DE60133422T2 - Verfahren zur transformation von agaricus bisporus - Google Patents

Verfahren zur transformation von agaricus bisporus Download PDF

Info

Publication number
DE60133422T2
DE60133422T2 DE60133422T DE60133422T DE60133422T2 DE 60133422 T2 DE60133422 T2 DE 60133422T2 DE 60133422 T DE60133422 T DE 60133422T DE 60133422 T DE60133422 T DE 60133422T DE 60133422 T2 DE60133422 T2 DE 60133422T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
gene
promoter
transformation
agrobacterium
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60133422T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60133422D1 (de
Inventor
C. Peter University Park ROMAINE
Xi University Park CHEN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Penn State Research Foundation
Original Assignee
Penn State Research Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Penn State Research Foundation filed Critical Penn State Research Foundation
Application granted granted Critical
Publication of DE60133422D1 publication Critical patent/DE60133422D1/de
Publication of DE60133422T2 publication Critical patent/DE60133422T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi

Description

  • SACHGEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein den Bereich der Molekularbiologie. Genauer gesagt betrifft die Erfindung neue Verfahren für die hocheffektive Transformation von Pilzen. Mit den erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich Pilzspezies durch dem Fachmann bekannte Rekombinationstechniken, darunter Manipulationen zur Erhöhung der Widerstandsfähigkeit gegen Pathogene, Schädlinge und Pestizide, zur Erhöhung des Ertrags und der Qualität, zur Verlängerung der Haltbarkeitsdauer, für besseren Genuss-, Nähr- und Heilwert u. ä. sowie für die kommerzielle Produktion von heterologen Proteinen verbessern.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Pilze sind mikroskopische sporentragende Organismen, die nicht über Chlorophyll verfügen und ihre Nahrung daher aus toter oder lebender organischer Materie beziehen. Introductory Mycology (eds.). Alexopoulos. C J., Mims, C. W. und Blackwell, M. (1996). 4th Edition. Chapter 1. Da sie sowohl Merkmale von Pflanzen als auch von Tieren haben, werden sie getrennt im Reich der Pilze klassifiziert. In diesem Reich gibt es „fadenförmige Pilze", die so benannt sind, weil ihre Vegetationskörper aus kleinen fadenartigen Filamenten bestehen, die als „Hyphen" bezeichnet werden. Normalerweise wachsen diese Hyphen in verzweigter Form und breiten sich über das als Nahrungsquelle dienende Substrat oder in ihm aus und bilden dabei ein Netz, das „Myzel" genannt wird. Somit ist das Myzel der Vegetationskörper des Pilzes. Im Lebenszyklus der Mehrzahl der fadenförmigen Pilze bringt das vegetative Myzel entweder ungeschlechtliche oder geschlechtliche Sporen hervor. Ungeschlechtliche Sporen tragen eine Vielfalt von Bezeichnungen, verbreitete Termini sind jedoch „Konidien", „Konidiosporen" oder einfach „Sporen". Das vegetative Myzel des Pilzes kann sich mit den entsprechenden biologischen und ökologischen Signalen auch in eine geschlechtliche Sporen tragende Struktur differenzieren. Manche Pilze produzieren recht große faserige („fleischige") Sporen, die als „Ständerpilze", „Fruchtkörper", „Basidiokarpe", „Ascokarpe" oder „Basidome" bezeichnet werden. Die Fruchtkörper mancher Pilze sind essbar und werden wegen ihrer Genuss-, Nähr- oder Heileigenschaften geschätzt; sie sind als solche sehr gefragt oder werden kommerziell gezüchtet.
  • Der Fruchtkörper lässt sich in spezialisierte Gewebe wie die fleischige, schirmförmige Kappe (Pilzhut), den Stiel (Stipes), die Hauttasche an der Stielbasis (Volva) und Lamellen, die die geschlechtlichen Sporen tragen, einteilen. Eine Schleier genannte Hülle ist ein dünnes Gewebe, das die Unterseite der Kappe bedecken kann. Der Schleier reißt, wenn der Fruchtkörper seine volle Reife erreicht, legt die Lamellen frei und gestattet das Freisetzen der geschlechtlichen Sporen in die Umwelt. Die Fruchtkörper mancher Pilze verfügen jedoch nicht über Lamellen und bestehen stattdessen aus fleischigem Gewebe mit kleinen Poren oder Fruchtknotenfächern, die die geschlechtlichen Sporen beherbergen. Von den fleischigen Reproduktionsstrukturen der Pilze produzierte geschlechtliche Sporen werden durch verschiedene Termini wie „Ascosporen", „Basidiosporen" oder einfach „Sporen" bezeichnet.
  • Somit lässt sich der Fruchtkörper von Pilzen funktional mit der Reproduktionsstruktur von Pflanzen vergleichen, während sowohl die ungeschlechtlichen als auch die geschiechtlichen Sporen mit den Samen von Pflanzen vergleichbar und wichtig für das Überleben des Pilzes in der Natur sind. Unter geeigneten Umweltbedingungen keimt die Spore aus und bildet eine weitere Generation von vegetativen Hyphen, womit sie den Lebenszyklus des Pilzes vollendet.
  • Fadenförmige Pilze spielen eine überaus wichtige Rolle als primäre Zersetzer in ihren jeweiligen natürlichen Lebensräumen. Sie haben auch einen großen Einfluss auf die Nahrungsgüterproduktion. Manche Pilze wie die Ständerpilze werden als Nahrungsmittel genutzt, während andere Pflanzenpathogene sind, die für verheerende Nutzpflanzenverluste in aller Welt führen. Fadenförmige Pilze sind auch in Industrie und Medizin von Bedeutung, da sie sowohl verschiedene Arrays von Enzymen (z. B. Proteasen, Lipasen) als auch primäre (z. B. organische Säuren) und sekundäre Metaboliten (z. B. die Antibiotika Penicillin und Cephalosporin) absondern. Der kultivierte Pilz Agaricus bisporus ist mit einer Weltproduktion von 1,5 Millionen Tonnen im Jahre 1990 eine bedeutende Nutzpflanze. Fadenförmige Pilze sind auch als Wirte für die Großproduktion von homologen und heterologen Proteinen attraktiv, denn sie sind in der Lage, beträchtliche Mengen an Proteinen auszuscheiden.
  • Etwa 40% der kommerziell erhältlichen Enzyme sind aus fadenförmigen Pilzen abgeleitet. Lowe, Handbook of Applied Mycology. Fungal Biotechnology (eds.) Arora, D. K. Elander, R. P. & Mukerji, K. G. 681–708 (Marcel Dekker, New York; 1992). Diese Enzyme werden normalerweise von Spezies der Genera Aspergillus und Trichoderma produziert. Da sie große Mengen an Protein in das Medium absondern, können sie durch Fermentation im industriellen Maßstab gezüchtet werden und sind sie allgemein als sicher für die Nahrungsgüterindustrie anerkannt. Zu den allgemeinen Problemen der kommerziellen Züchtung von Ständerpilzen (A. bisporus) gehören durch Krankheitserreger wie Verticillium fungicola (Welkekrankheit), Trichoderma harzianum, Biotypen 2 und 4 (Grünschimmel), Pseudomonas tolaasii (Braunflecken) und dsRNA-Viren (La France und Fleckenkrankheit) verursachte Krankheiten, das Hauptschadinsekt (Pilzmücken wie Lycoriella mali), ein extrem kurzer Lebenszyklus des Produkts infolge bakteriellen Verderbs und rascher Seneszenz, und die Braunverfärbung des Fruchtkörpers, die der Wirkung endogener Polyphenoloxidasen (PPO, wie Tyrosinase) zugeschrieben wird. Zur weiteren Verbesserung der Produktqualität haben sich herkömmliche Zuchtprogramme für A. bisporus nur in bescheidenem Maße als erfolgreich erwiesen und sind langfristig unter Umständen nicht erfolgreich. Das liegt daran, dass die herkömmlichen Zuchttechniken für Pilze sehr zeitaufwendig sind, und daran, dass die genetische Variation bei handelsüblichen Stämmen begrenzt ist und wenig Fortschritt durch Selektion bietet (Horgen et al., „Homology between mitochondrial DNA of Agaricus bisporus and an internal portion of a linear mitochondrial plasmid of Agaricus bitorquis" Curr Genet. 1991 Jun; 19 (6): 495–502).
  • Im Falle von A. bisporus wird das Hauptproblem für effektive Zuchtstrategien durch den eher anormalen Lebenszyklus hervorgerufen, der die ungewöhnliche gleichzeitige Aufspaltung beider Elternkerne in jeweils eine Basidiospore umfasst. Nach der Keimung dieser Basidiospore wird heterokaryotisches Myzel gebildet, das Kerne und genetische Merkmale enthält, die sich nicht von den im Elternmyzel enthaltenen unterscheiden. Außerdem wird während der Meiose nur geringe Rekombinationsaktivität beobachtet (Summerbell et al., Genetics, Oct. 123 (2) 1989 S. 293–800).
  • Aus diesem Grunde haben Forscher in aller Welt versucht, ein Transformationssystem zur Einführung neuer Merkmale für kommerziell genutzte Pilze wie A. bisporus zu entwickeln. Bei anderen Pilzen wie auch bei Pflanzen, Tieren und Bakterien ist die Anwendung der Gentransfertechnologie recht gebräuchlich und hat bereits kommerzielle Anwendung gefunden. Jedoch das Fehlen eines effizienten, reproduzierbaren, stabilen Transformationssystems, das allgemein bei vielen Pilzen vor einem Wildtyphintergrund anwendbar ist, hat die molekularbiologische Forschung solcher Organismen bisher stark behindert.
  • Zu den gegenwärtigen Transformationstechniken für Pilze gehörten eine Kombination von CaCl2 und Polyethylenglycol (PEG), Elektroporation und die Anwendung der Partikelkanone zur Einbringung von DNA in Protoplasten, das Myzel oder in Sporen. Diese verliefen entweder erfolglos oder waren nicht reproduzierbar. Das Fehlen eines praktischen Gentransfersystems ist das wohl größte Einzelhindernis für die Nutzung molekularer Ansätze zur genetischen Verbesserung von Pilzen. Trotz beträchtlichen Interesses an der Entwicklung eines Transformationssystems ist derzeit kein Verfahren im allgemeinen Gebrauch, was an deren zu geringer Effektivität oder zu geringem Nutzen und Komfort liegt.
  • In jüngsten Ansätzen wurden mehrere Pilze, darunter A. bisporus, mit Hilfe eines Transformationssystems auf Agrobacterium-Basis transformiert. Obwohl diese Verfahren komfortabler sind als die vorhandenen Strategien auf Protoplastenbasis, haben sie bisher mit vergleichsweise geringer Effektivität der Transformation unter Einsatz von komplizierten Systemen zu kämpfen.
  • Zum Beispiel beschreiben Gouka et al. ein Transformationsverfahren für gezielte homologe Rekombinationen in Pilzen (Gouka et al. Nature Biotechnology Vol 17 June 1999, „Transformation of Aspergillus awamori by Agrobacterium tumefaciens-mediated homologous recombination" S. 598–601). Nach diesem Verfahren werden ein gentechnisch speziell konstruierter Empfängerstamm von A. awamori mit einem infolge Deletion am 3'-Ende funktionsunfähigen pyrG-Gen und ein Agrobacterium-Stamm mit einem für die Restaurierung des pyrG-Gens durch Rekombination geeigneten binären Vektor verwendet. Eine homologe Rekombination zwischen dem Reparaturkonstrukt und dem Empfängerwirt führen zur Restaurierung des funktionalen pyrG-Gens und zur Integration des Vektors am pyrG-Genort. Die Studie meldete ein Hoch von 150 Transformanten pro 107 Konidien.
  • De Groot et al. berichten über noch ein weiteres auf Agrobacterium beruhendes Verfahren zur Transformation von fadenförmigen Pilzen (De Groot et al. Nature Biotechnology Vol 16 September 1998, „Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi" S. 839–842). Diese Studie erforschte die Fähigkeit von Agrobacterium zur Übertragung von T-DNA auf die A. awamori-Protoplaste (vegetative Zellen mit entfernten Zellwänden) und Konidien. Die Transformationsfrequenz schwankte von ungefähr 800 bis 7200 Transformanten pro 107 Protoplasten, was bis zu 600 Mal über den PEG-Transformationsraten lag. Wenn Konidien verwendet wurden, schwankte die Transforrmationsfrequenz von 1000 bis 9000 Transformanten pro 107 Konidien. Vegetatives Myzelgewebe wurde ebenfalls verwendet.
  • Weitere Pilztransformationsstrategien werden in den Patentschriften WO 95/02691 und WO 98/45455 offen gelegt. All diese Bemühungen haben sich auf die Transformation mit Protoplasten, Sporen und vegetativem Myzel als Empfängergewebe konzentriert.
  • Wie aus dem oben Gesagten ersichtlich ist, besteht unter Fachleuten laufender Bedarf an effektiven, komfortablen und schnellen Pilztransformationssystemen.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, ein Transformationssystem für Pilze bereitzustellen, das den genannten Bedarf deckt.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Mechanismen zur Anwendung von transgenen Techniken wie jenen, die auf Bakterien, andere als fadenförmige Pilze (Hefe), Pflanzen und Tiere zur Erhöhung des Ertrags, der Widerstandsfähigkeit gegen Krankheiten und Schädlinge, Produktqualität, der Haltbarkeitsdauer oder des Genuss-, Nähr- und Heilwerts, zur kommerziellen Produktion oder für vergleichbare Protokolle Anwendung finden.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Polynukleotidkonstrukten, Vektoren, transformierten Zellen zur Verwendung in solchen transgenen Protokollen.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von genetischen Konstrukten zur Expression oder Inhibierung von Genprodukten in fadenförmigen Pilzen.
  • Weitere Aufgaben der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung der Erfindung.
  • DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Das hier beschriebene verbesserte Transformationsverfahren stellt eine praktische Methode für die Nutzung transgener Technologie bei der genetischen Verbesserung von fadenförmigen Pilzen zur Verfügung und stellt ein wichtiges Werkzeug für die molekulargenetische Analyse von biologischen Prozessen in diesen Organismen dar. Weiterhin ermöglicht das Verfahren die genetische Veränderung von Pilzen, so dass diese als Biofermentoren für die Großproduktion von kommerziell wichtigen Produkten wie zum Beispiel Wachstumshormonen dienen. Weiterhin kann das Transformationsprotokoll, mit Modifikationen hinsichtlich der Auswahl des Promoters und Stammes von Agrobacterium, auf alle Pilzspezies mit fleischigen Fruchtkörpern Anwendung finden und durch die Wahl des Agrobacteriums oder Promoters optimiert werden. Zu Beispielen von für diese Erfindung nützlichen fadenförmigen Pilzen gehören die folgenden Mitglieder der Phyla Basidiomycota und Ascomycota:
    Coprinus spp., Coriolus spp., Agaricus spp., darunter die Spezies bisporus, Flammulina velutipes, Lentinula edodes, Morchella ssp, Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus, Schizophyllum-Kommune und Tricholoma matsutake, unter anderen.
  • Herkömmliche transgene Techniken für Pilze nutzen Protoplaste, das vegetative Myzel oder Sporen als empfangende Zelle oder Gewebetyp. Die Anmelder haben überraschend festgestellt, dass sich bei Verwendung des geschlechtlichen Reproduktionsstrukturgewebes, also des Fruchtkörpers, der vorzugsweise Lamellengewebe aufweist, die Transformationsraten drastisch verbessern. Die Nutzung dieses Gewebes in einer beliebigen Art von hier beschriebenem transgenem Protokoll für Pilze stellt die weitestgehende Ausbildung dieser Erfindung dar.
  • In der vorliegenden Erfindung werden Agrobacterium-vermittelte Transformationen verwendet.
  • Die Anmelder haben ein hocheffektives, komfortables und schnelles genetisches Transformationssystem für fadenförmige Pilze wie A. bisporus konzipiert. Im bevorzugten Verfahren wird ein Agrobacterium-vermitteltes Transformationsprotokoll verwendet. Zu den wesentlichen Merkmalen dieses Protokolls gehört die Kokultivierung des Bakteriums mit Fruchtkörpergewebe anstelle von Basidiosporen. In einer bevorzugten Ausführungsform wurde die höhere Transformationseffektivität bei Verwendung eines homologen Promoters im Polynukleotidkonstrukt zum Antrieb der Genexpression beobachtet. Dieses Verfahren bietet neue Möglichkeiten für die genetische Verbesserung der kommerziell bedeutsamen Pilzspezies sowie anderer fadenförmiger Pilzspezies und potenziert den Nutzen von genmodifizierten Pilzen als Biofermentoren für die Massenproduktion kommerziell wertvoller Produkte. Die erfindungsgemäßen Verfahren boten eine Transformationseffektivität von 92% (Prozentsatz der Kolonien, die Gewebestücke regenerieren) auf der Grundlage von Resistenz gegenüber Antibiotika (Hygromycin). Dieser Wert liegt sechs bis sieben Größenordnungen über den bisher beschriebenen Agrobacterium-vermittelten Transformationsverfahren für A bisporus (ca. 0,00003%). Zudem wurden die Transformanten mit der hier offen gelegten Erfindung in nur 7 Tagen gewonnen, wogegen dies bei dem ursprünglich beschriebenen Verfahren 4–5 Wochen dauern würde.
  • Mit dem erfindungsgemäßen Transformationsverfahren können die dem Fachmann bekannten und routinemäßig an Bakterien, anderen als fadenförmigen Pilzen, Pflanzen und Tieren angewandten Techniken des genetischen Engineering für die genetische Manipulierung von Fadenpilzen genutzt werden, um die Zucht oder Produktion zu erleichtern oder den Genuss-, Nähr- und Heilwert zu verbessern bzw. rekombinante Proteine für die Ernte zu produzieren.
  • Die Erfindung umfasst weiterhin neue Zusammensetzungen, darunter aus solchen transgenen Pilzen isolierte Produkte. Eingeschlossen sind außerdem Expressionskonstrukte zur Verwendung in diesem Verfahren sowie die diese enthaltenden transformierten Zellen, Vektoren und transgenen Pilze.
  • Das erfindungsgemäße Fruchtkörpertransformationsprotokoll ist in Bezug auf seine Praktikabilität überlegen und bietet eine höhere Effektivität und größeren Komfort als andere Agrobacterium-vermittelten Transformationsverfahren; außerdem ist es schneller.
  • Begriffsbestimmungen
  • Sofern nicht anders angegeben, werden verschiedene erfindungsgemäße Zusammensetzungen und Verfahren hier und in der gesamten Patenschrift sowie in den Ansprüchen in der hier angegebenen Bedeutung verwendet.
  • Verschiedene Einheiten, Präfixe und Symbole können in ihrer SI-anerkannten Form bezeichnet werden. Sofern nicht anders angegeben, werden Nucleinsäuren von links nach rechts in der Ausrichtung 5' zu 3'-Reihenfolge notiert; Aminosäuresequenzen werden entsprechend von links nach rechts in Amino- zu Carboxyreihenfolge geschrieben. Zahlenbereiche schließen die sie definierenden Zahlen und jede ganze Zahl im definierten Bereich ein. Aminosäuren können hier entweder durch ihre allgemein bekannten Drei-Buchstaben-Symbole oder durch die aus einem Buchstaben bestehenden, vom Biochemischen Nomenklaturausschuss der IUPAC-IUB empfohlenen Symbole bezeichnet werden. Nukleotide werden gleichermaßen durch ihre allgemein anerkannten Einbuchstaben-Codes bezeichnet. Sofern nicht anders bestimmt, werden hier verwendete Software-, Elektrik- und Elektroniktermini gemäß ihrer Definition im New IEEE Standard Dictionary of Electrical and Electronics Terms (5th edition, 1993) verwendet. Die im Folgenden definierten Begriffe werden durch Bezugnahme auf die Patentschrift als Ganzes vollständiger definiert.
  • In diesem Dokument soll der Begriff „Agrobacterium" alle Bakterienspezies und ihre modifizierten Varianten einschließen, die eine gewünschte Pilzzelle infizieren können. Wiewohl hier das Ti-Plasmid des Agrobacterium tumefaciens beschrieben wird, ist die Erfindung nicht darauf beschränkt. Die Wahl des bestimmten bakteriellen Vektors umfasst mehr als die routinemäßige Optimierung von Parametern durch den Fachmann. Es können andere Bakterien verwendet werden, die für den Fachmann durch solche Quellen wie die Genbank erhältlich sind.
  • Ein „Antisense-Oligonukleotid" ist ein Molekül aus mindestens 6 zusammenhängenden nukleotiden, vorzugsweise komplementär zur DNA (Antigen) oder RNA (Antisense), die in den Prozess der Transkription oder Translation endogener Proteine eingreift, so dass Genprodukte inhibiert werden.
  • Ein „Klonierungsvektor" ist ein DNA-Molekül wie ein Plasmid, Cosmid oder eine Bakterienphage, die in der Lage ist, sich autonom in einer Wirtszelle zu replizieren. Klonierungsvektoren enthalten normalerweise einen oder eine geringe Anzahl an Restriktions-Endonuclease-Erkennungsstellen, an denen fremde DNA-Sequenzen in bestimmbarer Weise ohne Verlust der wesentlichen biologischen Funktion des Vektors eingebracht werden können, sowie ein Marker-Gen zur Kennzeichnung und Auswahl von mit dem Klonierungsvektor transformierten Zellen. Zu den Marker-Genen gehören normalerweise auch jene, die Widerstand gegen Antibiotika wie Hygromycin, Tetracyclin oder Ampicillin bieten.
  • Eine „codierende Sequenz" oder „codierende Region" bezieht sich auf ein Nucleinsäuremolekül, das die bei der Expression einer Sequenz zur Herstellung eines Genprodukts erforderlichen Sequenzinformationen hat.
  • Der Begriff „konservativ modifizierte Varianten" gilt sowohl für Amino- als auch für Nucleinsäuresequenzen. Im Hinblick auf bestimmte Nucleinsäuresequenzen beziehen sich konservativ modifizierte Varianten auf jene Nucleinsäuren die identische oder konservativ modifizierte Varianten von Aminosäuresequenzen codieren. Wegen der Degeneration des genetischen Codes wird ein gegebenes Protein durch eine große Anzahl an funktional identischen Nucleinsäuren codiert. Zum Beispiel codieren die Codonen GCA, GCC, GCG und GOU alle die Aminosäure Alanin. Somit kann an jeder Stelle, an der Alanin durch ein Codon angegeben ist, das Codon in eines der beschriebenen entsprechenden Codonen umgewandelt werden, ohne das codierte Polypeptid zu ändern. Solche Nucleinsäurevariationen sind „stille Variationen" und repräsentieren eine Spezies von konservativ modifizierter Variation. Jede Nucleinsäuresequenz hierin, die ebenfalls ein Polypeptid codiert, beschreibt jede mögliche stille Variation der Nucleinsäure. Jemand mit einem gewöhnlich vorausgesetzten Grad an Geschicklichkeit wird erkennen, das jedes Codon in einer Nucleinsäure (außer AUG, das normalerweise das einzige Codon für Methionin ist; und UGG, das normalerweise das einzige Codon für Tryptophan ist) zu einem funktionell identisches Molekül modifiziert werden kann. Entsprechend ist jede stille Variation einer Nucleinsäure, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid codiert in allen beschriebenen Polypeptidsequenzen impliziert und liegt im Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung.
  • In Bezug auf Aminosäuren wird jemand mit dem vorausgesetzten Grad an Geschicklichkeit erkennen, dass einzelne Substitutionen, Deletionen von oder Additionen zu einer Nucleinsäure, einem Peptid, Polypeptid oder einer Proteinsequenz, die eine einzelne Aminosäure oder einen kleinen Prozentsatz an Aminosäuren in der codierten Sequenz verändern, ihr etwas hinzufügt oder etwas von ihr löscht, eine „stille modifizierte Variante" darstellt, in der diese Änderung zur Substitution einer Aminosäure durch eine chemisch gleiche Aminosäure führt. Somit kann eine Anzahl an Aminosäureresten, die aus der Gruppe von ganzen Zahlen zwischen 1 und 15 ausgewählt wurde, auf diese Weise verändert werden. So können zum Beispiel 1, 2, 3, 4, 5, 7 oder 10 Veränderung(en) vorgenommen werden. Konservativ modifizierte Varianten bieten normalerweise die gleiche biologische Aktivität wie die nichtmodifizierte Polypeptidsequenz, von der sie abgeleitet sind. Zum Beispiel beträgt die Substratspezifität, Enzymaktivität oder Liganden-/Rezeptorbindung im Allgemeinen mindestens 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% des nativen Proteins für dessen natives Substrat. Konservative Substitutionstabellen, die funktionell gleiche Aminosäuren angeben, sind dem Fachmann wohlbekannt.
  • Die folgenden sechs Gruppen enthalten alle Aminosäuren, die konservative Substitutionen füreinander sind:
    • 1) Alanin (A), Serin (S), Threonin (T);
    • 2) Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E);
    • 3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
    • 4) Arginin (R), Lysin (S);.
    • 5) Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Valin (V); und
    • 6) Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W).
  • Siehe auch Creighton (1984), Proteins. W. H. Freeman and Company.
  • Der Begriff „Kosuppression" ist eine Methode zur Hemmung der Genexpression in Organismen, bei der ein Konstrukt in einen Organismus eingeführt wird. Das Konstrukt verfügt über eine oder mehrere Sequenzkopien, die mit einem residenten Gen identisch sind oder dessen Nukleotidhomologie aufweisen.
  • Mit „codieren" oder „codiert" ist in Bezug auf eine angegebene Nucleinsäure gemeint, dass sie die Information zur Translation in das angegebene Protein aufweist. Eine ein Protein codierende Nucleinsäure kann nicht translatierte Sequenzen (z. B. Intronen) in translatierten Regionen der Nucleinsäure aufweisen, oder solche intervenierenden nicht translatierten Sequenzen können fehlen (wie z. B. in cDNA). Die Information, nach der ein Protein codiert wird, wird unter Verwendung von Codonen angegeben. Normalerweise wird die Aminosäuresequenz von der Nucleinsäure mit dem genetischen „Universalcode" codiert. Jedoch können auch Varianten des Universalcodes, wie sie zum Beispiel in manchen Mitochondrien von Pflanzen, Tieren und Pilzen, im Bakterium Mycoplasma capricolum oder der Wimpernzelle Macronucleus vorhanden sind, verwendet werden, wenn die Nucleinsäure darin exprimiert ist.
  • Wenn die Nucleinsäure synthetisch zubereitet oder verändert wird, lassen sich bekannte Codonenpräferenzen des intendierten Wirts, in dem die Nucleinsäure exprimiert werden soll, ausnutzen. Beispiel: Obwohl die erfindungsgemäßen Nucleinsäuresequenzen sowohl in Pflanzen- als auch in Pilzspezies exprimiert werden können, lassen sich Sequenzen modifizieren, um die spezifischen Kolonpräferenzen und GC-Inhaltspräferenzen zu ergeben, denn diese Präferenzen können wie in der hier zitierten Literatur beschrieben verschieden sein.
  • Der Terminus „Expression" bezieht sich auf die Biosynthese eines Genprodukts. Die strukturelle Genexpression umfasst die Transkription des strukturellen Gens in mRNA und die anschließende Translation der mRNA in ein oder mehrere Polypeptid(e).
  • Ein „Expressionsvektor" ist ein DNA-Molekül, das ein in einer Wirtszelle exprimiertes Gen aufweist. Normalerweise wird die Genexpression unter der Kontrolle bestimmter regulatorischer Elemente einschließlich Promoter, gewebespezifischer regulatorischer Elemente und Enhancer durchgeführt. Von einem solchen Gen wird gesagt, dass es mit den regulatorischen Elementen „operativ verbunden" ist.
  • Für die Verwendung in diesem Dokument soll der Terminus „Fruchtkörper" Gewebe oder Zellen aus allen geschlechtlichen Reproduktionsstrukturgeweben eines Pilzes, die kein vegetatives Myzel und keine Sporen sind, einschließen, darunter die Kappe, den Stiel, die Lamellen, den Schleier, die Volva usw.
  • Für die Verwendung in diesem Dokument soll „heterolog" in Bezug auf eine Nucleinsäure eine Nucleinsäure bezeichnen, die einer fremden Spezies entstammt bzw., wenn sie der gleichen Spezies entstammt, durch einen bewussten menschlichen Eingriff aus ihrer nativen Form substanziell in ihrer Zusammensetzung und/oder ihrem genomischen Locus modifiziert wurde. Beispiel: Ein operativ mit einem heterologen strukturellen Gen verbundener Promoter stammt von einer anderen Spezies als der, aus der das strukturelle Gen abgeleitet wurde, bzw. wenn er der gleichen Spezies entstammt, ist der/das eine oder sind beide substanziell von ihrer ursprünglichen Form verändert. Ein heterologes Protein kann von einer fremden Spezies stammen bzw. wurde durch bewussten menschlichen Eingriff wesentlich von seiner Ausgangsform modifiziert, wenn es der gleichen Spezies entstammt.
  • Für die Verwendung in diesem Dokument soll der Terminus „hohe Stringenz" Bedingungen oder Hybridisierung wie folgt bedeuten: Hybridisierung für 12 Stunden bei 42°C in einer Pufferlösung mit 60% Formamid, 5 × SSPE, 2% SDS, 10 × Denhardt-Mix und 100 μg/ml Lachsspermien-DNA und Wäsche mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 55°C und 4 Tage lang bei –70°C Exposition auf Kodak X-Omat AR-Film.
  • Mit „Wirtszelle" wird eine Zelle bezeichnet, die einen Vektor enthält und die Replikation und/oder Expression des Vektors unterstützt. Bei Wirtszellen kann es sich um prokaryotische Zellen wie E. coli oder um eukaryotische Zellen wie Pilz-, Insekten-, Amphibien- oder Säugetierzellen handeln. Die Wirtszellen sind bevorzugt Pilzzellen.
  • Der Terminus „eingebracht" bedeutet im Zusammenhang mit dem Einsetzen einer Nucleinsäure in eine Zelle eine „Transfektion" oder „Transformation" oder „Transduktion" und bezieht sich unter anderem auf die Inkorporierung eines Nucleinzusatzes in eine eukaryotische oder prokaryotische Zelle ein, wobei die Nucleinsäure in das Genom der Zelle (z. B. Chromosom, Plasmid, Plastid oder mitochondriale DNA) inkorporiert, in ein autonomes Replikon umgewandelt oder transient exprimiert wird (z. B. transfizierte mRNA).
  • Der Begriff „Polynukleotidkonstrukt" oder „DNA-Konstrukt" wird manchmal mit Bezug auf eine Expressionskonstruktion verwendet. Hierzu gehören jedoch auch Antisense-Oligonukleotide oder für die Kosuppression nativer Wirtszellsequenzen bzw. extrinsischer Sequenzen konstruierte Nucleotide, wie sie z. B. in Viren zu finden sind.
  • Der Terminus „operativ verbunden" bedeutet, dass die zur Expression der Codierungssequenz erforderlichen regulatorischen Sequenzen an den entsprechenden Stellen zur Codierungssequenz in ein Nucleinsäuremolekül eingefügt sind, um so die Expression der Codierungssequenz zu ermöglichen. Diese gleiche Definition wird manchmal auf die Anordnung anderer Transkriptionskontrollelemente (z. B. Enhancer) in einem Expressionsvektor angewendet.
  • Transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen sind regulatorische DNA-Sequenzen wie Promoter, Enhancer, Polyadenylationssignale, Terminatoren u. ä., die für die Expression einer Codierungssequenz in einer Wirtszelle sorgen.
  • Für die Verwendung in diesem Dokument soll sich der Terminus „Polynukleotid" unter anderem auf ein Desoxyribopolynukleotid, Ribopolynukleotid oder deren Analoga, die den wesentlichen Charakterzug eines natürlichen Ribonukleotide aufweisen, indem sie unter stringenten Hybridisierungsbedingungen substanziell die gleiche nukleotidsequenz wie natürlich vorkommende nukleotide hybridisieren und/oder eine Translation in die gleiche(n) wie das/die natürlich vorkommende(n) nukleotid(e) erlauben. Ein Polynukleotid kann seine volle Länge haben oder eine Untersequenz eines nativen oder heterologen strukturellen oder regulatorischen Gens darstellen. Sofern nicht anders angegeben, bezieht sich der Begriff auf die angegebene Sequenz und deren komplementäre Sequenz. Somit sind DNAs oder RNAs mit aus Stabilitäts- oder anderen Gründen modifizierten Gerüsten „Polynukleotide" im Sinne dieses Dokuments. Überdies sind ungewöhnliche Basen aufweisende DNAs oder RNAs wie Inosin oder modifizierte Basen wie tritylierte Basen, um nur zwei Beispiele zu nennen, sind Polynukleotide im Sinne dieses Dokuments. Es wird zu schätzen sein, dass eine viele verschiedene Modifikationen an DNA und RNA vorgenommen wurden, die vielen dem Fachmann bekannten nützlichen Zwecken dienen. Der Terminus Polynukleotid wird in diesem Dokument so gebraucht, dass er solche chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierte Formen von Polynukleotiden sowie für Viren und Zellen charakteristische chemische Formen von DNA und RNA, darunter einfache und komplexe Zellen.
  • Die Begriffe „Polypeptid", „Peptid" und „Protein" werden in diesem Dokument austauschbar verwendet und bezeichnen ein Polymer von Aminosäureresten. Die Begriffe gelten für Aminosäurepolymere, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste ein künstliches chemisches Analogon der entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure sowie der entsprechenden natürlichen Aminosäurepolymere. Der wesentliche Charakter solcher Analoga natürlich vorkommender Aminosäuren besteht darin, dass bei ihrer Inkorporierung in ein Protein dieses Protein besonders reaktionsfreudig gegenüber von diesem gleichen Protein bewirkten Antikörpern, die aber vollständig aus natürlich vorkommenden Aminosäuren bestehen. Die Begriffe „Polypeptid", „Peptid" und „Protein" schließen auch Modifikationen ein, darunter unter anderem Phosphorylierung, Glycosylierung, Lipidanbindung, Sulfatbildung, Gammacarboxylierung von Glutaminsäureresten, Hydroxylierung und ADP-Ribosylierung. Wie bekannt und oben angemerkt ist, sind Polypeptide nicht vollständig linear. So können Polypeptide zum Beispiel als Ergebnis einer Ubiquitinierung verzweigt sein, sie können mit und ohne Verzweigung ringförmig sein, was im Allgemeinen die Folge posttranslationaler Ereignisse, darunter natürliche Verarbeitungsereignisse und Ereignisse, die durch menschliche Manipulation, die nicht natürlich auftreten, bewirkt wurden. Ringförmige, verzweigte und verzweigte ringförmige Polypeptide können durch nichttranslationale natürliche Prozesse und durch vollständig synthetische Verfahren synthetisiert werden. Weiterhin sieht die Erfindung die Verwendung von methioninhaltigen und methioninfreien Terminalvarianten des erfindungsgemäßen Proteins vor. Mit Bezug auf ein Protein schließt der Terminus „N-terminale Region" ungefähr 50 an das Aminoterminalende eines Proteins angrenzende Aminosäuren ein.
  • Die Termini „Promoter", „Promoter-Region" oder „Promoter-Sequenz" beziehen sich generell auf transkriptionale regulatorische Regionen eines Gens, die sich an der 5'- oder der 3'-Seite der Codierungsregion oder innerhalb von Intronen befinden. Normalerweise ist ein Promoter eine DNA-regulatorische Region, die in der Lage ist, RNA-Polymerase in einer Zelle zu binden und die Transkription einer Codierungssequenz stromabwärts (zum 3'-Ende hin) zu initiieren. Die typische 5'-Promoter-Sequenz ist an ihrem 3'-Ende durch die Initiationsstelle der Transkription begrenzt und erstreckt sich stromaufwärts (zum 5'-Ende hin), so dass sie die Mindestanzahl der zur Initiierung der Transkription auf einem Niveau oberhalb der Nachweisgrenze notwendigen Basen oder Elemente umfasst. Innerhalb der Promotersequenz sind eine Transkriptionsinitiationsstelle (komfortabel durch Mapping mit Nuclease S1 definiert) sowie Proteinbindungsbereiche (Konsensussequenzen) für die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich. Der Begriff Promoter umfasst die wesentlichen regulatorischen Merkmale der jeweiligen Sequenz und kann optional eine lange terminale Wiederholungsregion vor der Translationsinitiationsstelle umfassen.
  • Ein „rekombinanter Wirt" kann jede prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein, die entweder einen Klonierungsvektor oder einen Expressionsvektor enthält. Dieser Terminus schließt jene prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen ein, die genetisch für die Aufnahme der Klongene in den Chromosomen oder Genomen der Wirtszelle eingerichtet wurden.
  • Der Terminus „Reportergen" bezeichnet ein Gen, das ein Produkt codiert, welches sich leicht mit Standardverfahren direkt oder indirekt nachweisen lässt.
  • Der Terminus „selektierbares Markergen" bezeichnet ein Gen, das ein Produkt codiert, welches bei Expression einen selektierbaren Phänotyp wie Antibiotikaresistenz auf eine transformierte Zelle überträgt.
  • Im Hinblick auf Oligonukleotide oder sonstige einsträngige Nucleinsäuremoleküle bezeichnet der Terminus „spezifisch hybridisierend" die Assoziation zwischen zwei einsträngigen Nucleinsäuremolekülen von hinreichend komplementärer Sequenz, um eine solche Hybridisierung unter den vom Fachmann allgemein angewandten vorbestimmten Bedingungen, d. h. Stringenzbedingungen, zu gestatten (mitunter auch als „substanziell komplementär" bezeichnet). Insbesondere bezeichnet der Terminus die Hybridisierung eines Oligonukleotids mit einer substanziell komplementären, in einem einsträngigen DNA- oder RNA-Molekül enthaltenen Sequenz bis zum substanziellen Ausschluss der Hybridisierung des Oligonukleotids mit einsträngigen Nucleinsäuren einer nicht komplementären Sequenz.
  • Ein „strukturelles Gen" ist eine DNA-Sequenz, die in Messenger-RNA (mRNA) transkribiert wurde und dann in eine Sequenz von für ein bestimmtes Polypeptid charakteristischen Aminosäuren translatiert wird.
  • Ein „Vektor" ist ein Replikon wie ein Plasmid, eine Phage, ein Cosmid oder ein Virus, in das/die/den ein anderes Nucleinsäuresegment operativ eingesetzt werden kann, um die Replikation oder Expression des Segments zu bewirken.
  • BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 zeigt den Aufbau des binären Vektors pBGgHg. pBGgHg ist 9,6 kb groß und besteht aus einem pCAMBIA 1300 Gerüst mit dem Kanamycin-Resistenzgen (R) und der rechten (R/B) und linken (L/B) Randsequenz der T-DNA des Agrobacteriums. Das Hygromycin-Resistenzgen (R) und das verstärkte grüne Fluoreszenzgen (EGFP) befinden sich zwischen den Randsequenzen und werden beide durch den A. bisporus Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase-Promoter (Pgpd) und den Blumenkohlmosaikvirusterminator (35S-3') ergänzt. Es werden Restriktionsenzymstellen mit Genabständen in kb dargestellt.
  • 2 veranschaulicht die Auswahl von putativen hygromycinresistenten Transformanten des Agaricus bisporus. Stücke des Lamellengewebes des Fruchtkörpers wurden 3 Tage lang mit dem (A+) und ohne den (A–) Agrobacterium tumefaciens-Stamm AGL-1, der den Vektor pBGgHg mit dem GPD Promoter und HPH-Genkonstrukt von A bisporus trug, kokultiviert. Gezeigt wird das Aussehen der Kulturen nach 2 Wochen auf Selektionsmedium mit 30 μg/ml Hygromycin.
  • 3 stellt den Zeitablauf für die Auswahl der hygromycinresistenten Transformante dar. Lamellengewebe und Nichtlamellengewebe aus Fruchtkörpern wurde drei Tage lang mit Agrobacterium tumefaciens AGL-1, das den Vektor pBGgHg trug, kokultiviert. Die Auswahl der antibiotikaresistenten Transformanten erfolgte auf Selektionsmedium mit 30 μg/ml Hygromycin.
  • 4 zeigt die Southern-Blot-Analyse von aus putativen hygromycinresistenten Transformanten von Agaricus bisporus isolierter DNA. Genomische DNA (5–10 μg) wurde aus beiden Kulturen isoliert, mit SacI aufgeschlossen und mit einer 32P-markierten HPH-Gensequenz (ca. 1 kb) sondiert. Bahnen 1–6, aus putativen Transformanten AT1-AT6 isolierte DNA; Bahn 7, aus nichttransformiertem A. bisporus isolierte DNA. Es werden die Positionen der DNA-Marker (kb) dargestellt.
  • 5 zeigt die PCR-Analyse von aus putativen hygromycinresistenten Transformanten von Agaricus bisporus isolierter DNA. Die PCR-Verstärkung erfolgte auf genomischer DNA mit den Primern (gpd-FH/hyg-R), die eine den A. bisporus abdeckende Sequenz von ca. 970 bp (GPD-Promoter und HPH-Gen) definieren. Bahnen 1–10, DNA isoliert aus den putativen Transformanten AT3, AT4, AT9, AT10, AT11, AT12, AT16, AT19, AT24 bzw.; Bahn 11 negative Kontrolle mit Wasser; Bahn 12, DNA isoliert vom nicht transformierten A. bisporus; Bahn 13, positive Kontrolle mit Plasmidvektor pBGgHg, Bahn M, DNA-Marker (kb).
  • 6 zeigt die Expression der Hygromycinresistenz-Eigenschaft in den Basidiosporen der ersten Generation, die aus den transgenen Kulturen von Agaricus bisporus produziert wurden. Basidiosporen aus zwei transgenen Linien (AT3 und AT6) und der nicht transformierte Elternstamm (NP) wurden auf ein Selektionsmedium mit 50 μg/ml Hygromycin aufplattiert. Die Lebensfähigkeit der Basidiosporen des Elternstammes wurde auf einem Selektionsmedium ohne Antibiotikum (nicht dargestellt) ermittelt.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • In ihrem weitesten Sinne umfasst die Erfindung die Transformation von Pilzen mit einem dem Fachmann bekannten und in diesem Dokument beschriebenen Transformationsverfahren unter Verwendung von Fruchtkörpergewebe anstelle von Protoplasten, Sporen oder dem vegetativen Myzel als Empfängerzellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung die Nutzung von Agrobacterium-vermittelter Transformation.
  • Verfahren zur Nutzung der Agrobacterium-vermittelten Transformationssysteme wurden bereits für viele verschiedene Pflanzenarten beschrieben. Agrobacterium tumefaciens ist ein gramnegatives Bodenbakterium, das an den Verletzungsstellen infizierter Pflanzen Crown-gall-Tumoren verursacht. Während der Tumorinduktion überträgt das Agrobacterium Teile seines tumorinduzierenden (Ti) Plasmids, die T-DNA, die von 24 bp unvollständigen direkten Sequenzwiederholungen flankiert wird, auf Pflanzenzellen. Die T-DNA integriert sich dann an einer willkürlich gewählten Stelle in die Pflanzen-DNA. Der Prozess des T-DNA-Transfers hängt von der Induktion einer Menge von Virulenzgenen (vir), die sich auch auf dem Ti-Plasmid befinden, ab. Die vir-Gene werden aus verletzten Pflanzenzellen durch Verbindungen wie Acetosyringon (AS) abgeschieden. In Pilztransformationsschemen müssen AS oder andere vir-Induktoren zugegeben werden, um vir-Gen-Aktivität auszulösen. Die leichte Nutzbarkeit, die Transformationseffektivität und die Genauigkeit der T-DNA-Integration haben zu einer weitverbreiteten Nutzung dieses Organismus für den Gentransfer in Pflanzen und die Entwicklung der Transformationsprotokolle für wichtige Nutzpflanzen wie Reis und Mais geführt.
  • Im Allgemeinen werden Bakterienstämme wie Agrobacterium tumefaciens für die genetische Transformation verwendet, die während der Tumorgenese einen Teil ihrer Ti-Plasmiden auf Pflanzen übertragen. Normalerweise beherbergt das verwendete Agrobacterium Versionen des natürlich vorkommenden Ti-Plasmids, aus dem die Onkogene und die opal-trüben Stoffwechselgene entfernt wurden, so dass die DNA ohne die nachfolgende Bildung von Tumoren auf die Wirtszellen übertragen wird. Bei diesen Verfahren wird die zu übertragende DNA in ein Zellgenom innerhalb der Grenzen des Ti-Plasmids positioniert, wobei die DNA mit einem Selektionsmarkergen verbunden ist, um die Selektion der transformierten Zellen zu ermöglichen. Bakterien und Empfängerpflanzengewebe werden zusammen kultiviert, um den Transfer fremder DNA in die Pflanzenzellen zu gestatten, dann werden die transformierten Pflanzen auf Selektionsmedium regeneriert. Eine beliebige Anzahl an verschiedenen Organen und Geweben kann als Zielort für die Agrobacterium-vermittelte Transformation dienen, wie es speziell für die Mitglieder der Familie der Kreuzblütler beschrieben wurde. Hierzu gehören dünne Zellschichten (Charest, P. J., et al, 1988, Theor. Appl. Genet. 75: 438–444), Hypokotyle (DeBlock, M., et al, 1989, Plant Physiol. 91: 694–701), Blattscheiben (Feldman, K. A., and Marks, M. D., 1986, Plant Sci. 47: 63, 69), Stämme (Fry J., et al, 1987, Plant Cell Repts. 6: 321–325), Kotyledone (Moloney M. M., et al, 1989, Plant Cell Repts, 8: 238–242) und Embryoide (Neuhaus, G., et al, 1987, Theor. Appl. Genet. 75: 30–36). Die Agrobacterium-vermittelte Transformation wurde in vielen Spezies als wirksam beschrieben, sowohl für einkeimblättrige als auch für zweikeimblättrige Pflanzen. Vor kurzem wurde eine Agrobacterium-Transformation in Hefe bestätigt. Siehe Bundock et al. „Trans-kingdom T-DNA tansfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae" The EMBO Journal vol. 14 no. 13S. 3206–3214, 1995. interessanterweise wurde jedoch nachgewiesen, dass die Übertragung in Hefe nach einem anderen Mechanismus abläuft als bei Pflanzen. Die Autoren schlussfolgern, dass die Integration vorwiegend durch Wirtsfaktoren statt durch das Bakterium selbst bestimmt wird. Dies ist wichtig, denn abhängig von dem bestimmten Wirt kann die Integration je nach Vorhandensein der Wirtsfaktoren auftreten oder nicht. Unlängst wurde die Agrobacteriumvermittelte Transformation im A. bisporus bestätigt, de Groot et al., doch nur mit sehr geringer Effektivität und als zeitlich ausgedehntes Verfahren.
  • Erfindungsgemäß soll ein Polynukleotidkonstrukt in eine fadenförmige Pilzzelle mittels Agrobacterium eingeführt werden, wobei letzteres als Vehikel für das transformierende Plasmid fungiert. Normalerweise wird das Polynukleotidkonstrukt innerhalb der Grenzen eines funktionsfähige vir-Gene enthaltenden Ti-Plasmid eingebracht, wiewohl sich die vir-Gene und das Polynukleotid nicht auf dem gleichen Plasmid zu befinden brauchen.
  • Die genetische Transformation findet dann durch einfaches Inkubieren des Agrobacteriums mit den Pilzfruchtkörper-Gewebezellen statt. Anschließend wird das Bakterium getötet und die Fruchtkörperzellen dürfen sich unter selektivem Druck regenerieren, um Transformanten zu identifizieren.
  • Somit stellt die Erfindung einen durch erfindungsgemäße Agrobacterium-vermittelte Transformation erhältlichen transformierten fadenförmigen Pilz bereit, der keine bakterielle DNA-Sequenz einschließlich T-DNA-Grenze aufweist. Solche transformierten Pilze können in einem Prozess zur Kultivierung eines transformierten Pilzes eingesetzt werden, um ein gewünschtes Protein oder eine gewünschte Spermien-Nucleinsäuresequenz herzustellen. Weiterhin können gemäß der vorliegenden Erfindung kurze einem Zielgen (wirts- oder virencodiert) entsprechende Nucleinsäuresequenzen, die unter Umständen kein Proteinprodukt codieren, zum Zweck des kosuppressiven Verstummens exprimiert werden. Die Erfindung sieht außerdem die Zucht transgener Pilze für die Ständerpilze als Nahrungsmittel, Medikamente usw. und als Quelle für ein gewünschtes Protein (z. B. Pharma-Produktion) sowie zum Züchten des vegetativen Myzels als Quelle eines gewünschten Proteins vor. Weiterhin kann das Protein innerhalb der Pilzzellen eine Extraktion erfordern, doch es kann auch zur Gewinnung in das Wachstumsmedium ausgeschieden werden.
  • Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren, bei dem das DNA-Fragment willkürlich in das Pilzgenom integriert wird, ein durch Agrobacterium-vermittelte Transformation erhältlicher transformierter Pilz, der ein oder mehrere Teile von T-DNA-Grenzsequenzen aufweist, und ein Verfahren zur Kultivierung eines solchen transformierten Pilzes zur Herstellung eines gewünschten Proteins oder einer spezifischen Nucleinsäuresequenz bereitgestellt.
  • Die Verwendung von supervirulenten A. tumefaciens-Stämmen wird bevorzugt, weil diese eine relativ hohe Transformationfrequenz ermöglichen; solche Stämme, deren Nutzung und Vektoren zur Herstellung solcher Stämme sind in der Literatur beschrieben; siehe Jin et al. (J. Bacteriology 169 (1987) 4417–4425 & Molecular Microbiology 7 (1993) 55–562), Raineri et al. (BIO/TECHNOLOGY 8 (January 1990) 33–38) and Ishida et al. (Nature Biotechnology 14, (1996) 745–750) für Pflanzentransformation und Piers et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 (1996) 1613–1618) für Hefetransformation.
  • Die Transformation kann durch ein a binäres System erfolgen., wobei die vir-Gene in Trans- oder Kointegration mit der homologen Rekombination zwischen einem ersten Plasmid und einem Wildtyp-Ti-Plasmid fungieren und die Onkogene auf die gleiche Art und Weise aus dem Plasmid heraustreiben, wie das dem Fachmann für die hier behandelte Pflanzentransformation bekannt ist.
  • Die Produktion von genetisch verändertem Pilzgewebe, das entweder ein strukturelles Gen. exprimiert oder die Expression eines strukturellen Gens inhibiert, verbindet die Lehren der vorliegenden Offenlegung mit einer Vielfalt von dem Fachmann bekannten Techniken und Mitteln. In den meisten Fällen existieren für die einzelnen Stufen des Gesamtprozesses jeweils alternierende Mittel. Die Wahl der Mittel hängt von Variablen wie dem für das Klonen und die Einführung des rekombinanten DNA-Moleküls gewählten Plasmidvektorsystem, der zu modifizierenden Pilzspezies, sowie den verwendeten Promoter- und Stromaufwärtselementen. Der Fachmann ist in der Lage, geeignete Alternativen zur Erzielung der Funktionalität auszuwählen und zu nutzen. Die Kulturbedingungen zur Expression gewünschter struktureller Gene sind dem Fachmann bekannt. Ebenfalls im Fach bekannt ist, dass eine Anzahl an Pilzspezies so transformiert und regeneriert werden kann, dass der gesamte Pilz einschließlich aller vegetativen und reproduktiven Gewebe wie Myzel, Fruchtkörper und Sporen, die gewünschte Gene unter regulatorischer Steuerung von erfindungsgemäßen Promoter-Molekülen enthalten und exprimieren, gewonnen werden kann. Wie dem Fachmann bekannt ist, kann die Expression in transformierten Pilzen gewebespezifisch und/oder spezifisch für bestimmte Entwicklungsstufen erfolgen. Die Selektion des abgeschnittenen Promoters und die Selektion des strukturellen Gens sind weitere Parameter, die zur Erzielung der gewünschten Pilzexpression oder -inhibition, wie sie dem Fachmann bekannt ist und hier gelehrt wird, optimiert werden können.
  • Es folgt ein allgemeiner Überblick über molekularbiologische Techniken zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren.
  • Die erfindungsgemäßen Polynukleotidkonstrukte weisen gleiche Elemente auf, die dem Fachmann in der Molekularbiologie wohlbekannt sind. Zum Beispiel sind die interessierenden DNA-Sequenzen in den einzelnen Konstrukten vorzugsweise operativ (d. h. positioniert zur Gewährleistung der Funktion) mit einem Promoter verbunden, der die Transkription der DNA (in ein RNA-Transkript) gestattet, und weisen einen Vektor auf, zu dem ein Replikationssystem gehört. In bevorzugten Ausführungsformen ist die interessierende DNA-Sequenz von exogenem Ursprung, um die Kosuppression der endogenen Gene zu verhindern, sofern Kosuppression nicht das gewünschte Protokoll ist.
  • PROMOTER
  • Die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Konstrukte, Promoter oder Steuersysteme können einen gewebespezifischen Promoter, einen induzierbaren Promoter oder einen konstitutiven Promoter einschließen.
  • Es steht eine große Anzahl an geeigneten Promotersystemen zur Verfügung. Ein für die Erfindung nützlicher konstitutiver Promoter ist zum Beispiel der Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) 35S. Es wurde nachgewiesen, dass er in vielen prokaryotischen und eukaryotischen Spezies hochaktiv ist.
  • Promoter (und andere regulatorische Elemente) können heterolog (d. h. nicht natürlich operativ mit einer DNA-Sequenz vom gleichen Organismus verbunden) sein. Für die Expression in Pilzen nützliche Promoter sind dem Fachmann bekannt und können induzierbar, konstitutiv, gewebespezifisch, von Eukaryoten, Prokaryoten oder Viren abgeleitet sein oder verschiedene Kombinationen dieser Charakteristika aufweisen.
  • Bei der Wahl eines Promoters für den Einsatz in den erfindungsgemäßen Verfahren kann es wünschenswert sein, einen gewebespezifischen oder entwicklungsregulierten Promoter zu verwenden. Ein gewebespezifischer oder entwicklungsregulierter Promoter ist eine DNA-Sequenz, die die Expression einer DNA-Sequenz selektiv in den für eine bestimmte Entwicklungsperiode und/oder Funktion im Pilz entscheidenden "Zellen/Geweben reguliert. Für die erfindungsgemäßen Verfahren kann jeder identifizierbare Promoter verwendet werden, der eine Expression in Pilzen auslöst, und es stehen viele solcher Promoter zur Verfügung. Es kann außerdem von Vorteil sein, einen induzierbaren Promoter zur Gewährleistung einer Expression während kontrollierter Zeiträume zu nutzen.
  • Ein induzierbarer Promoter kann auch bei der vorliegenden Erfindung genutzt werden. Siehe Ward et al. Plant Mol. Biol. 22; 361–366 (1993). Zu den induzierbaren Promotern gehören unter anderem der auf Kupfer reagierende Promoter des ACE1-Systems (Mett et al. PNAS 90; 4567–4571 (1993)); das In2-Gen aus Mais, das auf Benzolsulfonamid-Herbizid-Safener reagiert (Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227: 229–237 (1991) und Gatz et al., Mod. Gen. Genetics 243; 32–38 (1994)) oder der Tet-Repressor aus Tn10 (Gatz et al., Mot. Gen. Genet. 227: 229–237 (1991). Ein besonders bevorzugter induzierbarer Promoter ist ein Promoter, der auf ein Induktionsmittel reagiert, auf das Pilze normalerweise nicht reagieren. Als Beispiel kann der induzierbare Promoter aus einem Steroidhormongen dienen, dessen transkriptionale Aktivität durch ein Glucocorticosteroidhormon induziert wird. Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 0421 (1991).
  • Diese und andere solche Promoters sind bekannt und über solche Quellen wie Genbank beziehbar. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promoter gegenüber der Empfängerzellenspezies homolog. In einem Transformationsprotokoll für A. bisporus wird zum Beispiel ein GPD-Promoter (GPD: Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenat) von A. bisporus im Polynukleotidkonstrukt verwendet. Zwei Beispiele von pilzspezifischen Promotern sind unter anderem die GPD-Promoter aus den Pilzen A. nidulans, (Mattem et al. 1988, Fungal Genetics Newsletter 35:25) und A bisporus, (Harmsen et al. 1992 Current Genetics 22: 447–454).
  • Es kann außerdem wünschenswert sein, ein paar Intron-Sequenzen in die Promoter- Konstrukte einzubauen, denn der Einschluss von Intron-Sequenzen in die Codierungsregion kann zu verbesserter Expression und Spezifität führen.
  • Zusätzlich können Regionen eines Promoters zur Erzielung der gewünschten Promoter-Aktivität mit Regionen eines anderen Promoters fusioniert werden, was einen Hybrid-Promoter ergibt. Es können auch synthetische Promoter, die die Genexpression regeln, verwendet werden.
  • Das Expressionssystem kann durch die Nutzung von Ergänzungselementen wie Transkriptionsterminatoren und/oder Enhancer-Elementen weiter optimiert werden.
  • WEITERE REGULATORISCHE ELEMENTE
  • Zusätzlich zu einer Promoter-Sequenz kann eine Expressionskassette oder ein Polynukleotidkonstrukt stromabwärts vom strukturellen Gen auch eine Transkriptionsterminationsregion enthalten, um eine wirksame Termination zu gewährleisten. Die Terminationsregion oder das Polyadenylationssignal können vom gleichen Gen wie die Promotersequenz oder von anderen Genen gewonnen werden. Zu Polyadenylationssequenzen gehören unter anderem das Agrobacterium-Octopinsynthasesignal (Gielen et al., EMBO J. (1984) 3: 835–846) oder das Nopalinsynthasesignal (Depicker et al., Mol and Appl, Genet., (1982) 1: 561–573).
  • Der Transport des durch Transgene produzierten Proteins zu einem subzellulären Kompartiment wie Vakuole, Peroxistom, Glyoxysom, Zellwand oder Mitochondrion oder zur Sekretion in das Apoplast oder Wachstumsmedium erfolgt durch operative Verbindung der Nukleotidsequenz, die eine Signalfolge zur 5'- oder 3'-Region eines das interessierende Protein codierenden Gens codiert. Das Anvisieren des 5'- und/oder 3'-Endes des strukturellen Gens kann bei der Proteinsynthese und -verarbeitung bestimmen, wo sich das codierte Protein letztendlich befindet. Das Vorhandensein einer Signalfolge steuert ein Polypeptid entweder zu einer intrazellulären Organelle oder zu einem subzellulären Kompartiment oder zur Ausscheidung in das Apoplast bzw. in die äußere Umgebung. Dem Fachmann sind zahlreiche Signalfolgen bekannt.
  • MARKERGENE
  • Rekombinante DNA-Moleküle, die in diesem Dokument beschriebene DNA-Sequenzen und Promoter enthalten, können zusätzlich Selektionsmarkergene enthalten, die ein Selektionsgenprodukt codieren und dabei einer Zelle Resistenz gegen ein chemisches Mittel oder eine physiologische Beanspruchung oder den Zellen ein unterscheidbares Phänotypmerkmal verleihen, so dass die mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformierten Zellen leicht mit Hilfe eines Selektionsmittels selektiert werden können. Ein solches Selektions-Markergen ist Neomycin-Phosphotransferase (NPT II), die Resistenz gegen Kanamycin und das Antibiotikum G-418 verleiht. Mit diesem Selektionsmarker transformierte Zellen können durch einen Assay auf Vorhandensein in vitro von Phosphorylierung von Kanamycin mit den in der Literatur beschriebenen Techniken oder durch Testen auf Vorhandensein der mRNA-Codierung für das NPT II-Gen durch Northern-Blot-Analyse in RNA aus dem Gewebe der transformierten Pflanze selektiert werden. Es wird auch eine Verstärkung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Identifizierung des Vorhandenseins eines Transgens oder Expression mit Umkehrtranskriptions-PCR-Verstärkung zur Überwachung der Expression sowie PCR auf generische DNA angewendet. Zu weiteren verwendeten Selektionsmarkern gehören das Ampicillinresistenzgen, das Tetracyclinresistenzgen und das Hygromycin (HPH)-Resistenzgen. So selektierte transformierte Pilzzellen können in das vegetative Myzel hineinwachsen, das letztendlich den ganzen Pilz einschließlich der geschlechtlichen Reproduktionsstruktur (Fruchtkörper) und Sporen hervorbringt. Es versteht sich, dass ein Selektions-Markergen auch nativ im Pilz vorhanden sein kann.
  • PROTEINE
  • Mit den erfindungsgemäßen transgenen Pilzen kann ein fremdes Protein in kommerziellen Mengen erzeugt werden. Somit ergeben die Techniken zur Selektion und Propagierung transformierter Pilze, die dem Fachmann wohlbekannt sind, eine Vielzahl von transgenen Pilzen, die auf herkömmliche Weise geerntet werden und ein fremdes Protein, das aus interessierendem Gewebe oder der Gesamtbiomasse extrahiert oder in das Wachstumsmedium (flüssig oder fest) ausgeschieden und dann gewonnen werden kann. Die Proteinextraktion aus Pflanzen- und Pilzbiomasse kann durch bekannte Verfahren, wie sie zum Beispiel von Heney and Orr, Anal. Biochem. 114: 92–6 (1981) und der dort zitierten Literatur beschrieben werden.
  • Für die relativ kleine Anzahl an transgenen Pilzen, die höhere Expressionsniveaus aufweisen, kann eine genetische Karte erzeugt werden, vor allem über herkömmliche Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen (RFLP), PCR-Analyse und Mikrosatelliten-DNA-Analyse (SSR), die den ungefähren Chromosomenstandort des integrierten DNA-Moleküls identifiziert. Beispielmethodologien in dieser Hinsicht sind bei Glick und Thompson, METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY 269–284 (CRC Press, Boca Raton, 1993) zu finden. Kartenangaben zu Chromosomenstandorten sind hilfreich für den Markenschutz eines hierunter fallenden transgenischen Pilzes. Wenn eine unbefugte Propagierung erfolgt und Kreuzungen mit anderem Ideoplasma vorgenommen werden, kann die Karte der Integrationsregion mit vergleichbaren Karten für Verdachtspilze verglichen und ermittelt werden, ob letztere mit dem Pilz, der hier Gegenstand ist, einen Prozentsatz gemeinsam haben. Kartenvergleiche umfassen Hybridisierungen, RFLP, PCR, SSR und Sequenzierung, was alles herkömmliche Techniken sind.
  • Gleichermaßen lassen sich mit der vorliegenden Erfindung agronomische Gene in transformierten Pi9lzen exprimieren. Genauer gesagt können Pilze genetisch so konstruiert werden, dass sie bestimmte Phänotypen von landwirtschaftlichem Interesse exprimieren. Zu den in dieser Hinsicht betroffenen Genen gehören die im Folgenden kategorisierten.
  • 1. Gene, die Resistenz gegen Schädlinge oder Krankheiten verleihen und
    • (A) Resistenzgene gegen Pflanzenkrankheiten codieren. Pflanzenschutz wird häufig durch spezifische Interaktion zwischen dem Produkt eines Krankheitsresistenzgens (R) in der Pflanze und dem Produkt eines entsprechenden Avirulenzgens (Avr) im Krankheitserreger aktiviert. Eine Pflanzenart kann mit einem geklonten Resistenzgen transformiert werden, um Pflanzen zu konstruieren, die gegen bestimmte Stämme von Krankheitserregern resistent sind. Siehe zum Beispiel Jones et al, Science 266: 789 (1994) (Klonen des Cf-9-Gens der Tomate für Resistenz gegen Cladosporium fulvum); Martin et al., Science 262: 1432 (1993) (Pto-Gen der Tomate für Resistenz gegen Pseudomonas syringae pv. Tomate codiert eine Proteinkinase); Mindrinos et al., Cell 78: 1089 (1994) (Arabidopsis RSP2-Gen für Resistenz gegen Pseudomonas syringae).
    • (B) Ein Bacillus thuringiensis-Protein, sein Derivativ oder ein danach modelliertes synthetisches Polypeptid codiert. Siehe zum Beispiel Geiser et al., Gene 48: 109 (1986), wo das Klonen und die Nukleotidsequenz eines Bt Endotoxingens offen gelegt wird. Außerdem können Endotoxingene codierende DNA-Moleküle zum Beispiel unter den ATCC-Zugangsnummern 40098, 67136, 31995 und 31998 von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erworben werden.
    • (C) Ein Lectin. Siehe zum Beispiel die Offenlegung von Van Damme et al, Plant Molec. Biol. 24: 25 (1994), die die Nukleotidsequenz mehrerer Mannose bindender Lectingene von Clivia miniata angeben.
    • (D) Ein vitaminbindendes Protein wie Avidin. Siehe die PCT-Anmeldung US 93/06487 , deren Inhalt hierin inkorporiert ist. Die Anmeldung lehrt die Nutzung von Avidin und Avidin-Homologen als Larvizide gegen Schadinsekten.
    • (E) Ein Enzyminhibitor, zum Beispiel ein Protease- oder Amylaseinhibitor. Siehe zum Beispiel Abe et al., J. Blol. Chem. 262: 16793 (1987) (Nukleotidsequenz des Reiscysteinproteinaseinhibitors), Huub et al., Plant Molec. Biol. 21: 985 (1993) (Nukleotidsequenz des cDNA-codierenden Tabakproteinaseinhibitors I) und Sumitani et al, Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1243 (1998) (Nukleotidsequenz des Streptomyces nitrosporeus alpha-Amylaseinhibitors).
    • (F) Ein insektenspezifisches Hormon oder Pheromon wie ein Ecdysteroid und Juvenilhormon, eine seiner Varianten; ein auf ihr basierendes Mimetikum oder ein Antagonist oder Agonist von ihm. Siehe zum Beispiel die Offenlegung von Hammock et al., Nature 344: 458 (1990) zur Baculovirusexpression geklonter Juvenilhormonesterase, eines Deaktivators des Juvenilhormons.
    • (G) Ein insektenspezifisches Peptid oder Neuropeptid, das bei Expression die Physiologie des betroffenen Schädlings zerstört. Siehe zum Beispiel die Offenlegungen von Regan, J. Blol. Chem. 269 (1994) (Expressionsklonen ergibt DNA-Codierung für den diuretischen Hormonrezeptor bei Insekten) und Pratt et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163: 1243 (1989) (ein Allostatin wird in Diploptera puntata identifiziert. Siehe auch US-Patent Nr. 5,266,317 an Tomalski et al., in dem gencodierende insektenspezifische paralytische Neurotoxine offen gelegt werden.
  • 2. Gene, die Herbizidresistenz verleihen. Beispiele:
    • (A) Ein Herbizid wie Imidazalinon oder ein Sulfonylharnstoff, durch das/den der Wachstumspunkt oder das Meristem inhibiert wird. Beispielgene in dieser Kategorie codieren nach mutantem ALS und ARAS-Enzym wie zum Beispiel bei Lee et al., EMBO J. 7: 1241 (1988) bzw. Miki et al., Theor. Appl. Genet. 80: 449 (1990) beschrieben.
    • (B) Glyphosat (Resistenz verliehen durch mutante 5-Enolpyruvyl-3-Phosphikimatsynthase (EPSP) bzw. aroA-Gene) und weitere Phosphonoverbindungen wie Glufosinat (Phosphinothricinacetyltransferase (PAT) und Phosphinothricinacetyltransferase-(bar)-Gene vom Streptomyces hygroscopicus) und Pyridinoxy- oder Phenoxyproprionsäuren und Cyclohexone (ACCase inhibitorcodierende Gene). Siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4,940,835 an Shah et al., in dem die Nukleotidsequenz einer Form von EPSP offen gelegt wird, die Glyphosatresistenz verleihen kann. Ein mutantes aroA-Gen codierendes DNA-Molekül kann unter der ATCC-Zugangsnummer 39256 bezogen werden; die Nukleotidsequenz des mutanten Gens ist in der US-Patentschrift 4,769,061 an Comai offen gelegt. Die europäische Patentanmeldung 0 333 033 an Kumada et al. und die US-Patentschrift 4,975,374 an Goodman et al. offenbaren Nukleotidsequenzen von Glutaminsynthetasegenen, die Resistenz gegen Herbizide wie L-Phosphinothricin verleihen. Die Nukleotidsequenz eines Phosphinothricinacetyl-Transferasegens wird in der europäischen Patentanmeldung 0 242 246 von Leemans et al angegeben. De Greef et al., Bio/Technology 7: 61 (1989) beschreiben die Produktion von transgenen Pflanzen, die bar-Hybridgene für die Aktivität der Phosphinothricinacetyl-Transferase exprimieren. Beispiele für Gene, die Resistenz gegen Phenoxyproprionsäuren und Cyclohexone wie Sethoxydim und Haloxyfop vermitteln, sind die Gene AccI-S1, AccI-S2 und AccI-S3, die von Marshall et al., Theor. Appl. Genet. 83: 435 (1992) beschrieben werden.
    • (C) Ein die Photosynthese inhibierendes Herbizid wie Triazin (psbA und gs + Gene) und ein Benzonitril (Nitrilase-Gen). Przibilla et al., Plant. Cell 3: 169 (1991) beschreiben die Transformation von Chlamydomonas mit Plasmiden, die mutante psbA-Gene codieren. Nukleotidsequenzen für Nitrilasegene werden im US-Patent 4,810,648 an Stalker offen gelegt, und DNA-Moleküle mit diesen Genen sind unter den ATCC-Zugangsnummern 53435, 67441 und 67442 erhältlich. Das Klonen und die Expression von DNA-Code für eine Glutathion-S-Transferase wird von Hayes et al., Biochem: J. 285 173 (1992) beschrieben.
  • 3. Gene, die eine Mehrwerteigenschaft verleihen oder zu ihr beitragen Beispiele:
    • (A) Veränderter Fettsäuremetabolismus, zum Beispiel durch Transformation einer Pflanze mit einem Antisense-Gen von Stearoyl-ACP-Desaturase zur Erhöhung des Stearinsäuregehalts der Pflanze. Siehe Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2624 (1992).
    • (B) Verringerter Phytatgehalt: (1) Die Einführung eines Phytase codierenden Gens würde den Abbau des Phytats fördern und der transformierten Pflanze mehr freies Phosphat zuführen. Siehe zum Beispiel Van Hartingsveldt et al., Gene 127: 87 (1993), worin die Nukleotidsequenz eines Phytasegens von Aspergillus niger offenbart wird. (2) Ein Gen, das den Phytatgehalt herabsetzt, kann eingebracht werden. Bei Mais lässt sich dies zum Beispiel dadurch erreichen, dass man mit einem einzelnen Allel assoziierte DNA, die für Maismutanten mit niedrigem Phytinsäurespiegel verantwortlich ist, klont und wieder einführt. Siehe Raboy et al., Maydica 35: 383 (1990).
    • (C) Modifizierte Kohlehydratzusammensetzung, die zum Beispiel von der Transformation von Pflanzen mit einem Gen, das ein das Verzweigungsmuster von Stärke veränderndes Enzym codiert, bewirkt wird. Siehe Shiroza et al., J. Bacteriol. 170: 810 (1988) (Nukleotidsequenz des Fructosyltransferase-Gens von Streptococcus mutans), Steinmetz et al. Mol. Gen. Genet. 200: 220 (1985) (Nukleotidsequenz des Levansucrase-Gens von Bacillus subtilis), Pen et al., Bio/Technology 10: 292 (1992) (Produktion von transgenen Pflanzen, die Amylase vom Bacillus licheniformis exprimieren), Elliot et al., Plant Molec. Biol., 21: 515 (1993) (Nukleotidsequenzen von Tomateninvertase-Genen), Søgaard et al., J. Biol. Chem. 268: 22480 (1993) (ortsgerichtete Mutagenese des Amylase-Gens der Gerste) und Fisher et al., Plant Physiol. 102: 1045 (1993) (verzweigend wirkendes Enzym II in Maisendospermstärke). Antisense oder kosuppressive Techniken können gemäß der hier angegebenen Literatur ebenfalls verwendet werden.
  • TRANSFORMATION
  • Herkömmliche Transformationstechniken können zusätzlich zur Agrobacterium-Transfektion angewendet werden. Zu weiteren Verfahren, die zur Einbringung rekombinanter Moleküle in Pflanzenzellen angewendet wurden gehören mechanische Mittel wie die direkte DNA-Aufnahme, Liposome, Elektroporation (Guerche, P. et al, 1987, Plant Science 52: 111–116) und Mikroinjektion (Neuhaus, G., et al, 1987, Theor. Appl. Genet. 75: 30–36). Der Möglichkeit des Einsatzes von Mikroprojektilen und einer Pistole oder einem anderen Gerät zum erzwungenen Einbringen kleiner, mit DNA beschichteter Metallteilchen in Zellen wurde ebenfalls beträchtliche Aufmerksamkeit gewidmet (Klein, T. M. et al., 1987, Nature 327: 70–73).
  • Es ist häufig wünschenswert, dass sich die DNA-Sequenz in einem homozygoten Zustand befindet, was mehr als ein Transformationsereignis mit einem ersten und einem zweiten rekombinanten DNA-Molekül, die beide das gleiche Genprodukt codieren, erfordern kann. Weiterhin ist bei einigen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, dass Pilzzellen mit einem rekombinanten DNA-Molekül, das mindestens zwei DNA-Sequenzen enthält, oder mit mehr als einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert werden. Die DNA-Sequenzen oder rekombinanten DNA-Moleküle in solchen Ausführungsformen können physisch verbunden sein, indem sie sich im gleichen Vektor befinden, oder sich physisch getrennt auf unterschiedlichen Vektoren befinden. Eine Zelle kann gleichzeitig mit mehr als einem Vektor transformiert werden, wenn die einzelnen Vektoren über ein eindeutiges Selektions-Markergen verfügt. Als Alternative kann eine Zelle nacheinander mit mehr als einem Vektor transformiert werden, indem nach der Transformation mit dem ersten Vektor ein Zwischenschritt zur Regeneration zugelassen wird. Weiterhin kann es möglich sein, eine geschlechtliche Kreuzung zwischen einzelnen Pilzen oder Pilzlinien mit verschiedenen DNA-Sequenzen oder rekombinanten DNA-Molekülen durchzuführen, wobei die DNA-Sequenzen oder rekombinanten Moleküle mit dem gleichen Chromosom verbunden sind oder sich auf dem gleichen Chromosom befinden, und dann aus der Nachkommenschaft der Kreuzung Pilze zu selektieren, die beide DNA-Sequenzen oder rekombinanten DNA-Moleküle enthalten.
  • Die Expression von rekombinanten DNA-Molekülen, die die hierin in transformierten Pilzzellen beschriebenen DNA-Sequenzen und Promoter enthalten, lassen sich mit dem Fachmann bekannten Northern-Blot-Techniken und/oder Southern-Blot-Techniken überwachen.
  • Die regenerierten Pilze werden in Standardwachstumsmedien (z. B. feste oder flüssige Nährmedien, Getreide, Vermiculit, Kompost, Torf, Holz, Sägemehl, Stroh usw.) transferiert und in einer dem Fachmann bekannten Weise gezüchtet oder kultiviert.
  • Nachdem das Polynukleotid stabil in die regenerierten transgenen Pilze inkorporiert wurde, kann es durch geschlechtliche Kreuzung auf andere Pilze übertragen werden. Je nach Art der zu kreuzenden Spezies kann eine beliebige Anzahl von Standardtechniken angewendet werden.
  • Es kann nützlich sein, eine Anzahl von individuellen transformierten Pilzen mit einem rekombinanten Konstrukt zu generieren, um Pilze frei von eventuellen Positionseffekten zu gewinnen. Es kann außerdem von Vorteil sein, Pilze zu selektieren, die über mehr als eine Kopie des eingebrachten rekombinanten DNA-Moleküls verfügen, um hohe Expressionsniveaus des rekombinanten Moleküls zu gewinnen.
  • Wie oben angemerkt, kann es wünschenswert sein, Pilzlinien zu produzieren, die für ein bestimmtes Gen, nach Möglichkeit in der bestimmten Spezies, homozygot sind. Bei manchen Spezies wird dies durch die Verwendung einsporiger Kulturen erreicht. Durch Einsatz dieser Techniken ist es möglich, eine haploide Linie zu erzeugen, die das eingesetzte Gen trägt, und die Chromosomenzahl dann entweder spontan oder unter Einsatz von Colchicin zu verdoppeln. Dadurch erhält man einen Pilz, der für das eingesetzte Gen homozygot ist, was leicht per Assay getestet werden kann, wenn das eingesetzte Gen ein geeignetes Selektions-Markergen zur Erkennung der dieses Gen tragenden Pilze aufweist. Als Alternative können Pilze selbstbefruchtet sein, was zur Produktion eines Gemischs von Sporen führt, das im einfachsten Fall aus drei Arten, nämlich homozygot (25%), heterozygot (50%) und Null (25%) für das eingefügte Gen bestehen kann. Wiewohl es relativ leicht ist, Nullpilze aus den das Gen tragenden Pilzen auszuzählen, ist es in der Praxis möglich, homozygote von heterozygoten Pilzen durch eine Southern-Blot-Analyse zu trennen, bei der peinlich darauf geachtet wird, dass genau gleichwertige Mengen an DNA aus der Mischpopulation geladen werden und Heterozygoten durch die Intensität des Signals einer für das eingesetzte Gen spezifischen Sonde ermittelt werden. Es ist ratsam, die Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse zu überprüfen, indem man jeder unabhängigen Transformante die Selbstbefruchtung gestattet, denn zusätzliche Nachweise der Homozygotie können aus der folgenden einfachen Tatsache gewonnen werden: Wenn die Pilze für das eingefügte Gen homozygot wären, enthalten alle nachfolgenden Zelllinien aus dem befruchteten Individuum das Gen, wenn der Pilz heterozygot für das Gen wäre, enthält die aus dem befruchteten Samen gezüchtete Generation null Pilzlinien. Somit lassen sich durch einfache Selbstbefruchtung homozygote Pilzlinien selektieren, die auch durch Southern-Blot-Analyse überprüft werden können.
  • Die Schaffung homozygoter Elternlinien ermöglicht die Produktion von Hybridpilzen und Sporen, die eine veränderte Proteinkomponente enthalten. Mit den Eltern werden transgene homozygote Elternlinien erhalten, die entweder die erste oder die zweite operativ mit einem Promoter verbundene DNA-Sequenz enthalten. In dieses Schema ebenfalls eingebunden sind die Vorteile des Züchtens einer hybriden Nutzpflanze, einschließlich der Kombinationen von wertvollen Charakterzügen und der Heterose.
  • Das folgende Beispiel dient zur Veranschaulichung der Erfindung. Die Beispiele und Darstellungen in diesem Dokument beziehen sich speziell auf A. bisporus; doch lassen sich die Lehren aus diesem Dokument gleichermaßen auf beliebige andere Pilze mit fleischigem Fruchtkörper anwenden.
  • BEISPIEL 1
  • Es wurden Fruchtkörper von sechs handelsüblichen Stämmen von A. bisporus gezüchtet. Vegetative Myzelkulturen der Stämme wurden aus handelsüblicher Getreidebrut abgeleitet und auf Kartoffeldextrose-Hefe-Agar gehalten. Genomische DNA wurde durch herkömmliche Phenolextraktion in Gegenwart von Lithiumchlorid und Ethanolniederschlag aus Fruchtkörpern (1–3 g) und Bouillonkulturen (100 mg Myzel) isoliert.
  • Es wurden die öffentlich verfügbaren Stämme AGL-1, EHA-105 und GV3850 von A. tumefaciens gewonnen. Das Escherichia coli HPH-Gen (Hygromycin B Phosphotransferase) und der trpC- Promoter von Aspergillus nidulans wurden ebenfalls bereitgestellt. Der binäre Vektor pCAMBIA 1300 (CAMBIA, Canberra, Australien), das durch Aequorea victoria verstärkte grüne Fluoreszenzgen (EGFP) und der CaMV 35S Terminator wurden ebenfalls aus öffentlichen Quellen bezogen. Der Promoter für das GPD-Gen von A. bisporus wurde durch PCR-Verstärkung mit den veröffentlichten Sequenzdaten gewonnen.
  • Unser binärer Plasmidvektor (9,6 kb) mit der Bezeichnung pBGgNg bestand aus einem pCAMBIA 1300 Gerüst mit den HPH- und EGFP-Genen, die jeweils mit dem Terminator CaMV 35S verbunden waren und durch den GPD-Promoter von A. bisporus gesteuert wurden (1). Zur Konstruktion des Vektors pBGgNg wurde das Zwischenplasmid pEGFP.g durch Exzision des Promoters CaMV 35S aus PE2113-EGFP mit HindIII und KpnI und Einfügen der GPD-Promotersequenz, die durch PCR-Verstärkung mit den Primern gpd-FH und gpd-RK gewonnen wurden, die jeweils HindIII bzw. KpnI Restriktionsorte enthalten. Das Zwischenplasmid pHph.g wurde aus PCSN44 durch Exzision des trpC-Promoters mit HindIII und ClaI und Blunt-End-Ligation des GPD-Promoters, der durch PCR-Verstärkung mit den Primern gpd-FH und gpd-RC abgeleitet wurde, konstruiert. Das Zwischenplasmid pBHg wurde durch Aufschließen von pCAMBIA 1300 mit BstXI und XhoI zur Entfernung des HPH-Gens und des Promoters CaMV 35S und Einfügen durch Blunt-End-Ligation des HPH-Gens und GPD-Promoters, der mit BamHI aus pHph.g exzidiert wurde, hergestellt. Schließlich wurde pBGgHG durch Exzision des EGFP-Gens mit dem GPD-Promoter aus pEGFP.g über EcoRI und HindIII und Einfügen des Fragments durch Blunt-End-Ligation an der BamHI-Stelle in pBHg konstruiert.
  • Eine Southern-Blot-Analyse wurde mit einem 32P-markierten ca. 1 kb Fragment des HPH-Gens als Sonde durchgeführt. Eine PCR-Analyse wurde mit den Primern gpd-FH ('5-GAAGAAGCTTTAAGAGGTCCGC-3') und hyg-R. (5'-GGCGACCTCGTATTGGGAATC-3') durchgeführt, die eine den GPD-Promoter und das HPH-Gen überspannende Sequenz von ca. 970 definieren.
  • Als nächstes wurde das ursprüngliche Agrobacterium-vermittelte Transformationsverfahren für S. cerevisiae in seiner Abänderung für Sporen von fadenförmigen Pilzen in die vorliegende Erfindung einbezogen, mit dem Unterschied, dass Fruchtkörpergewebe anstelle von Basidiosporen von A. bisporus mit A. tumefaciens kokultiviert wurde. Dies hatte einen überraschenden wesentlichen Einfluss auf die effektive Transformationseffizienz. Es wurden Fruchtkörper gewählt, die nahezu reif waren, deren Schleier jedoch intakt war und deren Lamellen nicht freigelegt ("reife Lamellen" oder "Lamellen") waren; Fruchtkörper wurden durch Einweichen in 10%-iger handelsüblicher Natriumhypochloritlösung oberflächensterilisiert und danach mit sterilem destilliertem Wasser gespült. Der Schleier wurde mit einem sterilen Skalpell entfernt, das exponierte Lamellengewebe weggeschnitten und zum Gebrauch in quadratische Stücke von 2–5 mm geschnitten.
  • Wenn dies indiziert war, wurde bei manchen Experimenten das von den Kappen und Stämmen der Fruchtkörper erhaltene fleischige Gewebe als Gewebequelle zur Transformation ("Nichtlamellengewebe") verwendet. In noch einer weiteren Abwandlung des Grundprotokolls, und wo indiziert, wurde die Transformation auf unentwickeltem Lamellengwebe aus unreifen Fruchtkörpern zwischen den Entwicklungsstufen vom Primordium zum geschlossenen Pilz („unreife Lamelle") durchgeführt.
  • In allen Fällen wurden Gewebestücke mit der Bakteriensuspension in Induktionsmedium mehrere Minuten lang vakuuminfiltriert, bis die Luft aus dem Gewebe entfernt war, und dann auf ein Stück steriles 3 MM Whatman-Filterpapier übertragen, das auf Kokultivierungsmedium geschichtet wurde. Die Gewebestücke wurden auf diesem Medium 3–4 Tage lang inkubiert, bevor sie auf Selektionsmedium mit 80 μg/ml Hygromycin transferiert wurden. Die auf diesem Medium wachsenden Myzelkulturen wurden danach auf neues Selektionsmedium mit 30–50 μg/ml Hygromycin gegeben. Nach der Regenerierung auf diesem Medium konnten die Kulturen in einer flüssigen Nährlösung gezüchtet werden und ergaben ausreichend Myzelbiomasse zur Durchführung von Molekularanalysen (Southern und Northern-Blot-Analysen, PCR, RT-PCR usw.). Außerdem konnten die Kulturen auf sterilisiertem Getreidekorn (Brut) für die Inokulation von Kompost zur Produktion von Fruchtkörpern nach herkömmlichen Verfahren gezüchtet werden. Eine detaillierte Zusammenfassung des Fruchtkörper-Transformationsprotokolls ist angefügt (Tabelle 1.).
  • Tabelle 1. Fruchtkörperprotokoll für die Agrobacterium-vermittelte Transformation von Pilzen (Agaricus bisporus)
  • Allgemeine Anmerkungen: Zur Vorbereitung destilliertes Wasser, Filterpapier für die Kokultivierungsplatten, Flaschen zum Züchten des Agrobacteriums und Seitenhalsflaschen für die Vakuuminfiltration autoklavieren. LB-Medium, (LB)-Schalen, Minimalmedium (MM), Induktionsmedium (IM), Kokultivierungsmedium-Schalen (CC) und Selektionsmedium-Schalen (SM) zubereiten. Wenn "filtersterilisiert" angegeben ist, wurden die Reagenzien durch einen Membranfilter 0,2 μm passiert. Alle Reagenzien bei 6°C aufbewahren. Darauf achten, dass MES und K-Puffer ausfällen können; daher vor dem Gebrauch diese Reagenzien erwärmen, bis sie vollständig aufgelöst sind. Unmittelbar vor dem Gebrauch frisches AS aus dem kristallinen Feststoff zubereiten.
    • 1. Proben des Agrobacterium (Stamm AGL-1) aus den in 10% Glycerol bei –80°C Kulturen entnehmen und auf LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin schichten. Die Platte zwei Tage lang bei 28°C inkubieren.
    • 2. Das Agrobacterium mit einer sterilen Transferschleife aus der Schale rückgewinnen und 100 ml MM mit 50 μg/ml Kanamycin in einer Flasche (250 ml) inokulieren.
    • 3. Die Bakterienkultur über Nacht bei 28°C bei konstantem Rütteln mit 250 U/min auf AD600 = 0,6 – 0,8 bringen. Die Bakterien durch Zentrifugieren bei 2000 × g 15 Minuten lang sedimentieren.
    • 4. Die Bakterien in 100 ml IM resuspendieren. Die Bakterien durch Rütteln bei 100 U/min für 3–6 Stunden bei 25°C induzieren. Für eine hocheffiziente Transformation muss das IM direkt vor Gebrauch aus frischem AS (d. h. direkt vom Feststoff) zubereitet werden.
    • 5. Die Fruchtkörper durch Einweichen in 10%-ige Natriumhypochloritlösung etwa 1 Minute lang oberflächensterilisieren, dann drei Mal mit autoklaviertem destilliertem Wasser spülen. Fruchtkörper mit intakten Schleiern wählen, um eine größere Sterilität des Lamellengewebes zu gewährleisten.
    • 6. Mit einem sterilen Skalpell den Schleier vom Fruchtkörper abtrennen, die freigelegten Lamellen wegschneiden und das Lamellengewebe in Stücke von 25 mm schneiden.
    • 7. Die 100 ml AS-induzierte Agrobacterium-Suspension aus dem Schüttelapparat sowie 100–150 Stücke des zerschnittenen Lamellengewebes in eine sterile Seitenhalsflasche (250 ml) transferieren. Mit einem Vakuum die Luft aus den Zwischenzellräumen entfernen. Auf Luftblasen achten, die den Gewebestücken entweichen. Die Vakuumbehandlung fortsetzen, bis die Mehrzahl der Gewebestücke zum Flaschenboden gesunken sind.
    • 8. Die Agrobacterium-Suspension aus der Flasche dekantieren. Die Gewebestücke auf Petrischalen mit CC-Medium und darüber gelegtem sterilisiertem Whatman 3 MM Filterpapier transferieren. Zwischen dem Papier und dem Medium befindliche Luftblasen sind sorgfältig zu entfernen. Außerdem müssen die Gewebestücke gleichmäßig auf der Papieroberfläche verteilt werden, um den Kontakt mit dem Medium zu maximieren. Die Schalen mit Plastikfolie versiegeln und 3–4 Tage lang bei 20–24°C inkubieren.
    • 9. Die Fruchtkörpergewebestücke auf Petrischalen mit SM, das 30 μg/ml Hygromycin enthält, transferieren. Die Schalen mit Plastikfolie versiegeln und bei 22–24°C im Dunkeln inkubieren. Putativ hygromycinresistente Kolonien von A. bisporus können 7 Tage nach der Inkubation an den Rändern der Gewebestücke wachsen und an weiteren ca. 30 Tagen auftreten.
    • 10. Die hygromycinresistenten Kolonien in frische SM-Schalen mit 30–50 μg/ml Hygromycin transferieren. Die Schalen wie zuvor versiegeln und inkubieren.
    • 11. Putativ transformierte Myzelkulturen können zur Authentifizierung einer Molekularanalyse unterzogen (Southern und Northern-Hybridisierungsanalysen, PCR, RT-PCR usw.) und zur Zubereitung von Brut für die Produktion von Fruchtkörpern verwendet werden.
  • Reagenzien/Medien für die Transformation
  • LB-Medium (LB) (Petrischalen)
    • • 10 g NaCl
    • • 10 g Trypton
    • • 5 g Hefeextrakt
    • • 15 g Agar
  • Mit destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1 l bringen. 20 Minuten lang autoklavieren Schalen nach Wunsch befüllen.
  • Minimalmedium (MM) (Alle Lösungen sind filtersterilisiert)
    • • 10 ml K-Puffer, pH 7,0: 200 g/l K2HPO4 145 g/l KH2PO4
    • • 20 ml M-N: 30 g/l MgSO4·7H2O 15 g/l NaCl
    • • 1 ml 1% CaCl2·2H2O (w/v)
    • • 10 ml 20% Glucose (w/v)
    • • 10 ml 0,01% FeSO4 (w/v)
    • • 5 ml Elementstamm: 100 mg/l ZnSO4·7H2O 100 mg/l CuSO4·5H2O 100 mg/l H3BO3 100 mg/l MnSO4H2O 100 mg/l Na2MoO4·2H2O
    • • 2,5 ml 20% NH4NO3 (w/v)
    • • 50 μg/ml Kanamycin
  • Mit autoklaviertem destillierten Wasser auf ein Endvolumen von 1 l bringen.
  • Induktionsmedium (IM) (Alle Lösungen sind filtersterilisiert)
    • • 0,8 ml 1,25 M K-Puffer: 170 g/l K2HPO4
    • Mit Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 4,9 einstellen
    • • 20 ml M-N:
    • • 1 ml 1% CaI2·2H2O
    • • 5 ml Elementstamm (siehe MM oben)
    • • 2,5 ml 20% NH4NO8 (w/v)
    • • 10 ml 50% Glycerol
    • • 40 ml 1 M MES: 39,04 g C8H13NO4S oder 42,64 g C6H13NO4S·H2O;
    • Mit NaOH auf einen pH-Wert von 5,5 einstellen
    • • 10 ml 20%-ige Glucose (w/v)
    • • 100 mM Acetosyringon (0,196 g in 2–3 ml 70% ETOH auflösen und das gesamte Volumen verwenden, für jeden Gebrauch frisch zubereiten)
    • • 50 μg/ml Kanamycin
    • Mit autoklaviertem destillierten Wasser auf ein Endvolumen von 1 l bringen. Alles lagern
  • Kokultivierungsmedium (CC) (Petrischalen) (Alle Lösungen sind filtersterilisiert)
    • • IM und Inhalt:
    • • 20% Glucose
    • • 1,5% Agar
    • 20 Minuten lang autoklavieren Schalen nach Wunsch befüllen.
  • Selektionsmedium (SM) (Petrischalen)
    • • 20 g Malzextrakt
    • • 2,1 g MOPS
    • • 1,5% Agar
    • Mit KOH auf einen pH-Wert von 7,0 einstellen
    • Mit destilliertem Wasser auf 1 l bringen
  • 20 Minuten lang autoklavieren, abkühlen und folgende Antibiotika zugeben (filtersterilisiert):
    • • 30 oder 50 μg/ml Hygromycin
    • • 200 μg/ml Cefotaxim
    • • 100 μg/ml Moxalactam
  • Sofern nicht anders angegeben, wurde bei allen hier beschriebenen Experimenten Lamellengewebe von reifen Fruchtkörpern des Agrobacterium tumefaciens-Stammes AGL-1, der den binären Plasmidvektor pBGgHg trägt, eine Induktionszeit von 2–6 Std. in 200 μg/ml AS, eine Kokultivierungszeit von 3 Tagen und eine Selektion von 28 Tagen auf einem 30 μg/ml Hygromycinmedium verwendet. In den Anfangsexperimenten wurde der AS-Ansatz außerdem in 70% Ethanol und wochen- bis monatelang vor Gebrauch bei –20°C gelagert. In den späteren Experimenten wurde das AS jedoch für jedes Experiment frisch in 70% Ethanol zubereitet, da dies durchgängig eine hohe Transformationseffektivität bewirkte.
  • Kontrollbehandlungen umfassten beide Arten von Gewebestücken: die nur mit Induktionsmedium vakuuminfiltrierten Stücke und die mit Bakterien infiltrierten, die nicht mit AS induziert wurden.
  • Hygromycin-resistente Kolonien von A. bisporus traten bereits 7 Tage nach Inkubation auf Selektionsmedium an den Rändern der Gewebestücke auf (2 und 3). Die erfindungsgemäßen Verfahren boten eine Transformationseffektivität von 92% (Prozentsatz der Kolonien, die Gewebestücke regenerieren) auf der Grundlage von Resistenz gegenüber Hygromycin. Dieser Wert liegt sechs bis sieben Größenordnungen über den bisher beschriebenen Agrobacterium-vermittelten Transformationsverfahren für A bisporus (ca. 0,00003%). Das erfindungsgemäße Fruchtkörper-Transformationsprotokoll ist in seiner Praktikabilität bei weitem überlegen und beträchtlich effektiver, komfortabler und schneller als das ursprüngliche Agrobacterium-vermittelte Transformationsverfahren, das für A. bisporus beschrieben wurde.
  • Die Wahl des Promoters, des Stammes von A tumefaciens und der Art des Fruchtkörpergewebes wurde variiert, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung herauszustellen. In einer Reihe von drei Experimenten, in denen die Konstrukte des HPH-Gens und der Promoter A. bisporus GPD, Aspergillus nidulans trpC oder CaMV 35S verglichen wurden, transformierte nur der Vektor mit dem homologen Promoter (d. h. A. bisporus GPD)A. bisporus mit hoher Effektivität (Tabelle 2.)
  • Es ist somit wahrscheinlich, dass Promoter für andere Gene von A. bisporus mit annähernd gleicher Effektivität anstelle des Promoters A bisporus GPD verwendet werden können. Tabelle 2 Einfluss der Promoter-Herkunft auf die Transformation von Agaricus bisporus
    Transformationseffektivitäta
    Herkunft des Promoters Exp.I Exp.II Mittel
    Agaricus bisporus GPD 7/50(14%) 8/50(16%) 15%
    Aspergillus nidulans TrpC 1/50(2%) 0/50(0%) 1%
    CaMV 35S 0/50(0%) 0/50(0%) 0%
    • aAusgedrückt als Anzahl der gewonnenen hygromycinresistenten Kolonien/Anzahl der Fruchtkörpergewebestücke auf Selektionsmedium mit 30 μg/ml Hygromycin
  • Von den drei untersuchten Bakterienstämmen transformierten nur AGL-1 und EHA-105, jedoch nicht GV3850 den A. bisporus, wobei die durchschnittliche Effektivität in zwei Experimenten bei ca. 23% lag (Tabelle 3). Tabelle 3 Einfluss des Stammes von Agrobacterium tumefaciens auf die Transformation von Agaricus bisporus
    Transformationseffektivitäta
    Herkunft des Promoters Exp.I Exp.II Mittel
    AGL-1 7/50(14%) 16/50(32%) 23%
    EHA-105 4/50(8%) 18/50(36%) 22%
    GV3850 0/50(0%) 0/50(0%) 0%
    • aAusgedrückt als Anzahl der gewonnenen hygromycinresistenten Kolonien/Anzahl der Fruchtkörpergewebestücke auf Selektionsmedium mit 30 μg/ml Hygromycin
  • Es können Fruchtkörperstücke aus Lamellengewebe sowie Nichtlamellengewebe vom Stamm und von der Kappe der Fruchtkörper zur Transformation von A. bisporus verwendet werden, aber das Lamellengewebe bietet die höchste Transformationseffektivität (Mittel von 57% gegenüber 17%) (Tabelle 4). Lamellengewebe bietet nicht nur eine höhere Effektivität als Nichtlamellengewebe, sondern die Transformanten treten auch früher auf dem Antibiotikum-Selektionsmedium in Erscheinung. Aus Lamellengewebe abgeleitete hygromycinresistente Transformanten entwickelten sich bereits 7 Tage nach der Inkubation auf Selektionsmedium im Vergleich zu 10 Tagen für nicht aus Lamellengewebe abgeleitete Transformanten (3). Tabelle 4 Einfluss der Art des Fruchtkörpergewebes auf die Transformation von Agaricus bisporus
    Transformationseffektivitäta
    Art des Exp.I Exp.II Exp.III Exp.IV Mittel
    Fruchtkörpergewebes
    Lamelle 23/50(46%) 44/50 15/50 32/50 57%
    (88%) (30%) (64%)
    Nicht Lamelle 5/50(10%) 10/50 8/50(16%) 11/50 17%
    (20%) (22%)
    • aAusgedrückt als Anzahl der gewonnenen hygromycinresistenten Kolonien/Anzahl der Fruchtkörpergewebestücke auf Selektionsmedium mit 30 μg/ml Hygromycin
  • Die Kokultivierung von A. tumefaciens mit Lamellengewebe aus reifen Fruchtkörpern sowie unentwickelten Lamellen aus unreifen Fruchtkörpern, entweder mit Einsatz von 200 μM oder 400 μM AS im Induktionsschritt, lieferte vergleichbare Effektivitätswerte der Transformation mit Mittelwerten von 53% bis 82% (Tabelle 5). Tabelle 5 Einfluss des Entwicklungsstadiums des Fruchtkörperlamellengewebes auf die Transformation von Agaricus bisporus
    Transformationseffektivitäta
    Art des AS Exp.I Exp.II Exp.III Mittel
    Fruchtkörpergewebes Konz.b
    Reife Lamelle 200 μM 46/50(92%) 30/50(60%) 41/50(82%) 78%
    400 μM 28/58(56%) - - 56%
    Unreife Lamelle 200 μM 44/50(88%) 3/50(6%) 33/50(66%) 53%
    400 μM 415–(82%) - - 82%
    • aAusgedrückt als Anzahl der gewonnenen hygromycinresistenten Kolonien/Anzahl der Fruchtkörpergewebestücke auf Selektionsmedium mit 30 μg/ml Hygromycin
    • bFür die Induktion des Bakteriums verwendete Konzentration von Acetosyringon (AS)
  • Die Induktion des Bakteriums mit AS für Zeiträume von 2 bis 24 Stunden ergab eine hohe Transformationeffektivität, die bei vier Experimenten im Durchschnitt im Bereich von 30% bis 48% lag (Tabelle 6). Tabelle 6 Einfluss der Induktionszeit des Agrobacterium tumefaciens mit Acetosyringon auf die Transformation von Agaricus bisporus.
    Induktionszeit Transformationseffektivitäta
    (h) Exp.I Exp.II Exp.III Exp.IV Mittel
    0 0/50(0%) 0/50(0%) 0/50(0%) 0/50(0%) 0%
    2 - - 9/50(22%) 30/50(60%) 41%
    3 23/50(46%) 14/50(28%) 32/50(64%) 27/50(54%) 48%
    6 17/50(34%) 4/50(8%) 13/50(26%) 40/50(80%) 37%
    24 4/50(8%) 26/50(52%) - - 30%
    • aAusgedrückt als Anzahl der gewonnenen hygromycinresistenten Kolonien/Anzahl der Fruchtkörpergewebestücke auf Selektionsmedium mit 30 μg/ml Hygromycin
  • Die Induktion von A. tumefaciens mit 20°C und 25°C lieferte hohe Transformationseffektivitätswerte von 48% bzw. 60% (Tabelle 7). Tabelle 7 Einfluss der Temperatur bei Induktion des Agrobacterium tumefaciens auf die Transformation von Agaricus bisporus.
    Induktionstemperatur (°C) Transformationseffektivitäta
    20 24/50(48%)
    25 30/50(60%)
    • aAusgedrückt als Anzahl der gewonnenen hygromycinresistenten Kolonien/Anzahl der Fruchtkörpergewebestücke auf Selektionsmedium mit 30 μg/ml Hygromycin
  • Eine effektive Transformation von A. bisporus wurde erzielt, wenn Fruchtkörpergewebe mit A. tumefaciens über einen Temperaturbereich von mindestens 18°C bis 28°C kokultiviert wurde (Tabelle 8). Es deutete sich jedoch an, dass die Effektivität bei der höchsten getesteten Temperatur (Mittelwert 9%) im Vergleich zu den niedrigeren Temperaturen (Mittel von 32% bis 47%) sinkt. Tabelle 8 Einfluss der Temperatur bei der Kokultivierung von Agrobacterium tumefaciens und Fruchtkörpergewebe auf die Transformation von Agaricus bisporus.
    Temperatur Transformationseffektivitäta
    (°C) Exp.I Exp.II Exp.III Exp.IV Mittel
    18 - - - 22/50(44%) 44%
    20 21/50(42%) 8/50(16%) 37/50(74%) 28/50(56%) 47%
    22 1/5/50(30%) 6/50(12%) 34/50(68%) 14/50(28%) 35%
    24 5/50(10%) 9/50(18%) 32/50(64%) 18/50(36%) 32%
    26 4/50(8%) 5/50(10%) 38/50(76%) 19/50(38%) 33%
    28 5/50(10%) 4/50(8%) 5/50(10%) - 9%
    • aAusgedrückt als Anzahl der gewonnenen hygromycinresistenen Kolonien/Anzahl der Fruchtkörpergewebestücke auf Selektionsmedium mit 30 μg/ml Hygromycin
  • Das Kokultivieren von A. tumefaciens und Fruchtkörpergewebe von A. bisporus für 1 bis 4 Tage ergab Transformationstendenzen mit Mittelwerten aus drei Experimenten im Bereich von 0% bis 62% (Tabelle 9). Es bestand ein allgemeiner Trend zur Effektivitätserhöhung bei Verlängerung der Dauer der Kokultivierung. Tabelle 9 Einfluss der Zeitdauer bei der Kokultivierung von Agrobacterium tumefaciens und Fruchtkörpergewebe auf die Transformation von Agaricus bisporus.
    Zeit Transformationseffektivitäta
    (Tage) Kokultivierung Exp.I Exp.II Exp.III Mittel
    Temperatur °C
    1 21 - - 0/50(0%) 0%
    24 4/50(8%) 1/50(2%) 1/50(2%) 4%
    2 21 - - 18/50(20%) 20%
    24 20/50(40%) 15/50(30%) 20/50(40%) 37%
    3 21 - - 29/50(58%) 58%
    24 21/50(42%) 19/50(38%) 21/50(42%) 41%
    4 21 - - 31/50(62%) 62%
    24 - - 24/50(48%) 48%
    • aAusgedrückt als Anzahl der gewonnenen hygromycinresistenten Kolonien/Anzahl der Fruchtkörpergewebestücke auf Selektionsmedium mit 30 μg/ml Hygromycin
  • Southern-Blot-Analysen haben bestätigt, dass das HPH-Gen in das Genom von A bisporus integriert wurde (4). Wir haben bei den Southern-Blot-Analysen oder der PCR-Verstärkung (5) unter 37 antibiotikumresistenten Kulturen keine falschen positiven Ergebnisse festgestellt.
  • Das hier offen gelegte Pilztransformationssystem bietet ein Niveau an Effektivität und Zufriedenheit, das sich mit der Blüten-Dip-Agrotransformationsmethode für das Modellpflanzensystem Arabidopsis thaliana vergleichen lässt. Transgene vegetative Myzelkulturen könnten so in unter 2 Wochen generiert und reife Fruchtkörper etwa 8 Wochen später unter kontrollierten Umweltbedingungen produziert werden. Es wurden dreißig hygromycinresistente transgene Pilzlinien ausgebracht, die alle normale Fruchtkörper entwickelten. Der Charakterzug der Antibiotikaresistenz wurde bei nicht vorhandenem Selektionsdruck während des vegetativen Wachstums und der Reproduktionsentwicklung der Kulturen aufrechterhalten und von den Fruchtkörpern und Basidiosporen exprimiert (6).

Claims (16)

  1. Verfahren zur Transformation eines fadenförmigen Pilzes, umfassend: Einführen eines in einer Empfängerzelle eines fadenförmigen Pilzes erwünschten Polynukleotidkonstrukts in Zellen eines Fruchtkörpergewebes des Pilzes durch Agrobacterium-vermittelte Transformation, wobei das Agrobacterium das Polynukleotidkonstrukt in T-DNA-Grenzen und eine aktive vir Agrobacterium – Region enthält, in Anwesenheit einer vir induzierenden Verbindung.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der fadenförmige Pilz Agaricus bisporus ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polynukleotidkonstrukt sich auf einem von Agrobacterium abgeleiteten Plasmid befindet.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zellen ein Lamellengewebe (gill tissue) umfassen.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Zellen des Fruchtkörpergewebes ausgewählt sind aus der Gruppe, umfassend Lamellen, Kappe, Stiel, Schleier und Volva.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Polynukleotidkonstrukt eine Expressionskassette umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Expressionskassette ein strukturelles Gen enthält, das operativ mit einer Promotersequenz verbunden ist, die die Expression in einer Pilzzelle steuern kann.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Promoter eine Pilz-Promotersequenz ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Pilz-Promoter und die empfangende reproduktive Zelle von der gleichen Spezies stammen.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, weiterhin umfassend den Schritt, transgene Kulturen aus den Gewebezellen zu regenerieren.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Kulturen in etwa zwei Wochen regeneriert werden.
  12. Pilzzelle, transformiert mit dem Verfahren nach Anspruch 1.
  13. Plasmid zur Transformierung einer Pilzzelle, enthaltend das Plasmid mit der Bezeichnung BGgHg, das ein pCAMBIA 1300 Gerüst darstellt, mit HPH- und EGFP-Genen, von denen jedes mit dem CaMV 35S-Terminator verbunden und von dem GPD-Promoter von A. bisporus kontrolliert ist.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, weiterhin umfassend den Schritt der Selektierung transformierter Zellen.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und 14, wobei die vir induzierende Verbindung ein Pflanzenverletzungs-Produkt ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Pflanzenverletzungs-Produkt Acetosyringon ist.
DE60133422T 2000-06-28 2001-06-28 Verfahren zur transformation von agaricus bisporus Expired - Lifetime DE60133422T2 (de)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21463000P 2000-06-28 2000-06-28
US214630P 2000-06-28
PCT/US2001/020566 WO2002000896A2 (en) 2000-06-28 2001-06-28 Method for transformation of agaricus bisporus
US894630 2001-06-28
US09/894,630 US6964866B2 (en) 2000-06-28 2001-06-28 Methods and compositions for highly efficient transformation of filamentous fungi

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60133422D1 DE60133422D1 (de) 2008-05-08
DE60133422T2 true DE60133422T2 (de) 2008-08-21

Family

ID=26909200

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60133422T Expired - Lifetime DE60133422T2 (de) 2000-06-28 2001-06-28 Verfahren zur transformation von agaricus bisporus

Country Status (8)

Country Link
US (2) US6964866B2 (de)
EP (1) EP1409693B1 (de)
AT (1) ATE390488T1 (de)
AU (1) AU2001271560A1 (de)
CA (1) CA2452183C (de)
DE (1) DE60133422T2 (de)
ES (1) ES2302739T3 (de)
WO (1) WO2002000896A2 (de)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9597379B1 (en) 2010-02-09 2017-03-21 David Gordon Bermudes Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies
US8771669B1 (en) 2010-02-09 2014-07-08 David Gordon Bermudes Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
EP2558566A4 (de) * 2010-04-14 2013-10-02 Penn State Res Found Strategien zur transgenen manipulation von fadenpilzen
US9249418B2 (en) 2011-10-31 2016-02-02 Bp Corporation North America Inc. Use of plant promoters in filamentous fungi
US9737592B1 (en) 2014-02-14 2017-08-22 David Gordon Bermudes Topical and orally administered protease inhibitors and bacterial vectors for the treatment of disorders and methods of treatment
CN104726344B (zh) * 2014-08-25 2019-10-22 上海市农业科学院 一种适于香菇工厂化栽培菌种沪f2及其指纹图谱以及栽培方法
CN104651389B (zh) * 2014-12-29 2017-06-06 河南农业大学 一种脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法
CN106244620A (zh) * 2016-09-09 2016-12-21 福州大学 不依赖介质直接转化外源dna进入黑曲霉休眠孢子的方法
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
CN107916273A (zh) * 2017-10-23 2018-04-17 上海市农业科学院 一种双孢蘑菇遗传转化的方法
CN109628626B (zh) * 2018-12-07 2022-07-26 东莞东阳光保健品研发有限公司 鉴定梯棱羊肚菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2167152A1 (en) 1993-07-13 1995-01-26 Andreas Mooibroek Production and application of transgenic mushroom mycelium and fruitbodies
BR9807941A (pt) * 1997-04-07 2000-02-22 Unilever Nv Processos para a produção e para cultivar um bolor transformado, e, bolor transformado

Also Published As

Publication number Publication date
US7700349B2 (en) 2010-04-20
AU2001271560A1 (en) 2002-01-08
CA2452183A1 (en) 2002-01-03
WO2002000896A2 (en) 2002-01-03
US6964866B2 (en) 2005-11-15
EP1409693A2 (de) 2004-04-21
EP1409693B1 (de) 2008-03-26
US20050070007A1 (en) 2005-03-31
WO2002000896A3 (en) 2003-08-28
ATE390488T1 (de) 2008-04-15
CA2452183C (en) 2013-12-24
US20020016982A1 (en) 2002-02-07
ES2302739T3 (es) 2008-08-01
DE60133422D1 (de) 2008-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8686218B2 (en) Strategies for the transgenic manipulation of filamentous fungi
DE69733945T2 (de) Metabolismusregulierung durch verändern des gehaltes an trehalose-6-phosphat
Valverde et al. Huitlacoche (Ustilago maydis) as a food source—biology, composition, and production
DE602004004070T2 (de) Verwendung der regulatorischen sequenz des gos2-gens aus reis für die genexpression in dikotyledonen pflanzen oder pflanzenzellen
DE69822142T2 (de) Transformation von schimmeln durch agrobacterium, insbesondere von der gattung aspergillus
DE60133422T2 (de) Verfahren zur transformation von agaricus bisporus
CA2183067A1 (en) Expression of the glucose oxidase gene in transgenic organisms
DE60038748T2 (de) Mykotoxin-resistente transgene Pflanze und Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselben
EP4012028A1 (de) Nukleinsäuresequenz zum nachweis von sojabohnenpflanze dbn8002 und nachweisverfahren dafür
DE69924005T2 (de) Transgene pflanzen mit konditional lethalem gen
US9605271B2 (en) Disease resistant plant expressing WRKY45 under control of infection-responsive promoter
CN102851297B (zh) 一种烟蚜hunchback基因cDNA及其应用
CN102154337B (zh) 一种棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMAPK6及其应用
CN101781654B (zh) 棉花抗真菌病害相关基因GhMPK7及其应用
EP4215039A1 (de) Lox3-genmodulation und heerwurmtoleranz
US20230313220A1 (en) Lox3 gene modulation and armyworm tolerance
CN104844700A (zh) 新的水稻杂种劣势基因及其应用
AU692228B2 (en) Expression of the glucose oxidase gene in transgenic organisms
KR20160020195A (ko) 아밀로스 함량이 저하된 벼 품종 및 이의 제조방법
CN104558197A (zh) 提高植物抗虫性的融合蛋白及其应用
CN117305320A (zh) GmLBP3蛋白和基因的应用、制剂、突变体及载体
DE10045182A1 (de) Verwendung von Palatinase- und Trehalulase-Sequenzen als nutritive Marker in transformierten Zellen
CN101235382B (zh) 一种抗虫转基因油菜的培育方法
George An investigation into the potential of oxalate decarboxylase enzyme, to confer tolerance to Sclerotium cepivorum in transgenic Alliums
CN107523585A (zh) 异位表达的不同基因组合及其在提高植物营养组织油含量的应用

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8328 Change in the person/name/address of the agent

Representative=s name: WESTENDORP SOMMER, 80336 MUENCHEN