CN1219885C

CN1219885C - 转基因植物及其生产方法

Info

Publication number: CN1219885C
Application number: CN99814975.6A
Authority: CN
Inventors: W·A·凯勒; S·F·法比詹斯基; P·G·阿尼森; J·K·哈默林德尔; S·R·韦布
Original assignee: National Research Council of Canada; Dow AgroSciences LLC
Current assignee: National Research Council of Canada; Corteva Agriscience LLC
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2005-09-21
Anticipated expiration: 2019-12-22
Also published as: CA2354185A1; AU1851600A; US6753459B2; US7371935B2; MXPA01006457A; DE69924005T2; CN1331747A; EP1140043A2; EP1140043B1; JP2002532114A; CA2354185C; DE69924005D1; AU776046B2; WO2000037060A2; US20030188329A1; US20050060768A1; ATE289807T1; WO2000037060A3

Abstract

本发明公开了用于生产通过施用化学试剂或生理应激能从生长地点选择性去除的转基因植物之遗传构建体、转化载体和方法。本发明将具有商业意义的性状的靶基因与能选择性表达而导致植物死亡的条件致死基因相连接。利用本发明的遗传构建体、转化载体和方法，能避免环境的侵入和转基因植物对商业非工程生产的污染。也讲述了芸苔属的种的转化方法。

Description

转基因植物及其生产方法

发明领域

本发明涉及转基因植物，特别是适用于利于环境的田间种植的转基因植物，及用于其生产的遗传构建体和载体。本发明也涉及用于方便地筛选和鉴定转基因植物的新型遗传构建体及其后代。本发明还涉及用于生产转基因芸苔属(Brassica)物种的新型载体和转化方法。

背景技术

转基因植物

众所周知，通过重组DNA技术可给予作物种新的和改变的性状(所谓的“新性状”)。为了产生这些具有新性状的作物，需要一种向作物基因组中插入重组DNA的方法。该方法—通常称为转化—在技术上是有吸引力的，并需要在发展培养、转化及完整植物再生方法方面进行大量工作。对于某些物种，转化已成为常规，而对于另一些物种，转化仍十分困难且耗时。然而，经遗传改造而表达新性状的某些作物变种已加入到商业生产线中，另一些也正在为商品化生产进行田间试验。

许多这样的转基因作物变种具有可产生改变的表型的新性状。这些表型包括新组合物、增强的害虫、病害或环境应激抗性，和除草剂耐受性。这种耐受性为农民提供了控制杂草的新方法和新的生产机会。

目前在商业上影响农业特性的许多新性状通称为“输入(input)”性状，即与生产经济学有关的性状。例如，除草剂耐受性是一种输入性状，因为它使农民在控制杂草方面有更多选择；这些新除草剂耐受性一般能降低杂草控制成本。于是生长作物所需的生产经济学或“输入”有利地改变。其他性状如昆虫抗性可通过减少化学杀虫剂的使用而减少农民的花费。

除了输入性状之外，还有改变收获植物的组成或质量的“输出(output)”性状。这些性状影响作物的终产物或“输出”，可能包括改变的油或粉组成，降低的抗营养含量，和具有改变的加工特性的作物。为了发展具有可产生新产物、经济价值和增多的用途的输出性状的作物，已进行了大量努力。

某些性状被归类为高价值“输出”性状。这些性状存在于用于“分子耕作(farming)”以生产具有商业或药学用途的新型蛋白质的作物中。分子耕作非常有希望经济地生产大量商业上有用且有价值的蛋白质。作物在大量生产蛋白质中的应用相比发酵技术而言有许多优点，包括：易于生产；在植物贮藏器官如块茎或种子中合成时产物的稳定性；和回收有价值的副产品如植物的粉、油或淀粉的可能性。

打算通过分子耕作大量生产的蛋白质包括工业酶，例如微生物来源的酶，如蛋白酶、淀粉或碳水化合物修饰酶(例如α淀粉酶、葡萄糖氧化酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶或果胶酶)。另外，已建议在多种作物种中生产在纸浆造纸工业中特别有价值的酶如木质素酶或过氧化物酶。能通过分子耕作生产的在商业或工业上重要的酶的其他例子有磷酸酶、氧化还原酶、肌醇六磷酸酶、凝乳酶和蛭素。有工业价值的酶的数量众多，植物是以预计与发酵相当的成本大量生产这些蛋白质的合适的载体。

另外，分子耕作预期可用于生产和施用疫苗、抗体(Hein，M.B.和Hiatt，A.C.，US 5,202,422)、肽激素(Vandekerckhove，J.S.，US 5,487,991)、血液因子等。可以假设经改造能生产选择的治疗剂的可食用植物能提供一种药物施用方法，该方法是节省成本的，并且特别适用于在农村或不发达国家施用治疗剂。能栽培含有治疗剂的植物材料并掺入到饮食中(Lam，D.M.和Arntzen，C.J.，US 5,484,719)。

总之，作物的新型输入和输出性状范围极广，并能发展大量新产物和方法。因此，生产具有新性状的植物并将最初的转基因植物纳入栽培和变种发展计划的可靠方法是使这些产品商品化的重要工具。

转基因植物生产的一个问题是，转基因事件在植物细胞中回收后，需要进行大量工作来回收形态学正常、能育的植物，以在随后的栽培方案中使用。因而，可简单鉴定已接受转基因的植物的方法是商业化的首要目的。

通过不需要生物化学或比色测定的可靠方法选择或鉴定转基因植物是特别方便的。具有灵活性的方法是特别有价值的，如能在转基因变种发育的任一时间使用的方案。最优选的方法可在培养中筛选，在栽培和渐渗活性中鉴定，以及在田间水平上鉴定和辨别。

与转基因植物的田间种植有关的忧虑

有人提出，由于通过自然选择或通过有性重组一般无法获得的遗传能力的表达，遗传修饰的作物的种植能导致环境损害。进一步提出，种植的转基因植物能通过植物本身的扩散或通过与野生亲属杂交进入自然生态系统。这些问题曾有过广泛争论，并进行了实验来检测转基因植物的持续存活和性状从作物种向野生亲属的转移(例如，加利福尼亚大学，农业生物学的风险评估；国际会议论文集，1990，Casper，R.和Landsman，J.，1992；遗传修饰的植物及微生物田间试验的生物安全结果，第2届国际遗传修饰植物及微生物田间试验生物安全结果研讨会论文集，1992，Goslar，德国，Dale，P.等人，1992；转基因植物的田间种植，英国作物保护协会，Brighton作物保护会议：害虫与病害，第I、II和III卷；第3届国际遗传修饰植物及微生物田间试验生物安全结果研讨会论文集，1994，Monterey，California，Jones，D.D.，1994)。

迄今为止获得的研究与实验结果的一致性支持了转基因向野生亲属潜在扩散的程度高度依赖于物种和环境条件的观点。某些物种可能无法与亲属杂交，而其他物种或许是可能的(Raybould和Grey，J.，应用生态学(Applied Ecology)30：199-219，1993)。任何转化植物能进入其他栖息地的程度，因而环境危险，也依赖于植物种本身。许多作物高度特化并适于非竞争性栽培实践，因而一般不认为它们是严重的环境危险(Dale等人，植物栽培(Plant Breeding)111：1-22，1993；Fishlock，D.，《PROSAMO报告》，Laboratory of the GovernmentChemist，Queens Road，Teddington，Middlesex，UK TW11 OLY出版)。

然而通常认为，可能会有一定的危险—一某些作物、观赏植物或为天然药理学目的栽培的植物可能会成为杂草危害，因为常常为了观赏、烹调或医学原因从另一种环境中同时引入许多目前影响农业生产的杂草种(Keeler，K.H.，生物技术(Biotechnology)7：1134-1139，1989)。

尽管需要多年的研究才能完全了解转基因植物对环境的潜在的影响，但目前可能更严重的问题与具有转基因植物新性状的农业生产的污染有关。直感(Xenia)作用(杂交花粉对种子组成的直接作用)和志愿者或田间保留的种子都能污染随后的农业生产。尽管这些事件在过去不是主要问题，但欲一般消费的作物无意中污染为其他目的开发的不可目视辨别的变种，如含有药学活性蛋白质的作物，已成为特别关注的问题。因此，以简单可靠的方法辨别转基因植物的能力是有价值的。

目前，已利用物理分离结合用作花粉采集器的边行(border rows)获得具有所研究与发展的转基因性状的植物(例如，加拿大农业与农业食品，调控指令94-08；测定具有新性状的植物的环境安全性的评价标准，调控指令94-09；芸苔(Brassica napus L.)(芸苔(Canola)/油籽油菜)的生物学，调控指令95-01；在加拿大田间测试具有新性状的植物)。然而，随着转基因植物的商业生产的增多，商品污染的可能性显著增加。这种潜在的污染已成为油籽油菜工业的主要忧虑，当更多不同的重组基因型到达市场时，这将成为其他主要作物(例如玉米)的重要问题。

商业作物生产污染可影响质量和表现的来自另一栽培品种的性状可能是一个严重问题。然而，由于可能的食品污染，芸苔(或其他作物)作为有商业或医学价值的异源蛋白质的生产载体的应用是一个可能更严重的问题。尽管能执行如上所述的生产标准来保持各个转基因系的同一性并降低无意的污染，但最终仍可发生基因向其他栽培品种的外流。与不能赋予独特形态学或易于鉴定的性状(如除草剂耐受性)的基因发生及扩散有关的问题尚未解决。

尽管已用多种技术向植物中导入基因，但在现有技术中遗传构建体不包含可用于在培养中鉴定和筛选转基因植物细胞或控制转基因持续或潜在扩散的特征。因此，在可辨别转基因植物与非转基因植物，或可辨别携带不同性状的转基因植物的机制中起作用的遗传构建体将解决污染问题。对非转基因植物无影响、但在鉴定时可排除含有特定转基因的植物的机制也可提供解决方案。此外，从不含特定转基因的其他商业作物中选择性排除含有这些转基因的作物的机制也是有价值的。

植物转化方法

一般而言，目前广泛使用两种方法向植物细胞中导入DNA。第一种包括用农杆菌属(Agrobacterium)或类似的土壤细菌转移DNA。将目标植物组织或细胞与合适的农杆菌菌株共培养，将质粒DNA注入植物细胞中(Schilperoot，R.A.等人，US 4,940,838；Schilperoot，R.A.和Hoekema，A.，US 5,464,763)。随后，被转化的各个植物细胞再生为完整植物。

农杆菌转化系统在历史上基于是冠瘿病病原菌的天然细菌载体的使用。冠瘿病代表天然形式的植物转化的结果。天然存在的农杆菌的肿瘤诱导(Ti)质粒包含：向植物细胞中转移DNA所需的DNA序列；向宿主植物DNA中整合外源DNA所需的DNA序列，称为边界片段；基因，称为癌基因，可导致植物生长调节物的形成，可在感染部位形成菌瘿。Ti质粒一般也编码导致形成某些类型的异常氨基酸(冠瘿氨基酸)的基因，这些异常氨基酸能被农杆菌代谢，但不能被植物细胞代谢。在天然系统中，被转移到受体植物宿主中的Ti质粒部分(T-DNA)通常含有所有这些基因和DNA序列。

已广泛研究了致瘤农杆菌株的癌基因。农杆菌质粒上一般有两种类型的癌基因：tmr癌基因和tms癌基因。tmr癌基因(也称为ipt基因)，其编码一种可合成异戊基腺苷5’-单磷酸的酶，该化合物是一种细胞分裂素植物激素，可诱导适当宿主中的根形成。称为tms的癌基因(包括tms癌基因1和tms癌基因2)编码引起适当宿主中植物生长素过量产生的酶，导致根的产生。tms和tmr基因结合起来通过导致适当宿主上冠瘿的产生。

含有Ti癌基因的植物在表型上异常，由于生长激素不平衡具有冠瘿瘤或卷曲的和扭曲的叶。这些异常植物不适于商业用途。尽管这些植物在转化后易于鉴定，但它们不能形成形态学正常的植物。因此，已用多种方法修饰了农杆菌Ti质粒，一般是通过去除癌基因，使之成为向植物细胞中导入DNA的工具。迄今使用过的农杆菌转化方法一般使用已经去除了导致细胞分裂素和植物生长素形成的基因和冠瘿氨基酸合成基因的Ti质粒。这些质粒一般被称为是“解除武装的(disarmed)”。因此，一般认为“武装的(armed)”Ti质粒含有癌基因。

进一步改造在植物转化中使用的Ti质粒，使之含有限制位点，以便在一个或多个边界片段之间或附近导入外源基因，和用于鉴定和筛选转化细胞的基因，如抗生素抗性基因或β-葡糖醛酸糖苷酶合酶(GUS)基因。通常将复制基因导入Ti质粒中，以使质粒能在非农杆菌宿主中复制。DNA运动和质粒从细菌细胞的转移所需的vir(毒力)基因通常保留于分开的质粒上，或位于与含有欲转移的DNA的质粒不同的Ti质粒中，因而不能被转移到受体植物细胞中。

第二种广泛使用的用于产生转化植物的技术包括使用靶向微粒。已经利用这些方法转化农杆菌法无法转化的单子叶和双子叶植物。例如，Sanford等人，US 4,945,050；McCabe等人，US 5,149,655；Fitzpatrick-McElligott等人，US 5,466,587；和Cofee等人，US 5,302,523，US 5,464,765中描述了多种不同的微粒和轰击方法。用靶向微粒导入的DNA具有在植物细胞中表达的类似功能特征，相当于通过农杆菌系统导入的DNA，例如，使用的载体通常包含用于外源基因插入的工程位点和鉴定或筛选转化子所需的基因。

用来获得转化植物的其他方法包括：直接向细胞核中显微注射(Crossway等人，US 4,743,548)；和原生质体的直接DNA摄取(Paszkowski等人，US 5,231,019，US 5,453,367)。

尽管植物转化的普通方法众所周知，但植物转化方法的实际应用通常受植物细胞对转化和培养条件的基因型反应的限制。物种中只有一个或两个基因型可进行转化是正常的。因此有效转化作物种中的所有基因型不是简单的，或在某些情况中是可能的。尽管已进行了大量努力来改变培养和转化方法，但某些植物基因型仍不能用对其他基因型有效的技术转化。因此在某些情况中，首先使用可进行转化的特定基因型，然后使转基因事件杂交，或“渐渗”到不能使用同一转化方法的种质中。尽管该方法最终可向只有经过努力才能转化的种系中导入转基因，但该方法费时且费力，因为人们必须在每次有性杂交时筛选转基因。

可快速鉴别已通过转化或渐渗导入转基因的植物的方法将大大促进转基因植物的生产。特别是，非破坏性目测可快速筛查大量栽培系和分离群。如果在幼苗期或在种子发育(例如胚拯救)期应用，这种筛查方法可应用于商业品种生产计划，其可在早期筛选种系，因此不需要使植物生长成熟，从而节省了时间与土地资源。这种方法也能用来在栽培中除去大量无效系，并可简化栽培与渐渗方法。特别是，这种方法可用于生产携带输入或输出性状包括高价值输出性状的转基因的芸苔属植物。

芸苔转化

曾经报道了用农杆菌及其他方法对十字花科(Cruciferae)成员的转化。然而，特别涉及芸苔转化的许多报道详述了通过农杆菌介导的转化常规获得转化芸苔属的物种的困难。许多报道表明一种或两种特定变种已获得成功，但未叙述通用于芸苔属所有种的详细方法。尽管能使用培养条件的多种操作，但某些变种证明极难以用以前报道的方法转化。因此为通过杂交和渐渗在这些基因型中导入转基因进行了极大努力。可由这些基因型可靠生产转基因植物或提供渐渗这些性状的有效方法的任何提高和发现都将是技术上的重大改进。

最初的许多芸苔转化研究用一种基因型——芸苔Westar变种进行(Radke等人，理论与应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)75：685-694，1988；Moloney等人，植物细胞报道(Plant Cell Reports)8：238-242，1989；Moloney等人，1989，US 5,188,958；Moloney等人，1989，US 5,463,174)。Westar是一种合适的选择，因为它可响应以上引用的参考文献中描述的组织培养和转化方法，并允许转基因植物的回复。Westar保留有选择的用于转化实验的基因型；但通过与最近的栽培品种比较，认为该变种的农业特性较少。因此在可靠的转化技术与芸苔籽的商品基因型之间仍有差距。

此外，用所述方法或其变化进行的许多芸苔转化研究已获得十分不确定的结果，其依赖于特定植物物质对转化方法的固有反应。一个例子是，芸苔所达到的转化频率有时不定且极低(Fry等人，植物细胞报道6：321-325，1987；Mehra-Palta等人，第8届国际油籽油菜大会论文集，Saskatoon，Saskatchewan，1991；Swanson和Erickson，理论与应用遗传学78：831-835，1989)。在其他的芸苔属种中也观察到不定且通常较低的转化频率，如甘蓝(B.oleracea)(Christie和Earle，第5届十字花科植物遗传学会议论文集，Davis，46-47，1989；Metz等人，植物细胞报道15：287-292，1995；Eimert和Siegemund，植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)19：485-490，1992；DeBlock等人，植物生理学(Plant Physiol.)91：694-701，1989；Berthomieu和Jouanin，植物细胞报道11：334-338；Toriyama等人，理论与应用遗传学81：769-776，1991)；芜青(B.rapa)(Radke等人，植物细胞报道11：499-505，1992；Mukhopadhyay等人，植物细胞报道11：506-513，1992)；芥菜(B.juncea)(Barfield和Pua，植物细胞报道10：308-314，1991；Deepak等人，植物细胞报道12：462-467，1993；Pua和Lee，植物(Planta)196：69-76，1995)；幽芥(B.nigra)(Gupta等人，植物细胞报道12：418-421，1993)；和B.carinata(Narasimhulu等人，植物细胞报道11：359-362，1992；Babic，科学硕士论文，Saskatchewan大学，1994)。

芸苔属的许多种、变种和栽培品种代表具有根本不同的形态学和生理特征的不同群体。许多具有商业意义的芸苔属的种不能很好地施行或根本不能施行以前所述的方法。特别是，含有异常脂肪酸组合物的芸苔籽似乎不能进行常规转化。如US 5,965,755所述，一种基因型，其代表为变种AG019，是高油酸、低亚油酸的基因型，其对常规转化方法无反应，如Moloney(同上)所述。变种AG019和由其衍生的变种含有有价值的脂肪酸组合物，可产生具有提高的氧化稳定性和营养价值的油。与普通油分布的芸苔如转化的Westar杂交，作为一种导入转基因的方法，可引起油组分的丢失，需要大量的栽培尝试来重建希望的油分布。大多数情况中不能确定是否能实现。因此，需要一种可转化难以转化的芸苔，特别是油分布改变的芸苔籽，更特别地转化芸苔属AG019种及其后代的方法。

因此，转化难以转化的芸苔属基因型的方法是有价值的。此外，鉴定转化的植物细胞、植物及其后代的方法也具有价值，特别是在该方法简单、非破坏性，并可目视鉴别含有目的转基因的植物或细胞时。如果这些方法还可在田间水平鉴别，则多种用途是可行的。

已发展了一定程度上满足这些需要的方法。可见标记基因如β-葡糖醛酸糖苷酶或GUS基因是可用的，但需要生物化学或组织化学测定。可对施用的化学药品起反应的基因的代表是所谓的“条件致死”基因。然而，它们一般引起致死表型，从而无法用于在栽培过程中追踪转基因。因此，本发明的一个目的在于提供在栽培计划中有用的条件致死基因，以及其他商业上重要的目的。

条件致死基因

条件致死性状和引起这些性状的基因已知。许多条件致死基因可导致致死表型和植物死亡。然而，某些条件致死基因能以不一定引起细胞死亡的方式使用。这种条件致死基因的一个例子是农杆菌Ti质粒tms癌基因2。该癌基因编码吲哚乙酰胺水解酶(IAMH)，与编码吲哚乙酰胺合酶(IAMS)的农杆菌癌基因1一起，构成这类细菌典型的吲哚乙酸(IAA)合成途径的部分。

植物形成吲哚乙酸是通过与农杆菌不同的途径发生的。因此，植物中IAMH(癌基因2)的表达不导致吲哚乙酸的形成，因为该酶的底物吲哚乙酰胺在植物细胞中不存在。然而，对表达IAMH基因的植物施用吲哚乙酰胺导致IAA的快速积累。尽管IAA是一种天然存在的植物生长素植物生长调节剂，但不加控制的高水平IAA快速干扰了细胞代谢，导致衰老和细胞死亡。IAMH酶能水解其他吲哚酰胺相关的底物，包括萘乙酰胺，产生众所周知的合成植物生长调节剂萘乙酸(NAA)。

条件致死基因如IAMH癌基因在选择玉米植物中的应用在1994年1月授予的US 5,180,873(Jorgensen)中有述。Jorgensen叙述了含有条件致死基因的植物转化。随后对这些植物进行连锁分析，然后选择致死基因与原有的或通过传统栽培技术导入的靶基因座之间的紧密连锁。1995年6月授予Fabijanski等人的美国专利5,426,041描述了一种用IAMS与IAMH产生杂交种子的方法。没有专利描述以非致死方法使用癌基因2或在转化期间或之后筛选的方法。没有专利描述用癌基因2选择性去除已获得转化的遗传物质的有关物种的方法。

因此，也含新性状的遗传构建体内的条件致死基因提供了一种控制新性状扩散的有效方法。然而，由于致死基因不能提供鉴别或筛选转化植物细胞特别是芸苔属细胞的非破坏性方法，所以传统的条件致死基因不能解决筛选、鉴定和追踪转基因植物及其后代中存在的问题。

因此，本发明的另一目的在于修饰并使用一种以前鉴定的条件致死基因，以在栽培和商品化过程中追踪转基因，以及在田间条件下使用。

发明概述

本发明提供用来产生能被目视且非破坏性地鉴别的转基因植物的方法和遗传构建体。本发明还提供通过施用在表达的遗传构建体存在下能被转化为植物毒剂的良性化学药品，能从生长地点安全且特异地去除的转基因植物。本发明的方法、遗传构建体和植物特别适用于与输入或输出性状或蛋白质的异源产生有关的用途。

本发明提供一种遗传构建体，其含有与在植物细胞中起作用的启动子有效结合的条件致死基因。该基因用于筛选、鉴定或选择性杀伤表达该基因的植物。

本发明也提供了一种含有适于在植物细胞中表达的两种基因的遗传构建体。一种基因是条件致死基因。其中任一种或两种基因与在植物细胞中起作用的启动子有效结合。

该遗传构建体含有一种条件致死基因，该基因由于施用的化学制剂而表达杀伤植物。因此，根据本发明的广泛方面，提供了一种遗传构建体，其含有：a)一种适于在植物细胞中表达的条件致死基因，和b)一种编码蛋白质、肽或反义RNA的新性状基因；该新性状基因适于在植物细胞中表达，当表达时产生希望的表型。

根据本发明的另一方面，提供了一种用来生产能被鉴别的重组植物的方法，其包括：a)用包含新性状基因和条件致死基因的遗传构建体转化植物细胞，该新性状基因和条件致死基因适于在植物中独立表达；和b)使植物细胞再生为完整植物。

根据本发明的另一方面，提供了一种目视鉴别含有条件致死转基因的植物或其后代的方法，其包括：(a)用一种制剂处理植物或植物群体，该制剂含有一种是条件致死基因产物的底物的良性化学试剂(以在被条件致死基因的产物转化为植物毒素后产生亚致死水平的植物毒素的水平施用该良性化学试剂)；(b)目视鉴别表现亚致死表型的植物；和(c)选择鉴别的植物，使其回复为正常植物。

本发明也提供一种目视鉴别含有癌基因2作为转基因的萌发的种子或植物胚芽的方法，其包括：(a)在含有吲哚酰胺或相关衍生物、任选地含有一种植物生长素转运抑制剂的培养基上培养种子或胚芽；和(b)目视鉴别表现该表型的萌发的种子或胚芽。

本发明也提供一种筛选含有癌基因2作为转基因的萌发的种子或植物胚芽的方法，其包括：(a)在含有吲哚酰胺或相关衍生物、任选地含有一种植物生长素转运抑制剂的培养基上培养种子或胚芽；(b)目视鉴别表现该表型的萌发的种子或胚芽；和(c)将鉴别的种子或胚芽转移到不含吲哚酰胺或植物生长素转运抑制剂的培养基上；从而获得含有癌基因2作为转基因的萌发的种子或植物胚芽。

根据本发明的另一方面，提供了一种在转化过程中筛选转基因芸苔植物细胞的方法，其包括：用含有癌基因、任选地含有编码一种新性状的基因的遗传构建体转化芸苔植物细胞；在培养过程的一个步骤内，使该植物细胞接触能被该癌基因作用的植物激素的良性植物生长素衍生物；培养细胞，并以良性衍生物转化为活性植物激素作为鉴定表现与活性激素相关的表型的转化植物细胞的方法；回收转化的植物细胞。

本发明也提供一种转化芸苔的方法，包括在愈伤组织形成和回复步骤中在培养基中含有萘乙酸。

本发明适合于为大规模农业和工业用途生产作物，如芸苔属的种/变种。该方法可用于在栽培过程中追踪并鉴定转基因。该方法也可用于生产含有新性状的商品植物变种，其中必须避免相同种的其他商业生产通过并花传粉或志愿者播种的污染。另外，本发明通过提供一种从任何环境中选择性去除含有转基因的植物的方法进行环境保护。

本发明特别提供一种生产可表达异源蛋白质的作物的方法。本发明的方法能用于基本上消除其他商业生产中异源蛋白质表达物的污染。

另外，本发明还提供转化芸苔属的种和变种的方法，包括以前发现难以转化或仅能以极低效率转化的变种。这包括商业上重要的高油酸/低亚油酸变种，特别是AG019及其后代。

附图简述

在附图中，“C.R.”是指“编码区”，“TER.”是指“终止区”，“PROM.”是指“启动子”，“PR”是指“引物”。

图1说明含有条件致死农杆菌癌基因2的植物转化载体pJH121在载体pHS723中的构建。除了该癌基因外，该载体还含有一种编码β-葡糖醛酸糖苷酶-卡那霉素抗性融合蛋白的基因，用于筛选植物细胞。

图2说明含有条件致死农杆菌癌基因2的植物转化载体pJH122在载体pRD400中的构建。除了该癌基因外，该载体还含有用于筛选植物细胞的卡那霉素抗性基因。

图3说明植物转化载体pJH123的产生，该载体含有与一种异源基因连接的条件致死农杆菌癌基因2，该异源基因是一种与GUS编码序列框内融合的芥属(Arabidopsis)种子油质蛋白编码区。种子油质蛋白编码区提供了融合蛋白向种子油体的特异定位。异源基因受种子油质蛋白启动子的控制。

图4说明植物转化载体pJH125在载体pRD400中的构建，该载体含有在35S启动子控制下的条件致死农杆菌癌基因2。除了该癌基因外，该载体还含有用于筛选植物细胞的卡那霉素抗性基因。

图5说明植物转化载体pJH126的产生，该载体含有与一种异源基因连接、在35S启动子控制下的的条件致死农杆菌癌基因2，该异源基因是一种与GUS编码序列框内融合的芥属种子油质蛋白编码区。种子油质蛋白编码区提供了融合蛋白向种子油体的特异定位。该异源基因受种子油质蛋白启动子的控制。

图6说明植物转化载体pJH130在载体pHS723中的构建，该载体含有在35S启动子控制下的条件致死农杆菌癌基因2。除了该癌基因外，该载体还含有一种编码β-葡糖醛酸糖苷酶-卡那霉素抗性融合蛋白的基因，用于筛选植物细胞。

具体实施方案描述

本发明提供用于生产能容易地目视鉴别的转基因植物的遗传构建体。该遗传构建体也用于通过施用仅影响转基因植物的化学制剂能容易地从任何生长地点去除的重组植物。该遗传构建体也提供了一种能在转化过程中使用的新型筛选方法。

根据一个优选的实施方案，遗传构建体含有一种条件致死基因和编码希望的性状的第二种基因。其任一种或两种基因均可修饰，使其能在植物细胞中表达。

希望构建遗传构建体，使得含有转录和翻译调节区和编码靶基因与条件致死基因的DNA的DNA序列通过多克隆位点连接，以方便地替换另一种或其他靶序列和/或条件致死DNA序列。

本发明的遗传构建体能导入植物转化载体中。该载体含有适于在植物中选择性表达的条件致死基因，该基因与也适于在植物中表达的靶基因连接。

该载体可含有例如已知的在植物中复制、转化和选择所需的遗传序列。例如，该载体可包含右和任选地左T-DNA边界，其中该载体将在农杆菌介导的转化系统中使用，或用于筛选转化子的卡那霉素抗性基因(NPTII)。

可通过任何合适的方法，如农杆菌介导、电穿孔或粒子枪法，将该遗传构建体导入植物细胞中形成重组细胞。可通过任何合适的方法使植物细胞再生为完整植物。这些重组植物能在植物栽培中使用或直接在农业生产中使用。

构建体的第二种基因编码一种希望的蛋白质、肽或反义RNA。该基因可以是，例如，任何来源的天然存在的部分或全部基因(即异源基因)，改变形式的天然存在的基因，合成DNA序列，或天然存在序列与合成序列的组合。目标产物的编码序列中可存在一个或多个内含子。这第二种基因能在植物系统中转录或表达为翻译产物；例如，通过含有适当的转录和翻译起始区和终止区。这第二种基因的表达能由例如未改变的或改变的天然、组成型、诱导型、发育调节的或组织特异的启动子调节，该启动子可以与调节条件致死表型表达的启动子相同或不同。为基因选择启动子将随希望的作用或想达到的结果而不同。

在分子耕作应用中，第二种基因的种子特异表达是特别有用的。因此，这些系统中的第二种基因优选地包含能在发育的植物种子中，更具体地，在种胚或能贮存甘油三酯的其他种子组织中表达的转录和翻译调节区。这些调节区可包括，例如，油质蛋白启动子(Plant等人，植物分子生物学25：193-205，1994)。优选地，第二种基因包含：(i)在植物中起作用的转录和翻译调节区，包括起始和终止区；和(ii)编码嵌合肽或蛋白质的区域。该编码区优选地包含(a)编码至少一部分油体特异的蛋白质的区域，其足以引起嵌合产物向油体的导向或分配，和(b)编码希望的蛋白质或性状的区域。嵌合基因的油体区可包含一种油体特异的启动子。嵌合肽或蛋白质也可包含一种肽序列，该序列将油体特异的蛋白质与希望的蛋白质连接，并能通过化学或酶促方法特异切割(Moloney，PCT/CA91/00161)。

本发明提供一种制备能从生长环境中选择性去除的转基因植物的方法。提供了一种遗传构建体，其包含一种条件致死基因和编码希望的性状的第二种基因。用该遗传构建体转化植物细胞，并再生为完整植物。遗传构建体的制备、转化和再生能用任何合适的方法进行。

特别地，本发明可用于生产一种含有转基因的植物，其包含输入或输出性状或任何希望的性状，具有额外的新特征，使得希望时能从生长地点特异去除这些转基因植物及其后代。本发明使用一种遗传构建体，其包含(a)与之连接的一种新性状基因，(b)一种基因，其编码能将良性物质转化为可引起表型改变或完整植物死亡的物质的产物。鉴定为(b)的基因在此被称为条件致死基因。

根据另一个实施方案，遗传构建体含有一种与在植物细胞中起作用的启动子有效结合的条件致死基因。在这种情况下，条件致死基因用来筛选、鉴定或选择性杀伤表达它的植物。

条件致死基因能从任何来源获得，如植物、细菌、病毒或动物系统，并且可以是野生型、改变或合成的。这些基因适于在植物系统中转录和翻译，包含例如任何必需的转录和翻译起始和终止序列。能调节条件致死基因，以在例如施用化学物质或施加生理应激如热和/或冷休克后，起始细胞死亡。在一个实施方案中，使用一种条件致死基因，该基因可通过施用对生长环境无已知的不利影响的物质激活而引起细胞死亡。

多种条件致死基因在本领域中已知。条件致死基因一般具有两种作用机制。存在无毒物质时或基因活性诱导后，致死表型是条件性的。在第一种情况中，基因表达一种产物，该产物能作用于通常外部施用的无毒物质，使之成为毒性的，并能杀伤植物细胞。在此情况中，条件致死表型依赖于无毒物质的存在。不存在无毒物质时，致死表型不表达；存在该物质时，观察到致死表型。

在第二种情况中，条件致死基因编码一种对植物细胞有直接毒性的产物。然而，毒素基因的表达受启动子调节，使得希望时能抑制毒素的表达，并使植物生长。在此情况中，当诱导启动子表达时观察到致死表型。不需要施用外部物质。

除了以下所述的基因外，本领域技术人员能容易地测定植物致死性的候选基因。此外，也可测定该基因，以观察其本身能否使用，或者是否需要一种可调节的、可能异源的启动子来诱导条件致死表型。

在本发明中有用的条件致死基因的例子和分子耕作的应用包括但不限于：癌基因，如编码可引起细胞分裂素过量产生的异戊基转移酶的癌基因4，其含有化学诱导型启动子，如可由N，N-己二烯2，2-二氯乙酰胺和相关化合物诱导的来自谷胱甘肽-S-转移酶II基因的启动子(WO9301294；Albertsen，M.C.等人，US 5,478,369)；或受冷诱导启动子控制的癌基因，如来源于芥属(Baker等人，植物分子生物学24：701-713，1994；Lang和Pulva，植物分子生物学20：951-962，1992；Nordin等人，植物分子生物学21：641-653，1993)或芸苔(White等人，植物生理学106：917-928，1994)的低温诱导基因。其他有用的条件致死基因是可将无毒物质转化为毒性物质的基因，例如下列基因：可将2-氨基-4-甲氧基丁酸(methoxinine)转化为毒性甲氧基乙烯基甘氨酸的methoxinine脱氢酶(Margraff，R.等人，实验(Experimentia)36：846，1980)；可将无毒methoxinine转化为毒性2-氨基-4-[2-氨基-3-羟丙基]-反式-3-丁酸(根瘤菌毒素)的根瘤菌毒素合酶(Owens，L.D.等人，杂草科学(Weed Science)21：63-66，1973)；和能将除草剂草甘磷的无毒衍生物水解为植物毒性草甘磷化合物的膦酸单酯水解酶(Dotson，S.B.和Kishore，G.M.，美国专利5,254,801)。

作用于植物中通常不存在的物质的条件致死基因产物能被一种或多种其天然启动子、诱导型启动子或组成型启动子调节。作用于植物中通常存在的物质的条件致死基因产物优选地应由诱导型启动子调节，使其仅在特定条件下才有活性，由启动子的作用决定对植物的致死性性。已知许多诱导型启动子可用于鉴定合适启动子的筛查方法。有用的启动子在所有或特定细胞型中可能有活性，和/或是发育调节的。文献中描述了许多不同类型的细胞或组织特异的和发育调节的启动子(例如，Rocha-Sosa等人，US 5,4365,393；Allen和Lonsdale，US 5,412,085；Coruzzi等人，US 5,391,725；Conklin和Yamamoto，US 5,459,252)，能选择那些适合于有商业意义的性状的启动子，并在本发明实施中使用。然而应当理解，引起足够水平表达而导致转化植物细胞死亡的任何启动子均适用于本发明。优选在延长期或需要时引起高水平表达的启动子。

因此，在本发明的一个具体实施方案中，条件致死基因与编码能在植物细胞在表达的异源蛋白质的基因连接。该条件致死基因能在接触特殊应激化学制剂后表达致死表型。

一种优选的条件致死基因是来源于根瘤农杆菌的Ti质粒的癌基因2，其编码吲哚乙酰胺水解酶(IAMH)。一个例子是，在Barker等人的美国专利5,428,147中公开了章鱼肉碱T-DNA的DNA序列，包括癌基因2的编码区和启动子序列。IAMH的底物包括多种吲哚酰胺和相关的植物生长素衍生物，包括合成的化学试剂萘乙酰胺(NAM)。对表达癌基因2的植物施用NAM导致植物毒剂萘乙酸(NAA)的产生。编码条件致死基因的DNA也包含一种启动子，在植物细胞中由其开始以足以产生条件致死表型的量表达IAMH。该启动子可以是癌基因2的天然启动子，组成型启动子，如花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S，或细胞或组织特异的启动子。

在本发明的一个最优选的实施方案中，用农杆菌的癌基因2作为植物转化载体的部分。植物转化载体中癌基因2的存在具有许多优点。包括：用亚致死剂量的植物生长素吲哚酰胺和相关植物生长素衍生物引起含转化载体的植物表型可见改变的能力；用吲哚酰胺和相关植物生长素衍生物在转化过程中筛选植物细胞的能力；癌基因2作为种子和胚拯救方法的组分的应用，该方法可鉴定含有转化载体的转基因植物。

本发明还提供用前述构建体或载体转化的植物或细胞。在一个优选的实施方案中，植物或细胞是芸苔。一个具体的实施方案是具有改变的油组成的芸苔。优选地，芸苔具有高油酸、低亚油酸含量，如AG019或其亲属及衍生物。

本发明的一个方面，条件致死基因对于控制新基因(包括在分子耕作中使用的基因)的扩散是有价值的。

在一个实施方案中，通过施用在条件致死基因产物存在下可被转化为植物毒剂的化学试剂，从生长环境中除去含有条件致死基因如癌基因2的转基因植物。该化学试剂以可产生致死水平的植物毒素的水平施用。在一个具体实施方案中，癌基因2用作条件致死基因。此情况中的基因产物是IAMH，其可将吲哚酰胺或相关衍生物转化为植物毒素NAA。在一个特别优选的实施方案中，吲哚酰胺是NAM。

在一个优选的实施方案中，本发明提供条件致死基因如癌基因2作为可见的、可评分的标记，其允许辨别转基因与非转基因植物。该方法包括施用一定量的化学试剂，该试剂在被表达的条件致死基因转化后产生亚致死水平的植物毒素。目视鉴别那些表现出亚致死表型的含条件致死转基因的植物。

本发明还提供一种对转基因植物的筛选方法，因为鉴定为转基因的植物在无条件致死基因时回复为正常植物。如上所述，当用癌基因2作为条件致死基因时，化学试剂是一种吲哚酰胺或相关衍生物。在一个特别优选的实施方案中，吲哚酰胺是NAM。

条件致死基因如癌基因2作为可见标记的应用可将任何希望的基因包括编码异源蛋白质或“输入”或“输出”性状的基因掺入到植物中，甚至在这种植物难以转化时，如某些芸苔如A019。

在发育早期目视检测后代之后进行的有性杂交提供了一种鉴定转基因植物的方便、非破坏性、非生物化学的方法。理论上能一次筛查上千个植物。该方法提供了一种便宜且精确的追踪大栽培群体中新性状渐渗的方法。不需要生物化学测定如GUS测定或核酸分析如PCR。因此，含有编码输入或输出性状的基因的植物转化载体中条件致死基因如癌基因2的内含可使所述性状快速渐渗到多种植物变种中。

提供了一种筛查表达癌基因2的转基因植物的简单方法。向植物群体喷施萘乙酰胺的配制混合物。24小时内，在转基因植物中观察到偏上性和明显可见的表型改变。不含癌基因2的植物不受影响。选择受影响的植物。它们在72小时内回复，继续生长并结种。这种表型反应传递给后代。

本发明还提供作为可见、评分标记的癌基因2，其允许筛选表达癌基因2的萌发的种子或植物胚芽。该方法包括在培养基上培养种子或胚芽，该培养基含有(a)一种吲哚酰胺或相关的衍生物；和(b)一种植物生长素转运抑制剂；然后目视鉴别表现出该表型的萌发的种子或胚芽。通过转移到不含吲哚酰胺或植物生长素转运抑制剂的培养基上，所鉴定的转基因种子或胚芽能容易地回复。

本发明还提供一种在转化过程中筛选转基因植物细胞的方法。该方法用一种癌基因作为转化细胞的表达构建体或载体的部分。待该载体穿入植物细胞后，即让该细胞接触一种制剂，其含有(a)在癌基因表达产物存在下可变为活性激素的植物激素良性衍生物，和(b)一种植物生长素转运抑制剂。待细胞生长为团块后，目视鉴别细胞团是否表现与活性激素有关的表型。然后在不含激素衍生物的情况下使鉴别的细胞群回复，并通过常用的方法再生为完整植物。如果癌基因是癌基因2，则优选的良性衍生物是一种吲哚酰胺或相关的衍生物如NAM，而优选的抑制剂是萘基氨甲酰苯甲酸。

除可被IAMH转化为NAA的NAM之外，植物生长素转运抑制剂的应用大大加强了NAA的作用。因此，通过使用一种制剂可鉴定包含希望的性状和癌基因2的转基因植物细胞，该制剂含有：(a)一种吲哚酰胺及有关化合物；和(b)一种植物生长素转运抑制剂。

能使用多种植物生长素转运抑制剂(植物营养蛋白(phytotrophin))，包括：N-(1-萘基)氨甲酰苯甲酸“抑草生”(NPA)；2，3，5-三碘苯甲酸(TIBA)；9-羟基芴-9-羧酸(HFCA)；赤藓红、伊红、荧光素；缩氨基脲(SCB)和乙烯利。一般而言，以施用植物生长素衍生物速率的10％～100％使用植物生长素。在某些情况中，使用相对于施用的植物生长素衍生物为200％～400％的植物生长素转运抑制剂。

尽管任何植物或细胞都能在本发明的方法中使用，但在一个优选的实施方案中，所使用的植物或细胞是芸苔。一个特别优选的实施方案是具有改变的油组成的芸苔。优选地，芸苔是具有高油酸、低亚油酸含量的芸苔，如AG019或其亲属和衍生物。

芸苔转化

也公开了一种用来获得转化的芸苔的新方法。该方法尤其可用于转化已发现难以用以前的方法转化的栽培品种。特别优选变种AG019及其后代。

在本发明的这一特定实施方案中，用来获得转化的芸苔AG019植物的方法包括转化、筛选和再生等步骤。该方法能用于用任何希望的遗传物质转化芸苔AG019植物及其后代。遗传物质插入已知适用于农杆菌转化的转化载体中。

转化方法包括植物细胞与合适的根瘤农杆菌菌株的共培养。已用于芸苔转化的菌株为数众多，包括例如GV3101/pMP90株(Konez和Schell，分子普通遗传学(Molecular Gen.Genet.)204：383-396，1986)、LBA4404/pAL4404株(Ooms等人，质粒(Plasmid)7：15-29，1992)和A281/pEHA105株(Hood等人，转基因研究(Transgenic Res.)2：208-218，1983)。

农杆菌用来以选择的遗传构建体转化芸苔细胞。芸苔细胞可以是任何形式，例如，培养的或愈伤组织中的细胞，或植物组织中的细胞，然而，下胚轴是优选的。预培养欲转化的细胞。在该处理中，将细胞置于再生培养基上3天。该再生培养基含有大量和微量养分、维生素和可诱导发芽的生长调节剂。

预培养处理后，使细胞接触选择的农杆菌菌株的培养物。然后将细胞置于共培养培养基上，优选地在约15℃下保持适当的时间，优选地约3天。

共培养后，将细胞转移到愈伤组织形成和回复培养基上7天。然后将外植体置于含有大量和微量养分、维生素和可诱导发芽的生长调节剂的选择培养基上。该选择培养基也含有杀菌剂，如羧苄青霉素。优选地，也含有一种选择剂。细胞在选择培养基上生长直到形成苗(推断的转化子)。对于油分布改变的芸苔的转化，向愈伤组织形成和回复培养基中加入激素NAA可大大促进转基因苗的形成。为加速再生，定期将所有生长的苗转移到新鲜选择培养基上。将小植物置于苗延伸培养基上，最后置于生根培养基上。

已发现上述用来获得转化的芸苔植物的方法尤其可用于芸苔AG019变种。

以下所述实施例是为了说明，绝非意在限制本发明的范围。

实施例1：新型芸苔转化方法

以下概述的方法可方便地转化芸苔，特别是芸苔变种AG019及其后代。对于AG019转化方法的所有步骤，使用下列组织培养(TC)条件：22+/-1℃，16小时光和8小时暗循环，光强度为100mE/m2/s。

种子在100％乙醇中表面消毒10秒种。乙醇浴后，将种子转移到100％Javex(5.64％w/v次氯酸钠)+0.1％吐温20(v/v)中10分钟，随后在100％Javex+0.1％吐温20(v/v)中再10分钟。表面消毒后，用大约800ml无菌水洗涤种子。表面消毒的种子接种于pH5.8的1/2强度的MMOM(Murashige基本有机培养基)、1％(w/v)蔗糖、0.8％(w/v)琼脂中。表面消毒的种子在上述TC条件下温育5-7天。

将含有植物转化载体构建体的单菌落农杆菌转移到AB基本培养基(Watson等人，1975)中，28℃48小时，这产生大约6×10⁸cfu/mL的密度。从发芽的种子中收获下胚轴，转移到预培养基(MMOM，3％(w/v)蔗糖，5.0mg/L BAP，0.7％(w/v)琼脂和NAA 0.1mg/L，pH5.8)中，在上述TC条件下温育3天。然后将下胚轴外植体从预培养基转移到含目的农杆菌菌株的AB基本培养基中，温育至少2分钟。然后将下胚轴外植体接种回预培养基中，在上述TC条件下温育3天。

共培养后，将下胚轴外植体转移到愈伤组织形成/回复培养基(MMOM，3％(w/v)蔗糖，5.0mg/L BAP，0.1mg/L NAA，0.7％(w/v)琼脂，pH7.5+300mg/L Timentin)中，在上述TC条件下温育以除去农杆菌，并允许愈伤组织形成和下胚轴外植体回复。应当指出，该步骤包括加入通常促进转基因苗回复的激素NAA。愈伤组织形成/回复后，将下胚轴外植体转移到新苗诱发培养基(MMOM，3％(w/v)蔗糖，4.5mg/L BAP，0.7％(w/v)琼脂，pH5.8+300mg/L Timentin，5.0mg/L硝酸银，和必要时的选择剂如卡那霉素)中，并在上述TC条件下温育大约4周，以诱导新苗的形成。在新苗诱发培养基上温育4周后，将绿苗和愈伤组织转移到含有MMOM、3％(w/v)蔗糖和0.7％(w/v)琼脂+300mg/L Timentin+选择剂的pH5.8苗延伸培养基中。绿苗和愈伤组织用上述TC条件温育另外4周。将绿苗从苗延伸培养基转移到生根培养基(MMOM，3％(w/v)蔗糖和0.7％(w/v)琼脂；0.1mg/L NAA或IBA；pH7.5)中，再温育4周或直到根发育到可移植到土壤中。形成根后，将小植物转移到土壤中在温室条件下生长。

实施例2：含有条件致死基因(癌基因2)的新型植物转化载体的构建

如本实施例和实施例3-7所述构建含有农杆菌的癌基因2作为条件致死基因的新型植物转化载体。这些载体可转化植物，以从未转化的植物群体中选择性去除。在常规用于生产转基因芸苔属植物的载体中没有发现这些载体所引起的这些特征。

该载体的制备方法包括，首先通过PCR从根瘤农杆菌菌株A248中分离条件致死基因2，并在该基因的5’和3’端引入限制位点。DNA编码序列及质粒pTiA6的天然启动子和终止序列从Genbank获得(保藏号X00409)。

从根瘤农杆菌菌株A248中提取总DNA。从Ti质粒pTiA6中扩增2.3kb PCR产物，该产物从靠近癌基因1(IAA-M)5’端的Hind III位点向全长双向启动子、癌基因2的编码区(IAA-H)延伸，终止于其终止子。所用引物pr8349和pr7495根据公开的癌基因2序列设计(Genbank保藏号X00409)。为便于克隆该产物，引物的5’延伸部分在产生的PCR产物的5’端引入了3个限制位点XbaI、PstI和KpnI，并在3’端引入一个BamHI位点。

KpnI

XbaI PstI

pr8349 ^5’-AAAATCTAGACTGCAGGTACCGCACTCGGTGGAGATTTG^3’

BamHI

pr7495 ^5’-AAAAGGATCCCACAGCGTGTGCCTAAATAGGATTGCT-^3’

在含有0.1μg模板DNA、5单位(1μL)来自Stratagene(San Diego，California)的TaqPlus DNA聚合酶、10μl延伸Taq缓冲液(Stratagene)、0.5U(0.2μl)Pfu DNA聚合酶(Stratagene)、8μl 2.5mMdNTPs、5μM引物(每种2.5μl)和21.2μl水的PCR反应液中使用农杆菌菌株A248的总DNA。该反应由94℃2分钟开始，然后35个循环：94℃30秒，55℃30秒，72℃2分钟。循环结束后，反应液在72℃下保持7分钟，分离DNA。

获得1.8Kb产物，经限制酶切分析证实其对应于真癌基因2。

PCR产物用XbaI和BamHI消化，连接于质粒pHS723的相应位点(Hirji，R.，Hammerlindl，J.K.，Woytowich，A.E.，Khachatourian，G.G.，Datla，R.S.S.，Keller，W.A.，Selveraj，G.(1996)质粒pHS723及其衍生物：能进行有效筛选和后代分析的植物转化载体。第4届加拿大植物组织培养和遗传工程会议，Saskatoon，Saskatchewan，加拿大)，产生pJH121。产生的载体转移给农杆菌菌株GV3101∷pMP90，并在共培养实验中用来产生表达癌基因2的转化植物。该载体也提供用于转基因学筛选的卡那霉素抗性和GUS活性。图1说明了pJH121的产生。

实施例3：植物转化载体pJH122的构建

含有癌基因2和卡那霉素抗性标记的植物转化载体如下构建。质粒pJH121首先用XbaI消化，然后用BamHI消化，切下由其天然、全长启动子引导的2.3Kb的癌基因2编码区和终止子。凝胶纯化并电洗脱该片段。二元植物转化载体pRD400同样用XbaI和BamHI消化。pRD400是一种除了在新霉素磷酸转移酶基因中有一个碱基对改变而增强了选择性标记的表达外与pBIN 19相同的质粒(Datla等人，基因122：383-384，1992)。将电洗脱的癌基因盒连接于载体的相应位点。通过三亲杂交将产生的质粒pJH122转移到农杆菌菌株GV3101∷pMP90中，以转化植物。图2说明了pJH122的产生。

实施例4：植物转化载体pJH123的构建

构建一种含有条件致死基因和编码能在植物细胞中表达的异源蛋白质的基因的植物转化载体。在本实施例中，条件致死癌基因2与编码一种融合蛋白的异源基因连接。在此情况下，在油质蛋白基因与β-葡糖醛酸糖苷酶基因之间融合，受质粒SBS 2002中的油质蛋白启动子控制。质粒SBS 2002是一种植物转化载体，含有由芥属油质蛋白启动子和与β-葡糖醛酸糖苷酶编码区翻译融合的编码区组成的3.8kb盒，终止于胭脂氨酸合酶终止子。该盒在以pCGYOBPGUSA出现时基本上如van Rooijen和Molonehy所述(向油体亚细胞导向的油质蛋白结构域的结构需要。植物生理学109(1995)：1353-1361)。质粒SBS2002用PstI消化，并在琼脂糖凝胶上分离片段。电洗脱3.8kb油质蛋白-GUS-NOS终止盒，与PstI-BglII连接体连接。该连接体在PstI端磷酸化，而BglII端不磷酸化。通过激酶反应将得到的产物在BglII位点处磷酸化。如实施例3所述的植物转化载体pJH122用BamHI消化，并磷酸化。然后在BamHI酶的存在下将激酶处理的油质蛋白-GUS片段连接于载体的BamHI位点。当转化大肠杆菌时，只有Bam/Bgl连接才能存活。

通过三亲杂交将构建的载体pJH123转移给农杆菌菌株GV3101：pMP90进行植物转化。该载体赋予转化的组织和植物卡那霉素抗性，用于筛选及癌基因2的表达。另外，油质蛋白-GUS盒可用于导向种子油体的葡糖醛酸糖苷酶活性的表达(van Rooijen和Molonehy，1995)。图3说明了pJH123的产生。

实施例5：植物转化载体pJH125的构建

从提取自根瘤农杆菌菌株A248总DNA的Ti质粒pTiA6中PCR扩增从癌基因2编码区的翻译起始密码子延伸，终止于其终止子的区域。所用引物pr810109和pr7495根据公开的癌基因2序列设计(Genbank保藏号X00409)。为便于克隆该产物，引物的5’延伸部分在产生的PCR产物的5’端引入了2个限制位点XbaI和NcoI，并在3’端引入一个BamHI位点。

XbaI NcoI

pr10109 ^5’-AAAATCTAGAGTCCATGGTGGCCATTACCTCG-^3’

BamHI

pr7495 ^5’-AAAAGGATCCCACAGCGTGTGCCTAAATAGGATTGCT-^3’

PCR产物用XbaI和BamHI消化，连接于质粒p35S-35S-NOS的相应位点。质粒p35S-35S-NOS含有一个由含复制增强子序列的35S花椰菜花叶启动子(Kay，R.，Chan，A.，Daly，M.和McPherson，J.，CaMV 35S启动子序列的复制产生植物基因的强增强子。科学236(1987)1299-1302)和NOS终止子组成的600bp片段。启动子-终止子片段包含于常用的克隆载体pTZ17R中，从Raju Datla博士处获得(植物生物技术研究所，加拿大国家研究委员会，110 GymnasiumRoad，Saskatoon，Saskatchewan，S7N 0W9)，产生pJH124。从pJH124中分离2300bp启动子-癌基因盒作为HindIII-BamHI片段，连接于二元植物转化载体pRD400的多克隆位点的相应位点，产生植物转化载体pJH125。将该载体转移给农杆菌菌株GV3101：pMP90，在与外植体共培养中用以产生可表达癌基因2的转化植物。图4说明了pJH125的产生。

实施例6：植物转化载体pJH126的构建

从pSBS 2002中分离油质蛋白-GUS盒，如对pJH123的构建所述连接并激酶处理。植物转化载体pJH126(包含含有癌基因2编码区和由35S-35S启动子引导的终止子的pRD400)用BamHI消化，并去磷酸化。然后如对pJH123所述在BamHI酶存在下将激酶处理的油质蛋白-GUS片段连接于该载体的去磷酸化的BamHI位点。

通过三亲杂交将构建的载体pJH126转移给农杆菌菌株GV3101：pMP90进行植物转化。该载体赋予转化的组织和植物卡那霉素抗性，用于筛选及癌基因2的表达。另外，油质蛋白-GUS盒可用于导向种子油体的葡糖醛酸糖苷酶活性的表达。图5说明了pJH126的产生。

实施例7：植物转化载体pJH130的构建

从pJH24中分离2300bp 35S-35S启动子-癌基因盒作为HindIII-BamHI片段，并克隆于植物转化载体pHS723的相应位点中产生质粒pJH130。骨架载体pHS723表达一种GUS-NPT融合蛋白，该蛋白允许根据卡那霉素抗性筛选转化的细胞、植物及其后代，及根据葡糖醛酸糖苷酶活性的表达容易地筛选转化的组织。导入癌基因盒后，细胞、植物及其后代也能另外表达癌基因2基因产物。图6说明了pJH130的产生。

实施例8：含有载体pJH121的转化烟草植物的分析

回收含有上述pJH121构建体的转化的烟草植物，并用标准分析检测以确定插入载体的存在与否。选择证实的转化子，如下用NAM处理代表数量的植物，以证明条件致死表型。制备含200μg/mL NAM与0.1％吐温20的溶液。用增压喷雾器向植物喷施至流下。对于表达条件致死表型的植物，喷洒2天后叶子下垂且叶缘卷曲。5天内叶子缠绕，植物显示典型的植物生长素毒性。未转化的植物不受该处理的影响。

从转化的植物上收集种子，在NAM存在下萌发，以证实条件致死表型的种子表达。

实施例9：含有载体pJH121的转化芸苔植物的分析

回收含有上述pJH121构建体的转化芸苔植物，并用标准分析检测以确定插入载体的存在与否。选择证实的转化子，在生长的3-4叶阶段如下用NAM处理代表数量的植物，以证明条件致死表型。制备含200μg/mL NAM与0.1％吐温20的溶液。用增压喷雾器向植物喷施至流下。对于表达条件致死表型的植物，喷洒后生长25天后转基因植物仍矮小，而非转基因变种生长正常并开花。

实施例10：含有载体pJH125的转化芸苔的分析

回收含有上述pJH125构建体(35S癌基因2)的转化的芸苔植物，并用标准分析检测以确定插入载体的存在与否。选择证实的转化子，如下用NAM处理代表数量的植物，以证明条件致死表型。制备含200μg/mL NAM与0.1％吐温20的溶液。用增压喷雾器向植物喷施至流下。对于表达条件致死表型的植物，喷施2天后叶子下垂且叶缘卷曲。5天内叶子缠绕，植物显示典型的植物生长素毒性。未转化的植物不受该处理的影响。

实施例11：在栽培计划中作为正选择/评分标记的癌基因2的证明

当与目的性状转基因连接时，癌基因2能在转化、事件转变和常规栽培策略中用作正选择和评分标记，作为简单可见的标记用于追踪目的性状基因。在事件转变(回交，渐渗)和常规栽培计划中目视选择植物的能力缩短了从转基因事件与农业优良种质杂交体中鉴别含目的转基因的后代所需的时间和分析支持(ELISA；PCR；Southern印迹分析等)。此外，在栽培计划中快速目视选择减少了组织样品处理和在栽培计划中不感兴趣的分离群体中非转基因植物的保持，直到从实验室获得分析结果。

在本实施例中，种植20个来源于JH2984和JH2973转化事件的植物。这些转基因变种对于插入的植物转化载体pJH125为3∶1分离。在2-3叶阶段以1mg/mL的速度施用NAM。施用NAM24小时后，就可见表型对植物评分。根据扭曲的叶子的外观，随机取样8个植物作为推断的转基因，选择4个作为非转基因。PCR分析这些植物中转化载体的存在与否。经PCR证实，全部8个推断的转基因植物均携带转化载体，而经PCR分析，全部4个推断的无效或非转基因植物均显示为非转基因的。从而证明了癌基因2作为评分标记鉴定分离群体(例如栽培计划或在渐渗期间)中转基因变种的快速可靠应用。

实施例12：在胚芽和种子萌发中条件致死癌基因2作为评分标记的应用

癌基因2能在体外测定中用作种子萌发和胚芽拯救中的选择性标记，以便能更早地确定分离群体中转化载体的存在。在含NAM和植物生长素转运抑制剂的培养基上培养时，含pJH125的转基因植物的种子或胚芽与未转化的幼苗比较，能根据表型目视筛选。这种体外测定可减少鉴定纯合转基因系所需的时间和物理空间(例如生长容器中或栽培的植物数量)，胚拯救法能筛选并回收转化的幼苗，缩短了栽培计划中代与代的周期。

在本实施例中，在NAM和植物生长素转运抑制剂萘基氨甲酰苯甲酸(NPA)的存在下，使代表转化载体pJH125的两个分离群体的JH2973和JH2984的种子在体外发芽。根据表型筛选转基因幼苗，包括矮小的幼苗、小子叶、矮缩且膨胀的根，和在根/芽连接处的愈伤组织。未转化的分离体正常生长。将推断的转基因幼苗转移到非选择性培养基后，正常地回收并生长植物。如上证实这些植物中转化载体的存在。

对于芸苔显然，小孢子培养物生产小孢子衍生的胚芽的用途与癌基因2作为评分标记的用途结合，提供了一种生产纯合转基因系的有效方法。

实施例13：癌基因2在芸苔转化过程中作为选择性标记的应用

可修改实施例1中所详述的转化方法，使得在该方法中能使用癌基因2。特别是，为了转基因AG-019变种及其后代的成功回复，实施例1中所述的转化方法需要在预培养、共栽培、愈伤组织形成/回复和根诱导期用NAA处理。在转化载体中包含癌基因2的情况中，在7天温育期间愈伤组织形成和回复中用NAM代替NAA，提供了一种促进转基因植物细胞生长的有效方法，并提供了一种回复转基因芸苔的正选择方法。该培养基含有NAM代替NAA，一般含有比例为1∶2到2∶1(NAM：植物生长素转运抑制剂)的植物生长素转运抑制剂。

上文提及的每一专利、专利申请书和公开文本在此分别引用作为参考。

上述具体实施方案的修改为本领域技术人员所熟知，并由本发明叙述。旨在使所有这些修改均为附加的权利要求书所涵盖。

序列表

<110>加拿大国家研究委员会

<120>转基因植物和制备其的方法

<130>75151-9

<140>

<141>US60/113,546

<151>1998-12-22

<160>3

<170>patentIn Ver.2.0

<210>1

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

aaaatctaga ctgcaggtac cgcactcggt ggagatttg 39

<210>2

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

aaaaggatcc cacagcgtgt gcctaaatag gattgct 37

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<220>

<223>引物

<400>3

aaaatctaga gtccatggtg gccattacct cg 32

Claims

1.一种遗传构建体，其含有：

在植物的植物细胞中可表达的第一种条件致死基因；

其中所述第一种条件致死基因选自：

a)条件致死基因经改造适应于在所述植物中表达，所述表达应答于对所述植物细胞施用化学或生理应激；和

b)条件致死基因经构建一旦向所述植物细胞施用异源物质则表达对所述植物致死的基因产物；

以及，第二种基因，该基因在所述植物细胞中表达时赋予该植物细胞非天然存在的目的性状，该第二种基因选自：

a)编码药品的基因；

b)编码工业有用的酶的基因；

c)编码凝乳酶或蛭素的基因；

d)编码输入或输出性状的基因。

2.权利要求1的遗传构建体，其中该第二种基因编码一种药物活性化合物。

3.权利要求1的遗传构建体，其中该第二种基因编码一种工业有用的酶。

4.权利要求1的遗传构建体，其中该第二种基因编码凝乳酶或蛭素。

5.权利要求1的遗传构建体，其中第二种基因编码一种输入性状。

6.权利要求1的遗传构建体，其中第二种基因编码一种输出性状。

7.权利要求3的遗传构建体，其中所述工业有用的酶选自蛋白酶、淀粉或碳水化合物酶；木质素酶；过氧化物酶；磷酸酶；氧化还原酶和肌醇六磷酸酶。

8.权利要求3的遗传构建体，其中所述工业有用的酶选自α淀粉酶、葡萄糖氧化酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶。

9.权利要求5的遗传构建体，其中所述输入性状选自：对害虫抗性的增加；对病害抗性的增加；对环境应激抗性的增加；和对除草剂耐受性的增加。

10.权利要求6的遗传构建体，其中所述输出性状选自：改变的油组成；改变的粉组成；降低的抗营养含量；和改变的加工特性。

11.权利要求1的遗传构建体，其中所述条件致死基因是一种癌基因。

12.权利要求11的遗传构建体，其中所述条件致死基因是来源于根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的癌基因2。

13.权利要求11的遗传构建体，其中所述条件致死基因是来源于根瘤农杆菌的癌基因4。

14.权利要求13的遗传构建体，其中来源于根瘤农杆菌的癌基因4受来源于芥属的低温诱导型基因的启动子控制。

15.权利要求1的遗传构建体，其中条件致死基因是编码methoxinine脱氢酶的基因，编码根瘤菌毒素合酶的基因或编码膦酸单酯水解酶的基因。

16.权利要求1的遗传构建体，其中所述条件致死基因经改造适应于在所述植物中表达，所述表达应答于对所述植物细胞施用化学或生理应激。

17.权利要求1的遗传构建体，其中所述条件致死基因经构建一旦向所述植物细胞施用异源物质则表达对所述植物致死的基因产物。

18.权利要求1-17中任一项的遗传构建体，其还包含与所述第一种条件致死基因有效结合的诱导型启动子。

19.权利要求1-17中任一项的遗传构建体，其还包含与所述第一种条件致死基因有效结合的组织特异的启动子。

20.一种含有权利要求1-19中任一项的遗传构建体的植物转化载体。

21.一种转基因植物细胞，其含有权利要求1-19中任一项的遗传构建体。

22.权利要求21的转基因植物细胞，所述植物细胞是芸苔属的品种的细胞。

23.权利要求22的转基因植物细胞，所述第二种基因赋予该芸苔属品种高油酸、低亚油酸基因型。

24.权利要求22的转基因植物细胞，所述芸台属的品种是变种AG019或其衍生物。

25.一种从生长环境中选择性地去除至少一种植物的方法，包括：

向所述含有权利要求1-19中任一项的遗传构建体之转基因植物施用一种化学试剂，所述化学试剂经改造以被所述条件致死基因的一种或多种基因产物转化成所述植物的植物毒剂。

26.权利要求25的方法，其中所述施用化学试剂包括以如下量施用该化学试剂，其中所述量经选择以实现一旦经该条件致死基因的一种或多种基因产物转化，所述植物毒剂在所述植物中达到亚致死水平。

27.权利要求26的方法，其进一步包括目视鉴别所述植物的亚致死表型。

28.权利要求25的方法，其中遗传构建体含有癌基因2作为条件致死基因，而其中化学试剂含有一种吲哚酰胺或相关衍生物。

29.权利要求28的方法，其中所述吲哚酰胺是萘乙酰胺。

30.权利要求25的方法，其中植物是芸苔属的品种。

31.权利要求30的方法，其中所述第二种基因赋予所述芸苔属的品种高油酸、低亚油酸基因型。

32.权利要求30的方法，其中芸苔属品种是变种AG-019或其衍生物。

33.一种鉴别或筛选含有癌基因2作为转基因的萌发的种子或植物胚芽的方法，包括：

提供一种植物种子或植物胚芽的转基因植物细胞，所述转基因植物细胞包含权利要求12的遗传构建体；

在含有吲哚酰胺或相关衍生物的培养基上培养该转基因植物细胞；和

通过生长素过度产生表型的表达目视鉴别该转基因植物细胞。

34.权利要求33的方法，其中所述培养基还含有一种生长素转运抑制剂。

35.权利要求34的方法，其中所述生长素转运抑制剂选自N-(1-萘基)氨甲酰苯甲酸；2，3，5-三碘苯甲酸；9-羟基芴-9-羧酸；赤藓红；伊红；荧光素；缩氨基脲；和乙烯利。

36.权利要求34的方法，其中所述吲哚酰胺是萘乙酰胺，而生长素转运抑制剂是萘基氨甲酰苯甲酸。

37.权利要求33的方法，其中所述植物细胞存在于种子或植物胚芽。

38.权利要求33的方法，其中所述植物细胞衍生自芸苔属的品种。

39.权利要求38的方法，其中芸苔属的品种是具有高油酸、低亚油酸含量的品种。

40.权利要求39的方法，其中芸苔属的品种是变种AG-019或其衍生物。

41.权利要求33的方法，其还包括将该转基因植物细胞转移到不含吲哚酰胺的第二种培养基中，并回收该转基因植物细胞。

42.权利要求41的方法，其中第二种培养基含有萘乙酸。

43.权利要求33的方法，在提供步骤之前，其还包括用权利要求12的遗传构建体转化植物细胞，以获得所述转基因植物细胞。

44.一种用于产生含有癌基因2作为转基因的转基因植物的方法，包括：

在含有萘乙酰胺和生长素转运抑制剂的培养基上培养该转基因植物细胞；

通过生长素过度表型的表达目视鉴别该植物细胞；和

将该转基因植物细胞转移到含有萘乙酸的第二种培养基上以回收该转基因植物细胞。