ES2302739T3 - Metodo para la transformacion del agaricus bisporus. - Google Patents

Abstract

Un método de transformación de un hongo filamentoso comprendiendo lo que sigue: Introducción en células de un tejido de cuerpo fructífero de dicho hongo de un constructo de polinucleótido cuya presencia se desea en una célula receptora de hongo filamentoso por transformación mediada por Agrobacterium, comprendiendo dicho Agrobacterium dicho constructo de polinucleótido dentro de bordes de ADN-T y una región de Agrobacterium vir en presencia de un compuesto inductor vir.

Description

Método para la transformación del Agaricus bisporus.

Campo de la invención

Esta invención tiene que ver en general con el campo de la biología molecular. Más concretamente, esta invención se refiere a la caracterización de métodos novedosos para la transformación de hongos con un elevado rendimiento. Los métodos de la invención se pueden usar para mejorar las especies de hongos mediante tecnologías recombinantes conocidas por los expertos en la materia, como la manipulación para un aumento de la resistencia a los patógenos, a las plagas y a los pesticidas, y de rendimiento y calidad, mayor vida en almacén, una mejora del valor culinario, nutricional y medicinal, y factores similares, así como para la producción comercial de proteínas heterólogas.

Antecedentes de la invención

Los hongos son organismos microscópicos portadores de esporas y carentes de clorofila, y que por ello derivan su nutrición de materia orgánica muerta o viva. Introductory Mycology (eds.). Alexopoulos. C. J., Mims, C.W., y Blackwell, M. (1996). 4ª edición. Capítulo 1. Debido a que comparten rasgos tanto de las plantas como de los animales, se les clasifica por separado en el reino Fungi, o de los hongos. Dentro de este reino existen los "hongos filamentosos", que se designan así debido a que sus cuerpos vegetativos se componen de pequeños filamentos o hilos que se conocen como "hifas". Por regla general, las hifas se desarrollan de forma ramificada, y se extienden sobre o penetrando en el sustrato que se usa como fuente de alimentación, con lo que forman una red de hifas que se designa como "micelio". Así, el micelio es el cuerpo vegetativo del hongo. En el ciclo vital de la mayor parte de los hongos filamentosos, el micelio vegetativo da origen a esporas bien asexuales, bien sexuales. Las esporas asexuales se designan con una diversidad de nombres, pero los términos comúnmente usados son "conidias", "conidiosporas" o sencillamente "esporas". El micelio vegetativo del hongo puede diferenciarse, con los estímulos biológicos y medioambientales apropiados, en una estructura reproductiva portadora de esporas sexuales. Algunos hongos producen unas estructuras reproductoras portadoras de esporas, de bastante tamaño, y fibrosas ("carnosas"), que reciben diversas apelaciones como "setas", "cuerpos fructíferos", "basidiocarpos", "ascocarpos", "cuernos" o "basidomos". Los cuerpos fructíferos de algunos hongos son comestibles; son apreciados por sus cualidades culinarias, nutritivas o medicinales, y, por ello, son muy buscados, o cultivados comercialmente.

El cuerpo fructífero se puede diferenciar en tejidos especializados como el sombrero carnoso con forma de paraguas (pileus), el tallo, la vaina en la base del tallo (volva), y laminillas (lamellae) portadoras de las esporas sexuales. Un delgado tejido conocido como el velo (velium) puede cubrir la parte inferior del sombrero. El velo se rompe al llegar el cuerpo fructífero a la madurez, exponiendo las laminillas y permitiendo la descarga de las esporas sexuales al ambiente. Sin embargo, los cuerpos fructíferos de algunos hongos carecen totalmente de laminillas, y en su lugar se componen de un tejido carnoso perforado con diminutos poros o lóculos portadores de esporas sexuales. Las esporas sexuales producidas por las estructuras carnosas reproductivas de los hongos se describen mediante numerosos términos, como por ejemplo "ascósporas", "basidiosporas", o sencillamente "esporas".

Así, el cuerpo fructífero de los hongos es comparable en su funcionalidad con la estructura reproductiva de las plantas conocida como la flor, a la vez que las esporas tanto asexuales como sexuales son comparables con las semillas de las plantas, importantes para la dispersión y supervivencia del hongo en la naturaleza. Bajo condiciones ambientales idóneas, la espora germina para formar otra generación de hifas vegetativas, completando así el ciclo vital del hongo.

Los hongos filamentosos juegan un papel vital como uno de los principales descomponedores dentro de sus diversos hábitats naturales. También tienen un gran impacto sobre la producción de alimentos. Algunos hongos, como los champiñones, se usan como alimento, mientras que otros son patógenos de las plantas, y culpables de calamitosas pérdidas de cosechas por todo el mundo. Los hongos filamentosos son también importantes en la industria y en medicina al segregar un conjunto diverso de enzimas (p. ej., proteasas, lipasas) así como metabolitos primarios (p. ej., ácidos orgánicos) y secundarios (p. ej., los antibióticos penicilina y cefalosporina). El hongo cultivado Agaricus bisporus constituye una cosecha significativa, con una producción mundial en 1990 de 1,5 millones de toneladas. Los hongos filamentosos son también atractivos como huéspedes para la producción a gran escala de proteínas tanto homólogas como heterólogas, porque tienen la capacidad de segregar cantidades sustanciales de proteínas.

Alrededor del 40% de las enzimas comercialmente disponibles se derivan de hongos filamentosos. Lowe, Handbook of Applied Mycology. Fungal Biotechnology (eds.) Arora, D.K. Elander, R.P. & Mukerji, K.G. 681-708 (Marcel Dekker, New York; 1992). Estas enzimas son generalmente producidas por especies del género Aspergillus y Trichoderma. Debido a que segregan grandes cantidades de proteína al medio, se pueden cultivar con fermentación a gran escala, y se aceptan generalmente como seguras para la industria alimentaria. Los problemas generales asociados con el cultivo comercial de los champiñones (A. bisporus) incluyen enfermedades causadas por patógenos como el Verticillium fungicola (burbuja seca), los biotipos 2 y 4 de Trichoderma harzianum (moho verde), Pseudomonas tolaasii (pústula bacteriana), y el virus de ARNds (enfermedad de La France y enfermedad de parches), la grave plaga de insectos [la mosca negra [sciaridae] (Lycoriella mali), una breve vida en estantería del producto relacionada con el deterioro bacteriano y un rápido envejecimiento, y el oscurecimiento parduzco (magulladura) del cuerpo fructífero asociado con la acción de polifenoloxidasas endógenas (PPO, como la tirosinasa). Para mejorar la calidad del producto, los programas de cría convencionales para el A. bisporus han tenido un éxito solo moderado y puede que no sean suficientes a largo plazo. Esto se debe a que las técnicas convencionales de cría para los hongos consumen mucho tiempo, y debido a que la variación genética en las líneas comercialmente disponibles es limitada, y ofrecen poco avance mediante selección (Horgen et al, "Homology between mitochondrial DNA of Agaricus bisporus and an internal portion of a linear mitochondrial plasmid of Agaricus bitorquis" Curr Genet. 1991 Jun;19(6):495-502.

En el caso del A. bisporus, el principal problema para unas estrategias efectivas de cría surge debido al ciclo vital más bien anormal que involucra la excepcional segregación simultánea de cualquiera de ambos núcleos parentales en una basidiospora. Después del desarrollo de esta basidiospora, se forma el micelio heterocariótico que contiene núcleos y características genéticas que no difieren de las presentes en el micelio parental. Además, solo se observa una poca actividad recombinante durante la meiosis (Summerbell et al. Genetics, Oct. 123(2) 1989 pp. 293-800).

Por esta razón, investigadores por todo el mundo han tratado de desarrollar un sistema de transformación para los champiñones comerciales, como el A. bisporus, con el fin de introducir características novedosas. En el caso de otros hongos, así como de plantas, animales y bacterias, es bastante común la tecnología de transferencia genética, y ya ha resultado en su aplicación comercial. Sin embargo, la ausencia de un sistema eficiente, reproducible y estable de transformación, generalmente aplicable a un antecedente de tipo silvestre en muchos hongos, ha entorpecido gravemente la investigación en biología molecular en esta clase de organismos.

Las actuales técnicas de transformación para hongos han incluido una combinación de CaCl_{2} y de polietilenglicol (PEG), electroporación, y bombardeo de partículas para introducir ADN en protoplastos, micelio o esporas. Dichas técnicas o bien no han sido coronadas con el éxito o bien no son reproducibles. La ausencia de un sistema práctico de transferencia genética es el mayor obstáculo en solitario que impide el uso de planteamientos moleculares para la mejora genética de los champiñones. A pesar de un considerable interés en el desarrollo de un esquema de transformación, no hay ningún método en uso general en la actualidad, debido a un bajo rendimiento o falta de utilidad y provecho.

En recientes planteamientos, se han transformado varios hongos, incluyendo el A. bisporus, usando un sistema de transformación basado en el Agrobacterium. Aunque estos métodos son más cómodos que los sistemas existentes basados en protoplastos, hasta el presente han adolecido de un rendimiento relativamente bajo de transformación usando sistemas complicados.

Por ejemplo, Gouka et al. describen una transformación para recombinaciones homólogas dirigidas en hongos (Gouka et al. Nature Biotechnology Vol 17 June 1999, "Transformation of Aspergillus awamori by Agrobacterium tumefaciens-mediated homologous recombination" pp 598-601). Según este procedimiento se usan una cepa receptora A. awamori diseñada específicamente y que contiene un gen no funcional pyrG borrado en 3' y una cepa de Agrobacterium que contiene un vector binario idóneo para restaurar el gen pyrG mediante recombinación. La recombinación homóloga entre el constructo de reparación y el huésped receptor resulta en la restauración del gen funcional pyrG y la integración del vector en el locus pyrG. El artículo informaba de un máximo de 150 transformantes por 10^{7} conidias.

De Groot et al informan de otro método basado en el Agrobacterium para la transformación de hongos filamentosos (De Groot et al. Nature Biotechnology Vol 16 September 1998, "Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi" pp. 839-842). Este artículo investigaba la capacidad del Agrobacterium para transferir ADN-T a los protoplastos del A. awamori (células vegetativas de las que se han extraído las membranas celulares) y conidias. La frecuencia de transformación varió desde aproximadamente 800 a 7200 transformantes por 10^{7} protoplastos, o sea, hasta 600 veces superior que las tasas de transformación de PEG. Cuando se usaron conidias, la frecuencia de transformación varió de 1000 a 9000 transformantes por 10^{7} conidias. También se usó tejido micelial vegetativo.

En WO95/02691 y WO98/45455 se divulgan otros sistemas de transformación. Todos ellos se centran en transformaciones con el uso de protoplastos, esporas y micelio vegetativo como tejido receptor.

Como puede verse por lo anterior, hay en la técnica una necesidad continuada de desarrollo de sistemas efectivos, cómodos y rápidos de transformación de hongos.

Por tanto es un propósito de la presente invención proporcionar un sistema de transformación para hongos que supla la necesidad mencionada.

Un propósito adicional de esta invención es proporcionar mecanismos para la aplicación de técnicas transgénicas como las aplicadas a bacterias, a hongos no filamentosos (levaduras), plantas y animales para aumentar el rendimiento, la resistencia a las enfermedades y a las plagas, la calidad del producto, la vida en estantería, o el valor culinario, nutricional o medicinal, para la producción comercial, u otros protocolos semejantes.

Es también otro propósito de la invención proporcionar constructos de polinucleótidos, vectores, células transformadas, para su empleo en estos protocolos transgénicos.

Otro propósito de la presente invención es proporcionar constructos genéticos para la expresión o inhibición de productos genéticos en hongos filamentosos.

Otros propósitos de la invención se harán evidentes en la descripción que sigue de la invención.

Resumen de la invención

El método mejorado de transformación que se describe aquí proporciona un práctico método para el uso de tecnología transgénica en la mejora genética de hongos filamentosos, y representa una importante herramienta para el análisis genético molecular de los procesos biológicos en estos organismos. Además, el método posibilita la modificación genética de los hongos para que sirvan como biofermentos para la producción a gran escala de productos con importancia comercial, como, para dar un ejemplo, la hormona del crecimiento humano. Además, el protocolo de transformación, con modificaciones para la elección de promotor y cepa de Agrobacterium, es de aplicación a todas las especies de hongos con cuerpos fructíferos carnosos, y se puede optimizar mediante selección del Agrobacterium o del promotor. Entre los ejemplos de hongos filamentosos útiles para la invención se incluyen miembros de la clase Basidiomicetes y Ascomicetes como sigue:

Coprinus spp., Coriolus spp., Agaricus spp. incluyendo la especie bisporus, Flammulina velutipes, Lentinula edodes, Morchella ssp, Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus, Schizophyllum commune, y Tricholoma matsutake, entre otros.

Las técnicas transgénicas tradicionales para los hongos usan protoplastos, micelio vegetativo o esporas como célula o tipo de tejido receptor. Los solicitantes han encontrado para su sorpresa que cuando se usa tejido de estructura reproductiva sexual, esto es, el cuerpo fructífero, comprendiendo preferiblemente tejido laminar, las velocidades de transformación mejoran espectacularmente. El uso de este tejido en cualquier tipo de protocolo transgénico para hongos como se describe aquí comprende el más amplio aspecto de la invención.

En la presente invención se usa la transformación mediada por Agrobacterium.

Los solicitantes han ideado un sistema de transformación genética sumamente eficiente, cómoda y rápida para hongos filamentosos como el A. bisporus. El método preferido usa un protocolo de transformación mediado por el Agrobacterium. Las características críticas de este protocolo incluyen el cocultivo de la bacteria con tejido del cuerpo fructífero en lugar de basidiosporas. En una materialización preferida, se observaron rendimientos de transformación con el uso de un promotor homólogo en el constructo polinucleótido de expresión, para impulsar la expresión génica. Este método ofrece nuevas perspectivas para la mejora genética de especies de champiñones con importancia comercial así como de otras especies de hongos filamentosos, y potencia el uso de champiñones genéticamente modificados como biofermentadores para la producción en masa de productos comercialmente valiosos. Los métodos de la invención dieron un rendimiento de transformación de hasta el 92% (% de las piezas de tejidos regenerando colonias) basada en resistencia a los antibióticos (higromicina). Esto es de un orden de magnitud seis o siete veces superior al del método anteriormente comunicado de transformación mediada para el A. bisporus (\sim0,00003%). Además, se recuperaron transformantes en un plazo tan breve como el de 7 días mediante la invención que aquí se divulga en comparación con las 4 a 5 semanas para el método que se describió original-
mente.

Con el método de transformación de la invención, se pueden usar técnicas de ingeniería genética conocidas en la técnica y aplicadas rutinariamente a bacterias, a hongos no filamentosos, plantas y animales, para manipular genéticamente hongos filamentosos para facilidad de cultivo o producción, para la mejora del valor culinario, medicinal o nutricional, o para la producción de proteínas recombinantes para su cosecha.

La invención comprende además composiciones novedosas que incluyen productos proteínicos aislados de dichos hongos transgénicos. También se incluyen constructos de expresión para su uso en este procedimiento así como células y vectores transformados y hongos transgénicos que incorporan estos mismos.

El protocolo de transformación del cuerpo fructífero de la invención tiene una utilidad inmensamente superior, y ofrece un rendimiento efectivo superior y una mayor comodidad que otros métodos de transformación mediada por Agrobacterium, a la vez que es también más rápido.

Definiciones

Diversos términos relacionados con las composiciones y los métodos de la presente invención se han usado más arriba y también en la especificación y en las reivindicaciones, y a no ser que se indique en otro sentido, tendrán el significado que se especifica aquí.

Diversas unidades, prefijos y símbolos pueden denotarse en su forma aceptada a tenor del SI. A no ser que se indique en otro sentido, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3'; las secuencias aminoácidas se escriben de izquierda a derecha en la orientación amino a carboxi, respectivamente. El margen numérico es inclusivo de los números que definen dicho margen, e incluye cada uno de los enteros dentro del margen que se define. Los aminoácidos se pueden designar aquí bien por sus símbolos comúnmente conocidos de tres letras o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Igualmente, los nucleótidos se pueden designar por sus códigos de una letra comúnmente aceptados. A no ser que se disponga de otro modo, los términos de software, eléctricos y electrónicos que se usan aquí son según se definen en The New IEEE Standard Dictionary of Electrical and Electronics Terms (5th edition, 1993). Los términos que se definen más abajo quedan más plenamente definidos por referencia a la especificación como un todo.

Tal como se emplea aquí, el término "Agrobacterium" se usará con la intención de incluir cualquier especie bacteriana y sus variantes modificadas de forma conservadora que puedan infectar una célula fúngica deseada. Aquí se describe el plásmido Ti del Agrobacterium tumefaciens, pero la invención no queda limitada por ello. La elección de un vector bacteriano determinado no involucra nada más que la optimización rutinaria de parámetros por parte de los expertos en la materia. Otras bacterias pueden ser susceptibles de uso y están a disposición de los expertos en la materia por medio de suministradores como el Genbank.

Un "oligonucleótido antisentido" es una molécula con al menos 6 nucleótidos contiguos, preferiblemente complementarios de ADN (antigeno) o de ARN (antisentido), que interfiere con el proceso de transcripción o de traducción de proteínas endógenas de modo que los productos genéticos quedan inhibidos.

Un "vector de clonación" es una molécula de ADN como un plásmido, cósmido o bacteriófago que tiene la capacidad de replicarse de manera autónoma en una célula huésped. Los vectores de clonación suelen contener un sitio o una pequeña cantidad de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción en los que se pueden insertar secuencias extrañas de ADN de una forma determinable sin pérdida de función biológica esencial del vector, así como un gen marcador idóneo para su uso en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Los genes marcadores suelen incluir aquellos que proporcionan resistencia a antibióticos como la higromicina, tetraciclina o ampicilina.

Una "secuencia codificante" o "región de codificación" se refieren a una molécula de ácido nucleico que tenga una secuencia de información necesaria para producir un producto génico, cuando se expresa la secuencia.

El término "variantes modificadas de forma conservadora" es de aplicación tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a determinadas secuencias de ácidos nucleicos, variantes modificadas de forma conservadora se refiere a aquellos ácidos nucleicos que codifican variantes idénticas o modificadas de forma conservadora de las secuencias de aminoácidos. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína determinada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GOU codifican, todos ellos, el aminoácido alanina. Así, en cada posición en la que la alanina esté especificada por un codón, el codón se puede alterar a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones de los ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas" y representan una especie de variación modificada de forma conservadora. Aquí, cada secuencia de ácido nucleico que codifica también un polipéptido, por referencia al código genético, describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto en la materia reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto el AUG, que es generalmente el único codón para la metionina; y el UGG, que es generalmente el único codón para el triptófano) se puede modificar para conseguir una molécula funcionalmente idéntica. Así, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifique un polipéptido de la presente invención queda implícita en cada secuencia de polipéptidos que se describe y queda dentro del ámbito de la presente invención.

En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto en la materia reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia proteínica que altere, añade o suprima un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada de forma conservadora" donde la alteración resulte en la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Así, cualquier cantidad de residuos de aminoácidos seleccionados de entre el grupo de enteros consistentes de entre 1 a 15 se pueden alterar así. Así, por ejemplo, se pueden realizar 1, 2, 3, 4, 5, 7, o 10 alteraciones. Por regla general, las variantes modificadas de forma conservadora dan una actividad biológica similar a la de la secuencia polipeptídica no modificada de la que derivan. Por ejemplo, la especificidad de sustrato, la actividad enzimática o unión de ligando/receptor es por regla general de al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 80%, o 90% de la proteína nativa para su sustrato nativo. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos con una funcionalidad similar son cosa bien conocida en la técnica.

Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí:

1)

Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2)

Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3)

Asparagina (N), Glutamina (Q);

4)

Arginina (R), Lisina (S);

5)

Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y

6)

Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

Véase también, Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company.

El término "cosupresión" es un método para inhibir la expresión génica en organismos donde se introduce un constructo en un organismo. El constructo tiene una o más copias de secuencia que son idénticas a o que comparten homología de los nucleótidos con un gen residente.

Por "codificar" o "codificado", con respecto a un ácido nucleico especificado, se significa comprendiendo la información para traducción a la proteína especificada. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (p. ej., intrones) dentro de regiones traducidas del ácido nucleico, o puede carecer de dichas secuencias intercaladas no traducidas (p. ej., como en el ADNc). La información mediante la que se codifica una proteína se especifica con el uso de codones. Por regla general, la secuencia aminoácida está codificada por el ácido nucleico que usa el código genético "universal". Sin embargo, se pueden usar variantes del código universal, como las presentes en algunas mitocondrias de plantas, animales y hongos, en la bacteria Mycoplasma capricolum o en el ciliado Macronucleus, cuando el ácido nucleico se expresa en las mismas.

Cuando el ácido nucleico se prepara o altera sintéticamente, se puede conseguir ventaja de las preferencias conocidas de los codones del huésped en el que se desea expresar el ácido nucleico. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se puedan expresar tanto en especies de plantas como de hongos, las secuencias se pueden modificar para dar cuenta de las específicas preferencias de codón y de contenido en GC por cuanto se ha comprobado que estas preferencias difieren, como se describe en las referencias que aquí se citan.

El término "expresión" se refiere a la biosíntesis de un producto génico. La expresión génica estructural involucra la transcripción del gen estructural en ARNm y luego la traducción del ARNm en uno o más polipéptidos.

Un "vector de expresión" es una molécula de ADN que comprende un gen que se expresa en una célula huésped. Por regla general, se pone una expresión génica bajo el control de ciertos elementos reguladores incluyendo promotores, elementos reguladores específicos de tejidos, y potenciadores. De un gen así se dice que está "ligado operativamente a" los elementos reguladores.

Tal como se usa aquí, el término "cuerpo fructífero" incluye tejido o células de cualesquiera de los tejidos de la estructura reproductiva sexual de un hongo, aparte del micelio vegetativo y de las esporas, incluyendo el sombrero, el tallo, las láminas, el velo, la volva, etc.

Tal como se emplea aquí, "heterólogo" con referencia a un ácido nucleico es un ácido nucleico que se origina en una especie foránea, o, si en la misma especie, está sustancialmente modificado con referencia a su forma nativa en composición y/o en un locus del genoma por intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor enlazado operativamente a un gen estructural heterólogo procede de una especie diferente de aquella del que se derivó el gen estructural, o, si de la misma especie, uno o ambos están sustancialmente modificados con referencia a su forma original. Una proteína heteróloga puede originarse de una especie foránea o, si de la misma especie, está sustancialmente modificada respecto de su forma original por una intervención humana deliberada.

Tal como se usa aquí, el término "condiciones muy rigurosas" significará unas condiciones o una hibridación equivalentes a lo siguiente: hibridación durante 12 horas a 42ºC en un buffer conteniendo un 60% de formamida, SSPE 5 X, SDS al 2%, solución de Denhardt 10 X, y ADN de esperma de salmón 100 \mug/ml, y lavando con SSC 0,1 X, SDS 0,1% a 55ºC y exponiendo a una película Kodak X-Omat AR durante 4 días a -70ºC.

Por "célula huésped" se significa una célula que contiene un vector y que soporta la replicación y/o expresión del vector. Las células huéspedes pueden ser células procariotas como la E. coli, o células eucariotas como células fúngicas, insectos, anfibios o mamíferos. Preferiblemente, las células huéspedes son células fúngicas.

El término "introducido" en el contexto de insertar un ácido nucleico en una célula, significa "transfección" o "transformación" o "transducción", e incluye referencia a la incorporación de una adición nucleica a una célula eucariota o procariota en la que el ácido nucleico se pueda incorporar al genoma de la célula (p. ej., en el ADN del cromosoma, de un plásmido, de un plastidio, o mitocondrial). convertido en un replicón autónomo, o expresado de forma transitoria (p. ej., ARNm transfectado).

El término "constructo de polinucleótido" o "constructo de ADN" se usa a veces para designar una construcción de una expresión. Pero esto también incluye oligonucleótidos antisentido o nucleótidos proyectados para la cosupresión de secuencias en células huéspedes nativas o de secuencias extrínsecas que se correspondan, por ejemplo, con las que se encuentran en virus.

El término "ligado operativamente" significa que las secuencias reguladores necesarias para la expresión de la secuencia codificante aparecen en una molécula de ácido nucleico en las posiciones apropiadas en relación con la secuencia codificante de modo que posibilitan la expresión de la secuencia codificante. Esta misma definición se aplica a veces a la ordenación de otros elementos de control de transcripción (p. ej. potenciadores) en un vector de expresión.

Las secuencias de control de transcripción y de traducción son secuencias reguladoras del ADN, como los promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores y similares, que permiten la expresión de una secuencia codificadora en una célula huésped.

Tal como se usa aquí, "polinucleótido" incluye la referencia a un desoxirribopolinucleótido, a un ribopolinucléotido o a análogos de los mismos que tengan la naturaleza esencial de un ribonucleótido natural en que hibridizan, bajo rigurosas condiciones de hibridación, para dar sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos que los nucleótidos que aparecen en la naturaleza y/o permiten la traducción al mismo o a los mismos aminoácido(s) que el o los nucleótido(s) que aparecen en la naturaleza. Un polinucleótido puede ser de longitud total o una subsecuencia de un gen estructural o regulador nativo o heterólogo. Si no se indica en otro sentido, el término incluye la referencia a la secuencia especificada así como a la secuencia complementaria del mismo. Por ello, los ADNs o ARNs con esqueletos modificados para estabilidad o por otras razones como "polinucleótidos" tal como este término significa aquí. Además, los ADNs o ARNs que comprenden bases excepcionales, como la inosina, o bases modificadas, como bases tritiladas, para nombrar solo dos ejemplos, son polinucleótidos según el término se usa aquí. Se observará que se han realizado una gran variedad de modificaciones al ADN y al ARN que sirven a muchos propósitos útiles conocidos para los expertos en la materia. El término polinucleótido tal como se usa aquí abarca aquellas formas de polinucleótidos modificadas química, enzimática o metabólicamente, así como las formas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo, entre otras cosas, células simples y complejas.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan aquí de forma intercambiable para referirse a un polímero de amino y residuos. Los términos son de aplicación a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente que aparece en la naturaleza, así como de polímeros de aminoácidos que aparecen en la naturaleza. La naturaleza esencial de dichos análogos de aminoácidos naturales es que, cuando son incorporados en una proteína, aquella proteína es específicamente reactiva a anticuerpos que responden a la misma proteína pero consistente totalmente de aminoácidos que aparecen en la naturaleza. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" incluyen también modificaciones que incluyen pero sin limitarse a la fosforilación, hidroxilación y ADP-ribosilación. Se apreciará, como es bien sabido y como se observa más arriba, que los polipéptidos no son completamente lineales. Por ejemplo, los polipéptidos pueden ser ramificados como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser circulares, con o sin ramificaciones, generalmente como resultado de eventos postraduccionales, incluyendo eventos de procesamiento natural y eventos producidos por manipulación humana, que no suceden naturalmente. También se pueden sintetizar polipéptidos circulares, ramificados, y circulares ramificados, mediante un proceso natural no traduccional y mediante métodos totalmente sintéticos. Además, esta invención contempla el uso tanto de variantes terminales de la proteína de la invención que incorporan metionina como carentes de metionina. Con respecto a una proteína, el término "región N-terminal" incluirá aproximadamente 50 aminoácidos adyacentes al extremo amino-terminal de una proteína.

Los términos "promotor", "región promotora" o "secuencia promotora" se refieren generalmente a regiones reguladoras de transcripción de un gen, que se pueden encontrar en el lado 5' o 3' de la región codificante, o dentro de la región codificante, o dentro de intrones. Por regla general, un promotor es una región reguladora del ADN que puede ligar ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción secuencia abajo (en dirección 3') de una secuencia codificante. La secuencia promotora típica 5' está limitada en su terminal 3' por el sitio de inicio de transcripción y se extiende secuencia arriba (en dirección 5') para incluir la cantidad mínima de bases o de elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables sobre el fondo. Dentro de la secuencia promotora hay un sitio de inicio de transcripción (prácticamente definido mediante cartografía con nucleasa S1), así como dominios de unión de proteínas (secuencias de consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. El término promotor incluye los factores reguladores esenciales de dicha secuencia y puede optativamente incluir una larga región de repetición terminal antes del sitio de inicio de traducción.

Un "huésped recombinante" puede ser cualquier célula procariota o eucariota que contenga bien un vector de clonación, bien un vector de expresión. Este término incluye también aquellas células procariotas y eucariotas que han sido manipuladas mediante ingeniería genética para contener los genes clónicos en el cromosoma o genoma de la célula huésped.

El término "gen marcador" se refiere a un gen que codifica un producto fácilmente detectable por medios estándar, bien directa bien indirectamente.

El término "gen marcador seleccionable" se refiere a un gen codificante de un producto que, cuando se expresa, confiere un fenotipo seleccionable como resistencia contra los antibióticos a una célula transformada.

Con respecto a los oligonucleótidos u otras moléculas de ácido nucleico monocatenarias, el término "hibridación específica" se refiere a la asociación entre dos moléculas de ácido nucleico monocatenarias con una secuencia suficientemente complementaria para permitir dicha hibridación bajo condiciones predeterminadas de uso general en la técnica, esto es, condiciones rigurosas (a veces designada como "sustancialmente complementaria"). En particular, el término se refiere a la hibridación de un oligonucleótido con una secuencia sustancialmente complementaria contenida en una molécula monocatenaria de ADN o de ARN, para la exclusión sustancial de hibridación del oligonucleótido con ácidos nucleicos monocatenarios de secuencia no complementaria.

Un "gen estructural" es una secuencia de ADN que se transcribe en ARN mensajero (ARNm), que se traduce luego en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico.

Un "vector" es un replicón, como un plásmido, bacteriófago, cósmido o virus en el que pueda insertarse funcionalmente otro segmento de ácido nucleico para realizar la replicación o expresión del segmento.

Descripción de las figuras

La Figura 1 representa la organización de un vector binario pBGgHg. El pBGgHg tiene un tamaño de 9,6 kb y consiste de un esqueleto de pCAMBIA 1300 que contiene el gen de resistencia (R) a la kanamicina y las secuencias del borde derecho (R/B) y del borde izquierdo (L/B) del ADN-T del Agrobacterium. El gen de resistencia (R) a la higromicina y el gen de la proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) están situados entre las secuencias de los bordes y cada uno está unido al promotor de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (Pgpd) y al terminador del virus del mosaico de la coliflor (35S-3'). Se muestran los sitios de restricción enzimática con distancias cartográficas en kb.

La Figura 2 ilustra la selección de los supuestos transformantes de la resistencia a la higromicina del Agaricus bisporus. Se cocultivaron fragmentos del tejido de las láminas del cuerpo fructífero durante 3 días con la cepa AGL-1 con (A+) y sin (A-) del Agrobacterium tumefaciens portador del vector pBGgHg conteniendo el promotor GPD del A bisporus y el constructo del gen HPH. Se muestra la apariencia de los cultivos después de 2 semanas sobre el medio de selección con 30 \mug/ml de higromicina.

La Figura 3 representa el curso temporal para la selección de los transformantes resistentes a la higromicina. Se cultivaron tejidos de láminas y tejidos no de láminas de cuerpos fructíferos durante 3 días con Agrobacterium tumefaciens AGL-1 portador del vector pBGgHg. La selección de los transformantes resistentes al antibiótico se realizó sobre un medio de selección conteniendo higromicina 30 \mug/ml.

La Figura 4 ilustra el análisis por "Southern blot" de ADN aislado de transformantes putativos resistentes a la higromicina de Agaricus bisporus. Se aisló ADN genómico (5-10 \mug) de ambos cultivos digeridos con SacI, y sondeados con una secuencia de gen HPH marcado con ^{32}P de \sim1 kb. Bandas 1-6, ADN aislado procedente de los transformantes putativos AT1-AT6, respectivamente; Banda 7, ADN aislado procedente de A. bisporus no transformado. Se muestran las posiciones de los marcadores de ADN (kb).

La Figura 5 muestra un análisis PCR de ADN aislado de putativos transformantes resistentes a la higromicina de Agaricus bisporus. La amplificación por PCR se realizó sobre el ADN genómico usando cebadores (gpd-FH/hyg-R) definiendo una secuencia de \sim970 bp cubriendo el promotor GPD del A. bisporus y el gen HPH. Bandas 1-10, ADN aislado procedente de transformantes putativos AT3, AT4, AT9, AT10, AT11, AT12, AT16, AT19, AT24, y AT31, respectivamente; Banda 11, control negativo con agua; la Banda 12, ADN aislado de A. bisporus no transformado; Banda 13, control positivo con el vector plásmido pBGgHg, Banda M, marcadores de ADN (kb).

La Figura 6 muestra la expresión de la característica de la resistencia de la higromicina en las basidiosporas producidas procedentes de cultivos transgénicos del Agaricus bisporus. Las basidiosporas procedentes de dos líneas transgénicas (AT3 y AT6) y de la cepa parental no transformada (NP) fueron sembrados en placa sobre un medio de selección con 50 \mug/ml de higromicina. La viabilidad de las basidiosporas de la cepa parental quedó establecida sobre el medio de selección sin antibiótico (no se muestra).

Descripción detallada de la invención

En su sentido más amplio la invención comprende la transformación de hongos usando un método de transformación conocido en la técnica y descrito aquí usando tejido de cuerpo fructífero, en contraste a protoplastos, esporas, o micelio vegetativo como células receptoras.

En una materialización preferida, la invención comprende el uso de la transformación por el Agrobacterium.

Los métodos para el uso de sistemas de transformación basados en el Agrobacterium se han descrito para muchas diferentes especies de plantas. El Agrobacterium tumefaciens es una bacteria gram-negativa del suelo que origina tumores de agalla de la corona en sitios de lesiones de plantas infectadas. Durante la inducción del tumor, el Agrobacterium transfiere parte de su plásmido inductor de tumores (Ti), el ADN-T, que está flanqueado por repeticiones directas imperfectas de 24 bp, a células de las plantas. El ADN-T integra luego ADN en la planta en una posición aleatoria. El proceso de transferencia del ADN-T depende de la inducción de un conjunto de genes de virulencia (vir), que están también situados en el plásmido Ti. Los genes vir son inducidos por compuestos segregados de células lesionadas de plantas como la acetosiringona (AS). En los métodos de transformación de hongos, se tienen que añadir AS u otros inductores vir para inducir actividad de genes vir. La facilidad de uso, su rendimiento de transformación, y la precisión de la integración del ADN-T ha llevado al uso extendido de este organismo para la transferencia genética a plantas, y al desarrollo de protocolos de transformación para importantes cultivos incluyendo cereales como el arroz y el maíz.

Por lo general, se usan cepas de bacterias, como la Agrobacterium tumefaciens, para transformación genética mediante la transferencia de parte de su plásmido Ti a las plantas durante la tumorigénesis. Por regla general, el Agrobacterium empleado incorpora versiones modificadas del plásmido Ti natural en el que se han eliminado los oncogenes y los genes de metabolismo opalino de modo que el ADN se transfiere a las células huéspedes sin la consiguiente formación de tumores. Estos métodos involucran la inserción del ADN a transferir en el genoma celular dentro de los bordes del plásmido Ti, con el ADN unido a un gen marcador de selección para facilitar la selección de las células transformadas. Se cultivan juntas las bacterias y los tejidos de la planta receptora para conseguir la transferencia del ADN foráneo a células de la planta; luego las plantas transformadas se regeneran sobre medios de selección. Cualquier número de diferentes órganos y tejidos pueden servir como dianas para la transformación mediada por Agrobacterium tal como se describe específicamente para miembros de las Brassicaceae. Éstos incluyen capas finas de células (Charest, P.J., et al, 1988, Theor. Appl. Genet. 75:438-444), hipocótilos (DeBlock, M., et al, 1989, Plant Physiol. 91:694-701), discos foliares (Feldman, K.A., and Marks, M.D., 1986, Plant Sci. 47:63.69), tallos (Fry J., et al, 1987, Plant Cell Repts. 6:321-325), cotiledones (Moloney M. M., et al, 1989, Plant Cell Repts, 8:238-242) y embrioides (Neuhaus, G., et al, 1987, Theor. Appl. Genet. 75:30-36). La transformación mediada por Agrobacterium ha sido demostrada efectiva en muchas especies tanto de plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Recientemente, se ha confirmado la transformación mediante Agrobacterium en levadura. Véase, Bundock et. al. "Trans-kingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae" EMBO Journal vol. 14 no. 13 pg. 3206-3214, 1995. Pero, cosa interesante, se demostró que la transferencia en levadura tenía lugar mediante un mecanismo diferente al observado en plantas. Los autores concluyen que la integración está determinada de forma predominante por factores del huésped más que de la bacteria misma. Esto es importante porque, dependiendo del huésped determinado, la integración puede darse o no dependiendo de los factores presentes del huésped. Más recientemente, se ha confirmado la transformación mediada por el Agrobacterium en el A. bisporus, de Groot et al., pero solo con un muy bajo rendimiento y con un procedimiento excesivamente largo.

Según la invención, un constructo de polinucleótido que se tiene que introducir en una célula de un hongo filamentoso mediante el Agrobacterium, donde este último actúa como vehículo para un plásmido transformante. Por regla general, el constructo de polinucleótido se inserta dentro de los bordes de un plásmido Ti que contiene genes vir funcionales, aunque los genes vir y el polinucleótido no tienen necesariamente que estar en el mismo plásmido.

La transformación genética tiene lugar entonces simplemente incubando el Agrobacterium con las células del tejido del cuerpo fructífero del hongo. Posteriormente, se mata la bacteria y se permite que se regeneren las células del cuerpo fructífero bajo presión selectiva para identificar a los transformantes.

Así, la invención proporciona un hongo filamentoso transformado que se puede obtener por transformación mediada por Agrobacterium según la invención no comprendiendo ninguna secuencia de ADN bacteriano no deseada incluyendo un borde de ADN-T. Estos hongos transformados se pueden usar en un proceso para el cultivo de un hongo transformado para producir una proteína deseada o una secuencia de ácido nucleico espermático. Además, según la invención, se podrían expresar cortas secuencias de ácido nucleico, que pueden no codificar un producto proteínico, correspondiéndose con algún gen diana (codificado por el huésped o por un virus), para el propósito de un silenciamiento cosupresor. La invención contempla también el cultivo de hongos transgénicos para los champiñones como alimento, medicina, etc., y como fuente de una proteína deseada (p. ej., producción farmacéutica), así como para el desarrollo de micelio vegetativo como fuente de una proteína deseada. Además, la proteína puede permanecer dentro de las células del hongo y precisar extracción, pero la proteína puede también segregarse al medio de cultivo para su recuperación.

Según otra materialización de la invención se proporciona un proceso en el que el fragmento del ADN se integra aleatoriamente en el genoma del hongo, así como un hongo transformado que se puede conseguir por transformación mediada por el Agrobacterium, que comprende una o más partes de secuencias de los bordes del ADN-T, y un proceso para el cultivo de este hongo transformado para producir una proteína deseada o una secuencia de ácido nucleico específica.

Se prefiere el uso de cepas supervirulentas de A. tumefaciens, porque dan una frecuencia de transformación relativamente elevada; estas cepas, el uso de las mismas y los vectores para preparar dichas cepas aparece todo ello descrito en la literatura; véase Jin et al. (J. Bacteriology 169 (1987) 4417-4425 & Molecular Microbiology 7 (1993) 55-562), Raineri et al. (BIO/TECHNOLOGY 8 (January 1990) 33-38) e Ishida et al. (Nature Biotechnology 14, (1996) 745-750) para la transformación de plantas, y Piers et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996) 1613-1618) para la transformación de levaduras.

La transformación puede realizarse mediante un sistema binario donde los genes vir actúan en trans o mediante cointegración con recombinación homóloga entre un primer plásmido y un plásmido Ti silvestre, lo que lleva a la expulsión de los oncogenes del plásmido de una forma parecida a la que se conoce para la transformación de plantas como se considera aquí y es sabido por los expertos en la materia.

La producción de tejido de hongos modificado genéticamente bien expresando, bien inhibiendo la expresión de un gen estructural, combina las enseñanzas de la presente divulgación con una diversidad de prácticas y de recursos conocidos en la técnica. En la mayor parte de los casos, existen recursos alternativos para cada etapa del proceso global. La elección de recursos depende de las variables como el sistema de vector plásmido escogido para la clonación e introducción de la molécula de ADN recombinante, la especie de hongo que se desea modificar, el gen estructural determinado, los elementos promotores y los elementos usados secuencia arriba. Los expertos en la materia saben cómo seleccionar y usar alternativas apropiadas para conseguir funcionalidad. Las condiciones de los cultivos para la expresión de los genes estructurales y las células cultivadas que se desean son cosa conocida en la técnica. También, como se sabe en la técnica, un número de especies de hongos son susceptibles de transformación y de regeneración de modo que se pueda obtener todo el hongo, incluyendo todos los tejidos vegetativos y reproductivos como el micelio, los cuerpos fructíferos y las esporas, que contienen y expresan genes deseados bajo el control regulador de las moléculas del promotor según la invención. Como lo saben los expertos en la materia, la expresión en los hongos transformados puede ser específica de un tejido y/o específica de ciertas etapas del desarrollo. La selección de un promotor truncado y la selección de genes estructurales son otros parámetros que se pueden optimizar para conseguir la deseada expresión o inhibición en el hongo, como lo saben los expertos en la materia y se enseña aquí.

Lo que sigue es una visión general de técnicas de biología molecular que se pueden usar en la ejecución de los métodos de la invención.

Los constructos de polinucleótidos de la presente invención compartirán elementos semejantes, que son bien conocidos en la técnica de la biología molecular. Por ejemplo, en cada constructo las secuencias deseadas de ADN serán preferentemente ligadas operativamente (esto es, posicionadas para asegurar el funcionamiento de) a un promotor que permita que el ADN sea transcrito (en una transcripción de ARN) y comprenderá un vector que incluya un sistema de replicación. En materializaciones preferidas, la secuencia deseada de ADN será de origen exógeno en un esfuerzo para prevenir la cosupresión de los genes exógenos, a no ser que el protocolo deseado sea la cosupresión.

Promotores

Los constructos, promotores o sistemas de control que se usan en los métodos de la invención pueden incluir un promotor específico de tejido, un promotor inducible o un promotor constitutivo. Por ejemplo, un promotor constitutivo útil para la invención es el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S. Se ha demostrado que es sumamente activo en muchas especies procariotas y eucariotas.

Los promotores (y otros elementos reguladores) pueden ser heterólogos (es decir, no naturalmente ligados operativamente a una secuencia de ADN del mismo organismo). Los promotores útiles para la expresión en hongos se conocen en la técnica y pueden ser inducibles, constitutivos, específicos de tejido, derivados de eucariotas, procariotas o virus, o tener diversas combinaciones de estas características.

Al proceder a la elección de un promotor para su uso en los métodos de la invención, puede ser deseable usar un promotor regulado específico de tejido o regulado por el desarrollo. Un promotor específico de tejido o regulado por el desarrollo es una secuencia de ADN que regula la expresión de una secuencia de ADN de forma selectiva en las células o en los tejidos de forma crítica para un período de desarrollo y/o función determinado en el hongo. En los métodos de la presente invención se puede usar cualquier promotor identificable que cause expresión en los hongos, y hay muchos de estos promotores disponibles. También puede ser ventajoso usar un promotor inducible para proporcionar la expresión del constructo durante períodos controlados.

También se puede usar un promotor inducible en la presente invención. Véase Ward et al. Plant Mol. Biol. 22; 361-366 (1993). Los promotores inducibles ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aquel del sistema ACE1 que responde al cobre (Mett et al. PNAS 90; 4567-4571 (1993)); el gen In2 del maíz que responde a los protectores de herbicidas de bencenosulfonamidas (Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 (1991) y Gatz et al., Mod. Gen. Genetics 243; 32-38 (1994)) o al represor Tet del Tn10 (Gatz et al., Mot. Gen. Genet. 227: 229-237 (1991). Un promotor inducible particularmente preferible es un promotor que responde a un agente inductor al que los hongos no responden normalmente. Un promotor inducible ejemplar es el promotor inducible procedente de un gen de una hormona esteroide, cuya actividad transcripcional es inducida por una hormona glucocorticosteroide. Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 0421 (1991).

Estos y otros promotores parecidos son conocidos y son accesibles de fuentes como Genbank. En una materialización preferida, el promotor es homólogo a la especie de la célula huésped receptora. Por ejemplo, en el protocolo de transformación del A. bisporus, se usa un promotor de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GPD) del A. bisporus en el constructo del polinucleótido. Dos ejemplos de promotores específicos del hongo incluyen, pero no se limitan a, los promotores de la GPD procedentes del hongo A. nidulans, (Mattern et al. 1988, Fungal Genetics Newsletter 35:25), y A bisporus, (Harmsen et al. 1992 Current Genetics 22:447-454).

Puede ser también deseable incluir algunas secuencias de intrones en los constructos de promotor por cuanto la inclusión de secuencias de intrones en la región de codificación puede dar como resultado una potenciación de la expresión y de la especificidad.

Adicionalmente, se pueden unir regiones de un promotor con regiones de un promotor diferente para obtener la actividad de promotor deseada resultando en un promotor quimérico. También pueden usarse promotores sintéticos que regulan la expresión génica.

El sistema de expresión se puede optimizar adicionalmente mediante el empleo de elementos suplementarios como terminadores de transcripción y/o elementos potenciadores.

Otros elementos reguladores

Además de una secuencia promotora, un casete de expresión o constructo de polinucleótido debería contener también una región de terminación de transcripción, secuencia abajo del gen estructural para proporcionar una terminación eficiente. La región de terminación o señal de poliadenilación se puede obtener del mismo gen que la secuencia promotora o puede obtenerse procedente de diferentes genes. Las secuencias de poliadenilación incluyen, pero no se limitan a, la señal de la octopina sintasa del Agrobacterium (Gielen et al., EMBO J. (1984) 3:835-846) o a la señal de la nopalina sintasa (Depicker et al., Mol and Appl. Genet., (1982)1:561-573).

El transporte de proteína producido por transgenes a un compartimiento subcelular como la vacuola, peroxisoma, glioxisoma, membrana celular o mitocondria, o para secreción al apoplasto o medio de crecimiento, se consigue ligando operativamente la secuencia de nucleótidos que codifican una secuencia señal a la región 5' y/o 3' de un gen codificante de la proteína deseada. Las secuencias de direccionamiento en el extremo 5' y/o 3' del gen estructural pueden determinar, durante la síntesis y el procesado de la proteína, dónde queda finalmente ubicada la proteína codificada. La presencia de una secuencia señal dirige a un polipéptido a bien una organela intracelular o a un compartimiento subcelular o para secreción al apoplasto o al medio externo. En la técnica se conocen muchas secuencias señales.

Genes marcadores

Las moléculas de ADN recombinante que contienen cualesquiera de las secuencias y de los promotores de ADN que se describen aquí pueden también contener genes marcadores para selección que codifican un producto génico de selección que confiere resistencia a una célula frente a un agente químico o estrés fisiológico, o que confiere a las células una característica fenotípica distinguible de modo que las células transformadas con la molécula de ADN recombinante pueden ser fácilmente seleccionadas mediante el uso de un agente selector. Uno de estos genes marcadores de selección es la neomicina fosfotransferasa (NPT II), que confiere resistencia a la kanamicina y al antibiótico G-418. Las células transformadas con este gen marcador de selección se pueden seleccionar mediante la determinación de la presencia in vitro de la fosforilación de la kanamicina usando técnicas que aparecen descritas en la literatura, o comprobando la presencia del ARNm que codifica el gen de NPT II mediante el análisis por "Northern blot" en ARN procedente del tejido de la planta transformada. También se usa la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para identificar la presencia de un transgen o expresión usando la amplificación inversa PCR para monitorizar la expresión y la PCR sobre ADN genérico. Otros marcadores de selección comúnmente usados incluyen el gen de resistencia a la ampicilina, el gen de resistencia a la tetraciclina y el gen de resistencia a la higromicina (HPH). Las células fúngicas transformadas seleccionadas de esta manera pueden crecer y desarrollarse para formar el micelio vegetativo, que a su vez producirá el hongo entero, incluyendo la estructura reproductiva sexual (el cuerpo fructífero) y las esporas. Se debe comprender que un gen marcador de selección puede también ser nativo de un hongo.

Proteínas

Con genes transgénicos según la presente invención, se puede producir una proteína foránea en cantidades comerciales. Así, las técnicas para la selección y propagación de hongos transformados, que son bien conocidas en la técnica, producen una diversidad de hongos transgénicos que se recolectan de un modo convencional, y luego se puede extraer una proteína foránea de un tejido predeterminado o de la biomasa total, o segregarse a un medio de crecimiento (en estado líquido o sólido) y recuperarse a continuación. La extracción de proteínas desde biomasa vegetal y fúngica se puede conseguir por medios conocidos que se tratan, por ejemplo, en Heney and Orr, Anal. Biochem. 114:92-6 (1981), y en referencias aquí citadas.

Para la cantidad relativamente pequeña de hongos transgénicos que exhiben altos niveles de expresión, se puede generar un mapa genético, principalmente mediante análisis convencional de Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP), análisis de PCR, y Repeticiones de Secuencias Únicas (SSR), que identifica la localización cromosómica aproximada de la molécula ADN integrada. Para metodologías ejemplares relativas a esto, véase Glick and Thompson, METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 269-284 (CRC Press, Boca Raton, 1993). La información cartográfica relativa a la localización cromosómica es útil para la protección de la propiedad intelectual de un hongo transgénico determinado. Si se emprende una propagación no autorizada y se realizan cruces con otros germoplasmas, se puede comparar el mapa de la región de integración con mapas similares para hongos objeto de sospecha, para determinar si estos últimos tienen un porcentaje común con el hongo de que se trata. Las comparaciones cartográficas involucrarían hibridaciones, RFLP, PCR, SSR y secuenciación, todas ellas técnicas convencionales.

Asimismo, por medio de la presente invención, se pueden expresar genes agronómicos en hongos transformados. Más concretamente, los hongos se pueden manipular por ingeniería genética para expresar diversos fenotipos de interés agronómico. Los genes implicados a este respecto incluyen los que se relacionan más abajo.

1. Genes que confieren resistencia a plagas o enfermedades y que codifican

(A) Genes de resistencia a enfermedades de plantas. Las defensas de las plantas se activan a menudo por una interacción específica entre el producto de un gen de resistencia a enfermedades (R) en la planta y el producto de un correspondiente gen de avirulencia (Avr) en el patógeno. Una variedad de planta se puede transformar con un gen de resistencia clonado para transformar plantas mediante ingeniería genética para que sean resistentes a cepas patógenas específicas. Véase, por ejemplo, Jones et al, Science 266: 789 (1994) (cloning of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum); Martin et al., Science 262: 1432 (1993) (tomato Pto gene for resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato encodes a protein kinase); Mindrinos et al., Cell 78: 1089 (1994) (Arabidopsis RSP2 gene for resistance to Pseudomonas syringae).

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(B) Proteína del A. Bacillus thuringiensis, derivada del mismo o un polipéptido sintético modelado sobre la misma. Véase, por ejemplo, Geiser et al., Gene 48: 109 (1986), que revela la clonación y la secuencia de nucleótidos de un gen de endotoxina Bt. Además, las moléculas de ADN que codifican genes de endotoxinas se pueden adquirir por ejemplo en American Type Culture Collection (Rockville, MD), bajo los números de acceso de ATCC 40098, 67136, 31995 y 31998.

(C) Una lectina. Véase, por ejemplo, la divulgación por Van Damme et al, Plant Molec. Biol. 24: 25 (1994), que desvela las secuencias de nucleótidos de diversos genes de lectina de la Clivia miniata ligantes de la manosa.

(D) Una proteína ligante de vitaminas, como la avidina. Véase solicitud a PCT US93/06487, cuyo contenido queda por esto aquí incorporado. La solicitud enseña el uso de la avidina y de homólogos de la avidina como larvicidas contra plagas de insectos.

(E) Un inhibidor de enzimas, por ejemplo un inhibidor de proteasa o un inhibidor de amilasa. Véase, por ejemplo, Abe et al., J. Biol. Chem. 262: 16793 (1987) (nucleotide sequence of rice cysteine proteinase inhibitor), Huub et al., Plant Molec. Biol. 21: 985 (1993) (nucleotide sequence of cDNA encoding tobacco proteinase inhibitor I), y Sumitani et al, Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1243 (1998) (nucleotide sequence of Streptomyces nitrosporeus alpha-amylase inhibitor).

(F) Una hormona o feromona específica de un insecto como un ecdisteroide y una hormona juvenil, una variante de la misma; una forma mimética basada en la misma, o un antagonista o agonista de la misma. Véase, por ejemplo, la divulgación de Hammock et al., Nature 344: 458 (1990), de la expresión en el baculovirus de la esterasa clonada de la hormona juvenil, un inactivador de la hormona juvenil.

(G) Un péptido o neuropéptido específico de un insecto que, al expresarse, perturba la fisiología de la plaga afectada. Por ejemplo, véanse las divulgaciones de Regan, J. Biol. Chem. 269 (1994) (expression cloning yields DNA coding for insect diuretic hormone receptor), y Pratt et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163: 1243 (1989) (an allostatin is identified in Diploptera puntata). Véase también la patente U.S. n.º 5.266.317 a Tomalski et al., que divulga genes que codifican neurotoxinas paralizantes específicas de insectos.

2. Genes que confieren resistencia a un herbicida. Por ejemplo:

(A) Un herbicida que inhibe el ápice de crecimiento o meristema, como una imidazalinona o una sulfonilurea. Genes ejemplo en esta categoría codifican para las enzimas mutantes ALS y AHAS como se describe, por ejemplo, en Lee et al., EMBO J. 7:1241(1988), y Miki et al., Theor. Appl. Genet. 80: 449 (1990), respectivamente.

(B) El glifosato (resistencia impartida por los genes mutantes 5-enolpiruvil-3-fosfiquimato sintasa (EPSP) y aroA, respectivamente) y otros compuestos de los fosfonos como el glufosinato (genes de la fosfinotricina-acetil transferasa (PAT) y de la fosfinotricina-acetil transferasa (bar) del Streptomyces hygroscopicus), y ácidos piridinoxi- o fenoxi-propiónicos y ciclohexonas (genes que codifican inhibidores de ACCasas). Véase, por ejemplo, la patente U.S. n.º 4.940.835 a Shah et al., que divulga la secuencia nucleótida de una forma de EPSP que puede conferir resistencia al glifosato. Una molécula de ADN que codifica un gen mutante aroA se puede obtener bajo el número de acceso ATCC n.º 39256, y la secuencia de nucleótidos del gen mutante se divulga en la patente U.S. n.º 4.769.061 a Comai. La solicitud de patente europea n.º 0 333 033 a Kumada et al. y la patente U.S. n.º 4.975.374 a Goodman et al. divulgan secuencias de nucleótidos de genes de glutamina sintetasa que confieren resistencia a herbicidas como la L-fosfinotricina. La secuencia de nucleótidos de un gen de fosfinotricin-acetil transferasa se da en la solicitud europea n.º 0 242 246 a Leemans et al. De Greef et al., Bio/Technology 7: 61 (1989), describen la producción de plantas transgénicas que expresan genes quiméricos bar que codifican la actividad de la fosfinotricin-acetil transferasa. Ejemplos de genes que confieren resistencia a ácidos fenoxi-propiónicos y ciclohexonas, como el setoxidim y el haloxifop, son los genes Accl-S1, Accl-S2 y Acc1-S3 descritos por Marshall et al., Theor. Appl. Genet. 83: 435 (1992).

(C) Un herbicida que inhibe la fotosíntesis, como la triazina (genes psbA y gs+) y un benzonitrilo (gen de la nitrilasa). Przibilla et al., Plant. Cell 3: 169 (1991), describe la transformación de la Chlamydomonas con plásmidos que codifican genes mutantes psb. Se divulgan secuencias de nucleótidos para genes de nitrilasas en la patente U.S. n.º 4.810.648 a Stalker, y moléculas de ADN que contienen estos genes están disponibles bajo los números de acceso de ATCC 53435, 67441 y 67442. La clonación y la expresión de codificación de ADN para una glutationa S-transferasa se describen en Hayes et al., Biochem: J. 285 173 (1992).

3. Genes que confieren o que contribuyen a un factor de valor añadido. Como:

(A) Metabolismo modificado de los ácidos grasos, por ejemplo, mediante la transformación de una planta con un gen antisentido de estearoil-ACP desaturasa para aumentar el contenido de la planta en ácido esteárico. Véase Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2624 (1992).

(B) Contenido rebajado en fitato:

(1) La introducción de un gen codificante de fitasa potenciaría la descomposición del fitato, añadiendo más fosfato libre a la planta transformada. Por ejemplo, véase Van Hartingsveldt et al., Gene 127: 87 (1993) para una divulgación de la secuencia de nucleótidos de un gen de la fitasa del Aspergillus niger.

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(2) Se podría introducir un gen que reduce el contenido de fitato. Por ejemplo, en el maíz esto podría conseguirse por clonación y luego reintroduciendo el ADN asociado con el alelo individual responsable de los mutantes del maíz caracterizados por bajos niveles de ácido fítico. Véase Raboy et al., Maydica 35: 383 (1990).

(C) La modificación de la composición de los carbohidratos realizada, por ejemplo, transformando plantas con un gen que codifique una enzima que altere el patrón de ramificación del almidón. Véase Shiroza et al., J. Bacteriol. 170: 810 (1988) (nucleotide sequence of Streptococcus mutans fructosyl transferase gene), Steinmetz et al. Mol. Gen. Genet. 200: 220 (1985) (nucleotide sequence of Bacillus subtilis levansucrase gene), Pen et al., Bio/Technology 10: 292 (1992) (production of transgenic plants that express Bacillus licheniformis - amylase), Elliot et al., Plant Molec. Biol., 21: 515 (1993) (nucleotide sequences of tomato invertase genes), Søgaard et al., J. Biol. Chem. 268: 22480 (1993) (site-directed mutagenesis of barley alpha-amylase gene), y Fisher et al., Plant Physiol. 102: 1045 (1993) (maize endosperm starch branching enzyme II).

También se pueden usar técnicas antisentido o cosupresoras según las referencias que aquí se revelan.

Transformación

Se pueden usar técnicas tradicionales de transformación además de la transfección con Agrobacterium. Otros métodos que se han empleado para la introducción de moléculas recombinantes en células vegetales involucran medios mecánicos como la captación directa de ADN, liposomas, electroporación (Guerche, P. et al, 1987, Plant Science 52:111-116), y microinyección (Neuhaus, G., et al, 1987, Theor. Appl. Genet. 75:30-36). También ha recibido una considerable atención la posibilidad de usar microproyectiles y una pistola u otro dispositivo para forzar pequeñas partículas metálicas recubiertas con ADN en el interior de células (Klein, T.M. et al., 1987, Nature 327:70-73).

Es a menudo deseable tener la secuencia de ADN en estado homocigótico, lo que puede demandar más de un evento transformador para originar una línea parental, requiriendo una transformación con una primera y una segunda molécula de ADN recombinante, donde las dos codifican el mismo producto génico. Además, se contempla en algunas de las materializaciones del proceso de la invención que una célula fúngica se transforme con una molécula de ADN recombinante que contenga al menos dos secuencias de ADN o que sea transformada con más de una molécula de ADN recombinante. Las secuencias de ADN o las moléculas de ADN recombinante en tales materializaciones pueden estar físicamente unidas, incorporadas en el mismo vector, o físicamente separadas en diferentes vectores. Una célula puede ser simultáneamente transformada con más de un vector a condición que cada vector tenga un gen marcador de selección único. Como alternativa, una célula se puede transformar con más de un vector secuencialmente permitiendo una etapa intermedia de regeneración después de la transformación con el primer vector. Además, puede que sea factible realizar un cruce sexual entre hongos individuales o líneas de hongos que contengan diferentes secuencias de ADN o moléculas de ADN recombinante donde de forma preferente las secuencias de ADN o las moléculas recombinantes estén unidas o situadas en el mismo cromosoma, y luego seleccionar de entre la progenie del cruce aquellos hongos que contengan ambas secuencias de ADN o moléculas de ADN recombinante.

La expresión de moléculas de ADN recombinante que contengan las secuencias y promotores de ADN que se describen aquí en células fúngicas transformadas puede ser monitorizada usando las técnicas analíticas "Northern blot" y/o "Southern blot" conocidas por los expertos en la materia.

Los hongos regenerados se transfieren a medios de cultivo estándar (p. ej., medios nutrientes sólidos o líquidos, grano, vermiculita, fertilizante, turba, madera, serrín, paja, etc.) y se crían o cultivan de una forma que conocen los expertos en la materia.

Después que el polinucleótido ha quedado incorporado de forma estable en hongos transgénicos regenerados, se puede transferir a otros hongos mediante cruce sexual. Se puede usar cualquier técnica de reproducción estándar, lo cual dependerá de las especies a cruzar.

Es siempre útil generar una cantidad de hongos transformados individuales con cualquier recombinante-constructo para recuperar hongos exentos de cualesquiera efectos posicionales. También puede que sea preferible seleccionar hongos que contengan más de una copia de la molécula de ADN introducida de modo que se obtengan elevados niveles de expresión de la molécula recombinante.

Como se ha indicado más arriba, puede que sea deseable producir líneas de hongos que sean homocigotos para un gen determinado si es posible en la especie en particular. En algunas especies esto se consigue mediante el uso de cultivos monospóricos. Mediante el uso de estas técnicas, es posible producir una línea haploide portadora del gen insertado y luego doblar el número de los cromosomas bien espontáneamente, bien usando colquicina. Esto da origen a un hongo homocigótico para el gen insertado, que puede analizarse fácilmente si el gen insertado lleva consigo un gen marcador de selección idóneo para la detección de los hongos portadores de dicho gen. De forma alternativa, se puede autofecundar, llevando a la producción de una mezcla de esporas compuesta en el caso más simple de tres tipos, homocigóticos (25%), heterocigóticos (50%) y nulos (25%) para el gen insertado. Aunque es relativamente fácil distinguir mediante puntuación a los hongos nulos respecto a los que contienen el gen, es posible en la práctica distinguir mediante puntuación a los hongos homocigóticos de los heterocigóticos mediante análisis por "Southern blot" en el que se presta una cuidadosa atención a la carga de cantidades exactamente equivalentes de ADN de entre la población mixta, y se puntúan los heterocigotos por la intensidad de la señal de una sonda específica para el gen insertado. Es aconsejable verificar los resultados del análisis por "Southern blot" dejando autofecundar a cada transformante independiente, porque se puede obtener prueba adicional de homozigosidad por el simple hecho de que si el hongo era homocigótico para el gen insertado, todas las posteriores líneas de hongos del individual autofecundado contendrán el gen, mientras que si el hongo era heterocigótico para el gen, la generación criada a partir de la semilla autofecundada contendrá líneas nulas de hongos. Por tanto, solo con autofecundar se pueden seleccionar líneas de hongos homocigóticos que pueden también quedar confirmados mediante análisis por "Southern blot".

La creación de líneas parentales homocigóticas posibilita la producción de hongos híbridos y esporas asimismo híbridas que contendrán un componente proteínico modificado. Las líneas parentales transgénicas homocigóticas se mantienen con cada línea progenitora conteniendo bien la primera o la segunda secuencia de ADN recombinante ligada operativamente a un promotor. También incorporadas a este esquema están las ventajas de cultivar una cosecha híbrida, incluyendo la combinación de características más valiosas y vigor híbrido.

El ejemplo siguiente tiene el propósito de ilustrar la invención. Los ejemplos y las consideraciones que se dan aquí pueden referirse específicamente al A. bisporus; sin embargo, las enseñanzas que aquí figuran son igualmente aplicables a cualquier otro hongo, preferiblemente a hongos filamentosos que producen cuerpos fructíferos carnosos.

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Ejemplo 1

Se cultivaron cuerpos fructíferos de seis cepas híbridas comerciales de A. bisporus. Se derivaron cultivos miceliales vegetativos de las cepas a partir de sustrato comercial de cereal, y se mantuvieron sobre agar de levadura de dextrosa de patata. Se aisló ADN genómico de cuerpos fructíferos (1-3 g) y de caldos de cultivo (100 mg de micelio) por extracción convencional con fenol en presencia de cloruro de litio y precipitación con etanol.

Se obtuvieron las cepas públicamente disponibles AGL-1, EHA-105, y GV3850 del A. tumefaciens. El gen del HPH (higromicina B fosfotransferasa) de la Escherichia coli, junto con el promotor trpC del Aspergillus nidulans también proporcionado. El vector binario pCAMBIA 1300 (CAMBIA, Canberra, Australia), el gen de la proteína verde fluorescente potenciada (EGFP) de Aequora victoria, y el terminador CaMV 35S se obtuvieron también de fuentes públicas. El promotor para el gen de GPD del A. bisporus se obtuvo por amplificación PCR usando los datos de secuencia publicados.

Nuestro vector plásmido binario (9,6 kb), designado pBGgHg, se componía de un esqueleto de pCAMBIA 1300 que contenía los genes de HPH y EGFP, cada uno de los cuales se unió al terminador CaMV 35S y fue controlado por el promotor GPD del A. bisporus (Fig. 1). A fin de construir el vector pBGgHg, se generó el plásmido intermedio pEGFP.g escindiendo el promotor CaMV 35S del PE2113-EGFP con HindIII y KpnI e insertando la secuencia del promotor GPD obtenida mediante amplificación PCR con los cebadores gpd-FH y gpd-RK que contienen los centros de restricción HindIII y KpnI, respectivamente. El plásmido intermedio pHph.g se diseñó a partir de PCSN44 por escisión del promotor trpC con HindIII y ClaI y la unión de extremos romos con el promotor GPD derivado por amplificación PCR con los cebadores gpd-FH y gpd-RC. El plásmido intermedio pBHg se preparó digiriendo pCAMBIA 1300 con BstXI y XhoI para eliminar el gen del HPH y el promotor CaMV 35S e insertar mediante unión de extremos romos el gen del HPH y el promotor GPD, que había sido escindido de pHph.g usando BamHI. Finalmente, se construyó el pBGgHG escindiendo el gen de EGFP con el promotor GPD de pEGFP.g usando EcoRI y HindIII e insertando este fragmento mediante unión de extremos romos en el centro BamHI en pBHg.

Se realizó un análisis "Southern blot" con un fragmento de \sim 1 kb de gen del HPH marcado con ^{32}P como sonda. Se realizó un análisis con PCR usando los cebadores gpd-FH ('5-GAAGAAGCTTTA AGAGGTCCGC-3' y hyg-R. (5'-GGCGACCTCGTATTGGGAATC-3'), que definieron una secuencia de \sim970 abarcando el promotor GPD y el gen del HPH.

A continuación se adoptó en la presente invención el método original de transformación mediada por Agrobacterium para S. cerevisiae, modificado para el uso de esporas de hongos filamentosos, excepto que el tejido del cuerpo fructífero, en lugar de basidiosporas del A. bisporus, fue cocultivado con el A. tumefaciens. Esto tuvo un sorprendente e importante efecto sobre el rendimiento efectivo de transformación. Se seleccionaron cuerpos fructíferos que estaban aproximándose a la madurez, pero con el velo intacto y las láminas sin exponer ("lámina madura" o "lámina"); los cuerpos fructíferos se esterilizaron en su superficie empapándolos con una solución de hipoclorito sódico comercial al 10% (lejía) y luego enjuagándolos con agua destilada estéril. Se quitó el velo usando un bisturí estéril, y se cortó el tejido expuesto de las láminas y se seccionó en piezas de 2-5 mm cuadrados para su uso.

En algunos experimentos, donde estuviese indicado, el tejido carnoso derivado de los sombreros y de los tallos de cuerpos fructíferos se usó como fuente de tejido para la transformación ("tejido no laminar"). En otra variación con respecto al protocolo básico, y donde estuviese indicado, la transformación se realizó sobre tejido laminar no desarrollado tomado de cuerpos fructíferos inmaduros entre la etapa de desarrollo de aguja a botón ("lámina inmadura").

En todos los casos, las piezas de tejido se infiltraron al vacío con la suspensión bacteriana en un medio de inducción durante varios minutos, hasta que el aire quedó purgado del tejido, y luego se transfirieron a un trozo de papel de filtro 3MM Whatman estéril que había sido puesto sobre un medio de cocultivo. Se incubaron piezas de tejido sobre este medio durante 3-4 días antes de transferir a un medio de selección que contenía higromicina 80 \mug/ml. Los cultivos miceliales cultivados en este medio se transfirieron posteriormente a un nuevo medio de selección que contenía higromicina 30-50 \mug/ml. Después de la regeneración sobre este medio, los cultivos se pudieron criar en un medio nutriente líquido para obtener suficiente biomasa micelial para realizar análisis moleculares (análisis de "Southern blot" y "Northern blot", PCR, RT-PCR, etc.). También se podían hacer crecer cultivos sobre grano de cereal esterilizado ("spawn") para la inoculación de compost en la producción de cuerpos fructíferos por métodos convencionales. Se adjunta un resumen detallado del protocolo para la transformación del cuerpo fructífero (Tabla 1.).

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TABLA 1 Protocolo de cuerpo fructífero para la transformación de champiñones (Agaricus bisporus) mediada por Agrobacterium

Comentarios generales: Para comenzar los preparativos, esterilizar en autoclave agua destilada, papel de filtro para las placas de cocultivo, matraces para cultivar el Agrobacterium, y matraces con tubuladura lateral para infiltración al vacío. Preparar el medio LB, placas (LB), medio mínimo (MM), medio de inducción (IM), placas para medio de cocultivo (CC), y placas para medio de selección (SM). Donde se indica "esterilización por filtración", se pasaron los reactivos por un filtro de membrana de 0,2 \mu. Almacenar todos los reactivos a 6ºC. Obsérvese que el MES y el buffer K pueden precipitar, por lo que, antes de usar, se debería proceder a calentar estos reactivos hasta su total disolución. Inmediatamente antes de su uso, preparar AS nueva a partir del sólido cristalino.

1.

Extraer una muestra del Agrobacterium (cepa AGL-l) de cultivos guardados en glicerol al 10% a -80ºC y sembrar en placa sobre un medio LB conteniendo kanamicina 50 \mug/ml. Incubar la placa durante dos días a 28ºC.

2.

Recuperar el Agrobacterium de la placa con una aguja de transferencia estéril e inocular 100 ml de MM que contengan kanamicina 50 \mug/ml en un matraz de 250 ml.

3.

Mantener el cultivo bacteriano durante la noche a 28ºC con una agitación giratoria constante a 250 rpm hasta un D.E:_{600} = 0,6-.0,8. Sedimentar las bacterias mediante centrifugación a 2000 x g durante 15 minutos.

4.

Volver poner las bacterias en suspensión en 100 ml de IM. Inducir las bacterias mediante agitación giratoria a 100 rpm durante 3-6 hrs a 25ºC. Para una transformación con alto rendimiento, es importante preparar el IM justo antes de su uso con AS nueva (esto es, directamente a partir del sólido).

5.

Esterilizar la superficie de los cuerpos fructíferos empapándolos con una solución de hipoclorito sódico al 10% durante \sim1 minuto, enjuagándolos luego tres veces con agua destilada esterilizada en autoclave. Seleccionar los cuerpos fructíferos con velos intactos para asegurar una mejor esterilidad del tejido laminar.

6.

Con un bisturí estéril, separar el velo del cuerpo fructífero, extraer las láminas expuestas, y seccionar el tejido laminar en piezas de 25 mm.

7.

Transferir a un matraz de 250 ml con tubuladura lateral los 100 ml de suspensión de Agrobacterium inducida en la AS del agitador y 100-150 piezas del tejido laminar seccionado. Aplicar vacío para extraer el aire de los espacios intercelulares. Comprobar que no haya burbujas de aire que emanen de las piezas de tejido. Seguir aplicando vacío hasta que muchas de las piezas de tejido se asienten en el fondo del matraz.

8.

Decantar la suspensión del Agrobacterium desde el matraz. Transferir las piezas de tejido a placas de Petri que contengan medio CC recubierto con un trozo de papel de filtro Whatman 3MM esterilizado. Se debería tener cuidado en extraer las burbujas de aire que hayan quedado atrapadas entre el papel y el medio. También se deberían distribuir los trozos de tejido de forma uniforme sobre la superficie del papel para maximizar su contacto con el medio. Cerrar herméticamente las placas con film adherente, e incubar durante 3-4 días a 20-24ºC.

9.

Transferir las piezas de tejido del cuerpo fructífero a placas de Petri de SM con higromicina 30 \mug/ml. Cerrar herméticamente las placas con film adherente e incubar a 22-24ºC a oscuras. Pueden aparecer colonias de A. bisporus supuestamente resistentes a la higromicina en los márgenes de las piezas de tejidos después de 7 días de incubación, y seguir apareciendo durante \sim30 días.

10.

Transferir las colonias resistentes a la higromicina a placas con SM nuevo conteniendo higromicina 30-50 \mug/ml. Cerrar herméticamente e incubar las placas como anteriormente.

11.

Los cultivos miceliales supuestamente transformados pueden someterse a un análisis molecular para su autenticación (análisis de hibridación por Southern y Northern, PCR, RT-PCR, etc.), y usar para preparar inóculo de siembra ["spawn"] para la producción de cuerpos fructíferos.

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Reactivos/Medios para transformación Medio LB Medium (LB) (placas de Petri)

\bullet

\vtcortauna 10 g NaCl

\bullet

\vtcortauna 10 g triptona

\bullet

\vtcortauna 5 g extracto de levadura

\bullet

\vtcortauna 15 g agar

Ajustar a un volumen final de 1 L con agua destilada. Esterilizar en autoclave durante 20 min.

Verter en placas como se desee.

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Medio Mínimo (MM) (Todas las soluciones se esterilizan por filtración)

\bullet

\vtcortauna 10 ml de solución tampón K, pH 7,0:

\quad

K_{2}HPO_{4} 200 g/L

\quad

KH_{2}PO_{4} 145 g/L

\bullet

\vtcortauna 20 ml M-N:

\quad

MgSO_{4}\cdot7H_{2}O 30 g/L

\quad

NaCl 15 g/L

\bullet

\vtcortauna 1 ml CaCl_{2}\cdot2H_{2}O 1% (p/v)

\bullet

\vtcortauna 10 ml glucosa 20% (p/v)

\bullet

\vtcortauna 10 ml FeSO_{4} 0,01% (p/v)

\bullet

\vtcortauna 5 ml de solución madre:

\quad

100 mg/L ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O

\quad

100 mg/L CuSO_{4}\cdot5H_{2}O

\quad

100 mg/L H_{3}BO_{3}

\quad

100 mg/L MnSO_{4}H_{2}O

\quad

100 mg/L Na_{2}MoO_{4}\cdot2H_{2}O

\bullet

\vtcortauna 2,5 ml NH_{4}NO_{3} 20% (p/v)

\bullet

\vtcortauna Kanamicina 50 \mug/ml

Ajustar a un volumen final de 1 L con agua destilada esterilizada en autoclave.

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Medio de Inducción (IM) (Todas las soluciones se esterilizan por filtración)

\bullet

\vtcortauna 0,8 ml de solución tampón K 1,25 M:

\quad

K_{2}HPO_{4} 170 g/L

Ajustar a pH 4,9 con ácido fosfórico

\bullet

\vtcortauna 20 ml M-N:

\bullet

\vtcortauna 1 ml CaCl_{2}\cdot2H_{2}0 1%

\newpage

\bullet

\vtcortauna 5 ml de solución madre (véase MM más arriba)

\bullet

\vtcortauna 2,5 ml NH_{4}NO_{8} 20% (p/v)

\bullet

\vtcortauna 10 ml de glicerol 50%

\bullet

\vtcortauna 40 ml MES 1M:

\quad

39,04 g C_{8}H_{13}NO_{4}S ó 42,64 g C_{6}H_{13}NO_{4}S\cdotH_{2}O;

Ajustar a pH 5,5 con NaOH

\bullet

\vtcortauna 10 ml de glucosa 20% (p/v)

\bullet

\vtcortauna 100 mM de acetosiringona (disolver 0,196 g en 2-3 ml de ETOH 70% y usar todo el volumen; preparar nuevo para cada uso)

\bullet

\vtcortauna Kanamicina 50 \mug/ml

Ajustar a un volumen final de 1 L con agua destilada en autoclave. Almacenar todo

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Medio de cocultivo (CC) (placas de Petri - todas las soluciones se esterilizan por filtración)

\bullet

\vtcortauna IM y conteniendo:

\bullet

\vtcortauna Glucosa 20%

\bullet

\vtcortauna Agar 1,5%

Esterilizar en autoclave durante 20 min. Verter en placas como se desee.

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Medio de selección (SM) (placas de Petri)

\bullet

\vtcortauna 20 g extracto de malta

\bullet

\vtcortauna 2,1 g MOPS

\bullet

\vtcortauna agar 1,5%

Ajustar a pH 7,0 con KOH

Ajustar a 1 L con agua destilada

Esterilizar en autoclave durante 20 min, enfriar, y añadir los siguientes antibióticos (esterilización por filtrado):

\bullet

\vtcortauna Higromicina 30 ó 50 \mug/ml

\bullet

\vtcortauna Cefotaxima 200 \mug/ml

\bullet

\vtcortauna Moxalactama 100 \mug/ml

Excepto si se indica en otro sentido, todos los experimentos aquí descritos involucraron el uso de laminillas procedentes de cuerpos fructíferos maduros, Agrobacterium tumefaciens cepa AGL-1 portando un vector plásmido binario pBGgHg, un período de inducción de 2-6 h en AS 200 \mug/ml, un período de cocultivo de 3 días, y una selección en un medio de higromicina 30 \mug/ml durante 28 días. También, en los experimentos iniciales, se preparó la solución madre de AS en etanol 70% y se almacenó a -20ºC para su uso durante semanas a meses. No obstante, en experimentos posteriores se procedió a la preparación de AS nueva en etanol 70% para cada experimento, debido a que ello proporcionaba constantemente altos rendimientos de transformación.

Los tratamientos de control consistían bien en piezas de tejido infiltradas al vacío con medio de inducción solamente o bien infiltradas con bacterias que no se habían inducido con AS.

Aparecieron colonias de A. bisporus resistentes a la higromicina en los márgenes de las piezas de tejidos comenzando tan pronto como a los 7 días de incubación en el medio de selección (Figs. 2 y 3). Los métodos de la invención proporcionaron un rendimiento de transformación del 8 al 92% (% de las piezas de tejido regenerando colonias) en los experimentos basados en resistencia a la higromicina. Esto es superior en seis a siete órdenes de magnitud al método de transformación mediado por Agrobacterium para el A. bisporus comunicado anteriormente (\sim0,00003%). El protocolo de transformación del cuerpo fructífero según la invención tiene una utilidad inmensamente superior, ofreciendo un rendimiento efectivo superior, una mayor facilidad, y una rapidez mucho mayor que la del método original de transformación mediada por Agrobacterium descrito para el A. bisporus.

La elección de promotor, de cepa del A tumefaciens y del tipo de tejido del cuerpo fructífero se variaron para aislar materializaciones preferidas de la invención. En una serie de tres experimentos que comparaban constructos del gen del HPH y del GPD del A. bisporus, del trpC del Aspergillos nidulans, o del promotor CaMV 35S, solo el vector con el promotor homólogo (esto es, el GPD del A. bisporus) transformó el A. bisporus con un elevado rendimiento (Tabla 2).

Así, es probable que se pudieran emplear promotores para otros genes del A. bisporus en lugar del promotor GPD del A. bisporus con rendimientos parecidos.

TABLA 2 Efecto de la fuente del promotor sobre la transformación del Agaricus bisporus

1

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De las cepas bacterianas examinadas, solo la AGL-I y la EHA-105, pero no la GV3850, transformaron el A. bisporus, con una media de rendimiento cada una de \sim23% en dos experimentos (Tabla 3).

TABLA 3 Efecto de la cepa de Agrobacterium tumefaciens sobre la transformación del Agaricus bisporus

2

Se pudieron usar piezas de cuerpo fructífero compuestas de tejido de laminillas así como tejido no de laminillas derivado del tallo y del sombrero de cuerpos fructíferos para transformar A. bisporus, pero el tejido de laminilla proporcionó el mayor rendimiento de transformación (una media de 57% en comparación con 17%) (Tabla 4). No solo el tejido de laminillas proporcionó rendimientos más elevados que el tejido no de laminillas, sino que los transformantes aparecieron antes en el medio de selección de antibióticos. Los transformantes resistentes a la higromicina derivados del tejido de laminillas se desarrollaron tan pronto como 7 días después de incubación en un medio de selección en comparación con 10 días o más para transformantes derivados de tejido no de laminillas (Fig. 3).

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TABLA 4 Efecto del tipo de tejido de cuerpo fructífero sobre la transformación del Agaricus bisporus

4

5

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El cocultivo del A. tumefaciens con tejido de laminilla de cuerpos fructíferos maduros así como de laminillas poco desarrolladas de cuerpos fructíferos inmaduros, con AS 200 \muM ó 400 \muM usada durante la etapa de inducción, proporcionó rendimientos de transformación comparables con medias oscilando entre 53% y 82% (Tabla 5).

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TABLA 5 Efecto del estado del desarrollo del tejido de laminillas del cuerpo fructífero sobre la transformación del Agaricus bisporus

6

\newpage

La inducción de la bacteria con AS para períodos de entre 2 y 24 horas resultó en elevados rendimientos de transformación con una media en cuatro experimentos de entre 30% y 48% (Tabla 6).

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TABLA 6 Efecto del tiempo de inducción del Agrobacterium tumefaciens con acetosiringona sobre la transformación del Agaricus bisporus

7

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La inducción del A. tumefaciens con 20ºC y 25ºC proporcionó rendimientos de transformación respectivamente del 48% y 60%, (Tabla 7).

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TABLA 7 Efecto de la temperatura durante la inducción del Agrobacterium tumefaciens sobre la transformación del Agaricus bisporus

8

9

La transformación eficiente del A. bisporus resultó cuando se cocultivó tejido del cuerpo fructífero con A. tumefaciens en una gama de temperaturas de al menos 18ºC hasta 28ºC (Tabla 8). Sin embargo, hubo una indicación de que a la temperatura más elevada objeto de ensayo, disminuye el rendimiento (9% de la media) en relación con las temperaturas inferiores (32% a 47% del medio).

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TABLA 8 Efecto de la temperatura durante el cocultivo del Agrobacterium tumefaciens y del tejido de cuerpo fructífero sobre la transformación del Agaricus bisporus

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10

\newpage

El cocultivo del A. tumefaciens y del tejido del cuerpo fructífero del A. bisporus durante 1 a 4 días resultó en tendencias de transformación con medias para tres experimentos oscilando entre 0% y 62% (Tabla 9). Se dio una tendencia general al aumento del rendimiento con un aumento en la duración del cocultivo.

TABLA 9 Efecto de la duración del cocultivo del Agrobacterium tumefaciens y del tejido del cuerpo fructífero sobre la transformación del Agaricus bisporus

11

Los análisis "Southern blot" confirmaron que el gen del HPH estaba integrado en el genoma del A. bisporus (Fig. 4). No detectamos ningunos falsos positivos mediante análisis "Southern blot" o mediante amplificación PCR (Fig. 5) entre 37 cultivos resistentes a antibióticos.

El sistema de transformaciones de hongos divulgado aquí proporciona un nivel de rendimiento y de utilidad comparable con el procedimiento de transformación "floral dip" de Agro para el sistema de planta modelo, Arabidopsis thaliana. Se pudieron generar cultivos miceliales vegetativos transgénicos en menos de 2 semanas, y se pudieron producir cuerpos fructíferos maduros \sim8 semanas después bajo condiciones ambientales controladas. Se recolectaron treinta líneas de champiñones transgénicos resistentes a la higromicina y todos desarrollaron cuerpos fructíferos normales. El factor de resistencia al antibiótico se mantuvo de manera estable en ausencia de presión selectiva durante el crecimiento vegetativo y el desarrollo reproductivo de los cultivos, expresándose mediante los cuerpos fructíferos y las basidiosporas (Fig. 6).

Claims (16)

1. Un método de transformación de un hongo filamentoso comprendiendo lo que sigue: Introducción en células de un tejido de cuerpo fructífero de dicho hongo de un constructo de polinucleótido cuya presencia se desea en una célula receptora de hongo filamentoso por transformación mediada por Agrobacterium, comprendiendo dicho Agrobacterium dicho constructo de polinucleótido dentro de bordes de ADN-T y una región de Agrobacterium vir en presencia de un compuesto inductor vir.

2. El método de la reivindicación 1 donde dicho hongo filamentoso es el Agaricus bisporus.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2 donde dicho constructo de polinucleótido está dentro de un plásmido derivado de un Agrobacterium.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que dichas células comprenden un tejido de laminillas.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que dichas células de tejido del cuerpo fructífero se seleccionan de entre un grupo que consiste de laminillas, sombrero, tallo, velo y volva.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho constructo de polinucleótido comprende un casete de expresión.

7. El método de la reivindicación 6 donde dicho casete de expresión contiene un gen estructural ligado operativamente a una secuencia promotora capaz de dirigir la expresión en una célula fúngica.

8. El método de la reivindicación 7 donde dicho promotor es una secuencia de promotor de hongo.

9. El método de la reivindicación 8 donde dicho promotor de hongo y dichas células reproductivas receptoras son de la misma especie.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que comprende además la etapa de regenerar cultivos transgénicos desde dichas células de tejidos.

11. El método de la reivindicación 10 donde dichos cultivos se regeneran en alrededor de dos semanas.

12. Una célula fúngica transformada por el método de la reivindicación 1.

13. Un plásmido para la transformación de una célula fúngica comprendiendo el plásmido designado pBGgHg, que es un esqueleto de pCAMBIA1300 que contiene los genes de HPH y EGFP, cada uno de los cuales está unido al terminador CaMV 35S y controlado por el promotor GPD del A. bisporus.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 comprendiendo además la etapa de selección de células transformadas.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y 14 donde dicho compuesto inductor vir es un producto de una lesión de una planta.

16. El método de la reivindicación 15 donde dicho producto de lesión de la planta es la acetosiringona.