植物DNA(Hamilton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)9975-9979)。
                      实施例
本发明用下面的实施例1-12举例说明，前面是所用的材料和方法的介绍。这些实施例显示了泡盛曲霉的原生质体(实施例1)和分生孢子(实施例2)、构巢曲霉的分生孢子(实施例3)、黑曲霉的分生孢子(实施例4)、盘长孢状刺盘孢(实施例5)、豌豆腐皮镰孢分生孢子(实施例6)、禾本科镰孢分生孢子和再水化的冷冻干燥ATCC物(实施例7)、粗糙脉孢菌分生孢子(实施例8)、雷西木霉分生孢子(实施例9)、糙皮侧耳分生孢子(实施例1O)以及二孢蘑菇分生孢子(实施例11)的转化。而且，实施例12显示了在pyrG位点导入多拷贝的角质酶表达盒的泡盛曲霉的转化。
                      材料和方法
                    细菌和霉菌菌株
为进行细菌克隆，使用大肠杆菌DH5α(基因型：F-，endA1，hsdR17(rk -mk +)，supE44，thi-1，lambda-，recA1，gyrA96，relA1，Δ(argF-lacIZYA)U169，deoR(phi80d-(lacz)ΔM15)；Hanahan；J.Mol.Biol.166(1983)557-580)。根癌农杆菌菌株LBA1100用于霉菌的转化(Beijersbergen等，1992，Science，256，P.1324-1327)。霉菌菌株泡盛曲霉#40(在WO 93/12237的9页12行也提到的泡盛曲霉CBS 115.52的一种衍生物)、黑曲霉(菌株N402，在UNILEVER的WO 91/19782中也提到的黑曲霉变种ATCC9029、CBS120.49的一种cspA1(短分生孢子)突变体)、构巢曲霉(Labcollection URL-VL)、豌豆腐皮镰孢(CBS 230.34)、禾本科镰孢(ATCC 20334)、雷西木霉(CBS 383.78)、盘长孢状刺盘孢(CBS862.70)、粗糙脉孢菌(CBS 195.57)、糙皮侧耳菌株Somycel 3015和二孢蘑菇菌株Horst U1(均购自“Proefstation voor deChampignon-cultuur”，P.O.Box 6042，5960 AA Horst，荷兰)在使用根癌农杆菌的转化中用作受体。
泡盛曲霉#40(也称为黑曲霉泡盛变体#40)的制备在WO 91/19782的13页29-39行中介绍，其内容为：
“而黑曲霉泡盛变体转化子的产生水平可通过使用合适的黑曲霉泡盛变体的突变菌株例如黑曲霉泡盛变体#40来进一步提高，该菌株明显比野生型菌株产生更多的木聚糖酶。
突变体黑曲霉泡盛变体#40通过将黑曲霉泡盛变体的孢子诱变并选择木聚糖酶产生而获得。在麸培养基中，“xylA”黑曲霉泡盛变体#40转化子产生190000U的木聚糖酶，比产生量最大的黑曲霉泡盛变体转化子明显提高。”
在本发明中，使用了下面的限制性内切酶：
给出粘性末端                       给出平末端
AflII    C↓TTAAG                  SmaI    CCC↓GGG
BamHI    G↓GATCC
BglII    A↓GATCT
EcoRI     G↓AATTC
HindIII   A↓AGCTT
KpnI      GGTAC↓C
NotI      GC↓GGCCGC
PstI      CTGCA↓G
SacI      GAGCT↓C
SalI      G↓TCGAC
以及来自酿酒酵母的稀有切割限制性内切酶I-SceI 18bp：
5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’＝SEQ ID NO：1
                  质粒构建
质粒pUR5750(见图1)通过将一个4kb的BglII/HindIII片段克隆到二元载体pBIN19的BglII/HindIII位点(Bevan M.，NucleicAcids Res.22(1984)8711-8721)来构建，该片段存在于载体pAN7.1上(Punt等，Gene 56(1987)117-124)，含有与大肠杆菌hph基因编码区融合的、来自构巢曲霉gpd基因的启动子，并接着为来自构巢曲霉trpC基因的终止序列。
质粒pUR5751(见图2)通过将来自构巢曲霉的质粒复制子AMA1(Aleksenko和Clutterbuck，Molecular Microbiology 19(1996)565-574)从质粒pUR7984以一个5.3kb的HindIII片段的形式克隆到pUR5750的HindIII位点来构建。pUR7984通过将5.3kb的AMA1的HindIII片段从pHELP1(Clutterbuck提供)克隆到pAN7.1的HindIII位点来获得。该5.3kb的AMM1 HindIII片段是位于EMBL/GenBank/DDBJ核苷酸序列数据库的Ac.no.X78051所示的序列的位置367的HindIII位点和位置5620的HindIII位点之间。
农杆菌菌株LBA1100首先由Beijersbergen等(Science 256(1992)1324-1327)介绍，并在随后的几篇文献中提到，该菌株用构建物pUR5750和pUR5751按照Mozo和Hooykaas(PlantMol.Biol.16(1991)917-918)的方法进行电转化。
此农杆菌菌株LBA1100已于1997年3月27日根据布达佩斯条约在Centraalbureau voor Schimmelcultures，Baarn，荷兰进行了保藏(No.CBS 634.97)。
                   转化实验
含有二元载体pUR5750的农杆菌菌株在29℃在含有以下浓度的合适抗生素的LB平板上生长过夜：卡那霉素100ug/ml、壮观霉素250ug/ml、利福平20ug/ml。将一个单个菌落在一个基础培养基平板上划线。基础培养基(MM)每升含有：10ml K-缓冲液，pH7.0(200g/l K2HPO4、145g/l KH2PO4)、20ml M-N(30g/l MgSO47H2O、15g/l NaCl)、1ml 1％CaCl22H2O(w/v)、10ml 20％葡萄糖(w/v)、10ml 0.01％FeSO4(w/v)、5ml孢子元素(100mg/l ZnSO47H2O、100mg/l CuSO45H2O、100mg/l H3BO3、100mg/l MnSO4H2O、100mg/lNa2MoO42H2O)和2.5ml 20％的NH4NO3(w/v)(Hooykaas等，J.Gen.Microbiol.110(1979)99-100)、15g/l的细菌用琼脂以及适当的抗生素。平板在29℃温育1至2天。将几个菌落接种到含有适当抗生素的基础培养基中，在29℃生长过夜。将农杆菌细胞在诱导培养基中稀释至OD660约为0.15后，培养物在29℃生长6小时。诱导培养基(IM)与基础培养基的差别为10ml 20％葡萄糖(w/v)被10mM葡萄糖取代，并加入了40mM MES(ex Sigma)(pH5.3)、0.5％甘油(w/v)和200uM的乙酰丁香酮(AS)。为证明农杆菌介导的霉菌转化依赖于T-DNA转移，使用了一个阴性对照，其中vir诱导物AS缺省。分生孢子通过以下方法获得：使霉菌菌株在室温下在铺于PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板上的硝酸纤维素滤膜(Hybond-N，Amersham)上生长数天，并接着用生理盐溶液洗涤滤膜。泡盛曲霉原生质体按Punt和Van den Hondel的介绍(Methods in Enzymology216(1993)447-457)制备。在进行原生质体转化时，一个含有106-107原生质体的100ul小份与100ul农杆菌培养物混合。在进行分生孢子转化时，分生孢子在生理盐溶液中稀释成106、107或108分生孢子/ml，并取100ul与100ul农杆菌培养物混合。接着，将混合物铺于含有5mM葡萄糖的IM平板(含15g/l细菌用琼脂的IM培养基)上的硝酸纤维素滤膜上，并在室温或在29℃温育2、3、5或6天(如实施例中所示)。阴性对照样品在vir诱导物AS缺省的IM平板上温育。此后，将滤膜转至曲霉基础培养基平板上(Bennett和Lasure，培养基，见：Bennett和lasure(eds)真菌中的更多基因操作，Academic Press，San Diego(1991)441-458)或PDA平板上，平板中含有200uM头孢噻圬以杀死农杆菌细胞以及潮霉素(浓度见实施例)以选择转化子。
            DNA分离和Southern分析
进行Southern分析来在分子水平证明霉菌细胞已被转化和所需DNA已整合到基因组中。为获得菌丝体物质用于基因组DNA分离，将约108霉菌分生孢子接种到50ml补加有0.5％酵母抽提物的曲霉基础培养基中，并在30℃在摇床上以200rpm培养22小时至3天。菌丝体通过MiraclothR(Calbiochem)收集，并在液氮中快速冷冻。使用一台Mikro-DismembratorR(ex Braun Biotech International)用1750rpm、1分钟研磨成细粉。霉菌基因组DNA使用Qiagen基因组试剂盒(cat.no.10223)和厂商提供的从丝状真菌纯化基因组DNA的方法进行分离。细胞壁物质消化的步骤缺省。将约2.5ug的DNA用BglII或HindIII(4单位/ug)消化16小时，并在0.8琼脂糖TBE凝胶上分离。通过毛细印记(过夜)将DNA转移至Hybond N膜上，按照Hybond方法将膜(预)杂交。在进行图3中所示的Southern印迹时，将上面介绍的来自pAN7.1的4kb BglII-HindIII片段用作探针。在进行图4和5所示的Southern印迹时，将来自pAN7.1的0.8kb的BamHI/EcoRI用作探针，该探针含有部分的大肠杆菌hph基因。一种用α32P-dCTP标记的DNA探针使用来自GibcoBRL的RTSRadPrime DNA标记系统(cat.no.10387-017)来获得。电子自显影使用一台Instant Imager(Packard)来获得。
实施例1  泡盛曲霉原生质体的转化
在分离原生质体时，将106分生孢子/ml的泡盛曲霉接种于一个装有200ml包含0.5％酵母抽提物的MM培养基的摇瓶中，在摇床上以200rpm在30℃温育18小时。通过无菌的MiroclothR收集菌丝体，并用冰冷的0.6M MgSO4洗涤。菌丝体按5ml/g菌丝体在OM培养基(每升：500ml 2.4M MgSO4、480ml H2O、16.8ml 0.5M Na2HPO4、3.2ml 0.5M NaH2PO4、pH5.8-5.9)中重新悬浮。接着，在每克菌丝体中加入5mg的Novozym 234R和6mg的BSA。使原生质体化过程在30℃在摇床上以80-100rpm进行1-2小时。使用光学显微镜检查原生质体形成。将原生质体滤过无菌的MiraclothR，并在falcon试管中将样品分成30ml的小份。加入STC(1.2M山梨糖醇、10mMTris/HCl pH7.5、50mM CaCl22H2O)使体积达到50ml，在4℃用2000rpm离心10分钟收集原生质体。再在50mlSTC中洗涤原生质体，并按约108原生质体/ml的浓度在STC中重新悬浮。为比较使用根癌农杆菌的转化与PEG转化的频率，还进行PEG转化。将5ug的pAN7.1加入一小份100ul(107)原生质体中，混合并在冰上温育25分钟。在两个200ul小份和一个850ul小份中加入PEG，混合物在室温温育20分钟。最后，混合物用10ml的STC洗涤，在室温用2000rpm离心10分钟收集。并将样品铺于含有100ug/ml潮霉素的MM平板以选择转化子。
在进行根癌农杆菌转化时，将含有3×106至107原生质体的100ul小份与100ul按上面在材料与方法中的介绍培养的根癌农杆菌混合。用IM制备此样品的1/10、1/100和1/1000稀释物，随后，将混合物铺于含有5mM葡萄糖的IM平板上的硝酸纤维素膜上，并在室温或29℃温育2天。此后，将滤膜转至曲霉基础培养基平板上，平板中含有200uM头孢噻圬以杀死农杆菌细胞和100ug/ml的潮霉素以选择转化子。用含有二元载体pUR5750的根癌农杆菌进行三个独立的实验，在每次实验中，进行两组转化，并包括一组没有AS的阴性对照。结果示于下表3。转化的潮霉素抗性细胞仅在含有AS的培养基中获得。阴性对照从来不产生转化细胞。这些结果清楚地证明，vir基因的诱导是T-DNA转移到霉菌细胞中所必须的，因此也就证明，根癌农杆菌能够转化霉菌泡盛曲霉。转化频率为约300至7200转化子/107原生质体，远高于以前未发表的实验中所获得的PEG转化的数值。在用pAN7.1(含有也存在于pUR5750上的相同的潮霉素基因表达盒，见材料与方法)进行PEG转化时，获得了最高18个转化子每ug每107原生质体/这与Ward等发表的约12转化子/ug载体DNA的数值一致(见上文)。
这些数值证明，使用根癌农杆介导的霉菌转化可产生比PEG转化多至400倍的转化子(每ug每107原生质体)。
而且，在实验3中(见下表3)，使用同一批原生质体对两种转化方法进行了直接比较。在两组PEG转化中，每转化107原生质体使用5ug的pAN7.1，分别获得了6个和16个转化子。这平均为2.2个转化子每ug每107原生质体。使用根癌农杆菌的转化，获得了每107受体细胞300和480个转化子，即平均390转化子每107受体细胞。
因此，通过应用根据本发明的使用根癌农杆菌转化的方法，获得约多180倍的转化子。
表3使用根癌农杆菌转化霉菌
霉菌种 存在于农杆菌LBA1100的质粒    实验  培养基   原生质体或分生孢子的数目 HygR转化子的数目  每107受体的HygR转化子的数目
泡盛曲霉构巢曲霉     pUR5750pUR5751pUR5750pUR5750     1.2.3.1.2.1.2.   -AS+AS+AS-AS+AS+AS-AS+AS+AS-AS+AS+AS-AS+AS+AS-AS+AS-AS+AS-AS+AS   3×106原生质体3×106原生质体3×106原生质体3×106原生质体3×106原生质体3×106原生质体1×107原生质体1×107原生质体1×107原生质体3×106原生质体3×106原生质体3×106原生质体3×106原生质体3×106原生质体3×106原生质体1×107分生孢子1×106分生孢子1×107分生孢子1×105分生孢子1×107分生孢子1×107分生孢子(a)     0100197012002170048030001852550285170010002002     0333657039607233048030006178500950567010000200002
表3使用根癌农杆菌转化霉菌(续)
霉菌种 存在于农杆菌LBA1100的质粒  实验   培养基     原生质体或分生孢子的数目   HygR转化子的数目 每107受体的HygR转化子的数目
黑曲霉盘长孢状刺盘孢禾本科镰孢豌豆腐皮镰孢粗糙脉孢菌糙皮侧耳   pUR5750pUR5750pUR5750pUR5750pUR5750pUR5750 1.2.1.2.1.2.     -AS+AS-AS+AS+AS-AS+AS-AS+AS-AS+AS-AS+AS-AS+AS-AS+AS-AS+AS     1×107分生孢子1×107分生孢子(a)1×106分生孢子1×106分生孢子(a)1×105分生孢子(a)4×105分生孢子4×105分生孢子(Freeze dried(ATCC culture1×107分生孢子1×107分生孢子1×105分生孢子1×105分生孢子1×105分生孢子1×105分生孢子1.25×107分生孢子1.25×107分生孢子2.5×107分生孢子2.5×107分生孢子     05013050105010500500600120     05013005000250ND010500005000048048
表3使用根癌农杆菌转化霉菌(续)
霉菌种 存在于农杆菌LBA1100的质粒 实验 培养基   原生质体或分生孢子的数目  HygR转化子的数目   每107受体的HygR转化子的数目
雷西木霉二孢蘑菇   pUR5750pUR5750(b)   -AS+AS+AS-AS+AS   1×107分生孢子1×107分生孢子1×105分生孢子3×1.2×107分生孢子5×1.2×107分生孢子     024012010     0240120001.6
(a)在这些实验中选择不够严格。转化频率以在第二轮潮霉素选择中存活的转化子数目为基础(也参见实施例)。(b)质粒pUR5750存在于农杆菌株LBA1126而不是菌株LBA1100中。
在实验1和2中，铺板效率(相对于初始细胞数目的存活细胞％)通过在没有潮霉素的MM平板上进行1/1000和10000稀释度的铺板来确定。在实验1中，铺板效率为5％，在实验2中为2.6％。
转化子的Hyg抗性表型通过用分生孢子在含有200uM的头孢噻圬和100ug/ml的潮霉素的MM平板上划线用随机挑取的78个转化子进行了证明。由这些转化子中的8个，将来自独立菌落的分生孢子再在含有100ug/ml潮霉素的MM平板上划线。将此过程重复两次。接着分离分生孢子，并进行培养来获取菌丝体进行基因组DNA分离。DNA分离和Southern分析在材料与方法中介绍。基因组DNA用BglII或HindIII消化。BglII不能在T-DNA中切割，因此这一消化将产生一条包含整个T-DNA以及T-DNA右和左边位点两翼的染色体序列的片段。该片段至少为7.5kb。HindIII在T-DNA切割一次，pAN7.1探针只能检测携带潮霉素表达盒的T-DNA片段和T-DNA左边界的翼端染色体序列。该片段至少为5kb。还包括未消化的DNA，以证明高分子量染色体DNA中T-DNA的存在。Southern印迹的放射性自显影在图3中描述。在所有8个转化子中，T-DNA被整合在一个单一的染色体位点。8个转化子中有7个还含有一个单一的T-DNA整合。在一个转化子中，T-DNA以顺序重复的方式整合。在未消化的DNA样品中，杂交信号与高分子量DNA一致，这证明T-DNA已整合到染色体DNA中。
不仅用二元载体pUR5750进行根癌农杆菌介导的转化，还使用二元载体pUR5751(见图2)进行转化。此载体含有来自构巢曲霉的质粒复制子AMA1。携带AMA1复制子的质粒能够在构巢曲霉中自主维持，因此，该T-DNA应能够产生一种转化细胞，在这种转化细胞中，T-DNA以染色体外因子的形式存在。两组实验的结果示于上表3。转化频率为每107原生质体约300至950转化子。转化子的Hyg抗性表型通过用孢子在含有100ug/ml潮霉素的MM平板上划线用随机挑取的20个转化子进行了证明。
实施例2  泡盛曲霉分生孢子的转化
在进行泡盛曲霉分生孢子的根癌农杆菌转化时，将100ul含有107分生孢子的小份与100ul按材料与方法中的介绍培养的根癌农杆菌混合。由此样品，用IM培养基制备1/10或1/100稀释物。接着，将混合物铺于含有5mM葡萄糖的IM平板上的硝酸纤维素膜上，并室温温育2天。此后，将滤膜转至曲霉基础培养基平板上，平板中含有200uM头孢噻圬以杀死农杆菌细胞和100ug/ml的潮霉素以选择转化子。两组实验的结果在上表3中描述。在这种情况下，转化也依赖于AS对vir基因的诱导。转化频率为每107分生孢子约1000至2000转化子，这与原生质体转化后的频率在相同范围内。转化子的Hyg抗性表型通过用分生孢子在含有200uM的头孢噻圬和100ug/ml的潮霉素的MM平板上划线用随机挑取的15个转化子进行了证明。
实施例3  构巢曲霉分生孢子的转化
在进行构巢曲霉分生孢子的根癌农杆菌转化时，将100ul含有107分生孢子的小份与100ul按材料与方法中的介绍培养的根癌农杆菌混合。将混合物铺于含有5mM葡萄糖的IM平板上的硝酸纤维素膜上，并室温温育2天。此后，将滤膜转至曲霉基础培养基平板上，平板中含有200uM头孢噻圬以杀死农杆菌细胞和100ug/ml的潮霉素以选择转化子。滤膜用含有相同浓度的头孢噻圬和潮霉素的MM琼脂覆盖。
构巢曲霉的选择被证明非常困难。很明显，在共培养时，分生孢子发芽和生长非常迅速，难以进行严格的选择。此结果与Cullen等(Gene 57(1989)21-26)获得的结果一致。他们确定，开始选择前的温育时间对于好的结果来说非常重要。使用超过16小时的选择前温育期将产生明显的背景生长，而仅8小时这样温育期后没有观察到菌落。所报告的数字是在12小时这样的温育期后获得的。他们还观察到了对潮霉素敏感性的明显菌株差异。考虑到Cullen等的结果，本实施例的转化频率可通过优化进行选择前的温育期来提高。
结果在上表3中描述。总的来说，获得了15个推定的转化菌落。而且，阴性对照产生了3个生长和产生孢子的菌落。为证明转化的表型，将分生孢子在含有200uM头孢噻圬和1000ug/ml潮霉素的MM平板上划线。阴性对照不生长，而15个可能的转化子中只有2个能够生长。因此，在这种情况下，转化也依赖于AS对vir基因的诱导。
使用潮霉素抗性基因的PEG转化的文献数据显示每ug载体DNA5-20个转化子的转化频率(Cullen等，Gene 57(1989)21-26；Punt等，Gene56(1987)117-124)。使用另一个选择标记---argB基因，Fungaro等(FEMS Microbiology Letters 125(1995)293-298)获得了每ug载体DNA高至81个转化子，而用trpC基因作为标记每ug载体DNA获得了20-300转化子(Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)1470-1474)。这些文献数据表明，使用农杆菌转化得到的转化子数目可使用其他的选择标记基因来提高。
实施例4  黑曲霉分生孢子的转化
在进行黑曲霉分生孢子的根癌农杆菌转化时，将100ul含有105、106或107分生孢子的小份与100ul按材料与方法中的介绍培养的根癌农杆菌混合。将混合物铺于含有5mM葡萄糖的IM平板上的硝酸纤维素膜上，并室温温育2天。此后，将滤膜转至曲霉基础培养基平板上，平板中含有200uM头孢噻圬以杀死农杆菌细胞和200ug/ml的潮霉素以选择转化子。一般来说，选择被证明非常困难。很明显，在共培养时，分生孢子发芽和生长非常迅速，难以进行严格的选择。这在某种程度上可通过在滤膜上覆盖含有200uM头孢噻圬和200ug/ml潮霉素的MM琼脂来进行改善。
一个典型实验的结果在表3中描述。该实验在阴性对照平板上产生6个生长菌落，在含有AS的转化平板上产生6个推定的转化菌落。为证明这些菌落的Hyg抗性表型，将来自所有12个菌落的分生孢子在含有200uM头孢噻圬和200ug/ml潮霉素的MM平板上划线。6个推定的转化子中只有5个能在新的选择平板上生长。剩下的推定转化子和来自阴性对照实验的菌落不能生长。因此，在这种情况下，转化也依赖于AS对vir基因的诱导。将两个转化子用于Southern分析。基因组DNA用BglII或HindIII消化。BglII不能在T-DNA中切割，因此这一消化将产生一条包含整个T-DNA以及T-DNA右和左边位点两翼的染色体序列的片段。该片段至少为7.5 kb。HindIII在T-DNA切割一次，来自pAN7.1的针对hph基因的探针只能检测携带潮霉素表达盒T-DNA片段和T-DNA左边的翼端染色体序列。该片段至少为5kb。Southern分析(见图4)表明，在两种转化子中，T-DNA已整合到一个单一的染色体位点。这在分子水平证明了转化的表型。
使用潮霉素抗性基因的PEG介导的原生质体转化的文献数据显示转化频率为每ug 5-20转化子(Punt等，Gene 56(1987)117-124)到高达每ug 17000转化子(Mohr和Esser，Appl.Microbiol.Biotechnol.34(1990)63-70)。但是，后一作者在其出版物中提到：
“在完全培养基对初级分离物进行菌落纯化后，仅有少数菌株(约10％)在潮霉素平板上生长。”
很明显，他们在选择方法上遇到了困难。在使用argB基因通过电转化对完整的发芽分生孢子进行转化时，每ug 0.5-4转化子的转化频率已有介绍(Ozeki等，Biosci.Biotech.Biochem.58(1994)2224-2227)。
实施例5  盘长孢状刺盘孢分生孢子的转化
在进行盘长孢状刺盘孢分生孢子的根癌农杆菌转化时，将100ul含有105或106分生孢子的小份与100ul按材料与方法中的介绍培养的根癌农杆菌混合。将混合物铺于含有5mM葡萄糖的IM平板上的硝酸纤维素膜上，并室温温育2天。此后，将滤膜转至曲霉基础培养基平板上，平板中含有200uM头孢噻圬以杀死农杆菌细胞和100ug/ml的潮霉素以选择转化子。在室温温育5天后，转化平板上出现菌落。使用105分生孢子的转化产生7个转化子，而使用106分生孢子的转化产生175个转化子。在阴性对照平板上没有得到菌落。1天后，阴性对照平板上开始出现小菌落。很明显，选择不够严厉，不能完全抑制非转化细胞的生长。为证明Hyg抗性表型，将来自11个推定转化菌落和3个来自阴性对照菌落的菌丝体转至含有200uM头孢噻圬和100ug/ml潮霉素的MM平板上。11个推定转化子中有8个在新的选择平板上能够生长。剩下的3个推定转化子和来自阴性对照实验的3个菌落不能生长。因此在这种情况下，转化也依赖于AS对vir基因的诱导。表3中描述的结果已对获得的假阳性结果进行了修正。转化产生每107分生孢子500至1300转化子。将一个转化子按实施例4的介绍用于Southern分析，这表明T-DNA整合到一个单一的染色体位点，这在分子水平上证明了转化表型。
Stephenson等(Aust.Soc.Biochem.Mol.Biol.26(1994)Pos-1-31)报道了少于100转化子每ug的转化频率。以前，Armstrong和Harris(Phytopathology 83(1993)328-332)已经报道了在使用benomyl杀真菌剂作为选择标记时每108原生质体2-50个转化子的转化频率。
实施例6  豌豆腐皮镰孢分生孢子的转化
在进行豌豆腐皮镰孢分生孢子的根癌农杆菌转化时，将100ul含有105或107分生孢子的小份与100ul按材料与方法中的介绍培养的根癌农杆菌混合。将混合物铺于含有5mM葡萄糖的IM平板上的硝酸纤维素膜上，并室温温育2天。此后，将滤膜转至曲霉基础培养基平板上，平板中含有200uM头孢噻圬以杀死农杆菌细胞和100ug/ml的潮霉素以选择转化子。结果在上表3中描述。
转化107分生孢子产生1个转化子，在阴性对照平板上没有观察到菌落。转化子的Hyg抗性表型通过在含有200uM头孢噻圬和100ug/ml潮霉素的MM平板上生长来证明。在这种情况下，转化也依赖于AS对vir基因的诱导。
当潮霉素抗性基因用于原生质体的PEG转化时，对腐皮镰孢f.sp.cucurbitae race2已经报道了每ug每107原生质体10000转化子的转化频率(Crowhurst等，Current Genetics 21(1992)463-469)。腐皮镰孢f.sp.phaseoli用PEG和乙酸锂转化时，如Marek等的报道(Curr.Genet.15(1989)421-428)，每ug产生0.2-3.3个转化子。
实施例7  禾本科镰孢分生孢子和再水化的冷冻干燥ATCC材料的转化
在进行禾本科镰孢分生孢子的农杆菌转化时，将100ul含有4×105分生孢子的小份与100ul按材料与方法中的介绍培养的根癌农杆菌混合。还将获自美国典型培养物保藏中心的再水化的冷冻干燥培养物用于转化。存于双重安瓿的冷冻干燥物质通过加入0.4ml的无菌水并在室温温育30分钟进行再水化。用于转化的物质已在4℃贮藏了约2周。将100ul的ATCC小份与200ul根癌农杆菌混合。将混合物铺于含有5mM葡萄糖的IM平板上的硝酸纤维素膜上，并室温温育2天。将ATCC材料的半数在IM平板上共同培养5天。此后，将滤膜转至PDA平板上，平板中含有200uM头孢噻圬以杀死农杆菌细胞和100ug/ml的潮霉素以选择转化子。
结果在上表3中描述。使用4×105分生孢子转化产生了1个转化子，它即为每107分生孢子25个转化子。就ATCC材料而言，当其已共同培养了5天后，获得了5个转化子。在阴性对照平板上没有获得菌落。转化子的Hyg抗性表型通过将转化子在含有200uM头孢噻圬和150ug/ml潮霉素的PDA平板中培养进行了证明。在这种情况下，转化也依赖于AS对vir基因的诱导。将ATCC物质转化后获得的两个转化子按实施例4中介绍的方法进行Southern分析。这表明T-DNA整合到一个单一的染色体位点，这在分子水平上证明了转化的表型。
采用PEG转化方法，用构巢曲霉乙酰胺酶基因转化5×106至2×107禾本科镰孢原生质体，可产生每ug 5个转化子的转化频率(Royer等，Bio/technology 13(1995)，p.1479-1483)。
实施例8  粗糙脉孢菌分生孢子的转化
在进行粗糙脉孢菌分生孢子的农杆菌转化时，将100ul含有105分生孢子的小份与100ul按材料与方法中的介绍培养的根癌农杆菌混合。将混合物铺于含有5mM葡萄糖的IM平板上的硝酸纤维素膜上，并室温温育2天。此后，将滤膜转至曲霉基础培养基平板上，平板中含有200uM头孢噻圬以杀死农杆菌细胞和200ug/ml的潮霉素以选择转化子。结果在上表3中描述。在第一组实验中，使用105分生孢子产生了约50个转化子，而1/10的稀释物产生了5个转化子。在第二组实验中，使用105转化子也产生了约50个转化子。这说明转化能产生高至每107分生孢子5000个转化子。20个转化子的Hyg抗性表型通过在含有200uM头孢噻圬和200ug/ml潮霉素的曲霉基础培养基平板上培养转化子进行了证明。在这种情况下，转化也依赖于AS对vir基因的诱导。将两个转化子按照实施例4的方法用于Southern分析。这表明T-DNA整合到一个单一的染色体位点，这在分子水平上证明了转化的表型。
粗糙脉孢菌已用多种方法进行了转化。已经使用潮霉素抗性基因用电转化对发芽分生孢子进行了转化，获得了每ug每107分生孢子3000至6000转化子的转化频率(Chakraborty等，Can.J.Microbiolo.37(1991)858-863)。发芽分生孢子的乙酸锂转化产生了每ug每107分生孢子2至10个转化子的转化频率(Dhawale等，Curr.Gen.8(1984)77-79)。原生质体的PEG转化产生了范围为每ug 400至15000转化子的转化频率(Vollmer和Yanofsky，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)4867-4873)。
实施例9  雷西木霉分生孢子的转化
在进行雷西木霉分生孢子的农杆菌转化时，将100ul含有105或107分生孢子的小份与100ul按材料与方法中的介绍培养的根癌农杆菌混合。将混合物铺于含有5mM葡萄糖的IM平板上的硝酸纤维素膜上，并室温温育2天。此后，将滤膜转至曲霉基础培养基平板上，平板中含有200uM头孢噻圬以杀死农杆菌细胞和100ug/ml的潮霉素以选择转化子。
结果在上表3中描述。使用107分生孢子产生了约240个转化子，而使用105分生孢子产生了约12个转化子。这表明转化频率在每107分生孢子240至1200转化子之间变化。9个转化子的Hyg抗性表型通过在含有200uM头孢噻圬和100ug/ml潮霉素的曲霉基础培养基平板上培养进行了证明。在这种情况下，转化也依赖于AS对vir基因的诱导。将两个转化子按照实施例4的方法用于Southern分析。这表明T-DNA整合到一个单一的染色体位点，这在分子水平上证明了转化的表型。
当相同的潮霉素选择标记基因(pAN7.1)用于原生质体的PEG转化时，每ug每107原生质体可获得100个转化子(Mach等，CurrentGenetics 25(1994)567-570)。当潮霉素基因两翼为来自雷西木霉自身的同源表达信号时，Mach等报道每ug每107原生质体1800至2500转化子的提高的转化频率。Gruber也报道了相似的结果(Curr.Genet.18(1990)447-451)。使用异源载体，他们获得了每ug约800至1500转化子。一种含有同源pyrG基因的载体每ug可产生高达12000转化子。
实施例10  糙皮侧耳分生孢子的转化
食用蘑菇的转化的文献很少。Peng等人(Curr.Genet.22(1992)53-59)成功地转化了糙皮侧耳，但转化菌株不稳定。而最近，Yanai等(Biosci.Biotech.Biochem.60(1996)472-475)获得了糙皮侧耳的稳定转化子。
在进行糙皮侧耳分生孢子的农杆菌转化时，使用了两种方法。在实验1中，1.25×107分生孢子的小份与150ul按材料与方法中的介绍培养的根癌农杆菌混合。将混合物铺于含有5mM葡萄糖的IM平板上的硝酸纤维素膜上。在实验2中，2.5×107分生孢子铺于PDA平板上的硝酸纤维素膜上，并在室温预温育4天。接着，将滤膜转至一个培养皿，浸入25ml IM中的农杆菌培养物中(按材料与方法中的介绍培养6小时)，并在室温温育1小时。此后，将滤膜置于一个含有5mM葡萄糖的IM平板。将平板在室温温育3或6天。此后，将滤膜转至PDA平板上，平板中含有200uM头孢噻圬以杀死农杆菌细胞和75ug/ml的潮霉素以选择转化子。共培养6天后的结果在上表3中描述。使用107分生孢子转化产生了约48个转化子。
当分生孢子直接用于转化时，仅在共培养6天后获得转化子(实验1)。但当分生孢子在转化前预温育4天时(实验2)，在共培养3天和6天后获得转化子，尽管3天后转化子的数目低于6天后：是10而不是48。在此情况下，转化也依赖于AS对vir基因的诱导。
当在原生质体的PEG转化使用相同的潮霉素选择标记基因(pAN7.1)时，可获得约每ug每107活原生质体546个转化子(Peng等，Curr.Genet.22(1992)53-59)。使用bialaphos作为一种显性选择标记，Yanai等(Biosci.Biotech.Biochem.60(1996)472-475)获得了约每ug 2个转化子。
实施例11  二孢蘑菇分生孢子的转化
在进行二孢蘑菇的农杆菌转化时，使用来自商业菌株Horst U1(购自“Proefstation yoor de Champignmoncultuur”，P.O.Box6042，5960 AA Horst，荷兰)的分生孢子。使用下面的培养基使分生孢子萌发。一种购自Oxoid的Maltextract琼脂(MOX，50gr/l，包含Maltextract、真菌胨和琼脂)或一种“Proefstation voor deChampignoncultuur”确定的Maltextract琼脂(MPrf；2％Maltextract、10mM MOPS、1.5％琼脂、用KOH调至pH7.0)。将约1.2×107分生孢子铺于MOX或MPrf培养基上的硝酸纤维素膜上。将一种二孢蘑菇繁殖粒(也购自“Proefstation voor deChampignoncultuur”)置于围绕滤膜的琼脂，来促进分生孢子的发芽。培养皿用封口膜密封。平板在室温下温育5或7天。接着，将滤膜转移一个培养皿中，并浸入25ml的IM中根癌农杆菌培养物中(按材料与方法中的介绍培养6小时)。在转化时，使用根癌农杆菌菌株LBA1126(Bundock & Hooykaas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(1996)15272-75)，该菌株中导入了二元载体pUR5750。该菌株LBA1126按照限制使用的要求获自Bundock等工作的StateUniversity Leiden。将滤膜在室温下温育1小时。此后，将滤膜置于含有5mM葡萄糖的IM平板，并将平板在室温下温育5天。此后，将滤膜转至MOx或MPrf平板，平板中含有200uM头孢噻圬以杀死农杆菌细胞和25ug/ml的潮霉素(Van Rhee等，Mol.Gen.Genet 250(1996)252-258)以选择转化子。在温育大约5周后潮霉素抗性菌落开始出现。在五组转化中，获得了10个转化子(见上表3)。转化子用两种培养基并在转化前预温育5和7天获得。在这种情况下，转化也依赖于AS对vir基因的诱导。将7个转化子进一步在含有200uM头孢噻圬和含有或不含25ug/ml的潮霉素MPrf平板上培养。如实施例4所述对4个转化子进行Southern分析(见图5)，结果表明在所有的转化子中，T-DNA已整合到染色体DNA中，这在分子水平证明了转化的表型。
栽培蘑菇二孢蘑菇最近已由Van Rhee等(Mol.Gen.Genet 250(1996)252-258)进行了转化。但尽管它们能够转化一种单一的同核菌株ATCC 24663，它们不能直接转化商业的异形核的菌株Horst U1，后一菌株被广泛用于食用蘑菇的生产。就此菌株而言，在获得转化子前首先必须选择一种类似ATCC24663表型的衍生菌株。该菌株是一种重要的作物，在1990年全世界产量为150万吨(Van Rhee等，Mol.Gen.Genet 250(1996)252-258)，但在此菌种种应用生物技术仍受到缺乏一种通用的转化系统的阻碍。在蘑菇培养物中应用生物技术能大大提高质量和作物产量。
实施例12  泡盛曲霉中多拷贝基因的定点整合
实验设计：
在霉菌泡盛曲霉定点整合一种基因的多拷贝的实验设计显示于图6。该系统的基础包括两个组分，(1)一种含有purG基因并带有3’删除的真菌菌株，和(2)一种含有一个适用于在重组时恢复pyrG基因的二元载体的农杆菌菌株。该二元载体在T-DNA两边界之间含有一个修复结构，此修复结构携带一个5’缺失的pyrG基因。这样两个剪短的pyrG基因均具有共同的pyrG基因部分，并作为重组位点起作用。其他重组位点必须在pyrG基因的下游，这样在重组时pyrC基因得到恢复。
为导入至少一个其他基因，二元载体应在其两个重组位点之间，优选在剪短的pyrG基因的下游，含有多拷贝的至少一种编码所需蛋白的基因。作为一种替代方法，可以设想，当目标位点含有一个5’删除并且修复结构含有要导入的基因时，与至少一种基因的导入在3’删除的pyrG基因上进行的重组也可在要导入基因的上游进行第二次重组。但是，在这种情况下，必须注意不能干扰pyrG基因的启动子。
为特异性地检测同源重组整合，内源性的pyrG基因用作选择性标记基因(Gouka等，Current Genetics 27(1995)536-540)。
                  靶位点的构建
质粒pUR5710(图7)按下面的方法构建：将一个含有pyrG基因的5’部分的2.0kb的BamHI/SalI片段克隆到用BamHI和SalI消化的通用克隆载体pIC20R(Marsh等，Gene 32(1984)481-485)中，该片段存在于质粒pAW4.1上(Gouka等，见上文)。接着，将一个含有I-SceI内切酶的18bp识别位点(5’-TAGGGATAACAGGGTAAT-3’＝SEQ.ID.NO.1)并在两翼含有SalI和HindIII的合成DNA接头克隆到用SalI和HindIII消化的质粒pUR5710中。这产生质粒pUR5711(见图7)。质粒pUR5712(见图7)按下面的方法构建，将一个含有pyrG编码区下游序列的2.0kb的HindIII片段克隆到用HindIII消化的质粒pUR5711中，该片段存在于质粒pAW4.4(Gouka等，见上文)。该HindIII片段相对于pyrG基因编码区的方向与野生型的位置相同。质粒pUR5712被用来构建泡盛曲霉突变体pyrG-菌株AWCSCE。
        泡盛曲霉突变体pyrG-菌株AWCSCE的构建
野生型泡盛曲霉菌株的转化使用获自质粒pUR5712的纯化的(Qiaex凝胶分离试剂盒；Qiagen cat.no.20021)EcoRI片段进行，该片段含有突变的pyrG基因，并且删除位点含有I-SceI限制酶切位点(见图6和7)。每2×106原生质体用10ug的DNA转化。因为pyrG-菌株对5-FOA(5-氟-乳清酸，Boeke等Mol Gen Genet 197(1984)345-346)有抗性，pyrG-转化子可直接从野生型菌株中选择出来。转化子在补加了10mM尿苷、0.75mg/ml的5-FOA的MM平板(AspA被AspA-N取代，50×Aspa-N＝0.35M KCl、0.55M KH2PO4、用KOH将pH调至6.5)进行选择，并含有10mM脯氨酸作为氮源。所获转化子的突变表型通过使这些菌落在没有尿苷的MM平板上生长来检查。将两个不能在没有尿苷的情况下生长的转化子用Southern印迹分析作进一步的分析。观察到的DNA图谱与菌株AWCSCE的预期图谱一致。
                 多拷贝载体的构建
在构建质粒pUR5173时(见图8A)，质粒pAW4.4(Gouka等，见上文)用HindIII消化，将HindIII用Klenow补平，并接着用BamHI消化。分离所产生的1.6kb片段，该片段含有pyrG编码区下游的序列。而且，质粒pAW4.20(Gouka等，见上文)用BamHI和HindIII消化，分离0.4kb片段，该片段含有位于上面介绍的1.6kb片段的紧接上游的序列。将0.4kb的HindIII/BamHI和1.6kb的BamHI/补平的HindIII片段同时克隆到用HindIII和SmaI消化的通用克隆载体pBluescriptRSK(Stratagene)中，产生质粒pUR5713。
质粒pUR5714(见图8B)按下面的介绍构建：将一个1.0kb的含有pyrG基因的3’部分的BglI/HindIII片段克隆到用BamHI和HindIII消化的通用克隆载体pBluescriptRSK中，该片段存在于载体pAW4.1上。粘粒pUR5716(见图9)衍生自粘粒载体pJB8(Ish-Horowicz，D.和Burke，J.F.；Nucleic Acids Res 9(1981)2989))，它是通过用含有一个EcoRI和NotI限制酶切位点并具有下面序列的合成接头取代EcoRI/HindIII多接头片段获得的(见SEQ.ID.NO.2)：(5’-AATTC AT GCGGCCGC T-3’
        3’-G TA CGCCGGCG ATCGA-5’)
在此克隆步骤，HindIII位点丧失。粘粒pUR5718(见图9)通过同时将来自质粒pUR5714的1.0kb NotI/HindIII片段和来自质粒pUR5713的2.0kb HindIII/NotI片段克隆到NotI消化的质粒pUR5716中来获得。这样，此载体携带一个与泡盛曲霉突变体pyrG-菌株AWCSCE中pyrG靶位点的I-SceI位点的两侧都同源的序列。
质粒pUR5729(见图10)按下面方法构建，由质粒pUR7385(VanGemeren等，Applied Microbiology and Biotechnology 45(1996)755-763)将约1.5kb的PstI/SacI片段克隆到用PstI和SacI消化的通用克隆载体pIC19H中(Marsh等，见上文)，该片段含有来自豌豆腐皮镰孢的角质酶基因的开放阅读框(ORF)(cDNA的合成拷贝，Van Gemeren等，Journal of Biotechnology 40(1995)155-162)，此开放阅读框在来自泡盛曲霉的exlA基因的启动子和终止子的控制之下(Gouka等，Applied Microbiology and Biotechnology 46(1996)28-35)。
以粘粒pUR5718为基础，构建了一个含有在exlA表达信号控制下(如上文介绍)的角质酶基因的多个拷贝的新粘粒pUR5725。从质粒pUR5729以1.5kb的HindIII片段的形式分离此表达盒的一个单个拷贝，并将其连接到用HindIII消化的粘粒pUR5718中。在使用λ-DNA体外包装组件(Amersham；编码RPN1717)包装连接混合物后，将包装混合物转化到大肠杆菌菌株1046中(均按照组件提供的方法)。由此转化，获得了粘粒pUR5725(见图11)，它含有顺序排列的9拷贝的表达盒。
为制备一种能用于转化真菌的根癌农杆菌载体，构建了霉菌质粒pUR5752。这是一种二元载体，它在T-DNA的左和右边界重复序列之间含有一个单一的NotI位点，它是由质粒pSDM14(R.Offringa，phD.论文“使用农杆菌昨天系统在植物中进行基因打靶”；LeidenUniversity，Leiden 1992)通过用KpnI和BamHI消化并与下列退火的寡核苷酸连接而衍生的：
MGANotI：5’-CAATGCGGCCGCTAAG-3’(＝SEQ.ID.NO.3)
MGANotII：5’-CATGGTTACGCCGGCGATTCCTAG-3’(＝SEQ.ID.NO.4)
质粒pUR5752用于将多拷贝的约1.5kb片段导入NotI位点，该1.5kb片段含有由泡盛曲霉内木聚糖酶启动子和转录终止序列控制下的豌豆腐皮镰孢角质酶基因。因此，将一个来自pUR5725(见上文)、含有9拷贝的角质酶表达盒的17kb NotI片段连接到pUR5752的NotI位点。通过这种连接方法，获得了含有9个拷贝的表达盒的质粒pUR5756(见图12)和仅含4拷贝的表达盒(可能是因为在连接过程中通过分子内重组导致拷贝丢失)的质粒pUR5755。
用作一种对照，质粒pUR5753(不含任何角质酶基因)按如下方法构建，由质粒pUR5718(见上文)将一个3.0kb的NotI片段克隆pUR5752的NotI位点，该片段含有5’删除且具有下游序列的pyrG基因。除了没有HindIII位点之间的9拷贝基因外，质粒puR5753与质粒pUR5756相同，没有9拷贝的基因产生了一种含有下面元件的质粒：左边界、NotI位点、5’缺失的pyrG基因、HindIII位点、pyrG基因的3’下游序列、NotI位点、右边界。
质粒pUR5752和质粒pUR5753都可用于将任何同源或异源基因导入NotI位点或HindIII位点。
                转化和转化子的分析
在转化泡盛曲霉菌株AWCSCE时，使用含有二元载体pUR5753、pUR5755和pUR5756的根癌农杆菌菌株LBA1126(Bundock &Hooykaas，PNAS 93(1996)15272-75，其限制性使用见上文)。转化按上文材料与方法中的对分生孢子的介绍进行，除了IM培养基平板中另外含有1mM尿苷。
温育7天后获得转化子。使用106分生孢子的平均转化频率对pUR5753和pUR5755分别为17和30。但对pUR5756仅为0.5转化子。后一结果表明，每107分生孢子可获得5个含有多拷贝的角质酶表达盒的转化子。这个数字相当高，因为用传统的原生质体转化只可能在一个特定的位置整合一个单拷贝的基因，并且转化频率仅为每转化107原生质体1-2转化子(Gouka等，(1995)见上文)。
大量的转化子在曲霉基础培养基上纯化了两次，并从PDA平板上分离分生孢子。将转化子进行Southern分析来证实：a)表达盒的拷贝数，b)表达盒的整合位点，以及c)T-DNA两边界重复序列之外的DNA是否被整合。基因组DNA用BglI或SalI消化，将片段在0.7％琼脂糖凝胶上按大小分离，并印迹到Hybond-N膜上。杂交按前面的介绍进行，使用一个0.5kb的AflII/SacI片段作为探针，该片段含有泡盛曲霉exlA终止子，此终止子存在于角质酶表达盒。
当DNA用SalI消化时，所有的转化子都含有一个约5kb的杂交片段，它相当于内源性的exlA SalI片段。用pUR5755和pUR5756获得的转化子显示含有第二个杂交片段，它包括全部的PexlA-角质酶-TexlA表达盒。大小可表明存在于片段上的基因拷贝数目。我们发现在待测菌株中，整合了不同数目的表达盒。例如，在用含有衍生自质粒pUR5755(原来含有4个拷贝)的DNA的农杆菌转化的菌株#8、#9和#10含有2个拷贝，而在菌株#13、#14、#15和#17中存在4个拷贝，在菌株#12中存在7或8个拷贝，在菌株#16中存在9个拷贝，这些菌株均用含有衍生自质粒pUR5756(原来含有9个拷贝)的DNA的农杆菌转化。这些结果用BglI消化DNA进行了证明。后者在表达盒中切割一次，因此所有表达盒都以一个单一的1.5kb的杂交片段的形式存在。此杂交片段的强度可显示拷贝数目，并与上面SalI限制酶切片段获得的拷贝数一致。
而且，所有含有角质酶表达盒的转化子还另外含有一个1.8kb的杂交片段，该片段为与探针杂交的5’翼端片段。整合谱均与在pyrG位点的整合相匹配。这也为使用一个2.4kb BamHI/HindIII片段的相似DNA印迹的杂交所证实，该片段含有泡盛曲霉pyrG基因。另外，一个相当于内源性的exlA基因的5kb杂交片段存在于所有的转化子。最后，一个11.9kb的来自质粒pUR5750的HindIII/EcoRI片段被用来分析可能存在的细菌DNA序列，该片段含有T-DNA边界重复之外的根癌农杆菌DNA序列。没有转化子显示杂交信号，这表明它们均不含有细菌DNA。
总而言之，泡盛曲霉显示能用一种含有多拷贝的模型基因的根癌农杆菌进行转化，转化频率比传统的转化方法高。使用此系统，多基因拷贝可定向到pyrG位点，并且不整合不需要的细菌序列。
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根据布达佩斯条约进行微生物保藏的信息在本文19页26-29行中给出。根据EPC Rule 28(4)或非EPC缔约国的相似规定，这种保藏物的样品在索取时仅呈送给专家。

Claims (12)

1.一种制备转化的霉菌的方法，其特征为：
(1)首先将一种DNA片段克隆到一种根癌农杆菌载体上的T-DNA两边界之间，该DNA片段含有至少一个要被导入霉菌的可表达基因；
(2)将在T-DNA两边界之间含有该DNA片段的载体导入一种在其DNA中含有一个vir区域的根癌农杆菌菌株；
(3)通过加入一种vir诱导化合物使含有所说DNA片段的T-DNA从所说的根癌农杆菌中释放，并将根癌农杆菌菌株与需要转化的霉菌一起温育；并
(4)根据导入DNA或其表达产物的特征将转化的霉菌从未转化的霉菌中选择出来，并
可任选培养转化霉菌。
2.权利要求1的方法，其中霉菌属于真菌门。
3.权利要求1的方法，其中霉菌选自真菌亚部子囊菌、担子菌、半知菌、鞭毛菌和接合菌。
4.权利要求1的方法，其中DNA片段含有一种所需基因的多拷贝。
5.权利要求1的方法，其中DNA片段被整合到霉菌基因组的一个选择位点。
6.权利要求5的方法，其中DNA片段整合在霉菌基因组的pyrG位点(在黑曲霉中为pyrA位点，在粗糙脉孢菌中为pyr4位点)。
7.权利要求5的方法，其中转化霉菌不含任何不需要的细菌DNA序列，包括T-DNA边界。
8.一种可用权利要求7的农杆菌介导的转化获得的转化霉菌，它不含任何不需要的细菌DNA序列，包括T-DNA边界。
9.一种培养权利要求8的转化霉菌的方法，可任选诱导所需蛋白的产生。
10.权利要求1的方法，其中DNA片段随机整合在霉菌基因组中。
11.一种可用权利要求10的农杆菌介导的转化获得的转化霉菌，它含有T-DNA边界序列的一个或多个部分。
12.一种培养权利要求11的转化霉菌的方法，可任选诱导所需蛋白的产生。
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