DE69924005T2 - Transgene pflanzen mit konditional lethalem gen - Google Patents

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    • C12N15/8291—Hormone-influenced development
    • C12N15/8294—Auxins

Description

  • FACHGEBIET DER ERFINDUNGS
  • Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Pflanzen und insbesondere transgene Pflanzen, die zur umweltbewussten Freigabe für die Feldwirtschaft geeignet sind, sowie genetische Konstrukte und Vektoren für deren Herstellung. Die Erfindung betrifft zudem neue genetische Konstrukte zur zweckmäßigen Auswahl und Identifizierung transgener Pflanzen sowie deren Abkömmlinge. Die Erfindung betrifft ferner neue Vektoren und Transformationsverfahren zur Herstellung von transgenen Brassica-Sorten.
  • TECHNISCHER HINTERGRUND
  • Transgene Pflanzen
  • Es ist bekannt, dass neue und veränderte Merkmale (sogenannte „novel traits") in Feldfruchtarten über rekombinante DNA-Technologie eingebracht werden können. Um diese Feldfrüchte mit neuen Merkmalen zu erhalten, benötigt man ein Verfahren, zum Einbringen rekombinanter DNA in das Feldfruchtgenom. Dieses Verfahren, das üblicherweise als Transformation bezeichnet wird, ist technisch herausfordernd und sehr aufwendig bei der Entwicklung von Kulturprotokollen, der Transformation an sich und der Regeneration der Pflanzen als ganzes. Bei einigen Spezies ist die Transformation zur Routine geworden, während bei anderen Spezies die Transformation schwierig und zeitaufwendig bleibt. Nichtsdestotrotz, wurden einige Feldfruchtarten, die aufgrund genetischer Veränderungen neue Merkmale aufweisen, in die Handelsproduktionskette aufge nommen und andere werden in Vorbereitung auf die Handelsfreigabe Feldversuchen unterzogen.
  • Viele dieser transgenen Feldfruchtarten besitzen neue Merkmale, die veränderte Phänotypen aufweisen. Diese Phänotypen schließen neue Zusammensetzungen ein wie eine erhöhte Widerstandskraft gegenüber Schädlingen, Krankheit oder Umweltbelastungen und Verträglichkeit mit Herbiziden. Solch eine Verträglichkeit bietet den Landwirten neue Mittel zur Unkrautkontrolle sowie neue Produktionsmöglichkeiten.
  • Viele neue gegenwärtige Handelsmerkmale, die die agronomischen Eigenschaften beeinflussen, werden kollektiv als „input"-Merkmale bezeichnet, d.h. als solche Merkmale, die die ökonomische Seite der Produktion betreffen. Beispielsweise ist Herbizidverträglichkeit ein „input"-Merkmal, da sie den Landwirten mehr Alternativen bei der Unkrautkontrolle bietet; üblicherweise können die Kosten der Unkrautkontrolle über diese neuen Herbizidverträglichkeiten verringert werden. Demnach wird die Wirtschaftlichkeit der Produktion oder die „inputs", die zum Anbau der Feldfrüchte benötigt werden, vorteilhaft verändert. Andere Merkmale, wie die Widerstandskraft gegenüber Insekten, kann über eine verringerte chemische Insektizidverwendung die Kosten für die Landwirte verringern.
  • Zusätzlich zu den „input"-Merkmalen gibt es „output"-Merkmale, welche die Zusammensetzung oder Qualität der geernteten Pflanze verändern. Solche Merkmale beeinflussen die Endprodukte oder „outputs" einer Feldfrucht und können eine geänderte Öl- oder Mehlzusammensetzung einschließen oder auch einen reduzierten antinutritionalen Gehalt oder Feldfrüchte mit geänderten Verarbeitungscha rakteristika. Es wurde ein beachtlicher Aufwand hinsichtlich der Entwicklung von Feldfrüchten mit „output"-Merkmalen betrieben, die neue Produkte, ökonomischen Wert und erhöhte Nützlichkeit bieten.
  • Einige Merkmale werden als hochwertige „output"-Merkmale klassifiziert. Solche Merkmale sind in Feldfrüchten vorhanden, die in der „molekularen Landwirtschaft" eingesetzt werden, um neue Proteine mit gewerblichen oder pharmazeutischen Verwendungen herzustellen. Molekulare Landwirtschaft bietet eine gute Aussicht auf die ökonomische Herstellung großer Mengen gewerblich nützlicher und wertvoller Proteine. Die Verwendung von Feldfruchtpflanzen zur Massenproduktion von Proteinen bietet viele Vorteile gegenüber der Fermentationstechnologie, wie Produktionserleichterung, Produktstabilität bei Synthese in Pflanzenspeicherorganen wie Knollen oder Samen und die Möglichkeit, wertvolle Co-Produkte wie Mehl, Öl oder Stärke von der Pflanzen zu gewinnen.
  • Proteine, die für die Massenproduktion in der molekularen Landwirtschaft in Erwägung gezogen wurden, schließen industrielle Enzyme ein, beispielsweise solche aus mikrobiellen Quellen wie Proteasen, Stärke oder Carbohydrat modifizierenden Enzymen (d.h. alpha-Amylase, Glucoseoxidase, Cellulasen, Hemicellulasen, Xylanasen, Mannanasen oder Pectinasen). Zudem wurde die Herstellung von Enzymen wie Ligninasen oder Peroxidasen, welche insbesondere in der Zellstoff- oder Papierindustrie von Wert sind, in vielen Feldfrüchten vorgeschlagen. Andere Beispiele für gewerblich oder industriell wichtige Enzyme, die über molekulare Landwirtschaft hergestellt werden können, sind Phosphatasen, Oxidoreduktasen und Phytasen. Die Anzahl der industriell wertvollen Enzyme ist groß und Pflanzen bieten einen geeigneten Träger für die Massenproduktion dieser Proteine bei Kosten, die voraussichtlich mit denen der Fermentation konkurrieren können.
  • Zusätzlich wird molekulare Landwirtschaft für den Einsatz in der Herstellung und der Bereitstellung von Impfstoffen, Antikörpern (Hein, M. B. und Hiatt, A. C., US 5 202 422 ), Hormonpeptiden (Vandekerckhove, J. S., US 5 487 991 ), Blutfaktoren und ähnlichem in Betracht gezogen worden. Es wurde postuliert, dass essbare Pflanzen, die für die Herstellung ausgewählter therapeutischer Mittel konstruiert wurden, ein Mittel zur Arzneilieferung darstellen, welches kostengünstig und besonders geeignet für die Handhabung therapeutischer Mittel in ländlichen oder unterentwickelten Ländern sind. Das Pflanzenmaterial, welches die therapeutischen Mittel enthält, könnte kultiviert und in den Ernährungsplan eingebracht werden (Lam, D. M., und Arntzen, C. J., US 5 484 719 ).
  • Insgesamt weisen die betrachteten neuen Input- und Output-Merkmale ein sehr weites Anwendungsgebiet für Feldfrüchte auf und können zur Verbesserung von zahlreichen neuen Produkten und Verfahren führen. Dementsprechend sind verlässliche Mittel zur Herstellung von Pflanzen mit neuen Merkmalen und der Einsatz der ursprünglichen transgenen Pflanzen in die Zucht und Ausleseentwicklungsprogramme wichtige Werkzeuge für die Überführung dieser Produkte in den Handel.
  • Ein Problem transgener Pflanzenherstellung ist, dass im Falle der Entdeckung eines transgenen Ereignisses in einer Pflanzenzelle ein bemerkenswerter Aufwand nötig ist, um morphologisch normale, fruchtbare Pflanzen zur Verwendung für das anschließende Zuchtprogramm zu finden. Dem nach sind Verfahren, die eine einfache Identifikation von Pflanzen, die das Transgen erhalten haben, Primärziel für die Vermarktung.
  • Die Selektion oder Identifizierung transgener Pflanzen über verlässliche Methoden, die keine biochemischen oder kolorimetrischen Untersuchungen benötigen, sind besonders üblich. Ein Verfahren, das Flexibilität ermöglicht, beispielsweise ein Programm, das zu jedem Zeitpunkt der Entwicklung einer transgenen Art eingesetzt werden kann, kann zusätzlich wertvoll sein. Ein besonders bevorzugtes Verfahren würde die Selektion innerhalb der Kultur, eine Identifizierung während der Zucht und während introgressiver Aktivitäten sowie die Identifikation und Diskriminierung während der Feldwirtschaft ermöglichen.
  • Bedenken, die mit der Feldfreigabe transgener Pflanzen verbunden sind
  • Es wurde angemerkt, dass die Freigabe genetisch modifizierter Feldfrüchte aufgrund der Expression ihres genetischen Potentials zu Umweltschäden führen kann, da diese über natürliche Auswahl oder sexuelle Rekombination natürlicherweise nicht stattfinden würde. Es wurde außerdem darauf hingewiesen, dass freigegebene transgene Pflanzen in natürliche Ökosysteme eindringen können, entweder über eine Verbreitung der Pflanzen selbst oder über Hybridisierung mit wilden Verwandten. Über diese Fragen wurde ausführlichst diskutiert und Versuchsreihen zur Untersuchung des Weiterlebens transgener Pflanzen und hinsichtlich des Merkmalstransfers von Feldfrüchten zu wilden Verwandten wurden gestartet (z.B. University of California, Risk assessment in agricultural biology: proceedings of an international conference, 1990, Casper, R., & Landsman, J., 1992; The bio-safety results of field tests of genetically modified plants and microorganisms. Proceedings of the 2nd International Symposium on The Biosafety Results of Field Tests of Genetically Modified Plants and Microorganisms, 1992, Goslar, Germany, Dale, P. et al., 1992; The field release of transgenic plants, The British Crop Protection Council. Brighton Crop Protection Conference: Pests and Diseases, Vols. I, II and III; Proceedings of the 3rd International Symposium on The BioSafety Results of Field Tests of Genetically Modified Plants and Microorganisms, 1994, Monterey, California, Jones, D. D., 1994).
  • Die Übereinstimmung zwischen den Studien und den bislang erhaltenen experimentellen Ergebnissen stützt die Ansicht, dass das Ausmaß der möglichen Ausbreitung von Transgenen hin zu wilden Verwandten in großem Maße von der Art und den Umweltbedingungen abhängt. Bei einigen Arten ist eine Kreuzung mit den Verwandten nicht sehr wahrscheinlich, für andere jedoch schon (Raybould & Grey, J., Applied Ecology 30, 199–219, 1993). Das Ausmaß, zu dem jede transformierte Pflanze von anderen Lebensräumen Besitz ergreift, und somit die Umweltrisiken, hängen demnach von der Pflanzenart selbst ab. Viele Feldfrüchte sind hochspezialisiert und an nicht-kompetitive Kultivierungspraktiken angepasst und werden demnach üblicherweise nicht als ernstzunehmendes Umweltrisiko betrachtet (Dale et al, Plant Breeding 111, 1–22, 1993; Fishlock, D., The PROSAMO Report, veröffentlicht von dem Laboratory of the Government Chemist, Queens Road, Teddington, Middlesex, UK TW11 OLY).
  • Jedoch herrscht genereller Konsens darüber, dass wahrscheinlich das Risiko besteht, dass gewisse Feldfrüchte, Zierpflanzen oder Pflanzen, die für natürliche pharmakologische Zwecke kultiviert wurden, zu unkrautartigen Schädlingen werden, da viele der unkrautartigen Arten, die gegenwärtig die landwirtschaftliche Produktion beeinträchtigen, einstmals von einer anderen Umgebung eingebracht worden sind, oftmals zu Zierzwecken, oder aus kulinarischen oder medizinischen Gründen (Keeler, K. H., Biotechnology 7, 1134–1139, 1989).
  • Während jahrelanges Untersuchen nötig sein wird, um vollständig die mögliche Auswirkung transgener Pflanzen der Umwelt zu verstehen, betrifft ein möglicherweise ernster zu nehmendes kurzfristiges Problem die Kontamination der landwirtschaftlichen Produktion mit neuen Merkmalen transgener Pflanzen. Sowohl die Xenia-Effekte (die direkte Wirkung von Kreuzpollen auf die Samenzusammensetzung) als auch Wildwachsende oder Samen, die im Feld verbleiben, können die anschließende landwirtschaftliche Produktion kontaminieren. Obwohl solche Ereignisse in der Vergangenheit nicht ein Hauptproblem gewesen sind, wurde die versehentliche Kontamination von Feldfrüchten, die zum allgemeinen Verbrauch bestimmt waren, mit optisch nicht unterscheidbaren Arten, die für andere Zwecke bestimmt waren, wie beispielsweise Feldfrüchte, die ein pharmazeutisch wirksames Protein enthalten, zum Gegenstand besonderer Besorgnis. Demnach ist die Möglichkeit transgene Feldfrüchte auf einfache und verlässliche Weise zu unterscheiden, wertvoll.
  • Derzeit werden physische Isolierung kombiniert mit Einfassungsreihen, die als Pollenfallen fungieren, zur Untersuchung und Entwicklung von Pflanzen mit transgenen Merkmalen verwendet (z.B. Agriculture and Agri-Food Canada, Regulatory Directive 94-08; Assessment Criteria for Determining Environmental Safety of Plants with Novel Traits, Regulatory Directive 94-09: The Biology of Brassica napus L. (Canola/Rapeseed), Regulatory Directive 95-01; Field Testing Plants with Novel Traits in Canada). Jedoch steigen die Kontaminationsmöglichkeiten innerhalb einer Handelsware mit steigender kommerzieller Produktion transgener Pflanzen dramatisch. Dieses Kontaminationspotential wurde zum Hauptbedenken für die Ölsamenrapsindustrie und wird zu einer wichtigen Angelegenheit für andere wichtige Feldfrüchte (z.B. Getreide) werden, da eine große Anzahl verschiedener rekombinanter Genotypen den Markt erreicht.
  • Kontamination gewerblicher Feldfruchtproduktion mit Merkmalen anderer Sorten, die die Qualität und das Gedeihen beeinflussen, ist möglicherweise ein ernst zu nehmendes Problem. Jedoch ist wegen einer möglichen Kontamination von Lebensmitteln die Verwendung von Canola (oder anderer Feldfrüchten) als Produktionsträger für heterologe Proteine von gewerblichem oder medizinischem Wert möglicherweise ein noch ernster zunehmendes Problem. Obwohl Produktionsstandards, wie sie oben genannt wurden, zur Erhaltung der Identität einzelner transgener Linien und zur Reduzierung ungewollter Kontamination eingesetzt werden können, kann das Abfließen von Genen in andere Arten mit der Zeit auftreten. Die Fragen hinsichtlich Auftreten und Verbreitung von Genen, die keine unterschiedliche Morphologie und kein leicht identifizierbares Merkmal (wie Herbizidtoleranz) aufweisen, wurde bis jetzt noch nicht gelöst.
  • Obwohl viele Techniken zum Einbringen von Genen in Pflanzen verwendet wurden, weisen bekannte genetische Konstrukte keine Merkmale auf, die zur Identifizierung und Selektion transgener Pflanzenzellen in der Kultur oder für die Kontrolle der Persistenz oder der möglichen Verbreitung der Transgene nützlich sind. Demnach würden auch genetische Konstrukte, die in einen Mechanismus eingegliedert sind, der die Unterscheidung zwischen transgenen und nicht-transgenen Pflanzen oder von transgenen Pflanzen, die verschiedene Merkmale aufweisen, ermöglicht, das Kontaminationsproblem lösen. Ein Mechanismus, der keine Auswirkung auf die nicht-transgenen Pflanzen besitzt, der demnach eine Eliminierung der Pflanzen, die ein spezifisches Transgen tragen, über ihre Identifizierung ermöglicht, würde ebenso eine Lösung darstellen. Zudem wäre ein Mechanismus, der selektiv Feldfruchtpflanzen, die spezifische Transgene tragen, von anderen gewerblichen Feldfrüchten, die diese Transgene nicht haben, abtrennt, ebenfalls wertvoll.
  • Verfahren zur Transformation von Pflanzen
  • Im allgemeinen sind zwei Verfahren zum Einbringen von DNA in Pflanzenzellen gegenwärtig weit verbreitet. Die erste umfasst die Verwendung von Agrobacterium oder ähnlichen Bodenbakterien zur Übertragung von DNA. Zielpflanzengewebe oder -zellen werden mit einem geeigneten Agrobacterium-Bakterienstamm, der Plasmid DNA in Pflanzenzellen injiziert, co-kultiviert (Schilperoot, R. A. et al., US 4 940 838 ; Schilperoot, R. A. und Hoekema, A., US 5 464 763 ). Anschließend werden die individuell transformierten Pflanzenzellen zu ganzen Pflanzen regeneriert.
  • Das Agrobacterium-Transformationssystem basiert historisch auf der Verwendung eines natürlichen bakteriellen Vektors, der der ursächliche Erreger der Wurzelhalsgallenkrankheit ist. Die Wurzelhalsgallenkrankheit ist das Resultat einer natürlichen Form der Pflanzentransformation. Die natürlich vorkommenden Tumor induzierenden (Ti) Plasmide von Agrobacteria umfassen: Die DNA-Sequenzen, die für den Transfer der DNA in Pflanzenzellen benötigt werden; die DNA-Sequenzen, die zur Integration fremder DNA in die Wirtspflanzen DNA benötigt werden und Grenzfragmente genannt werden; und Gene, genannt Oncogene, die zur Bildung von das Pflanzenwachstum regulierenden Substanzen führen, was die Bildung von Gallen am Infektionsherd verursacht. Die Ti-Plasmide kodieren zudem typischerweise für Gene, was zur Bildung von bestimmten unüblichen Aminosäuretypen (Opinen) führt, die von Agrobacteria metabolisiert werden können, aber nicht von Pflanzenzellen. Im natürlichen System enthält der Anteil an Ti-Plasmid, der auf die empfangsbereite Wirtspflanze übertragen wird (die T-DNA) üblicherweise alle diese Gene und DNA-Sequenzen.
  • Die Oncogene der tumorigenen Agrobacterium-Bakterienstämme wurden ausführlich untersucht. Üblicherweise gibt es zwei Arten von Oncogenen auf dem Agrobacterium-Plasmid: Die tmr-Oncogene und die tms-Oncogene. Das tmr-Oncogen (auch bekannt als ipt-Gen) kodiert ein Enzym, das Isopentyladenosin 5'-monophosphat kodiert, welches ein Cytokininpflanzenhormon ist, das die Triebbildung in einem geeigneten Träger induziert. Die Oncogene, die als tms bezeichnet werden (umfassend tms-Oncogen 1 und tms-Oncogen 2) kodieren Enzyme, die für die Auxinüberproduktion in geeigneten Wirten verantwortlich sind, was zur Bildung von Wurzeln führt. In Kombination führen die tms- und tmr-Gene üblicherweise zur Bildung von Wurzelhalsgallen bei geeigneten Wirten.
  • Pflanzen, die Ti-Oncogene enthalten, sind phänotypisch abnormal, und besitzen Wurzelhalsgallentumore oder gekräuselte oder verdrehte Blätter aufgrund eines Ungleichgewichts an Wachstumshormonen. Diese abnormalen Pflanzen sind für gewerbliche Anwendungen ungeeignet. Obwohl diese Pflanzen im Anschluss an die Transformation leicht identifiziert werden können, bilden sie keine morphologisch normalen Pflanzen. Dementsprechend wurde das Agrobacterium Ti-Plasmid auf viele unterschiedliche Weisen modifiziert und zwar üblicherweise durch Entfernen der Oncogene, um ein Werkzeug zum Einbringen von DNA in Pflanzenzellen zu erhalten. Üblicherweise verwenden Agrobacterium-Transformationsverfahren, wie sie bisher eingesetzt wurden, Ti-Plasmide, in denen die Gene, die zur Bildung von Cytokininen und Auxinen führen sowie die Gene für die Opinsynthese entfernt wurden. Solche Plasmide werden üblicherweise als „entwaffnet" bezeichnet. Entsprechend wird ein „bewaffnetes" Ti-Plasmid üblicherweise als ein Oncogen enthaltend betrachtet.
  • Das Ti-Plasmid zur Verwendung in der Pflanzentransformation wurde ferner so konstruiert, dass es Restriktionsstellen aufweist, die geeignet sind zum Einbringen fremder Gene zwischen oder benachbart zu einem oder mehreren der Grenzfragmente, sowie Gene zur Identifizierung und Selektion transformierter Zellen, wie beispielsweise Gene für die antibiotische Widerstandskraft oder β-Glucuronidase-synthase Gene (GUS). Replikationsgene werden oft zur Replikation des Plasmids in Wirte, die nicht Agrobacterial-Wirte sind, in Ti-Plasmide eingebracht. Die Vir-(Virulenz)gene, die zur Mobilisierung der DNA und den Transfer des Plasmids von der bakteriellen Zelle benötigt werden, sind oft in einem separaten Plasmid oder in einem Teil des Ti-Plasmids enthalten, der nicht derje nige ist, der die zu transferierende DNA enthält, und werden demnach nicht zu den empfangsbereiten Pflanzenzellen transferiert.
  • Die zweite weit verbreitete Technologie, die zur Bildung transformierter Pflanzen verwendet wird, umfasst die Verwendung von gezielt ausgerichteten Mikroprojektilen. Diese Verfahren wurden zur Transformation sowohl von Monokotylen und Dikotylen eingesetzt, die sich den Agrobacterium-Verfahren widersetzen. Eine Vielzahl verschiedener Mikroprojektile und Beschießungsmethoden wurde beschrieben, beispielsweise in Sanford et al., US 4 945 050 ; McCabe et al., US 5 149 655 ; Fitzpatrick-McElligott et al., US 5 466 587 und Coffee et al., US 5 302 523 , US 5 464 765 . Die DNA, die unter Verwendung von gezielt ausgerichteten Mikroprojektilen eingebracht worden ist, umfasst ähnliche funktionale Merkmale zur Expression in Pflanzenzellen, äquivalent zu denen, die mittels Agrobacterium-Systemen eingebracht wurden. Beispielsweise umfasst ein oftmals verwendeter Vektor konstruierte Bereiche zum Einbringen fremder Gene sowie von Genen, die zur Identifizierung oder Selektion von Transformanten benötigt werden.
  • Andere Verfahren, die zum Erhalt transformierter Pflanzen verwendet werden, umfassen: Die Mikroinjektion direkt in den Zellkern (Crossway et al., US 4 743 548 ); sowie direkte DNA-Aufnahme über Protoplasten (Paszkowski et al., US 5 231 019 , US 5 453 367 ).
  • Obwohl die übliche Vorgehensweise bei der Pflanzentransformation gut verstanden wird, wird die praktische Anwendbarkeit von Pflanzentransformationsprozessen oftmals durch das genotypische Ansprechverhalten von Pflanzenzel len auf die Transformations- und Kultivierungsbedingungen beschränkt. Es ist nicht unüblich, für lediglich einen oder zwei enge Genotypen innerhalb einer Art transformierbar zu sein. Entsprechenderweise ist es nicht einfach oder in einigen Fällen möglich, alle Genotypen innerhalb einer Feldfruchtart effizient zu transformieren. Trotz zahlreicher Versuche, die Kultur- und Transformationsprotokolle zu ändern, widersetzen sich einige Pflanzengenotypen der Transformation durch Techniken, die für andere Genotypen wirksam sind. Demnach wird oft zunächst ein spezifischer transformierbarer Genotyp, verwendet, dann wird das transgene Ereignis gekreuzt oder im Keimplasma „introgressiert", das sich diesem Transformationsverfahren widersetzt. Obwohl diese Methode das allmähliche Einbringen von Transgenen in einer Linie, die nicht ohne übermäßigen Aufwand transformiert werden kann, erlaubt, benötigt das Verfahren Zeit und Aufwand, da das Transgen bei jeder geschlechtlichen Kreuzung selektiert werden muss.
  • Demnach würde ein Verfahren, das ein schnelles Unterscheiden von Pflanzen, in die die Transgene durch Transformation oder Introgression eingebracht worden sind, erlaubt, die Produktion transgener Pflanzen deutlich erleichtern. Insbesondere würde ein zerstörungsfreier visueller Ansatz ein schnelles Screening einer großen Anzahl von Zuchtlinien und Segregationspopulationen ermöglichen. Dieses Screening-Verfahren würde, wenn es im Keimstadium oder sogar im Samenentwicklungsstadium (d.h. Embryofreisetzung) angewandt wird, in vielen gewerblichen Produktionsprogrammen Verwendung finden, indem es die Linienselektion in einem frühen Stadium erlaubt und es so nicht mehr nötig ist, Pflanzen bis zur Reife wachsen zu lassen, wobei Zeit- und Landresourcen gespart werden. Ein solches Verfahren könnte zudem dazu verwendet werden, eine bedeutende Anzahl Nulllinien von der Kultivierung auszuschließen und somit eine rationelle Aufzucht und Introgressionsverfahren zu ermöglichen. Insbesondere wäre ein solches Verfahren zur Herstellung von Brassica-Pflanzen, die Transgene für Input- oder Output-Merkmale einschließlich wertvoller Output-Merkmale tragen, nützlich.
  • Brassica-Transformation
  • Über die Transformation von Mitgliedern der Cruciferae-Familie von Agrobacterium und andere Verfahren wurde berichtet. Jedoch haben viele der Berichte, die speziell die Brassica-Transformation betreffen, die Schwierigkeit aufgezeigt, routinemäßig transformierte Brassica-Arten über Agrobacterium vermittelte Transformation zu erhalten. Viele Berichte haben den Erfolg mit einer oder zwei besonderen Arten gezeigt, aber es gibt keine Lehre detaillierter Verfahren, die generell für alle Arten innerhalb des Brassica-Genus verwendbar sind. Obwohl viele Manipulationen der Kultivierungsbedingungen vorgenommen werden können, haben sich einige Arten als besonders schwierig mit den vorangehend berichteten Verfahren zu transformieren erwiesen. Demnach wurde ein großer Aufwand für das Einbringen von Transgenen in diese Genotypen über Kreuzung und Introgression betrieben. Alle Verbesserungen und Entdeckungen, die eine verlässliche Generierung transgener Pflanzen von diesen Genotypen ermöglichen oder wirksamere Mittel für das Introgressieren dieser Merkmale bereitstellen, würden eine bedeutende Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik darstellen.
  • Viele der anfänglichen Brassica-Transformationsstudien wurden mit einem einzigen Genotyp durchgeführt, B. napus cv Westar (Radke et al, Theor. Appl. Genet. 75, 685–694, 1988; Moloney et al., Plant Cell Reports 8, 238–242, 1989; Moloney et al., 1989, US 5 188 958 ; Moloney et al., 1989, US 5 463 174 ). Die Auswahl von Westar war zweckmäßig, da er auf Gewebekultivierung und Transformationsprotokolle, wie sie in den oben genannten Referenzen beschrieben werden, anspricht und den Erhalt transgener Pflanzen ermöglicht. Westar bleibt der Genotyp der Wahl für Transformationsexperimente, jedoch werden die agronomischen Merkmale der Art im Vergleich zu jüngeren Sorten als eher schlecht angesehen. Demnach verbleibt eine Lücke zwischen verlässlicher Transformationsstechnologie und gewerblichen Genotypen des Brassica napus-Ölsamens.
  • Zudem haben viele Brassica-Transformationsstudien, die unter Verwendung der beschriebenen Verfahren oder Variationen hiervon durchgeführt wurden, zu Ergebnissen geführt, die stark variieren und von dem immanenten Ansprechen des spezifischen Pflanzenmaterials auf das Transformationsprotokoll abhängen. Beispielsweise schwanken die Transformationshäufigkeiten, die für Brassica napus erhalten werden, oftmals und sind sehr niedrig (Fry et al., Plant Cell Reports 6, 321–325, 1987; Mehra-Palta et al., In Proc 8th Int. Rapeseed Congress, Saskatoon, Saskatchewan, 1991; Swanson and Erickson, Theor. Appl. Genet. 78, 831–835, 1989). Schwankende und oftmals geringe Transformationshäufigkeiten wurden zudem bei anderen Brassica-Arten, wie B. oleracea beobachtet (Christie and Earle, In Proc 5th Crucifer Genetics Workshop, Davis, 46–47, 1989; Metz et al., Plant Cell Reports 15, 287–292, 1995; Eimert und Siegemund, Plant Molec. Biol. 19, 485–490, 1992; DeBlock et al., Plant Physiol. 91, 694–701, 1989; Berthomieu und Jouanin, Plant Cell Reports 11, 334–338; Toriyama et al., Theor. Appl. Genet. 81, 769–776, 1991); B. ra pa (Radke et al., Plant Cell Reports 11, 499–505, 1992; Mukhopadhyay et al., Plant Cell Reports 11, 506–513, 1992); B. juncea (Barfield und Pua, Plant Cell Reports 10, 308–314, 1991; Deepak et al., Plant Cell Reports 12, 462–467, 1993; Pua und Lee, Planta 196, 69–76, 1995); B. nigra (Gupta et al., Plant Cell Reports 12, 418–421, 1993); and B. carinata (Narasimhulu et al., Plant Cell Reports 11, 359–362, 1992; Babic, M. Sc. Thesis, Univ of Saskatchewan, 1994).
  • Die verschiedenen Brassica-Gattungen, Arten und Sorten stellen sehr unterschiedliche Gruppen mit grundlegend verschiedenen Morphologien und physiologischen Charakteristika dar. Viele Brassica-Gattungen von gewerblichem Interesse sprechen nicht gut oder überhaupt nicht auf die vorangehend beschriebenen Verfahren an. Insbesondere scheinen Brassica napus Ölsamenarten mit unüblichen Fettsäurezusammensetzungen sich konventionellen Transformationsbemühungen zu widersetzen. Ein Genotyp, verkörpert durch die Art AG019, wie in US 5 965 755 beschrieben, ist ein hoher Ölsäure-, niedriger Linolsäuregenotyp. D.h. er schlägt nicht auf konventionelle Transformationsverfahren wie beispielsweise von Moloney (ibid) beschrieben an. Die Art AG019 und hiervon abstammende Arten besitzen wertvolle Fettsäurezusammensetzungen, die Öl mit verbesserter Oxidationsstabilität und Nährwert bereitstellen. Kreuzung mit Brassica napus von konventionellem Ölprofil, beispielsweise einem transformierten Westar als Mittel zum Einbringen eines Transgens verursacht einen Verlust hinsichtlich des Ölprofils und benötigt einen bedeutenden Zuchtaufwand, um das erwünschte Ölprofil zu rekonstruieren. In den meisten Fällen ist es unsicher, ob dies erreicht werden kann. Demnach wird ein Transformationsverfahren benötigt, welches zur Transformation von wider spenstigen Brassica, insbesondere Brassica napus-Ölsamenarten mit veränderten Ölprofilen, in besonders bevorzugter Weise der Transformation der Brassica-Art AG019 und deren Abkömmlingen nützlich ist.
  • Dementsprechend werden Verfahren zum Transformieren widerspenstiger Brassica-Genotypen wertvoll sein. Außerdem werden Verfahren zum Identifizieren transformierter Pflanzenzellen und Pflanzen sowie Abkömmlinge hiervon ebenfalls wertvoll sein, insbesondere wenn die Verfahren einfach, nicht zerstörerischer Natur sind und eine visuelle Identifikation der Pflanzen oder Zellen, die das interessierende Transgen enthalten, ermöglichen. Wenn solche Verfahren außerdem eine Diskriminierung auf Feldniveau ermöglichen, dann ist eine große Anzahl an Anwendungen realisierbar.
  • Verfahren wurden entwickelt, die diese Bedürfnisse bis hin zu einem gewissen Grad angehen. Visuelle Markierungsgene wie die β-Glucuronidase oder das GUS-Gen sind brauchbar aber bedürfen einer biochemischen oder histochemischen Untersuchung. Gene, die auf verwendete Chemikalien ansprechen, werden üblicherweise von sogenannten „bedingt letalen" Genen typifiziert. Jedoch führen diese typischerweise zu einem letalen Phänotyp und sind demnach nicht nützlich zum Aufspüren von Transgenen in einem Züchtungsverfahren. Demnach ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein bedingt letales Gen bereitzustellen, das in einem Züchtungsprogramm verwendet wird, ebenso wie andere gewerblich wichtige Ziele.
  • Bedingt letale Gene
  • Bedingt letale Merkmale und Gene, die diese Merkmale aufweisen, sind bekannt. Viele bedingt letale Gene führen zu einem letalen Phänotyp und Pflanzentod. Jedoch können einige bedingt letale Gene auf eine Weise verwendet werden, die nicht notwendigerweise zu Zelltod führt. Ein Beispiel solcher bedingt letaler Gene ist das Agrobakterium Ti-Plasmid tms-Oncogen 2. Dieses Oncogen kodiert für das Enzym Indolacetamidhydrolase (IAMH), das in Kombination mit dem Agrobacterium Oncogen 1, welches für die Indolacetamidsynthase (IAMS) kodiert, einen Teil der Indolessigsäure(IAA)-Synthese darstellt, der typisch für diese Art von Bakterium ist.
  • Die Bildung von Idolessigsäure über Pflanzen findet auf einem anderen Weg als die des Agrobacteriums statt. Demnach führt die Expression von IAMH (Oncogen 2) in Pflanzen nicht zur Bildung von Indolessigsäure, da das Substrat für das Enzym Indolacetamid in Pflanzenzellen nicht vorhanden ist. Jedoch führt die Applikation von Indolacetamid auf Pflanzen, die das IAMH-Gen exprimieren, zu einer schnellen Anhäufung von IAA. Auch wenn IAA ein natürlich vorkommender Auxinpflanzenwachstumsregulator ist, stören unkontrolliert hohe Werte an IAA schnell den Zellmetabolismus, was zu Seneszenz und Zelltod führt. Das Enzym IAMH ist fähig, andere, dem Indolamid verwandte Substrate einschließlich Naphthalenacetamid zu hydrolisieren, das zur Herstellung des gut bekannten synthetischen Pflanzenwachstumsregulators Naphthalenessigsäure (NAA) führt.
  • Die Verwendung eines bedingt letalen Gens wie dem IAMH-Oncogen zum Ausputzen von Maispflanzen ist in der US 5 180 873 (Jorgensen), veröffentlicht Januar 1994, beschrieben. Jorgensen lehrt die Transformation von Pflanzen, um ein bedingt letales Gen zu erhalten. Die Pflanzen werden anschließend einer Verknüpfungsanalyse unterzogen und schließlich hinsichtlich einer engen Verbindung zwischen dem letalen Gen und dem Ziellocus selektiert, der entweder von vornherein vorliegt oder über traditionelle Aufzuchttechniken eingebracht wurde. Die US 5 426 041 von Fabijanski et al., veröffentlicht Juni 1995, lehrt ein Verfahren zur Hybridsamenherstellung unter Verwendung von IAMS in Verbindung mit IAMH. Das Patent lehrt kein Verfahren zur Verwendung des Oncogens in einem nicht tödlichen Mittel oder zur Selektion während oder nach der Transformation. Auch lehrt das Patent kein Verfahren zur Verwendung von Oncogen 2 zum selektiven Entfernen verwandter Arten, die das transformierte genetische Material empfangen haben.
  • Demnach bietet ein bedingt letales Gen innerhalb eines genetischen Konstrukts, das ebenfalls ein neues Merkmal enthält, ein geeignetes Mittel zur kontrollierten Verbreitung des neuen Merkmals. Dennoch lösen traditionelle bedingt letale Gene nicht das vorliegende Problem des Selektierens, Identifizierens und Aufspürens transgener Pflanzen und deren Abkömmlinge, da die letalen Gene kein zerstörungsfreies Mittel zur Identifizierung oder Selektierung transformierter Pflanzenzellen, insbesondere Brassica-Zellen, bereitstellen.
  • Entsprechend ist ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung, ein vorher identifiziertes bedingt letales Gen zum Aufspüren von Transgenen während des Zucht- und Vermarktungsverfahrens sowie unter Feldbedingungen zu modifizieren und zu verwenden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren und genetische Konstrukte zur Herstellung transgener Pflanzen bereit, die visuell und zerstörungsfrei identifiziert werden können. Die vorliegende Erfindung stellt weiter transgene Pflanzen bereit, die sicher und spezifisch von einem Wachstumsort durch Anwendung einer geeigneten Chemikalie entfernt werden können, die in Gegenwart des exprimierten genetischen Konstrukts in ein phytotoxisches Mittel konvertiert wird. Die Verfahren, genetischen Konstrukte und Pflanzen der vorliegenden Erfindung sind besonders für die Anwendungen, die mit Input- oder Output-Merkmalen oder der heterologen Herstellung von Proteinen verwandt sind, geeignet.
  • Die vorliegende Erfindung liefert ein genetisches Konstrukt, umfassend ein bedingt letales Gen, das operabel mit einem in einer Pflanzenzelle funktionellen Promoter verknüpft ist. Das Gen wird verwendet zum Auswählen, Identifizieren oder selektiven Töten von Pflanzen, die dieses Gen exprimieren.
  • Das genetische Konstrukt umfasst ein bedingt letales Gen, das zum Töten der Pflanze als Reaktion auf die Anwendung einer chemischen Zusammensetzung exprimiert wurde. Demnach wird gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein genetisches Konstrukt bereitgestellt, umfassend:
    ein bedingt letales erstes Gen, das in einer Pflanzenzelle einer Pflanze exprimierbar ist, und
    ein zweites Gen, das in der Pflanzenzelle exprimierbar ist, wobei das zweite Gen, wenn es in der Pflanzenzelle exprimiert wird, der Pflanzenzelle ein interessierendes, nicht natürlich auftretendes Merkmal verleiht und wobei das zweite Gen aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus
    • a) einem Gen, das ein pharmazeutisches Produkt kodiert;
    • b) einem Gen, das ein industriell verwendbares Enzym kodiert;
    • c) einem Gen, das Rennin und/oder Hirudin kodiert; und
    • d) einem Gen, das ein Input- oder Output-Merkmal kodiert.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine transgene Pflanze bereitgestellt, umfassend:
    ein bedingt letales erstes Gen, das in mindestens einer Pflanzenzelle exprimierbar ist; und
    einem zweiten Gen, das in der Pflanzenzelle der transgenen Pflanze exprimierbar ist, wobei das zweite Gen, wenn es in der Pflanzenzelle exprimiert wird, der Pflanzenzelle ein interessierendes, nicht natürlich auftretendes Merkmal verleiht und wobei das zweite Gen aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
    • a) einem Gen, das ein pharmazeutisches Produkt kodiert;
    • b) einem Gen, das ein industriell verwendbares Enzym kodiert;
    • c) einem Gen, das Rennin und/oder Hirudin kodiert; und
    • d) einem Gen, das ein Input- oder Output-Merkmal kodiert.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum selektiven Entfernen von wenigstens einer Pflanze aus einer Wachstumsumgebung bereitgestellt, umfassend:
    Transformation mindestens einer Pflanzenzelle mit einem genetischen Konstrukt, enthaltend:
    ein bedingt letales erstes Gen, das in mindestens einer Pflanzenzelle exprimierbar ist, und
    ein zweites Gen, das in mindestens einer Pflanzenzelle exprimierbar ist, wobei das zweite Gen, wenn es in mindestens einer Pflanzenzelle exprimiert wird, der Pflanzenzelle ein interessierendes, nicht natürlich auftretendes Merkmal verleiht und wobei das zweite Gen aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
    • a) einem Gen, das ein pharmazeutisches Produkt kodiert;
    • b) einem Gen, das ein industriell verwendbares Enzym kodiert;
    • c) einem Gen, das Rennin und/oder Hirudin kodiert;
    • d) einem Gen, das ein Input- oder Output-Merkmal kodiert.
  • Die Erfindung ist gut geeignet für die Herstellung von Feldfrüchten, sowie Brassica-Gattungen/Arten für großmaßstabige landwirtschaftliche und industrielle Anwendungen. Das Verfahren findet Anwendung zum Aufspüren und Identifizieren von Transgenen während des Zuchtverfahrens. Das Verfahren findet zudem Anwendung zur Herstellung von gewerblichen Pflanzenarten, die neue Merkmale umfassen, wobei die Kontamination von anderen gewerblichen Produkten der gleichen Art über Kreuzbefruchtung oder Wildsamen vermieden werden muss. Zudem bietet die Erfindung einen Schutz für die Umwelt, da sie ein Verfahren zum selektiven Entfernen von Umgebungspflanzen, die Transgene aufweisen, bereitstellt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere ein Verfahren bereit zum Herstellen von Feldfruchtpflanzen, die heterologe Proteine exprimieren. Das erfindungsgemäße Verfahren kann dazu verwendet werden, eine Kontamination von heterologen Proteinexpressoren anderer gewerblicher Produkte im wesentlichen zu verhindern.
  • Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Transformation von Brassica-Gattungen und Arten bereit, einschließlich derer, von denen kürzlich herausgefunden wurde, dass sie sich widersetzen oder nur mit sehr geringen Umsatzraten transformiert werden können. Dies schließt die gewerblich wichtigen Gattungen mit hohem Öl- und niedrigem Linolgehalt, insbesondere AG019 und deren Abkömmlinge, ein.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • In den Figuren bezieht sich „C. R." auf „Kodierungsbereich"; „TER" bezieht sich auf „Terminationsregion"; „PROM" bezieht sich auf „Promoter" und „PR" bezieht sich auf „primer".
  • 1 zeigt die Konstruktion des Pflanzentransformationsvektors pJH121 umfassend das bedingt letale Agrobacterium Oncogen 2 in dem Vektor pHS723. Zusätzlich zu dem Oncogen enthält der Vektor ein Gen, das beta-Glucuronidase kodiert – ein Kanamycin-Resistenzfusionsprotein zur Selektion von Pflanzenzellen.
  • 2 zeigt die Konstruktion des Pflanzentransformationsvektors pJH122, umfassend das bedingt letale Agrobacterium Oncogen 2 in dem Vektor pRD400. Zusätzlich zu dem Oncogen enthält der Vektor das Kanamycin-Widerstandsgen zur Selektion von Pflanzenzellen.
  • 3 zeigt die Derivation des Pflanzentransformationsvektors pJH122, umfassend das bedingt letale Agrobacterium Oncogen 2, verknüpft mit einem heterologen Gen, das eine Arabidopsis-Oleosinsamen kodierende Region ist, die in den Rahmen mit der GUS kodierenden Sequenz eingebunden ist. Die Oleosinsamen kodierende Region bietet eine spezifische Ansammlung von Fusionsproteinen von Ölsamenkörpern. Das heterologe Gen ist unter Kontrolle des Ölsamenpromoters.
  • 4 zeigt die Konstruktion des Pflanzentransformationsvektors pJH125, umfassend das bedingt letale Agrobacterium Oncogen 2 unter der Kontrolle des 35S Promoters in dem Vektor pRD400. Zusätzlich zu dem Oncogen enthält der Vektor das Kanamycin-Resistenzgen zur Auswahl von Pflanzenzellen.
  • 5 zeigt die Ableitung des Pflanzentransformationsvektors pJH126, umfassend das bedingt letale Agrobacterium Oncogen 2 unter der Kontrolle des 35S-Promoters, verknüpft mit einem heterologen Gen, welches eine Arabidopsis Oleosinsamen kodierende Region ist, die in den Rahmen der GUS kodierenden Sequenz eingebracht ist. Die Oleosinsamen kodierende Region bietet eine spezifische Ansammlung an dem Fusionsprotein von Ölsamenkörpern. Das heterologe Gen ist unter Kontrolle des Oleosinsamen-Promoters.
  • 6 zeigt die Konstruktion des Pflanzentransformationsvektors pJH130, umfassend das bedingt letale Agrobacterium Oncogen 2 unter der Kontrolle des 35S-Promoters in dem Vektor pHS723. Zusätzlich zu dem Oncogen enthält der Vektor ein Gen, das beta-Glucuronidase kodiert – das Kanamycin-Resistenzfusionsprotein zur Selektion von Pflanzenzellen.
  • BESCHREIBUNG DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die Erfindung stellt genetische Konstrukte zum Herstellen transgener Pflanzen bereit, die leicht visuell identifiziert werden können. Diese genetischen Konstrukte sehen zudem rekombinante Pflanzen vor, die leicht von jedem Wachstumsort durch Anwendung einer chemischen Zusammensetzung, die lediglich diese transgenen Pflanzen angreift, entfernt werden können. Das genetische Konstrukt sieht zudem ein neues Selektionsverfahren vor, das während des Transformationsprozesses verwendet werden kann.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält das genetische Konstrukt ein bedingt letales Gen und ein zweites Gen zum Kodieren eines erwünschten Merkmals. Entweder eines oder beide Gene können modifiziert werden, um in einer Pflanzenzelle exprimierbar zu sein.
  • Es ist wünschenswert, dass das genetische Konstrukt so konstruiert ist, dass die DNA-Sequenzen die transkriptionalen und translationalen Regulationsregionen umfassen, und dass die DNA, die sowohl das Target als auch das bedingt letale Gen kodiert, über viele Klonierungsbereiche verknüpft ist, so dass eine zweckmäßige Substitution ei nes alternativen oder zusätzlichen Targets und/oder bedingt letaler DNA-Sequenzen ermöglicht wird.
  • Das genetische Konstrukt der vorliegenden Erfindung kann in einen Vektor zur Transformation von Pflanzen eingebracht werden. Der Vektor umfasst das bedingt letale Gen, das zur selektiven Expression in Pflanzen konstruiert ist, die mit dem Target-Gen verknüpft sind, welches ebenfalls zur Expression in Pflanzen konstruiert ist.
  • Der Vektor kann die erforderlichen genetischen Sequenzen umfassen, beispielsweise zur Replikation, Transformation und Selektion in Pflanzen, soweit sie bekannt sind. Beispielsweise kann der Vektor die rechten und wahlweise die linken T-DNA-Grenzen enthalten, sofern der Vektor in einem Agrobacterium vermittelten Transformationssystem oder einem kanamycinresistenten Gen (NPTII) zur Selektion von Transformanien verwendet werden muss.
  • Das genetische Konstrukt kann in Pflanzenzellen zur Bildung rekombinanter Zellen über jedes geeignete Verfahren eingebracht werden wie durch Agrobacterium vermittelte Elektroporation oder Teilchenbeschussverfahren. Die Pflanzenzellen können zu ganzen Pflanzen über jedes geeignete Verfahren regeneriert werden. Die rekombinanten Pflanzen können in der Pflanzenzucht oder direkt in der landwirtschaftlichen Produktion verwendet werden.
  • Das zweite Gen des Konstrukts kodiert ein gewünschtes Protein, Peptid oder Antisens-RNA. Das Gen kann beispielsweise einen Teil oder die Gesamtheit eines natürlich vorkommenden Gens aus jeder Quelle (d.h. ein heterologes Gen), eine geänderte Form eines natürlich vorkommenden Gens, eine synthetische DNA-Sequenz oder eine Kom bination von natürlich vorkommendem und synthetischen Sequenzen sein. Ein oder mehrere Introns können in der Kodierungssequenz des Target-Produkts vorliegen. Dieses zweite Gen kann als Translationsprodukt in einem Pflanzensystem transkribiert oder exprimiert werden; beispielsweise indem es geeignete Transkriptions- und Translationsiniziierungs- und -terminierungsregionen aufweist. Die Expression dieses zweiten Gens kann beispielsweise über einen unveränderten oder veränderten ursprünglichen, einen konstitutiven, einen indizierbaren, einen umweltregulierten oder gewebespezifischen Promoter reguliert werden, der der gleiche oder verschieden von dem Promoter sein kann, der die Expression des bedingt letalen Phänotyps reguliert. Die Auswahl des Promotors für das Gen wird in Abhängigkeit von dem erwünschten Effekt oder dem zu erreichenden Ergebnis, variieren.
  • In Anwendungen der molekularen Landwirtschaft ist die samenspezifische Expression des zweiten Gens besonders nützlich. Demnach beinhaltet das zweite Gen in diesen Systemen vorzugsweise transkriptional und translational regulierende Regionen, die zur Expression in sich entwickelnden Pflanzensamen und in besonders bevorzugter Weise in dem Samenembryo oder anderem Samengewebe, das Triglyceride speichern kann, befähigt sind. Solche Regulierungsregionen können beispielsweise den Oleosinpromoter einschließen (Plant e al., Plant Molecular Biology 25, 193–205, 1994). Vorzugsweise umfasst das zweite Gen: (i) in Pflanzen wirksame Transkription und Translation regulierende Regionen einschließlich Iniziierungs- und Terminierungsregionen; und (ii) eine Region, die ein chimäres Peptid oder Protein kodiert. Diese Kodierungsregion umfasst vorzugsweise (a) eine Region, die zumindest einen Teil eines ölkörperspezifischen Proteins kodiert, der da zu ausreicht, das chimäre Produkt zu einem Ölkörper zu targetieren oder zu partitionieren und (b) die Region, die das gewünschte Protein oder Merkmal kodiert. Die Ölkörperregion des chimären Gens kann einen ölkörperspezifischen Promoter aufweisen. Das Chimäre Peptid oder Protein kann zudem eine Peptidsequenz aufweisen, welche das ölkörperspezifische Protein mit dem erwünschten Protein verknüpft, und welche spezifisch über chemische oder enzymatische Mittel gespalten werden kann (Moloney, PCT/CA92/00161).
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze bereit, die selektiv von einer Wachstumsumgebung entfernt werden kann. Ein genetisches Konstrukt wird bereitgestellt, das ein bedingt letales Gen und ein zweites Gen, das ein bestimmtes Merkmal kodiert, aufweist. Eine Pflanzenzelle wird mit dem genetischen Konstrukt transformiert und zu einer ganzen Pflanze regeneriert. Herstellung des genetischen Konstrukts, Transformation und Regeneration werden unter Verwendung aller geeigneter Verfahren ausgeführt.
  • Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung die Herstellung von Pflanzen bereit, die ein Transgen enthalten, das ein Input- oder Output-Merkmal oder jedes erwünschte Merkmal aufweist, wobei neu ist, dass solche transgene Pflanzen und deren Abkömmlinge spezifisch von einem Wachstumsort entfernt werden können, wenn es erwünscht ist. Die Erfindung verwendet ein genetisches Konstrukt, das einschließt (a) ein neues Merkmalsgen, mit welchem verknüpft ist, (b) ein Gen, das ein Produkt kodiert, das eine geeignete Substanz in eine Substanz konvertieren kann, welche eine Veränderung des Phänotyps oder Tod der gesamten Pflanze verursacht. Die Gene, die unter (b) i dentifiziert werden, werden hier als bedingt letale Gene bezeichnet.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform umfasst das genetische Konstrukt ein bedingt letales Gen, das funktionsfähig mit einem Promoter, der in einer Pflanzenzelle wirksam ist, verknüpft ist. In diesem Fall wird das bedingt letale Gen dazu verwendet, eine dieses exprimierende Pflanze, auszuwählen, zu identifizieren oder selektiv zu töten.
  • Bedingt letale Gene können aus jeder Quelle erhalten werden, wie Pflanzen-, bakteriellen, viralen oder Tiersystemen, und können vom Wildtyp, verändert oder synthetisch sein. Diese Gene sind zur Transkription und Translation in einem Pflanzensystem hergerichtet und schließen beispielsweise jede notwendige Transkriptions- oder Translationsinitiierung und Stoppsequenzen ein. Das bedingt letale Gen kann so eingestellt werden, dass es Zelltod, beispielsweise durch Ansprechen auf die Anwendung einer chemischen Substanz oder als Ansprechen auf die Anwendung von physiologischem Stress wie einem Hitze- und/oder Kälteschock initiiert. In einer Ausführungsform wird ein bedingt letales Gen verwendet, welches dazu angeregt wurde, Zelltod bei Anwendung einer Substanz, die keine schädlichen Einflüsse auf die Wachstumsumgebung hat, zu verursachen.
  • Viele bedingt letale Gene sind im Stand der Technik bekannt. Bedingt letale Gene besitzen üblicherweise zwei Wirkungsmechanismen. Der letale Phänotyp ist bedingt durch entweder dem Vorhandensein einer nicht toxischen Substanz oder der Induktion von Genaktivität. Im ersten Fall exprimiert ein Gen ein Produkt, das auf eine nicht toxische Substanz einwirken kann, welche üblicherweise extern angewendet wird, wobei diese so verändert wird, dass sie toxisch und dazu fähig wird, eine Pflanzenzelle zu töten. In diesem Fall hängt der bedingt letale Phänotyp von der Anwesenheit der nicht toxischen Substanz ab. In Abwesenheit der nicht toxischen Substanz wird der letale Phänotyp nicht exprimiert; in Anwesenheit der Substanz wird der letale Phänotyp beobachtet.
  • Im zweiten Fall kodiert ein bedingt letales Gen ein Produkt, das direkt toxisch für eine Pflanzenzelle ist. Jedoch wird die Expression des Toxigens durch einen Promoter reguliert, so dass die Expression von Toxin unterdrückt werden kann, wenn es erwünscht ist und die Pflanze wachsen gelassen werden kann. In diesem Fall wird der letale Phänotyp beobachtet, wenn der Promoter zum Exprimieren induziert wird. Keine Anwendung einer externen Substanz ist nötig.
  • Zusätzlich zu den nachstehend beschriebenen Genen, kann der Fachmann leicht ein Gen, das ein Kandidat für Letalität in Pflanzen ist, untersuchen. Zudem kann das Gen dahingehend untersucht werden, dass gesehen werden kann ob es alleine verwendet werden kann oder ob ein regulierbarer möglicherweise heterologer Promoter nötig ist, um einen bedingt letalen Phänotyp zu induzieren.
  • Beispiele von bedingt letalen Genen, die für die vorliegende Erfindung nützlich und Anwendungen für die molekulare Landwirtschaft sind, aber sind nicht beschränkt sind auf: Ein Oncogen, wie Oncogen 4, das das Enzym Isopentyltransferase kodiert, das eine Überproduktion von Cytokinin verursacht, mit einem chemisch induzierbaren Promoter, wie dem Promoter des Glutathion-S-transferase II- Gens, das über N,N-Diallyl-2,2-dichloracetamid und ähnliche Verbindungen induziert werden kann (WO 9301294; Albertsen, M. C. et al., US 5 478 369 ); oder ein Oncogen unter der Kontrolle eines kalt induzierbaren Promoters wie beispielsweise den Niedrigtemperatur-induzierten Genen von Arabidopsis (Baker et al., Plant Molecular Biology 24, 701–713, 1994; Lang und Pulva, Plant Molecular Biology, 20, 951–962, 1992; Nordin et al., Plant Molecular Biology, 21, 641–653, 1993;) oder Brassica (White et al., Plant Physiology, 106, 917–928, 1994). Andere nützliche bedingt letale Gene sind solche, die eine nicht toxische Substanz in eine toxische Substanz konvertieren, beispielsweise Gene für das Enzym Methoxinindehydrogenase, welches 2-Amino-4-methoxybutansäure (Methoxinin) in toxisches Methoxyvinylglycin konvertiert (Margraff, R., et al., Experimentia 36, 846, 1980); das Enzym Rhizobitoxinsynthase, das nicht toxisches Methoxinin in toxische 2-Amino-4-[2-amino-3-hydroxypropyl]-trans-3-butansäure (Rhizobitoxin) konvertiert (Owens, L. D., et al., Weed Science, 21, 63–66, 1973); und das Enzym Phosphonatmonoesterhydrolase, das nicht toxische Derivate der Herbizidglyphosate in phytotoxische Glyphosatverbindungen hydrolisieren kann (Dotson, S. B. und Kishore, G. M., US 5 254 801 ).
  • Bedingt letale Genprodukte, die auf Substanzen, die normalerweise nicht in Pflanzen gefunden werden, einwirken, können reguliert werden von einem oder mehreren: ihrer nativen Promotoren, einem induzierbaren Promoter oder einem konstitutivem Promoter. Bedingt letale Genprodukte, die auf Substanzen, die normalerweise in Pflanzen gefunden werden, einwirken, sollten vorzugsweise durch induzierbare Promotoren reguliert werden, so dass sie lediglich unter bestimmten Umständen aktiv sind, wie es von der Wirkung des Promotors, letal für eine Pflanze zu sein, festgelegt wird. Viele induzierbare Promotoren sind bekannt, ebenso wie Screeningverfahren zur Identifizierung geeigneter Promotoren. Der geeignete Promoter kann in allen oder spezifischen Zelltypen aktiv sein und/oder umweltreguliert. Viele verschiedene Arten von zell- oder gewebespezifischen und umweltregulierten Promotoren wurden in der Literatur beschrieben (Z.B. Rocha-Sosa et al., US 5 436 393 ; Allen und Lonsdale, US 5 412 085 ; Coruzzi et al., US 5 391 725 ; Conklin und Yamamoto, US 5 459 252 ) und diejenigen, die für das Merkmal von gewerblichem Interesse dienlich sind, können bei Ausübung der vorliegenden Erfindung ausgewählt und eingesetzt werden. Jedoch muss verstanden werden, dass jeder Promoter, der genügend Expressionslevel bereitstellt, um einen Zelltod in der transformierten Pflanze zu bewirken, zum Einsatz in der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Promotoren, die eine große Anzahl von Expressionsleveln entweder während längerer Zeitabschnitte oder wenn und wo sie benötigt werden bereitstellen, sind bevorzugt.
  • Entsprechend ist in einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein bedingt letales Gen mit einem Gen verknüpft, das ein heterologes Protein, das in einer Pflanzenzelle exprimiert werden kann, kodiert. Hierbei kann dieses bedingt letale Gen unter Einwirkung einer spezifischen chemischen Zusammensetzung oder Stress einen letalen Phänotyp exprimieren.
  • Ein bevorzugtes bedingt letales Gen ist Oncogen 2 von dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, das das Enzym Indolacetamidhydrolase (IAMH) kodiert. Beispielsweise ist die DNA-Sequenz von Octopin T-DNA einschließlich der Kodierungsregion und der Promotersequenz von Oncogen 2 in dem US Patent 5 428 147 von Barker et al. offenbart. Das Substrat für IAMH schließt verschiedene Indolamide und verwandte Auxinderivate einschließlich des synthetischen chemischen Naphalenacetamids (NAM) ein. Anwendung von NAM auf Pflanzenzellen, die Oncogen 2 exprimieren, führt zur Herstellung von dem phytotoxischen Agens Naphthalenessigsäure (NAA). Die DNA, die das bedingt letale Gen kodiert, umfasst zudem einen Promoter, der IAMH in Pflanzenzellen in einer Menge exprimiert, die dazu ausreicht, den bedingt letalen Phänotyp zu übertragen. Dieser Promoter kann der für Oncogen 2 native Promoter sein, ein konstitutiver Promoter, wie der Blumenkohlmoasikviruspromoter CaMV35S, oder ein zell- oder gewebespezifischer Promoter.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird Oncogen 2 von Agrobacterium als Teil des Pflanzentransformationsvektors verwendet. Das Vorliegen von Oncogen 2 in dem Pflanzentransformationsvektor bietet viele Vorteile. Diese schließen ein: Die Fähigkeit, subletale Dosen von Auxinindolamiden und verwandten Auxinderivaten zu verwenden, um eine visuelle Veränderung im Phänotyp in Pflanzen, die den Transformationsvektor enthalten, zu bewirken; die Fähigkeit, Indolamide und verwandte Auxinderivate zur Selektion von Pflanzenzellen während des Transformationsprozesses zu verwenden; und die Verwendung von Oncogen 2 als Samenkomponente und Verfahren zum Retten von Embryos, die die Identifikation von den Transformationsvektor enthaltenden transgenen Pflanzen ermöglichen.
  • Die Erfindung stellt ferner Pflanzen oder Zellen bereit, die mit den vorgenannten Konstrukten oder Vektoren transformiert wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Pflanze oder Zelle Brassica. Eine besondere Ausfüh rungsform ist Brassica mit einer veränderten Ölzusammensetzung. Vorzugsweise weist Brassica einen hohen Öl- und niedrigen Linolsäuregehalt auf wie AG019 oder seine Verwandten und Abkömmlinge.
  • Ein Aspekt der Erfindung ist, dass das bedingt letale Gen nützlich zur Kontrolle der Verbreitung neuer Gene ist einschließlich solcher, die in der molekularen Landwirtschaft verwendet werden.
  • In einer Ausführungsform wird eine transgene Pflanze, die ein bedingt letales Gen, wie Oncogen 2, enthält, von einer Wachstumsumgebung durch Anwendung eines chemischen Mittels entfernt, das in Gegenwart des Produkts des bedingt letalen Gens in ein phytotoxisches Mittel konvertiert wird. Das chemische Mittel wird in einer Menge angewandt, die zu einer letalen Menge von Phytotoxin führt. In einer spezifischen Ausführungsform wird Oncogen 2 als bedingt letales Gen verwendet. Das Genprodukt in diesem Fall ist IAMH, das ein Indolamid oder einen verwandten Abkömmling in das Phytotoxin NAA konvertiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Indolamid NAM.
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liefert das bedingt letale Gen, wie beispielsweise Oncogen 2, als visuelle, auswertbare Markierungssubstanz, die die Unterscheidung transgener von nicht transgenen Pflanzen ermöglicht. Das Verfahren beinhaltet die Anwendung eines chemischen Mittels in einer Menge, die, wenn sie von dem exprimierten bedingt letalen Gen konvertiert wird, zu einem sub-letalen Gehalt an Phytotoxin führt. Pflanzen, die das bedingt letale Transgen enthalten, wer den visuell als diejenigen identifiziert, die den sub-letalen Phänotyp aufweisen.
  • Die Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Selektion der transgenen Pflanze, da die Pflanzen, die als transgen identifiziert wurden, sich in Abwesenheit des chemischen Mittels erholen und zu normalen Pflanzen werden. Wie oben beschrieben, ist das chemische Mittel ein Indolamid oder ein verwandtes Derivat, wenn Oncogen 2 als bedingt letales Gen eingesetzt wird. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Indolamid NAM.
  • Die Verwendung eines bedingt letalen Gens wie Oncogen 2 als visuelle Markierungssubstanz ermöglicht es, jedes erwünschte Gen einschließlich solcher, die ein heterologes Protein oder ein „input" oder „output"-Merkmal kodieren, in eine Pflanze zu inkorporieren, auch wenn solch eine Pflanze sich der Transformation widersetzt, wie gewisse Brassica wie A019.
  • Geschlechtliche Kreuzung, gefolgt von visueller Untersuchung der Abkömmlinge in einem frühen Entwicklungsstadium bietet ein geeignetes, zerstörungsfreies nicht biochemisches Mittel zur Identifizierung der transgenen Pflanze. Buchstäblich tausende von Pflanzen können auf einmal gescreent werden. Dieses Verfahren stellt ein kostengünstiges und genaues Mittel zum Aufspüren der Introgression neuer Merkmale innerhalb einer großen Zuchtpopulation bereit. Keine biochemischen Untersuchungen wie GUS-Untersuchungen oder Nukleinsäureanalysen wie PCR sind notwendig. Das Einbringen eines bedingt letalen Gens wie dem Oncogen 2 in Pflanzentransformationsvektoren, die Gene enthalten, die Input- oder Output-Merkmale kodieren, ermöglicht demnach die schnelle Introgression dieser Merkmale in eine Vielzahl von Pflanzenarten.
  • Es wird ein einfaches Verfahren zum Screening transgener Pflanzen, die Oncogen 2 exprimieren, bereitgestellt. Pflanzenpopulationen werden mit dem formulierten Gemisch von Naphthalinacetamid besprüht. Innerhalb von 24 Stunden werden epinastische und offensichtliche visuelle phänotypische Veränderungen bei den transgenen Pflanzen beobachtet. Pflanzen ohne Oncogen 2 werden nicht beeinflusst. Die beeinflussten Pflanzen wurden ausgewählt. Diese erholen sich innerhalb von 72 Stunden und fahren fort zu wachsen und Samen zu bilden. Dieses phänotypische Ansprechen wird auf nachfolgende Generationen übertragen.
  • Die vorliegende Erfindung liefert zudem Oncogen 2 als visuelle, auswertbare Markierungssubstanz, die die Selektion keimender Samen oder Pflanzenembryos, die Oncogen 2 exprimieren, ermöglicht. Das Verfahren beinhaltet die Kultivierung des Samens oder Embryos in einem Medium, enthaltend (a) ein Indolamid oder einen verwandten Abkömmling und (b) einen Auxintransportinhibitor; eine sich anschließende visuelle Identifizierung des keimenden Samens oder Embryos, das den Phänotyp aufweist. Der identifizierte transgene Samen oder Embryo erholt sich leicht bei Übertragung in ein Medium ohne Indolamid oder Auxintransportinhibitor.
  • Die vorliegende Erfindung liefert ferner ein Verfahren zur Selektion einer transgenen Pflanzenzelle während der Transformation. Das Verfahren verwendet ein Oncogen als Teil eines Expressionskonstrukts oder Vektors, der zur Zelltransformation verwendet wird. Sobald der Vektor in die Pflanzenzelle eingedrungen ist, wird die Zelle einer Formulierung ausgesetzt, enthaltend (a) ein geeignetes Derivat eines Pflanzenhormons, welches in Gegenwart des Oncogenexpressionsprodukts zu einem aktiven Hormon wird und (b) einen Auxintransportinhibitor. Nachdem die Zellen zu einem Klumpen wachsen gelassen wurden, wird der Zellklumpen visuell als das identifiziert, was der mit dem aktiven Hormon verknüpfte Phänotyp zeigt. Anschließend lässt man die identifizierte Zellgruppe sich in der Abwesenheit des Hormonderivates erholen und sich auf übliche Weise zu einer gesamten Pflanze regenerieren. Wenn das Oncogen Oncogen 2 ist, dann ist das bevorzugte geeignete Derivat ein Indolamid oder ein verwandter Abkömmling wie NAM und der bevorzugte Inhibitor ist Naphthylphthalamidsäure.
  • Die Anwendung eines Auxintransportinhibitors zusätzlich zu NAM, das von IAMH zu NAA konvertiert wird, verstärkt deutlich den Effekt von NAA. Demnach werden transgene Pflanzenzellen, die ein erwünschtes Merkmal und Oncogen 2 aufweisen, durch Anwendung einer Formulierung identifiziert, die enthält: (a) ein Indolacetamid und verwandte Verbindungen und (b) einen Auxintransportinhibitor.
  • Zahlreiche Auxintransportinhibitoren (Phytotrophine) enthaltend: N-(1-Naphthyl)phthalamidsäure „Naptalam" (NPA); 2,3,5-Triiodbenzoesäure (TIBA), 9-Hydroxyfluoren-9-carboxylsäure (HFCA), Erythrosin, Eosin, Fluorescein, Semicarbazon (SCBs) und Ethephon können verwendet werden. Typische Auxintransportinhibitoren werden in einem Verhältnis von zwischen 10 und 100% der Menge des verwendeten Auxinderivats eingesetzt. In einigen Fällen werden Verhältnisse von 200 bis 400% des Auxintransportinhibitors, bezogen auf das verwendete Auxinderivat, verwendet.
  • Obwohl viele Pflanzen oder Zellen in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, ist in einer bevorzugten Ausführungsform die verwendete Pflanze oder Zelle Brassica. Eine besondere Ausführungsform ist Brassica mit einer veränderten Ölzusammensetzung. Vorzugsweise hat Brassica einen hohen Olein- und niedrigen Linolsäuregehalt, wie AG019 oder seine Verwandten und Abkömmlinge.
  • Brassica-Transformation
  • Zusätzlich wird ein neues Verfahren zum Erhalt von transformiertem Brassica napus offenbart. Das Verfahren ist insbesondere zur Transformation von Sorten nützlich, die sich unter Verwendung bisheriger Methoden als schwierig zu transformieren herausgestellt haben. Insbesondere die Art AG019 und Abkömmlinge hiervon werden bevorzugt.
  • In dieser speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt das betreffende Verfahren zum Erhalt von transformierten Brassica napus AG019 Pflanzen, die Schritte der Transformation, Selektion und Regeneration ein. Das Verfahren kann zur Transformation von Brassica napus AG019-Pflanzen und deren Abkömmlingen mit jedem erwünschten genetischen Material verwendet werden. Das genetische Material wird in einen Transformationsvektor eingebracht, der zum Einsatz in der Agrobacterium Transformation bekanntermaßen geeignet ist.
  • Das Transformationsverfahren schließt Co-Kultivierung von Pflanzenzellen mit einem geeigneten Bakterienstamm von Agrobacterium tumefaciens ein. Bakterienstämme, die zur Brassica-Transformation verwendet worden sind, sind zahlreich und schließen beispielsweise den Stamm GV3101/p MP90 (Konez & Schell, Molecular Gen. Genet., 204, 383–396, 1986), den Stamm LBA4404/pAL4404 (Ooms et al., Plasmid, 7, 15–29, 1992) und den Stamm A281/pEHA105 (Hood et al., Transgenic Res., 2, 208–218, 1983) ein.
  • Das Agrobacterium wird zur Transformation von Brassica-Zellen mit einem ausgewählten genetischen Aufbau verwendet. Die Brassica-Zellen können in jeder Form vorliegen, beispielsweise als Zellen in Kultur oder als Kallus oder als Zellen in Pflanzengewebe, jedoch sind Hypocotyle bevorzugt. Die zu transformierenden Zellen werden vorkultiviert. Bei dieser Behandlung werden die Zellen 3 Tage lang auf ein Regenerationsmedium gebracht. Das Regenerationsmedium enthält Makro- und Mikronährstoffe, Vitamine und Wachstumsregulatoren, die die Triebbildung induzieren.
  • Nach der Vorkultivierungsbehandlung werden die Zellen mit einer Kultur des ausgewählten Agrobacterium-Bakterienstamms zusammengebracht. Die Zellen werden anschließend eine geeignete Zeit lang, vorzugsweise etwa 3 Tage lang, und vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 15°C, auf Co-Kultivierungsmedien gebracht.
  • Nach der Co-Kultivierung werden die Zellen 7 Tage lang auf Kallus- und Erholungsmedien übertragen. Die Explanate werden anschließend auf ein Selektionsmedium, das Makro- und Mikronährstoffe, Vitamine und die Triebbildung induzierende Wachstumsregulatoren enthält gebracht. Das Selektionsmedium enthält ferner ein Bacteriozid, beispielsweise Carbenicillin. Vorzugsweise enthält es außerdem ein Selektionsmittel. Die Zellen werden auf dem Selektionsmedium bis zur Bildung von Trieben (Putativtransformanten) wachsen gelassen. Im Falle einer Transformation von Bras sica napus mit veränderten Ölprofilen, steigert die Zugabe des Hormons NAA zu diesem Kallus- und Erholungsmedium deutlich die Bildung transgener Triebe. Um die Regeneration zu steigern, werden zur Aufzufrischung des Selektionsmediums alle sich entwickelnde Triebe auf eine normale Grundlage übertragen. Die Pflänzchen werden auf ein Triebverlängerungsmedium und anschließend auf ein Wurzelbildungsmedium gebracht.
  • Das oben beschriebene Verfahren zum Erhalt transformierter Brassica-Pflanzen hat sich als besonders nützlich für Brassica napus AG019-Arten erwiesen.
  • Die unten genannten Beispiele dienen dem Zweck der Illustration und sollen den Schutzbereich der Erfindung in keiner Weise einschränken.
  • Beispiel 1: Neues Brassica-Transformationsverfahren
  • Das unten beschriebene Verfahren erlaubt eine zweckdienliche Transformation von Brassica napus, insbesondere der Brassica napus Art AG019 und deren Abkömmlingen. Für alle Schritte des AG019-Transformationsprotokolls werden die folgenden Gewebekultur(TC)-Bedingungen verwendet: 22 +/– 1°C in einem 16 h Licht und 8 h Dunkelheitszyklus mit einer Lichtintensität von 100 microE/m2/s.
  • Die Samen werden 10 s lang in 100%igem Ethanol oberflächlich sterilisiert. Im Anschluss an das Ethanolbad werden die Samen auf 100%iges Javex (5,64% w/v Natriumhypochlorit) + 0,1% Tween 20 (v/v) 10 min lang übertragen, gefolgt von einem zusätzlichen 10minütigem Bad in 100% Javex plus 0,1% Tween 20 (v/v). Die Oberflächen-sterilisierten Samen werden anschließend mit etwa 800 mL sterilem Wasser gewaschen. Die Oberflächen-sterilisierten Samen werden auf halbe Dicke MMOM (Murashige minimal Organics medium), 1% (w/v) Sucrose, 0,8% (w/v) Agar bei pH 5,8 plattiert. Die Oberflächen-sterilisierten Samen werden 5 bis 7 Tage lang unter den oben beschriebenen TC-Bedingungen inkubiert.
  • Eine einzelne Kolonie von Agrobacterium, die das Pflanzentransformationsvektorkonstrukt enthält, wird zu dem AB-Minimalmedium (Watson et al., 1975) 48 Stunden lang bei 28°C übertragen, was eine Dichte von etwa 6 × 10*8* cfu/mL liefert. Von den gekeimten Samen werden Hypocotyle geerntet und in das Vorkulturmedium (MMOM, 3% (w/v) Sucrose, 5,0 mg/L BAP, 0,7% (w/v) Agar und NAA 0,1 mg/L, pH 5,8) übertragen und 3 Tage lang unter den oben beschriebenen TC-Bedingungen inkubiert. Die Hypocotylexplanate werden anschließend von dem Vorkulturmedium zu dem AB-Minimalmedium, das den interessierenden Agrobacterium-Stamm enthält, übertragen und mindestens 2 min. lang inkubiert. Die Hypcotylgewebe werden anschließend zurück auf das Vorkulturmedium plattiert und 3 Tage lang unter den oben beschriebenen TC-Bedingungen inkubiert.
  • Im Anschluss an die Co-Kultivation werden die Hypocotylgewebe zu dem Kallus/Erholungsmedium (MMOM, 3% (w/v) Sucrose, 5,0 mg/L BAP, 0,1 mg/L NAA 0,7% (w/v) Agar, pH 7,5 plus 300 mg/L Timentin) übertragen und unter den oben beschriebenen TC-Bedingungen inkubiert, um das Agrobacterium zu eliminieren und Kallusbildung und Regeneration der Hypocotylgewebe zu ermöglichen. Es sollte beachtet werden, dass dieser Schritt die Zugabe des Hormons NAA umfasst, was die Erholung der transgenen Triebe deutlich erleichtert. Im Anschluss an die Kallusbildung/Regeneration werden die Hypocotylgewebe in das Triebinduktionsme dium (MMOM, 3% (w/v) Saccharose, 4,5 mg/L BAP, 0,7% (w/v) Agar, pH 5,8 plus 300 mg/L Timentin, 5,0 mg/L Silbernitrat und gegebenenfalls ein Selektionsmittel wie Kanamycin übertragen) und etwa 4 Wochen lang unter den oben beschriebenen TC-Bedingungen inkubiert, um die Triebbildung zu induzieren. Nach 4 Wochen Inkubation auf dem Triebinkubationsmedium werden die grünen Triebe und Kallusse auf das Triebverlängerungsmedium übertragen, welches MMOM enthält, 3% (w/v) Sucrose und 0,7% (w/v) Agar plus 300 mg/l Timentin, plus einem Selektionsmittel bei pH 5,8. Die grünen Triebe und Kallusse werden weitere 4 Wochen unter Verwendung der oben beschriebenen TC-Bedingungen inkubiert. Die grünen Triebe werden von dem Triebverlängerungsmedium zu dem Wurzelbildungsmedium (MMOM, 3% (w/v) Saccharose und 0,7% (w/v) Agar; 0,1 mg/L NAA oder IBA; pH 7,5) übertragen und weitere 4 Wochen lang inkubiert, bis sich Wurzeln zur Übertragung in den Boden gebildet haben. Im Anschluss an die Wurzelbildung werden die Pflänzchen in den Boden übertragen und unter Gewächshausbedingungen wachsen gelassen.
  • Beispiel 2: Konstruktionen eines neuen Pflanzentransformationsvektors, umfassend ein bedingt letales Gen (Oncogen 2)
  • sNeue Pflanzentransformationsvektoren, die das Oncogen 2 von Agrobacterium als bedingt letales Gen enthalten, werden wie in diesem Beispiel und in den Beispielen 3 bis 7 beschrieben konstruiert. Diese Vektoren ermöglichen es, Pflanzen, die mit ihnen transformiert werden, selektiv von einer Population untransformierter Pflanzen zu entfernen. Solche Merkmale, wie sie von diesen Vektoren übertragen werden, finden sich nicht in Vektoren, die rou tinemäßig zur Herstellung transgener Brassica-Pflanzen verwendet werden.
  • Der Vektor wird dadurch hergestellt, dass zunächst das bedingt letale Oncogen 2 von dem Agrobacterium tumefaciens-Bakterienstamm A248 mittels PCR isoliert wird und Schnittstellen am 5' und 3' Ende des Gens eingebracht werden. Eine DNA-Kodierungssequenz wurde zusammen mit der nativen Promotor- und der Terminatorsequenz von dem Plasmid PTiA6 von der Genbank (Zugangs-Nr. X00409) erhalten.
  • Die gesamte DNA wurde von dem Agrobacterium tumefaciens-Bakterienstamm A248 extrahiert. Ein 2.3 Kb PCR-Produkt, das sich von der Hind III-Schnittstelle nahe dem 5'-Ende des Oncogens 1 (IAA-M) über die ganze Länge des bidirektionalen Promoters über die mit seinem Terminator endende Kodierungsregion des Oncogens 2 (IAA-H) erstreckt, wurde in einem Ti-Plasmid pTiA6 amplifiziert. Die verwendeten Primer pr8349 und pr7495 wurden unter Verwendung der veröffentlichten Sequenz des Oncogens 2 (GenBank-Zugangs-Nr. X00409) aufgebaut. Um das Klonieren des Produkts zu erleichtern, haben die 5' Extensionen auf den insertierten Primern, drei Schnittstellen XbaI, Pst I und Kpn I am 5' Ende und eine BamHI-Schnittstelle am 3' Ende des sich ergebenden PCR-Produkts insertiert.
  • Figure 00430001
  • Figure 00440001
  • Die gesamte DNA des Agrobacterium-Bakterienstamms A248 wird in einer PCR-Reaktion enthaltend 0,1 μg Templat DNA, 5 Einheiten (1 μL) TaqPlus DNA-Polymerase von Stratagen (San Diego, Californien), 10 μl Extend Tag Puffer (Stratagen), 0,5 U (0,2 μl) Pfu DNA-Polymerase (Stratagen), 8 μl 2,5 mM dNTPs, 5 μM Primer (jeweils 2,5 μl) und 21,2 μl Wasser verwendet. Die Reaktion wird bei 94°C 2 Minuten lang initiiert, anschließend werden 35 Zyklen von: 94°C 30 Sekunden lang, 55°C 30 Sekunden lang, 72°C 2 Minuten lang durchgeführt. Im Anschluss an die Zyklen wird die Reaktion 7 Minuten lang bei 72°C gehalten und die DNA wird isoliert.
  • Ein 1,8 Kb Produkt wird erhalten, welches über Restriktionsanalyse als authentisches Oncogen 2 verifiziert wurde.
  • Das PCR-Produkt wurde mit XbaI und Bam HI verdaut und mit den entsprechenden Bereichen des Plasmids pHS723 ligiert (Hirji, R., Hammerlindl, J. K. Woytowich, A. E., Khachatourian, G. G., Datla, R. S. S., Keller, W. A., Selveraj, G. (1996) Plasmid pHS723 and its derivatives: plant transformation vectors that enable efficient selection and progeny analysis; Fourth Canadian Plant Tissue Culture and Genetic Engineering Conference, Saskatoon, Saskatchewan, Canada), wobei pJH121 erhalten wird. Der erhaltene Vektor wurde auf den Agrobacterium-Bakterienstamm GV3101:pMP90 übertragen und in Co-Kultivierungsexperimenten zur Herstellung transformierter Pflanzen, die Oncogen 2 exprimieren, eingesetzt. Der Vek tor überträgt außerdem Kanamycin-Widerstandskraft und GUS-Aktivität zum Screenen von transgenen Substanzen. Die Derivation von pJH121 ist in 1 dargestellt.
  • Beispiel 3: Konstruktion des Pflanzentransformationsvektors pJH122
  • Ein Pflanzenransformationsvektor enthaltend Oncogen 2 und eine Kanamycin-Resistenz-Markierungssubstanz wurde wie folgt hergestellt: Das Plasmid pJH121 wurde zunächst mit Xba I und anschließend mit BamHI digeriert, um die 2,3 Kb Oncogen 2-Kodierungsregion und den Terminator, der von seinem nativen Promoter in voller Länge gesteuert wird, herauszuschneiden. Das Fragment wurde über ein Gel gereinigt und elektroeluiert. Der binäre Pflanzentransformationsvektor pRD400 wurde auf ähnliche Weise mit Xba I und Bam HI digeriert. Das Plasmid pRD400 ist identisch zu pBIN 19 mit Ausnahme eines einzigen Basenpaares, welches in dem Neomycinphosphotransferasegen verändert wurde, um die Expression der wählbaren Markierungssubstanz zu erhöhen (Datla et al., Gene 122, 383–384, 1992). Die elektroeluierte Oncogen-Kassette wurde mit den entsprechenden Bereichen des Vektors ligiert. Das erhaltene Plasmid pJH122 wurde über „triparental Mating" in den Agrobacterium-Bakterienstamm GV3101::pMP90 zur Transformation auf Pflanzen übertragen. Die Derivation von pJH122 wird in 2 dargestellt.
  • Beispiel 4: Konstruktion des Pflanzentransformationsvektors pJH123
  • Ein Pflanzentransformationsvektor, enthaltend ein bedingt letales Gen und ein Gen, das ein zur Expression in Pflan zenzellen befähigtes heterologes Protein kodiert, wurde hergestellt. In diesem Beispiel wurde das bedingt letale Oncogen 2 mit einem heterologen Gen, das ein Fusionsprotein kodiert, verknüpft. Die Fusion findet in diesem Falle zwischen dem Oleosin-Gen und dem beta-Glucuronidase-Gen unter Kontrolle des Oleosin-Promotors in dem Plasmid SBS 2002 statt. Das Plasmid SBS 2002 ist ein Pflanzentransformationsvektor, der eine 3,8 kb-Kassette enthält, bestehend aus einem Arabidopsis-Oleosin-Promoter und einer Kodierungsregion, welche translational mit der beta-Glucuronidase kodierenden Region verknüpft ist und in dem Nopalin-Synthase-Terminator endet. Die Kassette ist wesentlich, da sie in pCGYOBPGUSA erscheint, wie in van Rooijen und Moloney (Struktural requirements of oleosin domains for subcellular targenting to the oil body und Plant Physiology 109 (1995), 1353–1361) beschrieben. Das Plasmid SBS2002 wurde mit Pst I verdaut und die Fragmente auf Agarose-Gel separiert. Die 3,8 kb Oleosin-GUS-NOS ter.-Kassette wurde elektroeluiert und mit Pst I – Bgl II-Adaptern verknüpft. Die Adapter wurden phosphoryliert an dem Pst I-Ende, aber nicht an dem Bgl II-Ende. Das erhaltene Produkt wurde anschließend in den Bgl II-Schnittstellen über eine Kinase-Reaktion phosphoryliert. Der Pflanzentransformationsvektor pJH122, wie er in Beispiel 3 beschrieben wurde, wurde mit Bam HI verdaut und dephosphoryliert. Das kinasierte Oleosin-GUS-Fragment wurde anschließend mit den Bam HI-Bereichen des Vektors in Gegenwart des Bam HI-Ezyms verknüpft. Lediglich die Bam/Bgl-Verknüpfungen überstehen die Transformation in E.coli.
  • Der fertige Vektor pJH123 wurde über „triparental Mating" für Pflanzentransformationen auf den Agrobacterium-Bakterienstamm GV3101:pMP90 übertragen. Der Vektor über trägt Kanamycinresistenz zur Selektion und Expression von Oncogen 2 auf transformierte Gewebe und Pflanzen. Zusätzlich ermöglicht die Oleosin-GUS-Kassette die Expression von auf die Ölkörper von Samen gerichtete Glucuronidaseaktivität (van Rooijen und Moloney, 1995). Die Derivation von pJH123 wird in 3 dargestellt.
  • Beispiel 5: Konstruktion des Pflanzentransformationsvektors pJH125.
  • Die Region, die sich von dem translationalen Startcodon der Kodierungsregion von Oncogen 2 bis hin zu seinem Terminator erstreckt, wurde über PCR von dem Ti-Plasmid pTiA6, das aus der gesamten DNA des Agrobacterium tumefaciens-Bakterienstamms A248 extrahiert worden war, amplifiziert. Die verwendeten Primer pr10109 und pr7495 wurden unter Verwendung der veröffentlichten Sequenz von Oncogen 2 aufgebaut (GenBank Zugangsnummer X00409). Um das Klonieren des Produktes zu erleichtern, haben die 5' Extensionen auf den Primern zwei Schnittstellen, nämlich XbaI und NcoI an dem 5' Ende und einen BamHI-Bereich an das 3'Ende des erhaltenen PCR-Produkts insertiert.
  • Figure 00470001
  • Das PCR-Produkt wurde mit XbaI und Bam HI verdaut und mit den entsprechenden Bereichen des Plasmids p355-35S-NOS verknüpft. Das Plasmid p35S-35s-NOS umfasst ein 600 bp-Fragment, bestehend aus dem 35S Blumenkohlmosaikpromoter mit duplizierter Enhancer-Sequenz (Kay, R., Chan, A., Daly, M., and McPherson, J., Duplication of CaMV 35S Promoter sequences creates a strong enhancer for plant genes. Science, 236 (1987) 1299–1302) und dem NOS-Terminator. Das Promoter-Terminatorfragment ist in dem üblichen Klonierungsvektor pTZ17R enthalten und wurde von Dr. Raju Datla (Plant Biotechnology Institute National Research Council of Canada, 110 Gymnasium Road, Saskatoon, Saskatchewan, S7N 0W9) bekommen, wobei pJH124 erhalten wird. Die 2300 bp Promoter-Oncogen-Kassette wurde aus pJH124 als HindIII bis BamHI-Fragment isoliert und mit den korrespondierenden Schnittstellen der Vielfach-Klonierungsschnittstelle des binären Pflanzentransformationsvektors pRD400 verknüpft, um den Pflanzentransformationsvektor pJH125 abzuleiten. Der Vektor wurde auf den Agrobacterium-Bakterienstamm GV3101:pMP90 übertragen und in Co-Kultivierung mit Explanaten zur Herstellung transformierter Pflanzen, die Oncogen 2 exprimieren, eingesetzt. Die Herkunft von pJH125 wird in 4 dargestellt.
  • Beispiel 6: Herstellung des Pflanzentransformationsvektors pJH126.
  • Die Oleosin-GUS-Kassette von pSBS 2002 wurde wie für die Herstellung von pJH123 beschrieben isoliert, verknüpft und kinasiert. Der Pflanzentransformationsvektor pJH126 (bestehend aus pRD400, enthaltend die Oncogen 2- Kodierungsregion und einen Terminator, der von dem 355-35S-Promoter gesteuert wird) wurde mit BamHI digeriert und dephosphoryliert. Das kinasierte Oleosin-GUS-Fragment wurde anschließend in Gegenwart von BA HI Enzym wie für pJH123 beschrieben mit den dephosphorylierten BamHI-Bereichen des Vektors ligiert.
  • Der fertige Vektor pJH126 wurde über „triparental Mating auf den Agrobakteriumstamm GV3101::pMP90 für Pflanzentransformationen übertragen. Der Vektor überträgt auf transformiertes Gewebe und Pflanzen Kanamycin-Widerstandskraft für die Selektion und die Expression von Oncogen 2. Zusätzlich stellt die Oleosin-GUS-Kassette die Expression von auf den Ölkörper von Samen gerichtete Glucuronidase-Aktivität bereit. Die Abstammung von pJH126 wird in 5 dargestellt.
  • Beispiel 7: Konstruktion des Pflanzentransformationsvektors pJH130.
  • Die 2300 bp 35S-35S Promoter-Oncogen-Kassette wurde als HindIII bis BamHI-Fragment von pJH124 isoliert und in die entsprechenden Bereiche des Pflanzentransformationsvektors pHS723 kloniert, um das Plasmid pJH130 herzustellen. Der Gerüstvektor pHS723 exprimiert ein GUS/NPT-Fusionsprotein, welches die Selektion transformierter Zellen, Pflanzen und deren Abkömmlinge anhand der Kanamycin-Widerstandskraft ermöglicht und das leichte Screening von transformiertem Gewebe anhand der Expression von Glucuronidase-Aktivität. Mit der eingeführten Oncogen-Kassette exprimieren die Zellen, Pflanzen und deren Abkömmlinge ebenfalls zusätzlich das Oncogen 2-Genprodukt. Der Aufbau von PJH130 wird in 6 gezeigt.
  • Beispiel 8: Analyse von transformierten Tabakpflanzen enthaltend den Vektor pJH121.
  • Transformierte Tabakpflanzen, die das oben beschriebene pJH121-Konstrukt enthalten, werden erhalten und unter Verwendung einer Standardanalyse getestet, um das Vorliegen des eingebrachten Vektors festzustellen. Abgesicherte Transformanten werden ausgewählt und eine representative Anzahl von Pflanzen wird mit NAM behandelt, um den bedingt letalen Phänotyp wie folgt aufzuzeigen. Eine Lösung, enthaltend 200 μg/ml NAM mit 0,1% Tween 20 wird hergestellt. Die Pflanzen werden unter Verwendung eines Druckzerstäubers tropfnass gesprüht. Bei Pflanzen, die den bedingt letalen Phänotyp exprimieren, hängen zwei Tage nach dem Besprühen die Blätter herab und die Blattränder kräuseln sich. Innerhalb von fünf Tagen verdrehen sich die Blätter und die Pflanze zeigt die typische Auxintoxizität. Nicht transformierte Pflanzen werden von der Behandlung nicht beeinflusst.
  • Samen der transformierten Pflanzen werden gesammelt und in Gegenwart von NAM zum Keimen gebracht, um die Samenexpression des bedingt letalen Phänotyps zu bestätigen.
  • Beispiel 9: Analyse transformierter Brassica napus Pflanzen, die den Vektor pJH121 enthalten.
  • Transformierte Brassica napus Pflanzen, die das oben beschriebene pJH121 Konstrukt enthalten, werden regeneriert und unter Verwendung einer Standardanalyse getestet, um das Vorhandensein des eingebrachten Vektors zu bestätigen. Abgesicherte Transformanten werden ausgewählt und eine repräsentative Anzahl von Pflanzen im 3–4-Blätter-Wachstumsstadium mit NAM behandelt, um den bedingt letalen Phänotyp wie folgt zu beweisen. Eine Lösung, die 200 μg/ml NAM mit 0,1% Tween 20 enthält, wird hergestellt. Die Pflanzen werden unter Verwendung eines Druckzerstäubers tropfnass gesprüht. Bei den Pflanzen, die den bedingt letalen Phänotyp exprimierten, verblieben die transgenen Pflanzen 25 Tage nach dem Besprühen wachstumsverkrüppelt, während die nicht transgenen Arten normal aufwuchsen und blühten.
  • Von den transgenen Pflanzen wurden Samen gesammelt und in Anwesenheit von NAM zum Keimen gebracht, um die Samenexpression des bedingt letalen Phänotyps zu bestätigen.
  • Beispiel 10: Analyse von transformiertem Brassica napus enthaltend den Vektor pJH125.
  • Transformierte Brassica napus Pflanzen, die das oben beschriebene Konstrukt pJH125 (35S Oncogen 2) enthalten, werden regeneriert und unter Verwendung einer Standardanalyse getestet, um das Vorhandensein des insertierten Vektors zu ermitteln. Abgesicherte Transformanten werden selektiert und eine repräsentative Anzahl von Pflanzen wird mit NAM behandelt, um den bedingt letalen Phänotyp wie folgt nachzuweisen. Es wird eine Lösung enthaltend 200 μg/ml von NAM mit 0,1% Tween 20 hergestellt. Unter Verwendung eines Druckzerstäubers werden die Pflanzen tropfnass gesprüht. Bei Pflanzen, die den bedingt letalen Phänotyp exprimieren, hängen die Blätter zwei Tage nach dem Besprühen herab und die Blattränder kringeln sich. Innerhalb von 5 Tagen verdrehen sich die Blätter und die Pflanze zeigt typische Auxintoxizität. Nicht transfor mierte Pflanzen werden von der Behandlung nicht beeinflusst.
  • Beispiel 11: Demonstration von Oncogen 2 als positive, wählbare, auswertbare Markierungssubstanz in Zuchtprogrammen.
  • Oncogen 2 kann, wenn es mit dem interessierenden transgenen Merkmal verknüpft ist, als positive, wählbare und auswertbare Markierungssubstanz bei der Transformation, Ereigniskonversion und in konventionellen Zuchtstrategien als einfache visuelle Markierungssubstanz zum Aufspüren der interessierenden Genmerkmale verwendet werden. Die Möglichkeit, die Pflanzen in einer Eventkonversion (Rückkreuzung, Introgression) und konventionellen Zuchtprogrammen zu selektieren, verringert die Zeit und analytischen Aufwand (ELISA; PCR; Southern Blot Analysis, etc.), der zur Identifizierung des Abkömmlings, der das interessierende Transgen über Kreuzungen zwischen dem transgenen Ereignis und dem agronomischen Ausleseprotoplasma erhalten hat, benötigt wird. Zudem verringert die schnelle visuelle Selektion in einem Zuchtprogramm die Gewebeprobehandhabung und die Erhaltung nicht-transgener Pflanzen in sich aufspaltenden Populationen, die in dem Zuchtprogramm nicht von Interesse sind, bis die Ergebnisse der analytischen Analyse von dem Labor erhältlich sind.
  • In diesem Beispiel werden 20 Pflanzen der JH 2984 und JH 2973 Transformationsevente gepflanzt. Diese transgenen Arten wurden im Verhältnis 3:1 hinsichtlich des eingebrachten Pflanzentransformationsvektors pJH 125 segregiert. NAM wurde in einem Verhältnis von 1 mg/ml im 2–3- Blätter-Stadium angewandt. 24 Stunden nach Anwendung von NAM wurden die Pflanzen nach visuellem Phänotyp beurteilt. Ausgehend von der visuellen Erscheinung der verdrehten Blätter wurde eine Zufallsauswahl von 8 Pflanzen als möglicherweise transgen seiend getroffen, 4 wurden als nicht transgen ausgewählt. Diese Pflanzen wurden über PCR-Analyse auf das Vorliegen des Transformationsvektors hin untersucht. Alle 8 vermeintlich transgenen Pflanzen wurden als Träger des Transformationsvektors über PCR bestätigt, während alle 4 der vermeintlichen „Nullen" oder nicht transgenen Pflanzen über PCR sich als nicht transgen erwiesen. Demnach wird die schnelle und zuverlässige Verwendung von Oncogen 2 als auswählbare Markierungssubstanz zur Identifizierung transgener Arten innerhalb segregierter Population (z.B. wie Zuchtprogrammen oder während der Introgression) nachgewiesen.
  • Beispiel 12: Verwendung des bedingt letalen Oncogens 2 als auswählbare Markierungssubstanz im Embryo und der Samenkeimung.
  • Oncogen 2 kann als auswählbare Markierungssubstanz bei der Samenkeimung und Embryogewinnung bei in vitro Untersuchungen verwendet werden, wobei ein noch früheres Ermitteln des Vorliegens des Transformationsvektors in sich aufspaltenden Populationen ermöglicht wird. Samen oder Embryos der transgenen Pflanzen, die pJH 125 enthalten, können, wenn sie auf einem Medium, das NAM und einen Auxintransportinhibitor enthält, kultiviert werden, visuell auf Basis des Phänotyps selektiert werden, wenn sie mit nicht transformierten Setzlingen verglichen werden. Die in vitro Untersuchung verringert die Zeit und den physischen Platz (z.B. die Anzahl der Pflanzen in den Wachs tumszimmern oder in Kultivierung), die benötigt wird, um homozygote transgene Linien zu identifizieren und das Embryo-Rescue-Verfahren ermöglicht die Selektion und das Erhalten transformierter Setzlinge, was von Generation zu Generation die Zykluszeit eines Zuchtprogramms verringert.
  • In diesem Beispiel werden Samen von JH2973 und JH2984, die eine segregierte Population für den Transformationsvektor pJH125 darstellen, in vitro in Gegenwart von NAM und dem Auxintransportinhibitor Naphthylphthalamidsäure (NPA) keimen gelassen. Transgene Setzlinge werden auf Basis des Phänotyps, der verkrüppelte Setzlinge, kleine Cotyledone, verkrüppelte und geschwollene Wurzeln und Gallusse an der Kontaktstelle von Wurzeln/Trieben aufweist, ausgewählt. Nicht transformierte Segreganten wuchsen normal. Wenn die vermeintlich transgenen Setzlinge auf nicht selektives Medium übertragen wurden, erholten sich die Pflanzen und wuchsen normal. Die Anwesenheit des Transformationsvektors in diesen Pflanzen wurde wie oben bestätigt.
  • Es ist offensichtlich, dass bei Brassica napus die Verwendung der Mikrosporenkultur zur Herstellung von Embryos, die von Mikrosporen abstammen, in Verbindung mit der Verwendung von Oncogen 2 als auswertbare Markierungssubstanz ein geeignetes Mittel zum Erhalt homozygoter transgener Linien darstellt.
  • Beispiel 13: Verwendung von Oncogen 2 als auswählbare Markierungssubstanz während der Transformation von Brassica napus.
  • Das Transformationsprotokoll aus Beispiel 1 kann modifiziert werden, um die Verwendung von Oncogen 2 in dem Verfahren zu ermöglichen. Insbesondere benötigt das Transformationsprotokoll, das in Beispiel 1 dargestellt ist, ein Behandeln der Vor-Kultur mit NAA, Co-Kultivierung, Kallussenbildung/Gewinnung und Wurzelbildungsphasen, um transgene Arten von AG019 und deren Abkömmlinge erfolgreich zu erhalten. Ersatz von NAA durch NAM während der siebentägigen Kallussbildungs- und Inkubationsperiode stellt in den Fällen, wo Oncogen 2 in dem Transformationsvektor enthalten ist, ein geeignetes Mittel zum Beschleunigen des Wachstums der transgenen Pflanzenzellen dar sowie ein positives Selektionsverfahren für das Erhalten transgener Brassica bereit. Das Medium wird mit NAM anstelle von NAA hergestellt und enthält typischerweise einen Auxintransportinhibitor in einem Verhältnis von 1:2 bis 2:1 (NAM:Auxintransportinhibitor).
  • Veränderungen der vorangehenden spezifischen Ausführungsformen werden dem Fachmann bei Ausführung der Lehren dieser Erfindung offenkundig sein. Es ist beabsichtigt, dass alle diese Modifikationen durch die hier zugehörigen Ansprüche abgedeckt sind.
  • SEQUENCE LISTING
    Figure 00560001
  • Figure 00570001

Claims (15)

  1. Genetisches Konstrukt mit einem bedingt letalen ersten Gen, das in einer Pflanzenzelle einer Pflanze exprimierbar ist, und einem zweiten Gen, das in der Pflanzenzelle exprimierbar ist, wobei das zweite Gen, wenn es in der Pflanzenzelle exprimiert wird, der Pflanzenzelle eine interessierende, nicht natürlich auftretende Eigenschaft verleiht und wobei das zweite Gen aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (a) einem Gen, das ein pharmazeutisches Produkt codiert, (b) einem Gen, das ein industriell verwendbares Enzym codiert, (c) einem Gen, das Rennin und/oder Hirudin codiert, und (d) einem Gen, das ein Input- oder Output-Merkmal codiert.
  2. Genetisches Konstrukt nach Anspruch 1, wobei das zweite Gen ein Gen ist, das ein pharmazeutisches Produkt codiert.
  3. Genetisches Konstrukt nach Anspruch 1, wobei das zweite Gen ein Gen ist, das ein industriell verwendbares Enzym codiert.
  4. Genetisches Konstrukt nach Anspruch 3, wobei das industriell verwendbare Enzym aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Proteasen, die von mikrobiellen Quellen abgeleitet sind, Stärke- oder Kohlenhydratenzymen, die von mikrobiellen Quellen abgeleitet sind, vorzugsweise alpha-Amylasen, Glukoseoxidasen, Zellulasen, Hemizellulasen, Xylanasen, Mannanasen oder Pektinasen, Ligninasen, Peroxidasen, Phosphatasen, Oxidoreduktasen und Phytasen.
  5. Genetisches Konstrukt nach Anspruch 1, wobei das zweite Gen ein Gen ist, das Rennin und/oder Hirudin codiert.
  6. Genetisches Konstrukt nach Anspruch 1, wobei das zweite Gen ein Gen ist, das ein Input-Merkmal codiert.
  7. Genetisches Konstrukt nach Anspruch 6, wobei das Input-Merkmal aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus erhöhter Resistenz gegen Schädlinge, erhöhter Resistenz gegen Krankheit, erhöhter Resistenz gegen Umweltbelastungen und erhöhter Herbizidtoleranz.
  8. Genetisches Konstrukt nach Anspruch 1, wobei das zweite Gen ein Gen ist, das ein Output-Merkmal codiert.
  9. Genetisches Konstrukt nach Anspruch 8, wobei das Output-Merkmal aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus veränderter Ölzusammensetzung, veränderter Schrotzusammensetzung, vermindertem Anti-Ernährungsanteil und veränderten Verarbeitungseigenschaften.
  10. Genetisches Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das bedingt letale Gen aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Onkogen, vorzugsweise Onkogen 2 von Agrobacterium tumefaciens oder Onkogen 4 unter der Kontrolle eines Promotors eines bei niedriger Temperatur induzierbaren Gens von Arabidopsis, einem Gen, das Methoxinin-Dehydrogenase codiert, einem Gen, das Rhizobitoxin-Synthase codiert, und einem Gen, das Phosphonatmonoesterhydrolase codiert, und wobei das genetische Konstrukt vorzugsweise einen induzierbaren Promotor oder einen gewebespezifischen Promotor in funktionsfähiger Verbindung mit dem bedingt letalen ersten Gen umfaßt.
  11. Genetisches Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das bedingt letale Gen dafür angepaßt ist, in der Pflanze unter Ansprechen auf eine chemische oder physiologische Belastung, die auf die Pflanzenzelle angewendet wird, exprimiert zu werden.
  12. Genetisches Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das bedingt letale Gen so gestaltet ist, daß es ein Genprodukt exprimiert, das bei Anwendung einer exogenen Substanz auf die Pflanzenzelle für die spezielle Pflanze letal ist.
  13. Transgene Pflanze mit einem genetischen Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
  14. Verfahren zum selektiven Entfernen von wenigstens einer Pflanze aus einer Wachstumsumgebung, bei dem man ein chemisches Mittel auf eine transgene Pflanze nach Anspruch 13 anwendet, wobei das chemische Mittel so gestaltet ist, daß es von einem oder mehreren Genprodukten des bedingt letalen gens in ein Mittel umgewandelt wird, das für die Pflanze phtotoxisch ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Anwenden des chemischen Mittels das Anwenden dieses chemischen Mittels in einer Menge umfaßt, die so ausgewählt ist, daß sie ein sub-letales Niveau des phytotoxischen Mittels in der Pflanze nach dessen Umwandlung durch das eine oder die mehreren Genprodukte des bedingt letalen Gens bewirkt und das Verfahren weiterhin das visuelle Identifizieren eines sub-letalen Phenotyps der Pflanze umfaßt.
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